PAULO ROGÉRIO FERRETI BONAN
ANÁLISE DO FLUXO SALIVAR, QUANTIFICAÇÃO E,
IDENTIFICAÇÃO DE Candida E DE IgA ANTI-Candida SALIVAR EM
PACIENTES SUBMETIDOS À RADIOTERAPIA EM CABEÇ;E/
/
PESCOÇO
I
Dissertação apresentada ao Curso de Pós-Graduação em Biologia e
Patologia Buco-Dental, Faculdade de Odontologia de Piracicaba, UNICAMP, para a obtenção do Título de Mestre em Ciências.
Piracicaba 2001
PAULO ROGÉRIO FERRETI BONAN
ANÁLISE DO FLUXO SALIVAR, QUANTIFICAÇÃO E,
IDENTIFICAÇÃO DE Candida E DE lgA ANTI-Candida SALIVAR EM
PACIENTES SUBMETIDOS À RADIOTERAPIA EM CABEÇA E
PESCOÇO
Dissertação apresentada ao Curso de Pós-Graduação em Biologia e
Patologia Buco-Dental, Faculdade de Odontologia de Piracicaba, UNICAMP, para a obtenção do Título de Mestre em Ciências.
Orientador: Prof. Dr. Osvaldo Di Hipólito Júnior. Banca examinadora:
Prof. Dr. Pablo Agustin Vargas
Profa. Dra. Esther Goldenberg Birman Prof. Dr. Osvaldo Di Hipólito Júnior
Bonan, Paulo Rogério Ferreti.
B64a Análise do fluxo salivar, quantificação e, identificação de Candida e de IgA anti-Candida salivar em pacientes submetidos à radioterapia em cabeça e pescoço. I Paulo Rogério Ferreti Bonan. --Piracicaba, SP : [ s.n. ], 2001.
xiii, 84 f. : il.
Orientador: Prof. Dr. Osvaldo Di Hipólito Júnior.
Dissertação (Mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Odontologia de Piracicaba.
1. Candidíase. 2. Tratamento. 3. Radioterapia. 4. Microbiologia. I. Di Hipólito Júnior, Osvaldo. II. Universidade Estadual de Campinas. Faculdade de Odontologia de Piracicaba. III. Título.
Ficha catalográfica elaborada pela Bibliotecária Marilene Girello CRB/8-6159, da Biblioteca da Faculdade de Odontologia de Piracicaba- UNICAMP.
A Comissão Julgadora dos trabalhos de Defesa de Tese de MESTRADO, em sessão pública realizada em 22 de Fevereiro de 2001, considerou o candidato PAULO ROGÉRIO FERRETI BONAN aprovado.
-Dedico esse trabalho aos meus queridos pais, Laércio e Evanilde, à minha irmã Roberta, a minha namorada Silvana e às minhas avós Maria e Amélia por todo apoio, paciência, cuidado terno e amoroso e compreensão nos momentos dificeis e pelas risadas e contentamento na horas de alegria. Seus papéis superam o auxHio na escrita desse trabalho e se traduzem na minha formação, no meu pensar e nas minhas convicções.
" Digno és Jeová, sim, nosso Deus , de receber a glória, e a honra e o poder porque criaste todas as coisas e porque elas existiram e foram criadas por tua vontade "
Ao Prof. Dr. Osvaldo Di Hipólito Jr e ao Prof. Dr. Oslei Paes de Almeida por seus papéis imprescindíveis na minha formação acadêmica, científica e como ser humano. Muito obrigado por suas oportunas observações, por suas lições, por seus conselhos. Serei sempre grato a vocês.
AGRADECIMENTOS
À Faculdade de Odontologia de Piracicaba!UNICAMP, na pessoa de seu Diretor, Prof. Dr. Antônio Wilson Sallum, da Profa. Dra. Altair Antoninha Del Bel Cury, Coordenadora dos Cursos de Pós-Graduação e da Profa. Dra. Darcy de Oliveira Tosello, atual coordenadora do Curso de Pós-Graduação em Biologia e Patologia Buco-Dental.
A FAPESP, pela concessão da bolsa de estudos que permitiu a realização desse trabalho e do curso de Pós-Graduação.
A todos os professores, alunos e amigos do curso de Pós-Graduação em Biologia e Patologia Buco-Dental e de Estomatopatologia da Faculdade de Odontologia de Piracicaba!UNICAMP, Roberto, Cristina, Paola, Júnior, Renatinha, Newton, Rogério, Halbert, Mineiro, Danyel, Cláudio, Paulo Faria, Ana Lúcia, Karina, Cíntia, Karina e Marcelo pelo intercâmbio de boas risadas e pelo aprendizado do conhecimento científico.
Aos professores da Área de Patologia e Semiologia da Faculdade de Odontologia de Piracicaba!UNICAMP, Jacks, Ricardo, Edgard, Pablo, Márcio e Bozzo, por todos os "puxões-de-orelha", pelos conselhos, pelos direcionamentos. Sou muito grato a vocês.
Ao amigo Fábio Ramoa Pires, por todo apoio, orientação, correções nesses últimos 2 anos. Devo muito a você por minha formação profissional.
Aos amigos funcionários e médicos do Hospital dos Fornecedores de Cana de Piracicaba!SP por sua colaboração, bom convívio e prestimosidade que certamente foram importantíssimos na realização desse trabalho.
Aos am1gos funcionários da Área de Patologia da Faculdade de Odontologia de Piracicaba!UNICAMP, Adriano, Ana Cristina, Maria Helena, Rosa Maria, Aparecida e Rosa Scalco pelo inestimável apoio e auxílio durante esses dois anos.
Aos meus queridos amigos Mário, Eduardo, Fábio, Luiz Song, Rosalém e Sérgio Yuj i por todo apoio em momentos dificeis e por suas sinceras amizades.
SUMÁRIO
Resumo Abstract
Lista das abreviaturas
l-Introdução e Revisão da Literatura 2-Proposição
3- Material e Métodos
3.1-Coleta e processamento de saliva 3.2-Mensuração do fluxo salivar
3.3-Quantificação (isolamento e contagem) de Candida 3.4-ldentificação da espécies de Candida
3.4.1-Formação do tubo germinativo 3.4.2-Produção de clamidoconídeos
3.4.3-Fermentação de Carboidratos (Zimograma) 3.4.4- Assimilação de Carboidratos (Auxanograma) 3.4.5- CHROMagar e API 20 AUX
Página 1 2 3 4 17 18 20 21 22 24 25 26 27 28 30
3.5-Detecção de IgA anti-Candida salivar 4-Resultados 4.1-Dados gerais 4.1.1-Grupo I 4.1.2-Grupo 11 4.1.3-Grupo 111 4.2-Resultados Específicos 4.2.1-Grupo 111 4.2.2-Coleta salivar. 4.2.3-Quantificação de Candida
4.2.4-Identificação das espécies
4.2.5-Avaliação de lg~ Anti-Candida salivar
5-Discussão
5.1-Dados gerais
5.2-Fluxo salivar e quantificação de Candida
5.3-Identificação de Candida
5.4-Avaliação de lgA anti- Candida salivar
6-Conclusões 7-Referências Bibliográficas 32 34 34 34 35 35 38 38
41
45 48 51 54 54 58 62 65 67 69
-A radioterapia se constitui em um importante tratamento eletivo para cânceres de cabeça e pescoço, exclusiva ou conjugada com tratamento cirúrgico. Todavia, o tratamento radioterápico em campos envolvendo glândulas salivares resulta em quadros de xerostomia e conseqüente aumento na colonização de fungos, principalmente do gênero Candida. Objetivou-se nesse estudo avaliar fluxo salivar, contagens de Candida, incidência de espécies de Candida e avaliação de titulação de IgA anti-Candida, em 26 pacientes, antes, durante e após a radioterapia comparados aos valores obtidos com os de um grupo controle saudável (25 pacientes) e com um grupo de nove pacientes, que receberam radioterapia há mais de um ano. Observou-se a redução no fluxo salivar dos pacientes durante a radioterapia, incremento no número de pacientes positivos para Candida e diversificação entre espécies. A xerostomia, portanto , desempenha papel importante na colonização fúngica e durante a radioterapia ocorre aumento e diversificação das espécies de
ABSTRACT
The radiotherapy has been a elective treatment for head cancers and neck, exclusive or conjugated with surgical treatment. Though, the radiotherapic treatment in fields involving salivary glands results in xerostomia pictures and consequent increase in the colonization of yeasts, mainly of the gender Candida. The aim of this study was evaluate salivary flow, carriage of Candida, incidence of different species and evaluation of IgA anti-Candida, in 26 patient, before, during and after the radiotherapy and comparing the values obtained with one of a group control healthy (25 patients) and with nine patients, that received radiotherapy after one year. The reduction of salivary flow was show in patients during the radiotherapy, increasing in the number of patient positive for Candida, diversiftcation among species. The xerostomia, therefore, plays a important role in the yeast colonization and during the radiotherapy it increases and diversification ~
LISTA DE ABREVIATURAS
PH- potencial hidrogeniônico mg- miligramas
ELISA- enzyme-linked immunoabsorbent assay ml- mililitros
UFC- unidade formadora de colônia IgA- imunoglobulina A cGy- centigrays mllmin- mililitros/minutos g- grama J..Lg- micrograma o C- graus Celsius N- normal M- molar PBS- Phosphate-buffered Saline J..Ll- microlitros
1. INTRODUÇÃO e REVISÃO DA LITERATURA
A cavidade bucal é considerada como o principal sítio de ocorrência dos cânceres de cabeça e pescoço. Cerca de 90% dos cânceres bucais são do tipo espinocelular acometendo basicamente lábios, língua e assoalho, conforme citou a FUNDAÇÃO ONCOCENTRO DE SÃO PAULO 12, em
1993.
BLOIZIS & ROBINSON 5, em 1968, afirmaram que as formas de
tratamento mais amplamente indicadas para os tumores de cabeça e pescoço são a radioterapia ou uma combinação entre radioterapia e cirurgia . Também ressaltam que avanços ocorridos nesses procedimentos têm resultado numa maior sobrevida dos pacientes e no decréscimo de morbidade.
Dada a especificidade dessas duas formas terapêuticas, a radioterapia e a cirurgia são empregadas de maneira que uma complementa a outra. Isso ocorre porque o tratamento eficaz objetiva a eliminação do tumor, preservação da estrutura ou da função do orgão afetado da melhor forma possível e a manutenção da estética. De modo geral, nos pequenos tumores, a excisão cirúrgica e a radioterapia são igualmente eficazes ao passo que lesões
avançadas requerem a combinação entre técnicas (FUNDAÇÃO ONCOCENTRO DE SÃO PAULO 12, em 1993).
Para nortear a escolha entre as formas terapêutica supracitadas, LOPES
et al. 26, em 1998, ressaltaram a importância da localização da lesão, seu grau
de diferenciação histológica, o estadiamento clínico, além das condições clínicas do paciente.
WHITEMYER et al. 51, em 1997, indicaram a radioterapia como sendo
uma terapia efetiva no tratamento e controle dos carcinomas espinocelulares, destacando-se, no entanto, o impacto negativo causado pela radiação na saúde geral dos pacientes e em particular, na cavidade bucal.
A FUNDAÇÃO ONCOCENTRO DE SÃO PAULO 12, em 1993,
descreveu as formas terapêuticas da teleterapia, dividindo-as em duas fases distintas, englobando objetivos diferentes. A forma convencional ou pré-operatória visa controlar a doença em seu estágio sub-clínico, quando o tumor é primário ou em linfonodos. A dose utilizada, nesses casos, é de 4500 a 5000 cGy durante um período de 5 semanas ou em caráter tumoricida de 6000 a 7000 cGy em 6 a 7 semanas, com redução posterior de campo para 5000 cGy. A segunda fase, pós-operatória, objetiva erradicar a doença residual presente
ou suspeita situada nas margens da região cirúrgica. A dose preconizada é de 5500 cGy, durante o período de 6 semanas.
Como foi mencionado anteriormente, embora sejam bem visíveis os benefícios da radioterapia no tratamento do câncer bucal, efeitos secundários são observados nas regiões irradiadas como as alterações em mucosa, ossos, glândulas salivares e dentes, entre outras (WHITMYER et al. 50, em 1997;
KINDERLAN et al. 22, em 1998). Ulcerações e mucosite são ocorrências
comuns em pacientes em curso de tratamento radioterápico (BARRETT et al.
2
, em 1994 ). Com referência às glândulas salivares, a radioterapia pode
provocar alterações como atrofia, degeneração e diminuição na capacidade de produção de saliva (LOPES et al 26, em 1998).
EPSTEIN et al. 8, em 1999, realizaram um estudo através de
questionários enviados a pacientes irradiados há pelo menos 6 meses onde cerca de 65% dos pacientes os responderam relatando quais foram os principais desconfortos resultantes do tratamento radioterápico. Dificuldade em comer e mastigar foi relatada por 43% dos entrevistados. Xerostomia por 91,8%, mudança no paladar por 75,4%, disfagia por 63,1 %, dificuldade em falar por 50,8%, dificuldade em usar próteses por 48,5% e aumento na cavitação dentária por 38,5% dos pacientes dentados. A dor foi comum
(58,4%) e interferiu nas atividades diárias em 30,8% dos pacientes. A freqüência dos efeitos colaterais correlatados estava associada a dose e aos campos de radiação.
HOMES 16, em 1998, afirmou que a xerostomia se constitui em um
importante efeito colateral da radioterapia, embora alguns autores a encarem ainda como um sintoma menor com poucos efeitos prejudiciais. A gravidade da xerostomia vai desde queixas menores de secura e queimação em mucosa relativamente normal até total ausência de saliva com sensação de queimação grave (GARG & MALO 13, em 1997).
ROTHWELL 4\ em 1987, relatou que pouco após o início da
radioterapia de curso fracionado, a xerostomia surge e que, juntamente com a diminuição do fluxo salivar, ocorrem alterações na viscosidade, no pH, eletrólitos e em níveis de imunoglobulinas na saliva produzida. Devido a todas essas ocorrências, o paciente irradiado em cabeça e pescoço apresenta desconforto bucal noturno, dificuldades em engolir e falar, redução na movimentação dos lábios, aumento no risco de cáries e de outras infecções (WEERKAMP et al. 49, em 1987; CARL 7, em 1993; REGELINK et al. 37, em
Estudando o tratamento radioterápico para pacientes com Linfoma de Hodgkin cervical, KAPLAN 21, em 1985, mencionou que a radiação no campo
de manto engloba a glândula submandibular e parte da parótida dentro do campo de tratamento . Análises feitas através cálculos de radiação de cadáveres em campo de manto usando dosímetros diretamente dentro das glândulas evidenciaram que a glândulas submandibulares e as parótidas em sua porção inferior receberam mais de 90% da dose calculada para o tumor. Concluiu-se que a dose utilizada para a radiação do pescoço tipo manto é suficiente para causar redução parcial do fluxo salivar, com manifestações clínicas evidentes.
BROWN et al. 6, em 1975, realizaram um estudo longitudinal a fim de
avaliar o efeito da xerostomia induzida por radiação na microbiota bucal. Observaram que com a paralisação do fluxo salivar ocorre uma mudança na colonização de mtcroorgarusmos com aumento das espécies mats
.
.
cariogênicas.LIU et al. 25, em 1990, realizaram um estudo onde fizeram a avaliação
do fluxo salivar estimulado ou não de 4 7 pacientes com cânceres de cabeça e pescoço que receberam radioterapia com campos faciais bilaterais, unilateral ou manto com seis a 25 anos após o tratamento. Os dados obtidos foram
comparados com um grupo controle saudável. Foi relatado que houve redução significativa do fluxo salivar em pacientes irradiados bi ou unilateralmente e que houve uma redução menos intensa dos pacientes que receberam radiação de manto embora alguns estudos demonstrem quadros de xerostomia grave nesses pacientes. Observou-se que mesmo muitos anos após o tratamento o quadro de baixo fluxo salivar é persistente.
SCHUBERT & IZUTSU 44, em 1987, relataram que a recuperação na produção das glândulas salivares depende de fatores tempo-dose (incluindo as doses fracionadas) e possivelmente a idade do paciente. O período de função recuperadora nas glândulas salivares injuriadas vai geralmente de seis a 12 meses após o termino da radioterapia (REGELINK et al. 37, em 1998 ).
Além do desconforto resultante da hipossalivação e de alterações constitucionais, o baixo fluxo salivar induzido pela radioterapia, faz com que ocorra um aumento na colonização de Candida na cavidade bucal, sendo as manifestações clínicas da candidose diretamente ligadas a quadros xerostômicos (EPSTEIN et al. 9, em 1993; SCULLY & EPSTEIN 45, em 1996;
TARTARO et al. 48, em 1996; ROSSIE et al. 39, em 1987). Por esse
comum na região de orofaringe em pacientes irradiados (RAMIREZ-AMADOR et ai. 35, em 1997; QUINDOS et ai. 34, em 1996).
Em 1998, SWEENEY et ai 47, acompanharam pacientes terminais com
carcinomas em pulmão, mama e em cabeça e pescoço que apresentavam xerostomia. Dos pacientes avaliados, 67% apresentaram cepas fúngicas e manifestações clínicas associadas a essas leveduras como candidose pseudomembranosa e queilite angular na cavidade bucal. Embora a forma atrófica da candidose seja reconhecida, o componente eritematoso da mucosite por radiação permite apenas a identificação das formas mais características de candidose pseudomembranosa e pode mascarar os sintomas usuais de queimação da mucosa por Candida (MAXYMIW & WOOD 28, em 1989).
Diante desse fato, tem-se procurado entender qual é a real correlação entre a hipossecreção salivar e o incremento na colonização fúngica. O papel anti-microbiano da saliva parece assumir um significado importante nessa questão, já que essa possui importantes componentes proteicos que atuam contra Candida como as lisozimas, lactoperoxidase, imunoglobulinas, histatinas e lactoferrina (ROSSIE et ai. 39, em 1987).
JEGANATHAN et ai. 19, em 1987, analisaram imunoglobulina lgA
imunoglobulinas em níveis estatisticamente mais elevados do que os pacientes selecionados de um grupo controle.
Visando minorar os efeitos indesejáveis do aumento numérico de
Candida, alguns estudos tem sugerido terapêuticas profiláticas anti-fúngicas
pré-tratamento como a utilização de Fluconazol e de Anfotericina B
(FINLA Y 11, em 1996) e de redução da xerostomia com o uso da medicação
colinérgica durante o tratamento radioterápico (ZIMMERMAN et a!. 52 , em
1997). Quando o paciente já apresenta manifestações clínicas de candidose tem-se sugerido o uso de agentes anti-fúngicos como as pastilhas de nistatina, clotrimazol ou ungüento de nistatina para usuários de próteses (MERA W & REEVE 29, em 1998).
A utilização de medicação colinérgica em pacientes com baixo fluxo salivar possibilita a redução na colonização fúngica devido ao aumento do fluxo salivar. Um estudo realizado com 12 mulheres portadoras de Síndrome de Sjõgren na sua forma primária e secundária que se utilizaram de hipoclorito de pilocarpina em bochecho por um ano mostrou uma redução significante na colonização de Candida (RHODUS et a!. 38, em 1998). O grau de disfunção
salivar devido a radioterapia pode ser profundo com as glândulas salivares não respondendo a estimulação ou pode permitir uma resposta funcional residual
pela estimulação farmacológica por medicamentos como a pilocarpina (FERGUSON 10, em 1993).
ROSSIE et al. 39, 1997, relataram que além da xerostomia, deficiências
do sistema imune, má higienização, diabetes e antibioticoterapia estão entre outras causas comuns que favorecem o aparecimento da candidose. O diagnóstico dessa enfermidade é estabelecido mediante a análise da observação clínica do paciente, de sua história médica e de testes apropriados para a observação do fungo. LOPEZ-JORNET & BERMEJO-FENOLL 27, em
1994, correlacionaram a faixa etária com a secreção residual de saliva estudando uma população de 1493 pacientes saudáveis entre 5 e 88 anos de idade concluindo que o fluxo residual diminui com a idade. Isso certamente é um fator adjuvante no incremento dos níveis de Candida em pacientes irradiados idosos. OLIVER & SIITLLITOE 3\ em 1984, relataram que embora
alguns estudos tenham associado a condição de portador de Candida com o uso do fumo, um estudo feito com 1 00 pessoas saudáveis, fumantes e não-fumantes, mostrou que o papel do fumo é irrelevante, já que a prevalência de portadores de Candida foi a mesma (35%), para fumantes ou não. Esses dados discordam de EPSTEIN et al. 9, em 1993, que além de mencionarem o fumo
como um fator predisponente para a candidose citaram também o álcool e o uso de próteses como importantes fatores de relevância.
Com referência aos métodos de coleta para a avaliação de Candida em cavidade bucal, a escolha depende da natureza da lesão a ser investigada. O método de coleta de saliva total é indicado quando há um envolvimento generalizado em toda mucosa, ao passo que, o uso de swabs é mais apropriado quando lesões mais localizadas estão presentes (WILLIAMS & LEWIS 51 , em
2000). Com relação ao tipo de teste empregado na identificação, o uso de meios cromogênicos e os kits API 20C são bons métodos que são regularmente utilizados na prática laboratorial (WILLIAMS & LEWIS 51, em
2000; GIUSIANO & MANGIATERRA 15, em 1998).
A colonização de fungos em pacientes com câncer bucal e irradiados foi estudada por PAULA et a!. 32 , em 1990. Esfregaços de mucosa irradiada
corados em Gram e P AS revelaram um aumento de estruturas similares a leveduras, durante o tratamento em cerca de 61 % dos casos. Antes da radioterapia, as leveduras bucais que foram isoladas de 56 % dos pacientes representaram-se por Candida albicans (30%), Candida tropicalis (12%),
Candida glabrata e krusei (4%) e outras espécies diferentes (2%). Durante a radioterapia, leveduras foram isoladas de 72% dos casos, sendo Candida
albicans (36o/o), Candida tropicalis (16%), Rhodotorula rubra (6%), Candida kefyr (4%), Candida krusei, Pichia farinosa e outras nove espécieis (2o/o).
Sorotipo A de Candida albicans representou 93 % das amostras isoladas, antes do tratamento e 88% durante a radioterapia ..
LEUNG et al. 24, em 1998, realizaram um estudo visando a verificação
dos microorganismos de placas bacterianas subgengivais de bolsas periodontais rasas de pacientes previamente irradiados. Foram encontradas as mesmas espécies bacterianas principais encontradas numa população não-irradiada e um nível baixo de fungos e de micélios.
REEDING et al. 36, em 1999, estudaram a identificação de Candida em
pacientes irradiados utilizando CHROMagar, subcultura, tipagem molecular, além de realização de testes de sensibilidade antifúngica. Amostras de 30 pacientes submetidos a radioterapia foram cultivados semanalmente para
Candida. Pacientes que exibiram infecção clínica foram tratados com Fluconazol. Infecções ocorreram em 27% dos pacientes e foram devido predominantemente a Candida albicans (78% ). Pacientes irradiados portadores de Candida totalizaram 73% dos casos comparando com 52% de pacientes pertencentes a um grupo controle. A tipagem molecular evidenciou
que muitos pacientes mostraram as mesmas cepas durante o tratamento radioterápico.
LEUNG et a!. 23, em 2000, estudaram a colonização de leveduras e a
diversidade de cepas em pacientes irradiados em cabeça e pescoço, dentados e xerostômicos. Todos os pacientes, com carcinoma nasofaringeal, foram submetidos a regime de cuidados preventivos bucais acrescido de terapia antifúngica, se necessário. Foram feitas avaliações fenotípicas e genotípicas das amostras obtidas. Em todas as amostras isoladas foram espécies de
Candida e os pacientes irradiados tiveram um aumento na colonização fúngica comparado com os pacientes controle. A taxa de isolamento das espécies de
Candida permaneceu inalterada. A maioria dos pacientes coletados apresentaram os mesmos fenótipos para C. albicans e C. tropicalis na visita retomo. Foi observada a habilidade de adaptação fenotípica e genotípica que realça estrategicamente a sobrevivência dessa espécie na cavidade bucal, particularmente quando as defesas da saliva estão prejudicadas.
HOMES 16, em 1998, relatou que embora os efeitos colaterais
decorrentes do tratamento radioterápico sejam comuns, existe necessidade de novos estudos para compreensão ampliada dessas intercorrências. Com referencia a leveduras, há a necessidade de se compreender melhor o
mecamsmo de colonização, as espécies mais diretamente envolvidas e os mecamsmos de defesa envolvidos na saliva, particularmente as imunoglobulinas.
2-PROPOSIÇÃO
O objetivo do presente estudo é analisar os seguintes ítens:
1) determinação do perfil de tabagismo, etilismo e doses totais em pacientes em tratamento radioterápico;
2) determinação do fluxo salivar antes, durante e após a radioterapia; 3) avaliação da interferência da pilocarpina no fluxo salivar e na
quantificação de Candida;
4) quantificação do número de colônias de Candida antes, durante e após a radioterapia;
5) identificação da espécies de Candida;
3- MATERIAL E MÉTODOS
Fizeram parte do estudo 60 pacientes divididos em 3 grupos:
a) grupo I (grupo controle)- composto de 25 pacientes oriundos do OROCENTRO da FOPIUNICAMP com bom estado de nutrição, com idade entre 42 e 78 anos, sendo 20 do gênero masculino (80%) e cinco do gênero feminino (20% ), sem manifestações clínicas de afecções causadoras de xerostomia identificadas pelos meios propedêuticos e que nunca foram submetidos à radioterapia prévia em cabeça e pescoço;
b) grupo II - grupo de pacientes que foram submetidos à radioterapia há mais de um ano composto de nove pacientes oriundos do OROCENTRO da FOPIUNICAMP ou do Hospital dos Fornecedores de Cana de Piracicaba/SP, com idade entre 40 e 75 anos, sendo oito do gênero masculino (89%) e um do gênero feminino (11% ), submetidos à radioterapia exclusiva ou associada à
cirurgia como forma de tratamento de neoplasia maligna em cabeça e pescoço há mais de 1 ano.
c) grupo III- grupo de estudo composto de 26 pacientes oriundos do OROCENTRO da FOPIUNICAMP ou do Hospital dos Fornecedores de Cana de Piracicaba/SP, portadores de neoplasias malignas em cabeça e pescoço, com idade entre 22 e 83 anos, sendo 21 do gênero masculino (80,8%) e cinco do gênero feminino ( 19,2% ), que foram submetidos à radioterapia em cabeça e pescoço como forma exclusiva de tratamento ou associada à cirurgia/quimioterapia. Desses pacientes, 1 O se utilizaram de pilocarpina e 4, de Nistatina.
Os pacientes do grupo III foram entrevistados e examinados segundo a ficha clínica padronizada para o estudo, antes do início da radioterapia. Nos grupos I e II as informações foram obtidas a partir dos prontuários dos pacientes ou através de anamnese no OROCENTRO da FOPIUNICAMP ou no Hospital dos Fornecedores de Cana em Piracicaba/SP. Procurou-se estabelecer uniformidade entre faixa etária e gênero, intergrupos.
3.1-Coleta e processamento de saliva
As coletas de saliva foram realizadas distintamente para cada grupo do estudo seguindo o esquema abaixo:
a) grupo I - foi realizada uma coleta de saliva, com a qual foi feita mensuração do fluxo salivar, quantificação das colônias de Candida, identificação de espécies e detecção de anticorpos dos tipos lgA anti-Candida salivares.
b) grupo 11 - foi realizada uma coleta de saliva, com a qual foi feita mensuração do fluxo salivar, quantificação das colônias de Candida e identificação de espécies de Candida.
c) grupo 111 - os pacientes foram submetidos à quatro coletas de saliva, a primeira coleta antes ou até 4 dias após o início da radioterapia; a segunda
entre a 153 e a 23a sessões a partir do início da radioterapia; a terceira após o
término da radioterapia e a quarta coleta de 60 a 120 dias após a radioterapia. O conteúdo de cada uma das coletas dos 26 pacientes foi utilizado para mensuração do fluxo salivar, quantificação e identificação das espécies de
Candida e detecção de anticorpos dos tipos IgA anti-Candida salivares.
3.2-Mensuração do fluxo salivar
A saliva total não estimulada foi coletada por cinco minutos em frascos de vidro estéreis, identificados e pesados individualmente, em cada coleta (PIRES 33, em 1999). Os pacientes foram instruídos a reterem na cavidade
bucal a saliva produzida, depositando-a nos frascos em intervalos de um minuto. Nos casos de portadores de próteses, foi solicitada sua remoção durante a coleta. Após a coleta, o material foi conduzido diretamente para o laboratório e armazenado em geladeira à 4° C. O peso de cada coleta foi medido e ajustado para fluxo em mllmin para cada paciente (NA V AZESH et al. 30, 1992). Para o fluxo salivar total não estimulado, os valores de fluxo
normal situam-se próximos de 0,3 a 0,4 ml/min e os valores de hipossalivação, xerostomia, situam-se abaixo de 0,2 ou 0,1 mllmin (SREEBNY et al. 46, 1989).
3.3-Quantificação (Isolamento e contagem) de Candida
A análise microbiológica foi realizada com a mesma saliva utilizada para medição de fluxo salivar. Após a medição do fluxo salivar, o conteúdo da coleta foi homogeneizado em agitador e feitas diluições. Alíquotas de O, 1 ml de saliva pura foram acrescidas de 0,9 ml de solução fisiológica estéril e novamente homogeneizadas, gerando amostra de saliva diluída à 1
o-
1• Senecessário, da amostra diluída à 10-1 foi obtida alíquota de O,lml e acrescida de 0,9 ml de solução fisiológica estéril, obtendo-se diluição 1
o-
2• Alíquotas de0,1 ml da saliva pura, da diluição 10-1 e, eventualmente da diluição 10-2, foram
semeadas em duplicata em placas de Petri de cultura com agar Sabouraud dextrose com Cloranfenicol (0, 1 mg de quimicetina succinato por ml de meio) e incubadas em estufa de cultura a 3 7° C por 48 horas.
As culturas positivas foram contadas e foi obtida a média das duplicatas para a determinação do número de Unidades Formadoras de Colônias (UFC), selecionando-se, sempre que possível, a diluição que apresentou entre 30 e 300 colônias típicas por placa. Foram consideradas típicas as colônias de formato esférico, brancas, foscas, com aparência de porcelana, com diâmetro entre 1 a 8 mm e odor característico do gênero. As colônias foram isoladas em duplicata e qualificadas nos seguintes tipos morfológicos: tipo I (lisa com menos de 2 mm de diâmetro), tipo II (lisa com mais de 2 mm de diâmetro), tipo III (rugosa com menos de 2 mm de diâmetro) e tipo IV ( rugosa com mais de 2 mm de diâmetro). Colônias com aspecto ou odor atípico foram testadas por coloração de Gram, para descartar colônias
contaminantes de bactérias resistentes ao cloranfenicol.
O resultado, em UFC/ml de saliva, foi dado pela multiplicação da média do número de colônias das duas placas pelo fator de diluição e pela alíquota utilizada. Assim, os resultados foram multiplicados por 1 O vezes para a saliva pura, por 100 vezes para a diluição 10·1 e por 1000 vezes para diluição 1
o-
2• Os pacientes foram posteriormente categorizados em três grupos:"negativos" ou que não apresentaram crescimento de colônias em duas amostragens consecutivas, "portadores" que apresentaram contagens entre 1 e
399 UFC/ml e "positivos" que apresentaram contagens iguais ou superiores à 400 UFC/ml.
As colônias de cada tipo morfológico característico foram isoladas em duplicata e armazenadas em frascos contendo solução salina estéril à temperatura ambiente identificados de acordo com o paciente de origem, e
submetidas aos testes de identificação das espécies de Candida .
3.4-Identificação das espécies de Candida
A identificação foi realizada de acordo com SANDVÉN 43, em 1990,
3.4.1-Formação de tubo germinativo:
Uma alçada de cultura pura de 24 horas de levedura foi adicionada em tubo de ensaio (15 X150 mm) contendo 1,0 ml de soro estéril humano e incubada em estufa de cultura a 3 7° C por até 3 horas. Para visibilidade do tubo germinativo, uma gota de suspensão foi colocada entre lâmina e lamínula e observada à microscopia de luz (Fig. 1 ).
3.4.2-Produção de clamidoconídeos:
Foi utilizado o meiO ágar-fubá tween 80 (pH5,6), com a seguinte constituição:
Fubá ... 40g Ágar ... 15g Tween 80 ... 1 O ml Água destilada ... 1 000 ml
Quando da realização da prova, o ágar-fubá previamente preparado foi colocado em lâminas histológicas e depositadas dentro de placas de Petri esterilizadas. Após a solidificação do ágar, cada amostra foi semeada em estria única sobre a superficie do meio, colocando-se uma lamínula no centro da lâmina. No interior da placa de Petri, foi colocado algodão embebido em água., para manter a umidade do meio. O material foi incubado por 72 horas, à
temperatura ambiente, sendo analisado à microscopia de luz para a observação da presença de pseudohifas e clamidoconídeos.
3.4.3- Fermentação de Carboidratos (Zimograma)
Para a realização da prova foi utilizado o meio caldo vermelho de fenol, em 4 tubos de ensaio com tubos de Durhan em seu interior. Em cada tubo foi acrescentado um carboidrato (glicose, maltose, sacarose e lactose ), de modo a obter concentração de 20%. Após a autoclavagem (por 15 minutos a 120 °C), os tubos foram semeados com cultura pura de 24 horas de amostra mantida em ágar Sabouraud dextrose e a leitura realizada após 72 horas, considerando-se a produção de ácido pela viragem de pH (mudança de cor) e produção de gás no interior dos tubos de Durhan (Fig .2).
Figura 2: Prova de fermentação de carboidratos (da esquerda para a direita: glicose, sacarose, maltose, lactose)
3.4.4-Assimilação de Carboidratos (Auxanograma)
Para este teste foi utilizado o seguinte meio: Sulfato de amônia ... 5.0g Fosfato de Potássio monobásico ... l.Og Sulfato de magnésio ... 0,5g Ágar ... 20,0g
Após a dissolução em banho-maria, o meio foi distribuído (18-20 ml) em tubo de ensaio, autoclavado à 120°C por 15 min e armazenado em geladeira. Para execução da prova foi preparada uma suspensão da levedura em solução fisiológica esterilizada, com aproximadamente 1 O 8 células a partir de cultura em ágar Sabouraud dextrose. Desta suspensão foi colocado O, 1 ml nos tubos com o meio previamente liquefeito e resfriado (a cerca de 45
°
C) e vertidos em placa de Petri. Após a solidificação, discos de filtro previamente embebidos nos açúcares (glicose, maltose, sacarose, lactose e galactose) e secos em estufa foram colocados na superficie do meio a intervalos regulares de espaço. Após a incubação de 72 horas à 37° C, a leitura foi feita pela observação ou não de halo de crescimento ao redor do disco de papel (Fig. 3).L
5
Figura 3: Prova de Assimilação de Carboidratos (em sentido horário: glicose, galactose, sacarose, maltose e lactose)
3.4.5-CHROMagar e API 20 AUX:
Adicionalmente, utilizou-se a identificação de algumas amostras mediante o meio CHROMagar que possibilita a identificação de certas espécies através de cores diferentes (BERNAL et al. 4 em
BAUMGAR1NER et a/. 3, em 1996) e do Kit API 20 AUX
(BioMériuex) para sanar dúvidas provenientes de outros testes e confirmação de espécies não-Candida albicans. (HOUANG et ai. 17, 1997). Através do uso
do CHROMagar se possibilita a identificação de Candida albicans através da
cor verde esmeralda e C. tropicalis através da cor azul entre 48 e 72 horas de
incubação e entre temperaturas de 28 a 37 o C (GIUSIANO &
MANGIATERRA 15, em 1998). O KIT API 20 AUX é composto de uma
galeria contendo substratos desidratados que permitem realizar 19 testes de assimilação. As cúpulas são inoculadas com um meio mínimo semi-sólido e as leveduras se reproduzem se são capazes de se utilizar do substrato correspondente. A leitura dessas reações se faz por comparação com um controle de crescimento e a identificação se obtém mediante o uso de um catálogo analítico.
3.5-Detecção de IgA anti-Candida salivar
A detecção de anticorpos anti-Candida IgA foi feita mediante a realização do teste ELISA (JEGANATHAN & CHAN 18, em 1992) na saliva.
Nos pacientes analisados em tratamento radioterápico, a análise foi realizada nas quatro coletas sugeridas para esses pacientes. A técnica ELISA, descrita por JORGE 20 , em 1996, e adaptada, consiste no uso de placas de poliestireno
com 96 orificios (Hemobag) que foram sensibilizadas com (50 J.tg/ml) de
Candida em tampão carbonato-bicarbonato pH 9,6, guardadas a 4°C overnight. Antes do uso, as placas foram lavadas com PBS e os sítios livres do poliestireno bloqueados com 0,5% de gelatina em PBS, por 45 min a 37° C. Após a incubação as placas foram lavadas quatro vezes com PBS contendo O, 1% de Tween 20. As amostras previamente preparadas foram colocadas nos orificios, em duplicata, e as placas incubadas a 37° C por duas horas. Em seqüência, as placas foram lavadas cinco vezes com PBS-Tween-gelatina e 50 J..Ll do conjugado anti IgA humana, marcada com peroxidase, foi adicionado aos orificios, numa concentração de 1 J..Lg/ml. Atividade de peroxidase foi revelada utilizando-se 6 mg do substrato ortofenilenodiamino em 12 ml de
tampão citrato-ácido cítrico O, 1 M, pH 5,5 e adicionando-se 1 ÜJ.!l de peróxido de hidrogênio a 30%. A reação com o substrato (1 OOJ.!l) foi desenvolvida por cinco a 30 minutos a temperatura ambiente e bloqueada com 50J.!l de ácido sulfúrico 2N. As densidades ópticas (DO) foram lidas a 280nm em leitora de placas de ELISA. O controle positivo usado para a reação foi a saliva de paciente com candidose. Para facilitar as correlações com a quantificação de Candida, os valores de IgA salivar foram agrupados em baixo (até 1,8), médio (1,8 a 2,0) e alto (acima de 2,0).
4-RESULTADOS
4.1-DADOS GERAIS:
4.1.1-GRUPO I
A distribuição dos pacientes referente a gênero e faixa etária foi descrita em Material e Métodos. Entre os 25 pacientes pertencentes a esse grupo, 21 (84%) relataram experiência no hábito do tabagismo, sendo que 13 (62%) foram ex-fumantes e 8 (38%), fumantes. A experiência em etilismo crônico foi relatada por 1 O pacientes ( 40% ), sendo que seis pacientes (24%) confirmaram etilismo atual e quatro (16%), ex-etilismo. Com relação a utilização de próteses totais, oito (32%) eram usuários de próteses totais duplas, quatro (16%) eram portadores de próteses totais únicas, quatro (16%) pacientes eram portadores de próteses parciais removíveis e dois (8% ), usuários de próteses parciais fixas.
4.1.2-GRUPO 11
Entre os 9 pacientes pertencentes a esse grupo, oito (89%) relataram experiência no hábito do tabagismo sendo cinco (62,5%) ex-fumantes e três (37,5%) fumantes. A experiência em etilismo crônico foi relatada por sete pacientes, (77,8%) sendo que dois pacientes (22,2%) confirmaram etilismo atual e cinco (55,6%), ex-etilismo. Com relação a utilização de próteses totais, dois (22,2%) eram portadores de prótese total única e dois (22,2%) pacientes eram portadores de prótese parcial removível.
4.1.3-GRUPO 111
Entre os 26 pacientes pertencentes a esse grupo, 23 (88,5%) relataram experiência no hábito do tabagismo, sendo que 12 (46%) eram fumantes, 11 (42%) eram ex-fumantes e três (12%), não-fumantes. Dos tabagistas, 18
(77%) eram usuários de cigarro de papel e cinco (23%) de outras formas de fumo, conjugadas ou não. O tempo de tabagismo teve maior percentual em após 30 anos de uso (13) (57%) e outros períodos, inclusive os não especificados, totalizaram 1 O relatos ( 43% ).
A experiência em etilismo crônico foi relatada por 21 pacientes, (81 %) sendo que cinco pacientes (19%) confirmaram serem não-etilistas. A aguardente foi a bebida mais consumida (11) (52%), sendo seguida pelo uso de combinações entre bebidas (exemplo: pinga e cerveja) (6) (29%), cerveja (3) (14%) e destilados diversos (I) (5%) e o tempo de consumo médio mais comum foi de 20 a 30 anos (10) (47.5%) seguido por período indeterminado de consumo (5) (24%), mais de 30 anos (4) (19%) e até 20 anos (2) (9%). Quanto a utilização de próteses, 6 pacientes (23%) relataram o uso de próteses totais duplas e três (12%) de prótese totais únicas (monomaxilares). As comparações entre a experiência em tabagismo nos 3 grupos está demonstrada na Fig. 4, as relações intergrupos com referência ao etilismo na Fig.5 e a utilização de próteses em todos os grupos na Fig. 6.
1
grupo I grupo 11 grupo 111
D não-fumantes 11 ex-fumantes
li fumantes
Figura 4. Distribuição dos pacientes de acordo com hábito do tabagismo nos
3 grupos.
1
grupo I grupo 11 grupo 111
Cl não-etillsta 11 ex-etilista lletilista
grupo 111
grupo 11
grupo I
0% 20% 40% 60% 80% 100%
li!l Prótese total
li!l Prótese parcial O sem prótese
Figura 6. Distribuição dos pacientes com relação a utilização de próteses. Obs: As prótese totais ou parciais foram monomaxilares ou duplas.
4.2- RESULTADOS ESPECÍFICOS
4.2.1-GRUPO 111
Referente ao Grupo III, 23 pacientes (88%) foram acometidos por Carcinomas Espinocelulares (Fig. 7), um paciente ( 4%) por Linfoma
Não-Hodgkin, um paciente (4%) com Linfoma de Hodgkin e um paciente (4%) por Carcinoma Muco Epidermóide. Os locais de acometimento mais comuns foram o assoalho (4) (15%), língua (4) (15%), seio piriforme (3) (12%), área retromolar (2) (8%), hipofaringe (2) (8%), amígdala (2) (8%), dois ou mais sítios (2) (8%), mucosa jugal (2) (8%), laringe (1) (4%), loja amigdaliana (1) (4%), orofaringe (1) (4%), nódulos cervicais (1) (4%) e IIIb (classificação de Ann Harbor para Linfomas) (1) (4%) . Com relação aos casos de carcinoma espinocelular, o estadia (TNM) mais frequente foi o IV(15) (65%), seguido pelo III (6) (26%) e II (2) (9%). As doses totais de radiação nos tumores foram em média de 6482 cGy, sendo que a maior foi 8260 cGy e a menor de
1980 cGy (Tab.l ).
Tabela 1: Distribuição dos pacientes referente ao tipo de tumor, local e estadio da lesão e dose total recebida no tumor
PACIENTE TIPO DE TUMOR LOCAL DA LESÃO E DOSE TOTAL RECEBIDA
ESTADIO NO TUMOR
(cGy)
1 CEC ASSOALHO (IV) 8100
2 CEC ASSOALHO (III) 7100
3 CEC LÍNGUA E ASSOALHO (III) 7000
4 CEC REBORDO, PALATO 8260
MOLE, MUCOSA JUGAL
5 CEC
(IV)
LÍNGUA (IV) 7000
6 CEC ASSOALHO (III) 7200
7 CEC LÍNGUA (III) 7100
8 LINFOMA NÃO- AMIGDALA (pequenas 4500
HODGKIN células)
9 CARCINOMA MUCO-EPIDERMÓIDE
RETRO MOLAR (I) 6000
10 CEC SEIO PIRIFORME (IV) 7100
11 CEC METASTASE CERVICAL 6000
(IV)
12 CEC LÍNGUA(II) 7000
13 CEC SEIO PIRIFORME (IV) 8000
14 CEC AM;ÍGDALA (IV) 5700
15 CEC LlNGUA(IV) 6840
16 CEC RETROMOLAR (IV) 5880
17 CEC SEIO PIRIFORME (III) 7040
18 CEC OROF ARINGE (IV) 7000
19 CEC MUCOSA JUGAL (IV) 6840
20 CEC MUCOSA JUGAL (IV) 7000
21 CEC ASSOALHO (11) 7220
22 CEC LOJA AMIGDALIANA (IV) 7100
23 LINFOMA DE HODGKIN TIPO ESCLEROSE 2720 NODULAR (IIIb)
24 CEC HIPOFARINGE (IV) 6040
25 CEC HIPOFARINGE (IV) 1980
4.2.2--COLETA SALIVAR:
Os 25 pacientes pertencentes ao grupo I apresentaram média de fluxo salivar em repouso de 0,66 ml/min, sendo que o maior fluxo salivar nesse grupo foi de 1,9 ml /min e o menor fluxo, de 0,06 mllmin. Os nove pacientes do grupo li coletados apresentaram fluxo salivar médio de 0,290 ml/min, sendo o maior fluxo de 1,09 ml/min e o menor, de 0,014 ml/min. Referente aos 26 pacientes do grupo III, na primeira coleta, o fluxo médio foi de 0,653 mllmin, sendo o maior fluxo de 1,9 mllmin e o menor, de 0,092 ml/min; na coleta 2, 25 pacientes participaram e o fluxo salivar médio foi de 0,240 mllmin, sendo o maior fluxo de 0,590 ml/min e o menor, de 0,015 mllmin. A Fig. 8 demonstra o quadro de xerostomia após o início da radioterapia. Na coleta 3, 25 pacientes participaram e o fluxo salivar médio foi de 0,306 mllmin, sendo que o maior fluxo foi de 1,092 mllmin e o menor, de 0,018 mllmin. Na coleta 4, 11 pacientes foram coletados e a média de fluxo salivar foi de O, 184 mllmin, sendo o maior fluxo de 0,442 ml/min e o menor fluxo, de 0,003mllmin. A Fig. 9 exemplifica a correlação entre o fluxo salivar e as 4
coletas realizadas em pacientes do grupo III e o Fig. 1 O a correlação entre os grupos controle e as coletas do grupo III.
coleta 1 coleta 2 coleta 3 coleta 4
coletas
Figura 9 : Fluxo salivar (ml/min) em pacientes do grupo III- valores obtidos pelas médias dos grupos nas coletas
0,5
o
ml/min 0,3
grupo I grupo 11 grupo 111 c1 grupo 111 c2 grupo 111 c3 grupo 111 c4 Figura 10: Comparação entre as médias de fluxo salivar (ml/min) dos grupos controle com as médias das coletas do grupo III
Através de análise estatística se procurou correlacionar o fluxo salivar com a idade dos pacientes. Os dados do grupo I demonstraram a existência de correlação positiva (.011186 - Spearman) mas com ausência de significância (p=.957679); a correlação negativa foi observada no grupo II (.485384 -Spearman), entretanto sem significância (p=.185329). O grupo III apresentou correlação negativa ( -.128119 - Spearman) mas com índice não significativo (p=.532803). Associando-se o fluxo salivar com a cronicidade no hábito de fumar, observou-se correlação positiva no grupo I ( .165028 - Spearman) mas não significante (p=.430509), no grupo II. A correlação foi negativa (-.684007 - Spearman) e significante (p=.042158); o grupo III apresentou correlação negativa (-.055762 - Spearman) e não significativa (p=.786729). Procurou-se estabelecer também correlações entre o etilismo crônico e o fluxo salivar. Em todos os grupos as correlações foram negativas (Spearman grupo 1: -.345516, grupo II: -.277211 e grupo III: -.275868) mas não significativas (p= grupo I: .090705, grupo II: .470196 e grupo ID: .172531). Comparando-se a utilização de pilocarpina com o incremento no fluxo salivar nas coletas 2 e 3 observou-se correlação positiva (.08718 Spearman) mas não significativa (p= .836452).
Realizou-se o teste ANOVA (análise de variância), não paramétrica, para avaliar a significância na redução do fluxo salivar durante a radioterapia tendo como parâmetro o grupo I. Houve diferença significativa entre os grupos I e Ili (p= .0003) e entre os grupos I e li (p=.0132).
4.2.3-QUANTIFICAÇÃO DE Candida:
Os pacientes de todos os grupos foram analisados como negativos, portadores ou positivos para Candida . No Grupo I, 6 pacientes (24%) se
apresentaram negativos, 6 pacientes (24%) foram considerados portadores e 13 pacientes (52%) positivos para Candida (> 400 UFC/ml). A distribuição
dos pacientes de acordo com a caracterização e quantificação está alistada na Tab. 2 (ANEXO). Com relação ao Grupo li, nenhum paciente se apresentou negativo, 1 ( 11%) foi considerado portador e 8(89% ), positivos. A distribuição dos pacientes de acordo com o aspecto e quantificação das cepas está alistada na Tab. 3 (ANEXO).
Referente ao Grupo 111, na primeira coleta, seis pacientes (23%) foram negativos, 4 (15%) pacientes se apresentaram portadores e 16 (62%) positivos para Candida. Na coleta 2, dois (8%) pacientes se apresentaram negativos,
quatro (16%) portadores e 19 (76%) positivos. Na coleta 3, os pacientes negativos foram três (12%), 3 (12%) se apresentaram portadores e 18 (72%) positivos para Candida e 1(4%) não determinado (fluxo salivar muito baixo
impossibilitou análise). Na coleta 4, um paciente foi negativo (9,1%), um (9,1 %) era portador , oito (72,7%) se apresentavam como positivos e um (9,1 %) não determinado (fluxo salivar muito baixo). A Fig. 11 mostra a correlação entre UFC e as quatro coletas. A distribuição dos pacientes de acordo com a fenotipagem e quantificação das cepas está alistada na Tab. 4
(ANEXO), para coleta 1, Tab. 5 (ANEXO), para a coleta 2, Tab. 6
80 60 percentuais 40 20
o
10 20ao
40coleta coleta coleta coleta
coletas
...
o "O ~ o Q. li negativo 11 portador O positivoFigura 11 : Distribuição dos pacientes do grupo III relativa a presença de UFC de Candida
Através de análise estatística procurou-se correlacionar os valores de fluxo salivar com a quantificação de Candida em todos os grupos e em todas as coletas no grupo III. Procurou-se estabelecer correlações entre o fluxo salivar e UFC/ml nas 4 coletas salivares do grupo 3 e nos outros grupos Nos grupos I e II, a correlação foi negativa mas não significante (grupo 1: p=.354980; grupo 2: p= .733324). Com relação as 4 coletas do grupo III, as
coletas 1, 3 e 4 apresentaram correlações negativas e apenas na coleta 1 a correlação foi significativa (coleta 1: p=.007957, coleta 3: p= .0997 e coleta 4: .6198). A coleta 2 apresentou correlação positiva e não-significância (p=.8556).
4.2.4- Identificação das espécies de Candida
Os pacientes do grupo I apresentaram 24 diferentes espécies identificadas como sendo 14 de Candida albicans (58,3%), sete de Candida
tropicalis (29 ,2% ), uma de Candida krusei( 4,2% ), uma de Candida
13%
11 C.albicans
11 C.tropicalis Doutras
espécies
Figura 12: Distribuição das espécies encontradas em pacientes do grupo I
Referente ao Grupo li, foram encontradas 12 espécies diferentes sendo, cinco de Candida albicans ( 41,7% ), seis de Candida tropicalis (50%) e uma de Candida sp. (8,3%).
Os pacientes pertencentes ao Grupo III na coleta 1 apresentaram 27 espécies diferentes sendo dessas 19 de Candida albicans (70.4%) e oito de
Candida tropicalis (29,6%). Os pacientes do mesmo grupo submetidos a coleta 2 apresentaram 33 espécies diferentes sendo 13 de Candida albicans
(39.5%), 16 de Candida tropicalis (48,5%), duas de Candida sp (6%), um de
espécies diferentes foram identificadas sendo 12 de Candida albicans
(37.5%), 14 de Candida tropicalis (44,75o/o), duas de Candida parapsilosis
(6,25%), uma de Candida krusei (3,125%), uma de Candida lusitanae
(3,125%) e 1 de Candida sp (3,125%). Na coleta 4, 13 espécies diferentes
foram cinco de Candida albicans (38,45% ), cinco de Candida tropicalis
(38,45o/o), duas de Candida parapsilosis (15,4%) e um de Candida sp (7,7%).
Na Fig. 13, há a comparação entre as coletas 1, 2 e 3 e o incremento no número de espécies encontradas e na Fig. 14, a diferença entre a prevalência de C. albicans e C. tropicalis entre as espécies encontradas nas coletas 1, 2, 3
e 4.
33
Figura 13: Comparação entre o incremento do número de espécies diferentes
80 60 percentual de 40 espécies 20
o
coleta 1 coleta 2 coleta 3 coleta 4 coletas
11 C.albicans C.tropicalis 11 C.tropicalis C.albicans
Figura 14: Diferença entre a prevalência de C. albicans e C. tropicalis entre as espécies encontradas nas coletas 1, 2, 3 e 4.
4.2.5-A V ALIAÇÃO DE lgA ANTI-Candida
Os resultados obtidos da realização do ELISA para a detecção de IgA
anti-Candida foram para o grupo I (diluição da saliva para 1:8 e 1:16). Os dados obtidos foram classificados em níveis altos, médios e baixos (Tab .. 8). Para o grupo III os dados foram qualificados da mesma forma e alistados
Tabela 8: Distribuição dos pacientes do grupo I referente a colonização de
Candida e níveis de IgA anti-Candida
Quantificação de Candida IgA anti-Candida
Baixo Médio Alto
Negativo 1 (4%) 3(12%) 2(8%)
Portador 0(0%) 4(16%) 2(8%)
Positivo 0(0%) 9(36%) 4(16%)
Tabela 9: Distribuição dos pacientes do grupo III referente a colonização de
Candida e níveis de IgA anti-Candida
Quantificação de IgA anti-Candida Candida
Baixo Médio Alto
Negativo( coleta 1) 2(9%) 1(4%) 3(13%) Portador( coleta 1) 1(4%) 0(0%) 3(13%) Positivo( coleta 1) 2(9%) 5(22%) 6(26%) Negativo( coleta 2) 0(0%) 0(0%) 2(9%) Portador( coleta 2) 1(4,5%) 0(0%) 1(4,5%) Positivo( coleta 2) 0(0%) 0(0%) 18(82%) Negativo( coleta 3) 0(0%) 0(0%) 3(11%) Portador( coleta 3) 0(0%) 0(0%) 2(16%) Positivo (coleta 3) 1(5%) 1(5%) 12(63%) Negativo( coleta 4) 0(0%) 0(0%) 1(20%) Portador( coleta 4) 0(0%) 0(0%) 1(20%) Positivo( coleta 4) 0(0%) 0(0%) 3(60%)
Obs: Foram utilizadas amostras de saliva de 23 pacientes na coleta 1, 22 amostras de saliva de pacientes na coleta 2; 19 amostras na coleta 3 e 5, na coleta 4.
Procurou-se estabelecer correlações entre as os valores de positivo para UFC e índices mais altos de IgA no grupos I e III, todavia, os resultados através dos testes Mantel-Haenszel Chi-Square demonstraram que houve correlação positiva, mas sem significância.
5-DISCUSSÃO
5.1-DADOS GERAIS:
Embora a correlação entre gênero e colonização de Candida não é estabelecida, estudos tem tentado correlacionar a associação entre o incremento fúngico com o aumento da faixa etária e também com o tabagismo (OLIVER & SHILLITOE3\ em 1984; EPSTEIN et ai 9, em 1993 ). As
similaridades entre os grupos em faixa etária, gênero e tabagismo possibilitam a avaliação do papel da radioterapia e conseqüente diminuição do fluxo salivar de forma independente, sem se relevar as outras variáveis supracitadas. Referente ao uso de próteses e o aumento de leveduras bucais, JORGE 20, em
1996, relatou a incidência maior de Candida em usuários de próteses totais do que em pacientes dentados. Entre os pacientes pertencentes ao grupo I, 32% eram usuários de próteses totais duplas, e cerca de 23% dos pacientes oriundos do grupo III eram usuários desse tipo de prótese. Entretanto, antes do tratamento radioterápico foi solicitado aos pacientes que retirassem suas
próteses e que não as usassem durante todo o curso do tratamento diminuindo sua influência na colonização de Candida no decurso da radioterapia.
Houve também correlações similares entre os pacientes pertencentes ao grupo III e pacientes do grupo li relativas a distribuição por gênero (grupo Ili: 80,8% masculino e 19,2 % feminino; grupo li: 89% masculino e 11% feminino), a faixa etária (grupo Ili: 55,8 anos; grupo II: 58,9%) e a experiência presente ou passada referente ao hábito do tabagismo (grupo III: 88,5 %; grupo li: 89 % ). Os dados obtidos nessas variáveis (idade, gênero e experiência em tabagismo) são muito parecidos pois são correspondentes a um mesmo grupo de pacientes acometidos de neoplasias malignas em cabeça e pescoço, sendo a diferença observada apenas no tratamento recebido há mais de uma ano referente aos paciente do grupo II e nos pacientes antes, durante e após a radioterapia, em período inferior a 6 meses após o término do tratamento (grupo III).
Com relação ao tempo de tabagismo, os pacientes pertencentes ao grupo UI relataram na sua maioria que se utilizaram ou se utilizam do fumo por mais de 30 anos. Cerca de 47,5 %dos pacientes do grupo relataram consumo de álcool de 20 a 30 anos. Esses ítens são fortes fatores indicativos do papel da cronicidade e do papel significativo de tais hábitos na população
característica acometida por cânceres de cabeça e pescoço (ROTHS TEIN 40, 1994 ). Entre os tipos de fumo mais utilizados por esses pacientes, o cigarro de papel foi o mais comum (77%) ao passo que o uso de cigarros de palha e fumo conjugados com o cigarro de papel e outros tipos de fumo perfizeram o total de 23%.
Referente ao tipo histológico de tumor, 23 pacientes foram acometidos por carcinomas espinocelulares (88% ), dados próximos dos 95% dos citados pela FUNDAÇÃO ONCOCENTRO DE SÃO PAULO 12, em 1993, que cita
esse tipo como sendo o mais prevalecente em cabeça em pescoço. As doses totais empregadas no tratamento radioterápico foram em média de 6482 cGy, comparáveis com as doses médias tumoricidas que vão de 6000 a 7000 cGy citadas pela FUNDAÇÃO ONCOCENTRO DE SÃO PAULO 12, em 1993.
Essa dose média é superior a dose radioterápica de 6000 cGy que causa danos deletérios permanentes em glândulas salivares levando ao quadro de xerostomia irreversível, quando as glândulas salivares maiores se encontram no campo irradiado (SCULLY & EPSTEIN 45, em 1996). A doses abaixo de
5000 cGy foram empregadas em três pacientes sendo dois com linfomas e em um paciente falecido durante o tratamento radioterápico com carcinoma espinocelular. Embora esses pacientes não tenham recebido doses tão altas
quanto de dos outros pacientes do grupo, doses próximas a 2000 cGy podem causar dano no fluxo salivar permanente estabelecendo o quadro de xerostomia (SCULLY & EPSTEIN 45, em 1996).
Alguns pacientes, no curso do tratamento, se utilizaram de Nistatina ( 4 pacientes) e de pilocarpina (10 pacientes). Essas medicações possuem atuação sobre a colonização fúngica, já que a Nistatina é um anti-fúngico, indicado no combate a candidose (MERA W & REEVE 29, em 1998) e a pilocarpina age
no aumento do fluxo salivar contribuindo de forma indireta na redução de
Candida (RHODUS et al. 38 , em 1998). A análise estatística permitiu
evidenciar que houve um incremento no fluxo salivar nos pacientes que se utilizaram de pilocarpina na coleta 2 e 3 do grupo III, mas que esse não influenciou significativamente as contagens finais de UFC. A indicação da Nistatina foi realizada pelo radioterapeuta e a prescrição de pilocarpina no OROCENTRO seguindo um protocolo de tratamento de suporte para pacientes irradiados.
5.2- Fluxo salivar e quantificação de Candida
Os pacientes pertencentes ao grupo I tiveram fluxo salivar médio de 0,66 ml/min que é classificado como fluxo salivar acima dos valores de normalidade que se encontram entre 0,3 e 0,4ml /minem coletas de saliva não estimuladas (SREEBNY et al. 46, 1989). Os pacientes do grupo II apresentaram fluxo salivar médio de 0,290 mllmin, ou seja, fluxo médio inferior aos níveis de normalidade, esperado em pacientes após 1 ano do tratamento radioterápico onde a produção compensatória de saliva não é expressiva (REGELINK et a!. 37, em 1998 ). Os pacientes oriundos do grupo
UI, na coleta 1, apresentaram fluxo salivar médio de 0,653 mllmin, valor próximo ao do grupo I, evidenciando a similaridade existente intergrupos. Na coleta 2, o fluxo salivar médio foi de 0,240 mllmin, abaixo dos valores de normalidade demonstrando, que logo no início do tratamento radioterápico ocorrem quadros de hipossalivação (ROTHWELL 41 , em 1987). O fluxo
salivar nessa coleta não chegou a níveis xerostômicos (0, 1 a 0,2 mllmin) provavelmente devido ao uso de pilocarpina em 1 O pacientes dos 25 avaliados nessa coleta. Na coleta 3, o fluxo salivar médio foi de 0,306 mllmin, mais elevado do que na segunda coleta. Entre os pacientes coletados, 1 paciente
apresentou nessa coleta o fluxo de 1,092 mllmin, bem acima dos valores habituais, devido a estimulação com pilocarpina e a radiação em manto que causou danos as glândulas salivares envolvidas no campo mas com menos intensidade que a radiação em campos faciais (KAPLAN 2\ em 1985; LIU et
al. 25, em 1990).
Na coleta 4, o fluxo salivar médio foi de 0,184 mllmin, atingindo níveis xerostômicos. Um dos motivos para esse decréscimo no fluxo médio, provavelmente, está associado ao dano permanente nas glândulas salivares no campo de radiação, a descontinuidade no uso da pilocarpina após o tratamento e por esses pacientes ainda não se encontrarem na fase de função recuperadora nas glândulas salivares que vai de 6 meses a 1 ano (REGELINK et al. 37, em
1998 ). Realizando o teste ANOV A para verificar a correlação existente entre o fluxo salivar dos pacientes do grupo I e as coletas do grupo III, notou-se a redução significante nas coletas 2, 3 e 4. Evidenciou-se também redução significante no fluxo salivar do grupo 11 em comparação com o grupo I.
Embora o decréscimo no fluxo salivar também esteja associado com o
aumento da idade dos pacientes (LOPEZ-JORNET & BERMEJO-FENOLL 27,
em 1994 ), não houve significância entre a faixa etária e o fluxo salivar entre pacientes dentro dos próprios grupos. Isso provavelmente se explica porque os
pacientes pertencentes a esse grupos se encontram basicamente em grupos etários de meia-idade e idosos, onde a relação entre fluxo e idade não é tão facilmente comparada quando se utilizam pacientes mais jovens como parâmetro. Como exemplo, o grupo III, onde a variação entre a idade mínima e máxima foi de 61 anos, observou-se. uma correlação negativa, evidenciando a diminuição do fluxo salivar com a idade, embora não significante. Outras importantes associações que se tem tentado estabelecer com o decréscimo do fluxo salivar são feitas com o etilismo e com o tabagismo (OLIVER &
SHILLITOE 3\ em 1984; EPSTEIN et a/. 9, em 1993) . Estabeleceram-se
correlações entre o tempo de tabagismo e o fluxo salivar nos grupos estudados. Em todos os grupos, houve correlações negativas demonstrando a tendência na redução do fluxo salivar em detrimento ao maior tempo de consumo de fumo, entretanto apenas no grupo li, como sendo significante. As correlações negativas também foram observadas entre o consumo crônico de álcool e a redução do fluxo salivar, entretanto em nenhum dos grupos as diferenças foram significativas.
Referente a quantificação de Candida, os pacientes do grupo I apresentaram-se 52% positivos para Candida, 24% portadores e 24 % negativos. Esses dados se harmonizam com REEDING et a/. 36, em 1999, que
encontrou percentagens similares de portadores de Candida em uma população normal. Com relação ao grupo II, 89% dos pacientes se apresentaram positivos e 11% portadores de Candida e nenhum paciente negativo. Isso provavelmente ocorreu devido ao quadro de xerostomia evidenciado no fluxo salivar reduzido nesse grupo que contribui para o estabelecimento das leveduras na cavidade bucal (LIU et ai. 25, em 1990).
Conforme observado, os pacientes do grupo III, na coleta 1 , 62% foram positivos para Candida, índice superior ao encontrado no grupo L Isso pode ser explicado devido a dificuldade de higienização bucal dos pacientes (91% dos pacientes apresentavam estadios III e IV) e a utilização de medicamentos (ROSSIE et ai. 39, 1997). O índice de pacientes positivos subiu para 76% na coleta 2 permanecendo em 72% na coleta 3. O incremento na colonização fúngica durante o curso do tratamento radioterápico também foi encontrado por PAULA et ai. 32', em 1990, que isolaram leveduras em 72o/o
dos pacientes em radioterapia ao passo que antes do tratamento foram isolados fungos do gênero Candida em 56% dos pacientes. Na coleta 4, 72,7% dos pacientes se apresentaram positivos, concordando com autores que demonstraram alto índice de colonização fúngica pós-radioterapia (LEUNG et
