Naiara Cristina Lucredi
EFEITO DE ALTAS CONCENTRAÇÕES DE GLICOSE E SEUS DERIVADOS SOBRE A FUNÇÃO MITOCONDRIAL EM
ASTRÓCITOS
Dissertação submetida ao Programa de Pós-graduação em Bioquímica da Universidade Federal de Santa Catarina para a obtenção do Grau de Mestre em Bioquímica.
Orientador: Prof. Dr. Joana Margarida Navalho Gaspar
Coorientadora: Prof. Dr. Alexandra Susana Latini
Florianópolis 2019
Lucredi, Naiara Cristina
EFEITO DE ALTAS CONCENTRAÇÕES DE GLICOSE E SEUS DERIVADOS SOBRE A FUNÇÃO MITOCONDRIAL EM ASTRÓCITOS / Naiara Cristina Lucredi ; orientadora, Joana Margarida Navalho Gaspar, coorientadora, Alexandra Susana Latini, 2019.
120 p.
Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Biológicas,
Programa de Pós-Graduação em Bioquímica, Florianópolis, 2019.
Inclui referências.
1. Bioquímica. 2. Hiperglicemia. 3.
Neurotoxicidade da glicose. 4. Metilglioxal e AGEs. 5. Neurodegeneração. I. Navalho Gaspar, Joana Margarida. II. Latini, Alexandra Susana . III. Universidade Federal de Santa Catarina. Programa de Pós-Graduação em Bioquímica. IV. Título.
Dedico este trabalho a toda a minha família, em especial aos meus pais: Claudinei Peixoto Lucredi e Márcia Cristina Aguitoni Lucredi, que foram meus pilares de sustentação durante esses dois árduos anos de mestrado, sempre me incentivando e motivando a ir em busca dos meus sonhos.
AGRADECIMENTOS
Agradeço primeiramente a Deus por ter me dado saúde e forças para superar os vários obstáculos da pós-graduação, mantendo-me firme no meu propósito. Em segundo lugar, agradeço à minha família, a base da minha vida, em especial aos meus amados pais, Claudinei e Márcia, pelo apoio financeiro, psicológico, dedicação, incentivo e amor incondicional que me fizeram concretizar mais esta etapa acadêmica.
Ao meu noivo, amigo e companheiro Otávio Lopes, agradeço por ter entrado na minha vida para somar, compartilhando comigo todos os momentos de altos e baixos do mestrado com muita compreensão e sempre me incentivando a persistir nos meus objetivos.
Às minhas gatinhas e companheiras de casa Jolie e Marie, agradeço pelo amor e carinho irracional e sincero que me deu forças para persistir neste trabalho e almejar um futuro melhor para nós.
À minha orientadora, Joana Margarida Gaspar, agradeço por todo o auxílio nos protocolos experimentais executados neste trabalho, pelo apoio psicológico nos momentos ruins, ensinamento e colaboração intelectual para o desenvolvimento deste trabalho.
À minha coorientadora, Alexandra Latini, agradeço por todas as oportunidades para parcerias, participações em eventos, por fornecer espaço para a realização dos experimentos deste trabalho, pelo auxílio no planejamento experimental e pela ajuda intelectual para executar esta dissertação.
Ao Prof. Alcir Dafré e seu orientando de doutorado Gudrian Ricardo Lopes de Almeida do Laboratório de Defesas Celulares do Departamento Bioquímica, agradeço imensamente pela colaboração científica.
A todos os colegas de laboratório, aos atuais e aos que já fizeram parte, agradeço pela contribuição e incentivo.
Agradeço aos colegas de laboratórios vizinhos pelas trocas produtivas de conhecimento e auxílio com insumos para pesquisa.
Agradeço ao Laboratório Multiusuário de Estudos em Biologia (LAMEB) por ceder infraestrutura e ajuda técnica qualificada para a realização dos experimentos.
Agradeço ao Programa de Pós-Graduação em Bioquímica, à sua coordenadora Ariane Zamoner e aos seus secretários, que sempre foram muito prestativos.
Agradeço a todos meus amigos e colegas ou aqueles que em algum momento me ajudaram e contribuíram para este trabalho e para minha formação.
“A tarefa não é tanto ver aquilo que ninguém viu, mas pensar o que ninguém ainda pensou sobre aquilo que todo mundo vê.”
RESUMO
O diabetes mellitus (DM) é um dos distúrbios metabólicos mais comuns no mundo todo. Pacientes com DM possuem maior risco de desenvolver distúrbios neurodegenerativos e disfunção cognitiva, contudo os mecanismos subjacentes à neurodegeneração não foram ainda completamente elucidados. O DM é caracterizado por hiperglicemia crônica, considerada o principal fator patogênico associado ao desenvolvimento de complicações diabéticas. Em situações de hiperglicemia, ocorrem desvios à via glicolitica, levando à produção de metabólitos reativos, como por exemplo, o metilglioxal (MG). O MG é um composto altamente reativo que induz a formação de produtos finais de glicação avançada (AGEs). O aumento da concentração plasmática destes derivados (MG e AGEs), têm sido relacionado com disfunção celular e neurodegeneração induzidas pela glicotoxicidade. Neste trabalho, nós hipotetizamos que a exposição prolongada a altas concentrações de glicose e seus derivados prejudicam a função mitocondrial, reduzindo a viabilidade celular dos astrócitos. Assim, o objetivo deste trabalho foi investigar o efeito de altas concentrações de glicose e seus derivados (MG e AGEs) na viabilidade astrocítica e na função mitocondrial. Uma linhagem de células astrocíticas (C6) foi exposta à alta concentração de glicose ou MG por 24 ou 48 h para os ensaios de viabilidade, morte celular, determinação de MG intracelular, formação de AGEs, massa mitocondrial e respiração celular. As células foram também expostas a manitol, utilizado como controle osmótico. A exposição de astrócitos a altos níveis de glicose promoveu uma diminuição estatisticamente significativa na viabilidade celular (48h), no entanto não alterou a atividade da LDH (24 e 48h). A alta concentração de glicose resultou em um acúmulo significativo de MG e AGEs intracelular e, aumentou significantemente a massa mitocondrial. Embora a exposição ao MG não tenha afetado a viabilidade nem o conteúdo mitocondrial, o MG aumentou significantemente a respiração celular, sugerindo que o MG pode atuar como um desacoplador mitocondrial. Assim, a conclusão deste trabalho foi que a exposição prolongada a altos níveis de glicose e seus derivados (MG e AGEs), modificam a função mitocondrial, através de alterações na massa e respiração mitocondrial, evento associado à redução da viabilidade celular em astrócitos. Tais alterações podem predispor os astrócitos ao estresse oxidativo gerado pela glicose, contribuindo para o maior risco de neurodegeneração em pacientes afetados pelo DM.
Palavras-chave: Hiperglicemia , glicotoxicidade, metilglioxal, AGEs, disfunção mitocondrial, neurodegeneração.
ABSTRACT
Diabetes mellitus (DM) is the most common metabolic disorder worldwide. Patients with DM are at higher risk for developing neurodegenerative disorders and cognitive dysfunction, however the mechanisms underlying the induction of neurodegeneration have not been clearly elucidated. DM is characterized by chronic hyperglycemia, the main pathogenic factor linked to the development of diabetic complications. Under hyperglycemia, deviations of the glycolytic pathway occur leading to the production of reactive metabolites, such as methylglyoxal (MG). MG is a highly reactive compound that induces the formation of Advanced Glycation End-Products (AGEs). Increased plasma levels of both derivatives, MG and AGEs, have been related with the induction of cell dysfunction and neurodegeneration. In this work, we hypothesized that long-term exposure to high glucose concentrations and its derivatives (MG and AGEs) impairs astrocytic mitochondrial function, leading to a decrease in astrocytic cell viability. Therefore, the aim of this work was to investigate the effect of high glucose concentrations and its derivatives (MG and AGEs) on astrocytic viability and mitochondrial function. We used an astrocytic cell line (C6 cells) that were exposed to high glucose concentration or MG during 24 h or 48 h for cell viability and cell death assays, free intracellular MG determination, AGEs formation, mitochondrial mass and cell respiration and cell death assays. Cells were also exposed to mannitol as an osmotic control. High glucose concentration induced a significant decrease in astrocitic cell viability (48h). However, no changes were observed in LDH activity (both at 24 and 48h). The high concentration of glucose induced a significant intracellular accumulation of MG and AGEs. Mitochondrial mass was also increased in astrocytes treated with high glucose concentration. Although the exposure to MG did not affect cell viability or mitochondrial content, MG significantly increased cell respiration, suggesting that MG can act as a mitochondrial uncoupler. In conclusion, the prolonged exposure to high glucose concentration and its derivatives (notably MG and AGEs) modifies mitochondrial function, this event is linked to reduction of the cellular viability in astrocytes. These alterations can predispose astrocytes to oxidative stress generated by glucose, contributing to the greater risk for neurodegeneration in patients affected by DM.
Keywords: Hyperglycemia. Glucotoxicity. Methylglyoxal. AGEs. Mitochondrial dysfunction. Neurodegeneration.
LISTA DE FIGURAS
Figura 1 - Representação da ANLS ... ...33
Figura 2 - Vias metabólicas favorecidas por altos níveis de glicose...35
Figura 3 - Formação e sinalização dos AGEs...38
Figura 4 - Principais vias metabólicas envolvidas na síntese do metilglioxal...43
Figura 5 - Sistema das glioxalases...45
Figura 6 - Estrutura mitocondrial e cadeia respiratória...47
Figura 7 - Ciclo de vida mitocondrial...50
Figura 8 - Efeito in vitro de altas concentrações de glicose (25 mM; 24 e 48 h) sobre a viabilidade e morte de células C6 de astroglioma de rato...67
Figura 9 - Efeito de altas concentrações de glicose (25 mM; 48 h) sobre a formação de MG intracelular em células C6...69
Figura 10 - Formação de AGEs em células C6 tratadas com altas concentrações de glicose...70
Figura 11 - Efeitos do MG sobre a viabilidade e respiração de células C6...71
Figura 12 - Efeito de altas concentrações de glicose e do MG sobre a massa mitocondrial de células C6 em 24 e 48 h...72
Figura 13 - Efeito da obesidade sobre a concentração plasmática de MG e conteúdo de AGEs no plasma em pacientes pediátricos...73
Figura 14 - Mecanismo proposto para a queda da viabilidade celular em astrócitos...83
LISTA DE TABELAS
Tabela 1 - Critérios laboratoriais para diagnóstico de normoglicemia, pré-diabetes e DM ... 29 Tabela 2 - Dados dos pacientes obesos e controles...65
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS ADP: Difosfato de adenosina
AGES: Produtos finais de glicação avançada AIDS: Síndrome da imunodeficiência humana Akt: Proteína cinase B
AMP: Monofosfato de adenosina
AMPK: Proteína cinase ativada por AMP ANLS: lançadeira de lactato astrócito-neurônio ANOVA: Análise de variância
AP-1:proteína ativadora 1
ATF6: Fator de ativação transcricional 6 ATGs: Proteínas relacionadas à autofagia ATP: Trifosfato de adenosina
BAD: Proteína pró-apoptótica BECN1: Beclina 1
CHOP: Proteína homóloga à proteína de ligação à CCAT DA: Doença de Alzheimer
DAPI: 4',6'-diamino-2-fenil-indol DM: Diabetes mellitus
DM1: Diabetes mellitus do tipo 1
DM1A: Diabetes mellitus com presença de auto-anticorpos DM1B: Diabetes mellitus idiopática
DM2: Diabetes mellitus do tipo 2
DMB: 1,2-diamino-4,5-methilenodioxibenzeno DMEM: Meio Eagle’s com modificação de Dulbecco DMSO: Dimetilsulfóxido
DNA: Ácido desoxirribonucleico DP: Doença de Parkinson
Drp1: Proteína 1 relacionada à dinamina
EAATs: Transportadores de aminoácidos excitatórios EDTA: Ácido diaminotetracético
EGTA: Ácido tetracético etileno-bis (oxietilenonitrilo) ERK1/2: Cinases reguladas por sinais extracelulares 1/2 ERO: Espécies reativas de oxigênio
ERRs: Receptores relacionados ao estrogênio ERRα: Receptor relacionado ao estrogênio α ERRβ: Receptor relacionado ao estrogênio β ERRγ: Receptor relacionado ao estrogênio γ
F1-ATPase: Componente catalítico solúvel da ATP-sintase FAD: Dinucleotídeo de flavina-adenina oxidado
FADH2: Dinucleotídeo de flavina-adenina reduzido
FIP200: Proteína de 200 kDa da família de proteínas de interação FAK Fis1: Proteína de fissão 1
FMN:Mononucleotídeo de flavina
Fo-ATPase: Componente hidrofóbico da ATP-sintase sensível à oligomicina
GFAT: Glutamina: frutose-6-fosfato aminotransferase Gln: Glutamina GLO1: Glioxalase 1 GLO2: Glioxalase 2 GLS: Glutaminases Glu: Glutamato GluR:Receptores glutamatérgicos GLUT1:Transportador de Glicose 1 GLUT3: Transportador de Glicose 3 GLUTs: Transportadores de Glicose GS: Glutamina sintetase
GSH: Glutationa reduzida GSSG: Glutationa oxidada GTPase: Hidrolase de GTP HbA1c: Hemoglobina glicada
HIV: Vírus da imunodeficiência humana
Hoechst: 2'- [4 – etoxifenil] – 5 - [4 - metil-1-piperazinil] - 2,5' – bi - 1H benzimidazol triidrocloreto triidrato
HPLC: Cromatografia líquida de alta performance HRP: Peroxidase de rabanete
IDF: Federação Internacional de Diabetes INS: Insulina
IRE1: Proteína serina/treonina cinase/endoribonuclease JAK2: Janus cinase 2
JNK: Cinase c-Jun N-terminal
LC3B: Proteína associada a microtúbulos LDH: Lactato desidrogenase
LDH1: Isoenzima 1 da lactato desidrogenase LDH5: Isoenzima 5 da lactato desidrogenase MAPK: Proteínas cinases ativadas por mitógenos MBo: Metildiaminobenzeno-BODIPY
MCT1: Transportador monocarboxilato 1 MCT2: Transportador monocarbixilato 2 MCT4: Transportador monocarboxilato 4 MCTs: Transportadores monocarboxilato
MDR: Mitotracker Deep Red Mfn1: Mitofusina 1
Mfn2: Mitofusina 2 MG: Metilglioxal
MG-H1: Metil-glioxal-hidro-imidazolona MME: Membrana mitocondrial externa MMI: Membrana mitocondrial interna mtDNA: DNA mitocondrial
mTORC: Alvo da rapamicina em mamíferos
MTT: Brometo de 3- (4,5-dimetiltiazol-2-il) -2,5-difeniltetrazólio NAD+: Dinucleótido de nicotamida-adenina oxidado
NADH: Dinucleótido de nicotamida-adenina reduzido
NADP+: Dinucleótido de nicotinamida-adenina fosfato oxidado NADPH: Dinucleótido de nicotinamida-adenina fosfato reduzido NF-κB: fator de transcrição nuclear κ B
NRF: Fator nuclear para genes da respiração NRF1: Fator nuclear para genes da respiração 1 NRF2: Fator nuclear para genes da respiração 2 OGTT: Teste oral de tolerância à glicose OMS: Organização Mundial da Saúde Opa1: Proteína da atrofia óptica 1
P38: Proteína cinase 11 ativada por mitógenos PAI-1: Ativador do plasminogênio
PBS +: Tampão fosfato-salina com Ca2+ e Mg2+ PBS: Tampão fosfato-salina
PERK: Proteína cinase semelhante à RNA cinase do retículo endoplasmático
Pfkfb3: Fosfofrutocinase B3
PGC-1α: Coativador 1α ativado pelo receptor γ de proliferação peroxissomal
PI3-K/AKT: Fosfoinositide 3-cinase/proteína cinase B PI3P: Fosfatidilinositol 3-fosfato
PKC: Proteína cinase C
PPARs: Receptores ativados pelo proliferador de peroxissomos PPARα: Receptores α ativados pelo proliferador de peroxissomos PPARδ: Receptores δ ativados pelo proliferador de peroxissomos PPARγ: Receptores γ ativados pelo proliferador de peroxissomos PVDF: Fluoreto de polivinilideno
RAGEs: Receptores de AGEs RE: Retículo endoplasmático
SDS: Dodecil sulfato de sódio SFB: Soro fetal bovino SNC: Sistema nervoso central SQSTM1/p62: Sequestossomo-1
SSAO: Amina oxidase sensível à ação de semicarbazida
STAT1: Sinal transdutor e ativador da transcrição de proteínas 1 STAT1/3: Sinal transdutor e ativador da transcrição de proteínas 1/3 STZ: Estreptozotocina
TBS-t: Tampão tris-salina + tween. TCA: Ciclo do ácido cítrico
Tfam: Fator de transcrição mitocondrial A. TFEB: Fator de transcrição EB
TZDs:Tiazolidinedionas
UDP-GlcNAc: Uridina N-acetilglicosamina
UDP-GlcNac: Difosfato de uridina N-acetiglucosamina ULK1: Cinase 1 de ativação da autofagia tipo Unc-51 UQ: Ubiquinona
VLDL: Lipoproteína de densidade muito baixa VPS15: Fosfoinositide-3-cinase
LISTA DE SÍMBOLOS α - Alfa β - Beta δ - Delta γ - Gama κ - Kapa ψ - Psi Ca2+ - Íon cálcio Mg2+ - Íon magnésio
SUMÁRIO
1. INTRODUÇÃO... 27 1.1. DIABETES MELLITUS (DM)... 27 1.1.1. Relação entre DM, função cognitiva e doenças neurodegenerativas...30 1.2. METABOLISMO DA GLICOSE NO CÉREBRO E NEUROTOXICIDADE DA GLICOSE...32 1.2.1. Via dos polióis...36
1.2.2. Produtos finais de glicação avançada
(AGEs)...36 1.2.3. Ativação da PKC ...41 1.2.4. Via das hexosaminas...41 1.2.5. Metilglioxal (MG)...42 1.3. MITOCÔNDRIA...46 1.3.1. Morfologia e fisiologia mitocondrial...46 1.3.2. Dinâmica mitocondrial...49 1.3.3. Biogênese mitocondrial...51 1.3.4. Mitofagia...53 2. JUSTIFICATIVA...57 3. HIPÓTESE E OBJETIVOS...59 3.1. HIPÓTESE...59 3.2. OBJETIVO GERAL...59 3.3. OBJETIVOS ESPECÍFICOS...59 4. MATERIAIS E MÉTODOS...61 4.1. MANUTENÇÃO DA LINHAGEM CELULAR DE ASTROGLIOMA C6...61 4.2. ENSAIO DE VIABILIDADE CELULAR...61 4.3. ENSAIO DE MORTE CELULAR...62 4.4. DETECÇÃO DE MG INTRACELULAR...62 4.5. DETECÇÃO DE AGES NO LISADO DE CÉLULAS C6... 63 4.6. RESPIROMETRIA DE ALTA RESOLUÇÃO... 63 4.7. MASSA MITOCONDRIAL...64 4.8. DOSAGEM DE MG NO PLASMA DE CRIANÇAS OBESAS...64 4.9. DETECÇÃO DE AGES NO PLASMA...65 4.10. ANÁLISE ESTATÍSTICA... 66 5. RESULTADOS... 67
5.1. EFEITO DE ALTAS CONCENTRAÇÕES DE GLICOSE SOBRE A VIABILIDADE E A MORTE CELULAR DE ASTRÓCITOS (CÉLULAS C6)...67 5.2. EFEITO DE ALTAS CONCENTRAÇÕES DE GLICOSE SOBRE A FORMAÇÃO DE MG INTRACELULAR E AGEs EM CÉLULAS C6...68 5.3. EFEITOS DO MG SOBRE A VIABILIDADE E RESPIRAÇÃO MITOCONDRIAL DE CÉLULAS C6...71 5.4. EFEITO DE ALTAS CONCENTRAÇÕES DE GLICOSE E DO MG SOBRE A MASSA MITOCONDRIAL EM CÉLULAS C6...71 5.5. EFEITO DA OBESIDADE SOBRE OS NÍVEIS DE MG E AGES PLASMÁTICOS EM PACIENTES PEDIÁTRICOS...73 6. DISCUSSÃO...75 7. CONCLUSÃO...81 8. PERSPECTIVAS FUTURAS...83 9. REFERÊNCIAS...85
1. INTRODUÇÃO
1.1. DIABETES MELLITUS (DM)
O DM é um distúrbio metabólico de etiologia múltipla caracterizado por um estado de hiperglicemia persistente decorrente da falta de insulina e/ou da incapacidade desta exercer adequadamente os seus efeitos (Associação Americana de Diabetes – ADA, 2012; Sociedade Brasileira de Diabetes – SBD, 2017; Malecki & Skupien, 2008).
O Comitê Executivo para Diagnóstico e Classificação do DM da ADA (2017) e as diretrizes da SBD (2017), classificam o DM de acordo com sua etiologia em: DM tipo 1 (DM1A e DM1B); DM tipo 2 (DM2); DM gestacional; e outros tipos de DM, que podem surgir de forma secundária a alguma doença que provoque a destruição das ilhotas pancreáticas. No entanto, as formas mais comuns de DM são os DM1 e DM2, que resultam, respectivamente, da deficiência na produção do hormônio insulina e desordens primárias na sua sinalização e secreção.
Segundo a Organização Mundial da Saúde (OMS, 2016), o número de pessoas com DM2 no mundo aumentou de 108 milhões em 1980 para 422 milhões em 2014, bem como sua prevalência entre adultos maiores de 18 anos, que era de 4,7% em 1980 e passou a 8,5% em 2014. Além disso, pelo menos 50% dos afetados não recebe tratamento por desconhecer que padece de DM. A cada ano o DM e a hiperglicemia causam 3,75 milhões de mortes. Assim, o DM representa um dos principais problemas de saúde de ordem mundial. A prevalência do DM2 no Brasil é de 8,1 % em adultos na faixa etária de 20 a 75 anos, o que representa um número de 12,5 milhões de pessoas com o diagnóstico da doença e, isso provoca um gasto anual de aproximadamente 24 bilhões de dólares com saúde (Federação Internacional de Diabetes - IDF, 2017).
O DM2 é a forma mais frequente, afetando de 90% a 95% da população diabética. Esta condição possui etiologia multifatorial, envolvendo fatores genéticos e ambientais, que geralmente resulta de graus variáveis de resistência tecidual à insulina e de uma deficiência relativa na secreção do hormônio pelas células β pancreáticas (Malecki & Klupa, 2005). Apesar da forte herança familiar poligênica, o fator ambiental é muito relevante para o desenvolvimento desta patologia,
haja vista que os hábitos dietéticos e o sedentarismo são os principais contribuintes para a obesidade, que é o principal fator de risco para o desenvolvimento do DM2 (DeFronzo, 2009; DeFronzo, 2004; Machado
et al., 2006). Em 80 a 90% dos casos, associa-se ao excesso de peso e a
outros componentes da síndrome metabólica (SBD, 2017). O acúmulo de gordura no tecido adiposo visceral, leva à produção de citocinas pró-inflamatórias que induzem resistência à insulina, envolvida na gênese do DM2 e de suas comorbidades (ADA, 2017).
Embora em alguns países a incidência do DM2 tenha aumentado entre crianças e jovens devido à epidemia da obesidade, esta forma geralmente é observada em adultos a partir dos 40 anos e, a hiperglicemia, na maioria dos casos, pode ser controlada através da dieta, exercício físico e agentes hipoglicemiantes (Rao, 2015; Kowluru & Odenbach, 2004; Morini et al., 2004).
O DM1 manifesta-se geralmente durante a infância e adolescência e, caracteriza-se por uma severa perda ou total ausência de insulina, a qual está associada com a destruição das células β do pâncreas (Atkinson & Eisenbarth, 2001; Malecki & Klupa, 2005). Na maioria dos casos de DM (DM1A), a destruição dessas células é mediada por auto-anticorpos (Moore et al., 2009). O DM1B, ou DM idiopática representa a menor parte dos casos de DM1 e é atribuída àqueles onde a destruição das células β pancreáticas não é mediada por auto-anticorpos. Em ambos os subtipos de DM1, o paciente necessita de insulinoterapia (SBD, 2017). Estima-se que 88,3 mil brasileiros com menos de 20 anos sejam portadores de DM1 e que o Brasil ocupe o terceiro lugar em prevalência de DM1 no mundo (IDF, 2017). Embora a prevalência de DM1 esteja aumentando, corresponde à apenas de 5 a 10% de todos os casos de DM.
Ao longo da evolução do DM2, alteracões fisiopatológicas já estão presentes antes que os valores glicêmicos atinjam níveis acima do normal. O quadro onde os valores glicêmicos estão acima dos valores de referência, mas ainda abaixo dos valores de diagnóstico da doença é denominado de pré-diabetes, no qual a resistência à insulina já está instalada (ADA, 2019).
O critério de diagnóstico para DM é baseado na relação entre as concentrações plasmáticas de glicose e o risco para complicações microvasculares específicas (OMS, 2006). As categorias de tolerância à glicose têm sido definidas com base nos seguintes exames: glicemia em jejum (medida no sangue periférico coletado após jejum mínimo de 8 horas); teste oral de tolerância à glicose (OGTT), no qual a glicemia é medida em jejum e após a sobrecarga oral de 75 g de glicose dissolvida
em água, esse teste reflete a perda de primeira fase da secreção de insulina; e hemoglobina glicada (HbA1c), que reflete os níveis glicêmicos dos últimos 3 a 4 meses, sofre menor variabilidade dia-a-dia e é independente do estado alimentar (ADA, 2019). Pacientes com sintomas clássicos de hiperglicemia, tais como poliúria, polidipsia, polifagia e emagrecimento, podem ser submetidos à dosagem randômica de glicemia, independentemente do jejum, não havendo necessidade de confirmação por meio de segunda dosagem, caso se verifique glicemia aleatória ≥ 200 mg/dL (11,1 mM). No entanto, na ausência de sintomas característicos, a confirmação do diagnóstico de DM requer repetição dos exames alterados em uma segunda amostra de sangue (SBD, 2017). Os valores de normalidade para os respectivos exames, bem como os critérios diagnosticos para pré-diabetes e DM mais aceitos e adotados pela SBD, encontram-se na tabela 1.
Tabela 1. Critérios laboratoriais para diagnóstico de normoglicemia, pré-diabetes e DM Condição Glicemia do jejum (mg/dL) Glicemia 2 horas após sobrecarga de 75 g de glicose (mg/dL) Glicemia ao acaso HbA1c (%) Observações Normoglicemia < 100 < 140 - < 5,7 O valor de corte empregado pela OMS para normoglicemia do jejum é 110 mg/dL Pré-diabetes ≥ 100 e < 125* ≥ 140 e < 199# - ≥ 5,7 e < 6,4 DM ≥126 ≥200 ≥200 na presença de sintomas típicos ≥ 6,4 Na ausência de sintomas de hiperglicemia, é necessário confirmar o diagnóstico pela repetição dos testes Conversão dos valores em mg/dL para mM: 100 mg/ dL= 5,6 mM; 126 mg/dL= 7,0 mM; 140 mg/dL= 7,8 mM; 200 mg/dL= 11,1 mM
# Intolerância oral à glicose Adaptado de SBD (2017).
O DM é responsável por 14,5% da mortalidade mundial por todas as causas, sendo maior do que a soma dos óbitos causados por doenças infecciosas (1,5 milhão por HIV/AIDS, 1,5 milhão por tuberculose e 0,6 milhão por malária) (IDF, 2015). A análise da causa de óbito ao longo do desenvolvimento do DM, mostra que o coma cetoacidótico é uma importante causa de morte para os indivíduos com diagnóstico recente de DM 1, assim como a nefropatia diabética, a longo prazo. Nos indivíduos com DM 2, as doenças cardiovasculares são a principal causa de óbito.
A maior morbidade e mortalidade associada ao DM2 se devem ao desenvolvimento de alterações patológicas no sistema vascular (Winer & Sowers, 2004). As complicações microvasculares incluem retinopatia, nefropatia e neuropatia, enquanto que as macrovasculares incluem a doença coronária, doença vascular periférica e infarto (Brownlee, 2001; Zimmer et al., 2001; Wirostko et al., 2008). Os mecanismos moleculares e celulares das complicações vasculares crônicas no DM ainda não se encontram totalmente elucidados. No entanto, uma série de evidências sugerem que a hiperglicemia seria o gatilho para tais efeitos (Nishikawa et al., 2000; Schalkwiji & Stehouwer, 2005; Brownlee, 2005).
Além das complicações vasculares, o DM provoca mudanças progressivas no cérebro, que levam ao desenvolvimento de transtornos de humor, como depressão; e declínio cognitivo com aumentado risco de demência e doenças neurodegenerativas (Gavard et al., 1993; Manschot et al., 2008; Biessels et al., 2008).
1.1.1. Relação entre DM, função cognitiva e doenças neurodegenerativas
Há anos se sabe que o diabetes pode gerar declínio cognitivo, principalmente relacionado aos processos que envolvem aprendizagem e memória (Miles & Root, 1922; Ryan, 1988). Os principais déficits cognitivos encontrados em pacientes com DM1 são a baixa velocidade de processamento da informação e a pior eficiência psicomotora (Brands
et al., 2006; Ryan et al., 2003; Weinger et al., 2008), contudo, outros
déficits são verificados, incluindo prejuízos no vocabulário, inteligência geral, construção visual (Northam et al., 1998), atenção (Wessels et al., 2007), memória e função executora (Weinger et al., 2008). O
aparecimento do declínio cognitivo ocorre muito cedo em pacientes com DM1, cerca de 2 anos após o diagnóstico, antes mesmo do surgimento das complicações vasculares (Northan et al., 1998;). O controle glicêmico parece ser um fator crucial na performance cognitiva, haja vista que pacientes com DM1 e níveis de HbA1c maior que 8,8 % apresentam disfunção psicomotora (Jacobson et al., 2007).
Pacientes com DM2 também apresentam prejuízo cognitivo, incluindo redução da velocidade psicomotora, prejuízo na função executora, memória verbal, velocidade de processamento, fluência verbal, retenção visual e atenção. A patofisiologia do declínio cognitivo em pacientes com DM2 não está clara, mas sabe-se que a hiperglicemia e aspectos da sinalização da insulina são importantes para esse mecanismo (Gaspar et al., 2015; Ferreira et al., 2018; Kodl & Seaquist, 2008). Além disso, o DM2 aumenta o risco de demência de 1,5 a 2,5 vezes (Strachan et al., 2011). Alguns estudos mostram que pacientes com DM2 têm risco aumentado para o desenvolvimento de doenças neurodegenerativas como as Doenças de Alzheimer (DA) e de Parkinson (DP): um estudo realizado por Janson et al. (2004) mostrou que de 100 pacientes com DA, 81% apresentavam intolerância à glicose ou DM2; em outro estudo envolvendo 110 pacientes com doença de Parkinson, sendo 53 com demência, verificou-se que a resistência à insulina estava presente em 62% dos pacientes com DP e demência, dos quais 30% tiveram também prejuízo na tolerância à glicose, 5,6% foram diagnosticados com DM e 26% apresentaram apenas resistência à insulina (Bosco et al., 2012).
A hiperglicemia crônica está diretamente relacionada ao declínio cognitivo em pacientes com DM, no entanto, a patofisiologia do prejuízo cognitivo é multifatorial, incluindo o déficit na sinalização da insulina, disfunção mitocondrial e processos inflamatórios (Duarte, 2014; Gaspar et al., 2015; Ferreira et al., 2018; Arrieta-Cruz & Gutiérrez-Juárez, 2016; Zilliox et al., 2016).
O hipocampo, região do cérebro envolvida na formação da memória e aprendizagem associativa, é particularmente afetado pelo DM devido à sua sensibilidade a insulina, dessa forma a resistência à insulina hipocampal pode ser um mediador da disfunção cognitiva, visto que a insulina atua na sobrevivência neuronal, desenvolvimento de neurocircuitos, plasticidade sináptica, entre outros (Derakhshan & Toth, 2013; Biessels & Reagan, 2015; Arrieta-Cruz & Gutiérrez-Juárez, 2016; Ferrario & Reagan, 2018).
Os mecanismos pelos quais o DM predispõe à disfunção cognitiva e à neurodegeneração ainda não estão claros, mas sabe-se que
a hiperglicemia é um dos principais fatores causais, aumentando a produção de espécies reativas de oxigênio (ERO) e levando à disfunção mitocondrial, que são características também observadas nas DA e DP (Cheng et al., 2010; Reddy et al., 2009). Pouco se sabe sobre os efeitos da hiperglicemia no sistema nervoso central (SNC) devido às limitações das técnicas de imagem, as quais devem ser pouco invasivas, para avaliar a função das células nervosas no local, neste sentido, estudos in
vitro têm ajudado muito na compreensão do efeito da hiperglicemia
sobre a função mitocondrial nessas células. Racková et al. (2009) mostrou que a toxicidade da glicose em linhagem de células neuronais HT22 é mediada pelo estresse oxidativo, haja vista que altas concentrações de glicose aumentam a produção de ERO e reduzem a viabilidade celular. Peng et al. (2016) mostrou que a exposição de neurônios corticais primários a altas concentrações (10, 20, 25, 30 e 40 mM) de glicose por 6 dias leva à redução do consumo de oxigênio mitocondrial e diminuição das atividades dos complexos I e IV da cadeia respiratória e, portanto, disfunção mitocondrial.
1.2. METABOLISMO DA GLICOSE NO CÉREBRO E NEUROTOXICIDADE DA GLICOSE
A glicose é o principal substrato energético do cérebro, sendo que somente em condições especiais, como longos períodos de jejum, exercício físico intenso e diabetes, este poderá utilizar corpos cetônicos como fonte energética (Laffel, 1999). Apesar de o cérebro representar apenas 2% do peso corporal, é responsável, respectivamente, por 20 % e 25 % dos consumos de oxigênio e glicose corporal, tendo então, um metabolismo oxidativo muito ativo (Kety & Schmidt, 1948).
O tecido nervoso compreende basicamente dois tipos celulares: os neurônios e a glia, sendo que as principais células da glia são os astrócitos. Os neurônios têm como função básica receber, processar e enviar informações, enquanto a neuroglia ocupa os espaços entre os neurônios, exercendo a função de sustentação e de manutenção da homeostase neuronal (Machado, 1993).
Entre as principais funções dos astrócitos estão a manutenção dos níveis iônicos do meio extracelular, alterados com a descarga de potenciais de ação dos neurônios; captação e liberação de diversos neurotransmissores, tendo um papel crítico no metabolismo do neurtransmissores, glutamato e GABA; participação na formação da barreira hematoencefálica; secreção de fatores tróficos essenciais para a sobrevivência e diferenciação dos neurônios, direcionamento de axônios
e formação e funcionamento das sinapses [para revisão ver Volterra, & Meldolesi, 2005; Stipursky et al. (2010; 2011; 2012)]. Também estão envolvidos na regulação do fluxo sanguíneo cerebral e do acoplamento neurovascular, bem como no auxílio na defesa imune, por meio da síntese e secreção de diversas citocinas inflamatórias. Além disso, como visto anteriormente essas células têm grande impacto no controle energético cerebral, em razão do fornecimento de metabólitos aos neurônios (Rouach et al., 2008).
Os neurônios possuem altos requerimentos energéticos devido ao fato de serem células altamente diferenciadas que necessitam grandes quantidades de ATP para a correta manutenção dos gradientes iônicos transmembrana, e para os processos de neurotransmissão (Silver e Erecinska, 1998), enquanto os astrócitos são responsáveis por apenas 20 % do gasto energético cerebral (Harris et al., 2012; Hyder et al., 2013). Apesar disto, alguns estudos em cérebro de rato em repouso mostram que os astrócitos captam cerca de 50 % da glicose absorvida pelo órgão (Nehlig et al., 2004; Chuquet et al., 2010).
A explicação para esta descompensação energética está no mecanismo da lançadeira de lactato astrócito-neurônio (ANLS) (Figura 1), que permite a transferência de lactato do astrócito ao neurônio durante a atividade sináptica. Desta forma, a captação de glutamato pelos astrócitos durante a neurotransmissão glutamatérgica, estimula a captação de glicose e glicólise. O lactato produzido é captado pelos neurônios através de transportadores monocarboxilato (MCTs), sendo depois convertido em piruvato, o qual é posteriormente oxidado no ciclo do ácido cítrico (TCA) (Magistretti, 2009; Bélanger et al., 2011a; Pellerin & Magistretti, 2012). Alguns estudos sugerem que a ANLS não opera em sinapses GABAérgicas (Chatton et al., 2003; Peng et al., 1994; Magistretti & Allaman, 2018).
Figura 1. Representação da ANLS (Adaptado de Bélanger et al., 2011a). A glicose é transportada dos vasos sanguíneos aos astrócitos pelas células endoteliais. Após entrar nos astrócitos pelos transportadores GLUT1, a glicose é oxidada a piruvato pela via glicolítica e, o piruvato, por sua vez, é convertido em lactato pela isoenzima 5 da lactato desidrogenase (LDH5). O lactato é transportado ao meio extracelular pelos MCTs (MCT1 e MCT4 em astrócitos) e capturado pelos neurônios através do MCT2. Nos neurônios, o lactato é oxidado a piruvato pela isoenzima 1 da lactato desidrogenase e segue para a mitocôndria para ser totalmente oxidado (Falkowska et al., 2015). O glutamato (Glu) liberado na sinapse ativa os receptores glutamatérgicos (GluR) e está associado com importantes gastos energéticos nos neurônios. Uma grande proporção do glutamato liberado na sinapse é captada pelos astrócitos através dos transportadores de aminoácidos excitatórios (EAATs) junto com 3 íons sódio (Na+). Os íons Na+ são bombeados para o meio extracelular através da Na+/K+ ATPase, consumindo trifosfato de adenosina (ATP). Isso acarreta a captação da glicose pelos astrócitos e oxidação na via glicolítica. O glutamato captado pelos astrócitos é convertido em glutamina (Gln) pela ação da glutamina sintetase (GS), a qual é liberada para os neurônios, que a converte novamente em glutamato pelas glutaminases (GLS) (Allaman et al., 2015).
Devido à alta demanda energética dos neurônios, a principal fonte energética dos mesmos é a glicose (Hertz et al., 2007; Lundgaard et al., 2015; Kovar et al., 2009), no entanto, alguns estudos mostraram que os neurônios utilizam lactato eficientemente como substrato energético
(Schurr et al., 1997; Bouzier et al., 2000; Qu et al., 2000; Serres et al., 2005; Boumezbeur et al., 2010) e outros estudos ainda, mostraram que estas células têm preferência pelo lactato em relação à glicose quando ambos os substratos estão disponíveis (Itoh et al., 2003; Bouzier-Sore et
al., 2006). Há evidências de que o lactato é necessário para a
consolidação da memória (Newman et al., 2011; Susuki et al., 2011). Os neurônios apresentam pouco metabolismo glicolítico, pois a enzima fosfofrutocinase B3 (Pfkfb3), que é uma enzima que produz o modulador alostérico (frutose-2,6-bifosfato) da fosfofrutocinase (enzima reguadora chave desta via), é quase ausente nessas células devido à sua alta taxa de degradação proteossomal (Almeida et al., 2004; Herrero-Mendez et al., 2009). Isso explica o fato de essas células preferirem lactato em vez de glicose, além disso, a ativação excessiva da glicólise em neurônios leva ao estresse oxidativo e apoptose (Falkowska et al., 2015). Enquanto isso, a enzima Pfkfb3 é altamente expressa em astrócitos, o que corrobora com o fato dessas células serem altamente glicolíticas (Almeida et al, 2004; Herrero-Mendez et al., 2009; Bolaños
et al., 2009).
Quase a totalidade das células do sistema nervoso central (SNC) capta glicose independentemente da insulina, haja vista que as principais isoformas de transportadores de glicose (GLUTs) são GLUT1 e GLUT3, que transportam glicose independentemente da ação deste hormônio (Maher et al., 1991). Dessa forma, em um estado de hiperglicemia, a glicose atravessa a barreira hematoencefálica e se eleva a níveis anormais no fluido intersticial, e é desviada para caminhos metabólicos que podem resultar em neurotoxicidade (Figura 2) (Tomlinson & Gardiner, 2008).
Figura 2. Vias metabólicas favorecidas por altos níveis de glicose (Adaptado de Tomlinson & Gardiner, 2008). A rota normal da glicose dentro da célula é a glicólise. Entretanto, se a enzima hexocinase encontrar-se saturada devido a altas concentrações de glicose, este substrato é desviado para a via dos polióis, levando ao consumo de NADPH e, comprometendo a reciclagem da glutationa oxidada (GSSG) à glutationa reduzida (GSH) e, portanto, a detoxificação do peróxido de hidrogênio (H2O2). A frutose-6-fosfato, mais à frente na via
glicolítica, também pode ser desviada para uma via tóxica: a via das hexosaminas, onde essa molécula é empregada pela glutamina:frutose-6-fosfato aminotransferase (GFAT) para produzir difosfato de uridina N-acetilglicosamina (UDP-GlcNAc), o qual pode se combinar com resíduos de serina e treonina de proteínas intracelulares, comprometendo a sua função. O gliceraldeído-3-fosfato, por sua vez, pode ser convertido em metilglioxal (MG), que é altamente reativo e, pode glicar macromoléculas formando os produtos finais de glicação avançada (AGEs) (Tomlinson & Gardiner, 2008).
A hiperglicemia aumenta o fluxo da via metabólica dos polióis, glicação não enzimática de proteínas, ativa a proteína cinase C (PKC) e aumenta o metabolismo das hexosaminas e a produção de MG, o que culmina com a produção de espécies reativas, oxidação de proteínas, inativação de enzimas, alterações no sistema de defesa antioxidante,
entre outros danos (Mukherjee et al., 1998; Rosen et al., 2001; Folmer
et al., 2002; Brownlee, 2005). O aumento do estresse oxidativo induzido
pelo MG parece ocorrer em parte pela inativação de enzimas antioxidantes como glutationa redutase e glutationa peroxidase (Baynes e Thorpe, 1999; Ahmed, 2005).
1.2.1. Via dos polióis
Em condições de hiperglicemia, as células nervosas captam glicose livremente, sem depender da ação insulínica, dessa forma, o excesso de glicose pode ser desviado para a via do sorbitol, onde a mesma é convertida em sorbitol pela aldose redutase, utilizando NADPH. O sorbitol, por sua vez, é oxidado a frutose pela enzima sorbitol desidrogenase, reduzindo NAD+ a NADH, e posteriormente a frutose é fosforilada a frutose-6-fosfato, a qual pode ser metabolizada em 3-deoxiglicosona, um composto reativo que pode levar à produção de AGEs (Gonzalez et al., 1988; Szwergold et al., 1990).
Esta via resulta na produção exacerbada de espécies reativas de oxigênio (ERO) devido ao fato de provocar uma diminuição das concentrações intracelulares de equivalentes redutores na forma de NADPH, o que leva à redução dos níveis de GSH (Lee & Chung, 1999; Brownlee, 2001).
Ainda, como a via do poliol produz NADH, há um aumento na relação NADH/NAD+, o que leva à inibição da gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase (enzima da via glicolítica), aumentando as concentrações de trioses fosfato (gliceraldeído-3-fosfato e diidroxiacetona fosfato). O aumento na concentração destes intermediários glicolíticos leva à produção de metilglioxal (MG), o principal precursor de AGEs (Williamson et al., 1993). Além da produção de MG, o aumento das concentrações de trioses fosfato conduz à formação de diacilglicerol, levando à ativação de PKCs clássicas (Brownlee, 2001).
1.2.2. Produtos finais de glicação avançada (AGEs)
Os AGEs são um grupo de moléculas heterogêneas produzidas através da glicação não enzimática de proteínas, lipídeos e ácidos nucleicos. Estes, são produzidos em um conjunto de etapas químicas chamadas de reações de Maillard, onde os grupos carbonil de carboidratos reagem com grupos amino livres de outras macromoléculas celulares (Brownlee et al., 1988; Unoki & Yamagishi, 2008). A taxa de renovação de proteínas, o nível de hiperglicemia, resistência à insulina,
obesidade e o estresse oxidativo são fatores cruciais para a sua formação; desta forma, se alguma destas situações está presente, as proteínas tanto intra como extracelulares são passíveis de serem glicadas, e portanto, oxidadas (Yamagishi et al.,2005; Baynes & Thorpe, 1999).
A reação de Maillard para a formação de AGEs envolve três passos principais: a iniciação, a propagação e a formação de AGEs propriamente dita (Figura 3 A), (Thornalley, 2008). A iniciação abrange desde a formação da base de Schiff até a formação do produto de Amadori. Inicialmente, ocorre a condensação não enzimática de um açúcar redutor, como a glicose, com um grupamento amino livre de várias moléculas, incluindo proteínas, lipídeos e ácidos nucleicos, formando aldiminas instáveis, chamadas bases de Schiff (Bierhaus et
al., 1997; Njoroge & Monnier, 1989). Se a hiperglicemia persistir, em
poucas horas esta base sofre um rearranjo molecular originando cetoaminas estáveis, chamadas de produtos de Amadori, os quais são mais estáveis que a bases de Schiff. Um exemplo de produto de Amadori é a HbA1c, onde a glicose se conjuga com a globina (componente proteico da hemoglobina, presente nos eritrócitos) (Jakus & Rietbrock, 2004). Essa reação não requer a participação de enzimas e depende da concentração de glicose e proteínas, e também da meia vida das proteínas, além de depender da sua reatividade em termos de grupos aminos livres. Esta reação é irreversível (Hunt et al., 1988; Lapolla et
al., 2005; Zhang et al., 2009). Por sua vez, a fase de propagação envolve
reações de oxidação e desidratação dos produtos de Amadori, sendo estes convertidos a compostos carbonílicos (glioxal, deoxiglicosanas e metilglioxal), os quais, por serem mais reativos do que os açúcares que os originaram, agem como propagadores da glicação não enzimática de proteínas (Lapolla et al., 2005). Estes compostos dicarbonílicos possuem uma meia-vida longa (minutos a horas) e atravessam facilmente a membrana plasmática, podendo atuar longe do seu local de produção, modificando desta forma, biomoléculas intra e extracelulares. O acúmulo destes compostos é chamado de estresse por carbonilação (Thornalley et al., 1999). Os compostos propagadores reagem com grupamentos amino livres de proteínas através de reações de oxidação, desidratação e ciclização, formando compostos amarelo-marrons, insolúveis e irreversíveis, chamados de AGEs (Lapolla et al., 2005; Ravelojaona et al., 2007; Zhang et al., 2009), o qual seria a fase de formação de AGE propriamente dita.
Os AGEs podem causar alterações patológicas por três mecanismos diferentes: modificando as vias de transdução de sinal
envolvendo os ligantes de matriz extracelular; alterando as concentrações de sinais solúveis, como as citocinas, hormônios e radicais livres, através da interação com os RAGEs; e por último, alterando as funções das proteínas (Brownlee, 1995).
Sabe-se que a interação dos AGEs com os RAGEs ativa vias de sinalização relacionadas ao estresse oxidativo, estresse do retículo endoplasmático (RE) e, processos inflamatórios crônicos. A maioria dessas vias converge na ativação da proteína ativadora 1 (AP-1), do fator de transcrição pleiotrópico κ B (NF-κB) e do sinal transdutor e ativador da transcrição de proteínas 1/3 (STAT1/3), induzindo patologicamente a expressão de numerosos genes pró-oxidantes (Figura 3 B) (Nedić et al.,2013; Brownlee, 2001; Derubertis & Craven, 1994; Giacco & Brownlee, 2010; Liu et al., 2009).
A
AFigura 3. Formação e sinalização dos AGEs. A imagem A (Adaptada de Lapolla, 2005) mostra a reação de Maillard para a formação de AGEs com seus três passos: iniciação, propagação e a formação de AGEs propriamente dita. A iniciação abrange desde a formação da base de Schiff até a formação do produto de Amadori. A fase de propagação envolve reações de oxidação e desidratação dos produtos de Amadori, sendo estes convertidos a compostos carbonílicos propagadores da reação (glioxal, deoxiglicosanas e metilglioxal). Na formação de AGEs propriamente dita, os compostos propagadores reagem com grupamentos amino livres de proteínas através de reações de oxidação, desidratação e ciclização, formando compostos amarelo-marrons, insolúveis e irreversíveis, chamados de AGEs (Lapolla, 2005). A imagem B (Adaptada de Piperi et al., 2015) mostra que a transdução do sinal derivada da interação AGE/RAGE envolve a ativação de várias vias, como a das proteínas cinases ativadas por mitógenos - MAPK (ERK1/2, p38, JNK), fosfoinositide 3-cinase/proteína cinase B (PI3-K/AKT) e, janus cinase 2/sinal transdutor e ativador da transcrição de proteínas 1 (JAK2/STAT1). A ativação dessas vias culmina na ativação dos fatores de transcrição NF-κB, AP-1 e STAT1/3. Ao mesmo tempo, o excesso de AGEs pode induzir diretamente o estresse oxidativo, através do aumento da geração de ERO e causando o estresse do RE através do estímulo da resposta a proteínas mal dobradas (Piperi et al., 2015). A via UPR possui três sensores de estresse do RE: proteína cinase semelhante à RNA cinase do retículo endoplasmático (PERK), proteína serina/treonina cinase/endoribonuclease (IRE1) e Fator de ativação transcricional 6 (ATF6).
B
BEsses sensores induzem a expressão da CCAT/enhancer-binding protein homologous protein (CHOP) (Harding et al., 2000), que medeia a apoptose mediada por estresse do RE em várias linhagens celulares (Kim et al., 2008). A interação AGE/RAGE, ainda ativa a PKC (Brownlee, 2001; Derubertis & Craven, 1994; Giacco & Brownlee, 2010; Liu et al., 2009).
A relação entre concentrações de glicose sanguínea e acúmulo tecidual de AGEs tem sido mais estudada em modelos animais. Por exemplo, em vasos sanguíneos da retina de ratos com hiperglicemia crônica foi observado que há cerca de 10-45 vezes mais AGEs que em animais não diabéticos, após 5-20 semanas de hiperglicemia. Esta relação sugere que mesmo um aumento modesto na concentração de glicose sanguínea resulta em um aumento substancial no acúmulo de AGEs nos tecidos (Brownlee, 1995). No caso de pacientes diabéticos foi encontrado um aumento na concentração do MG, principal composto precursor de AGEs, em fluidos corporais e tecidos, o que leva a pressupor que este composto é um dos principais responsáveis pelas complicações diabéticas (Messier & Gagnon, 1996; Vander Jagt & Hunsaker, 2003).
Além disso, evidências experimentais sugerem que há um acúmulo de AGEs no cérebro de pacientes com demência do tipo DA e que a presença dessa enfermidade associada ao DM aumenta ainda mais o processo de acúmulo desses produtos ( Yan et al., 1994; Dei et al., 2002; Jono et al., 2002; Girones et al., 2004). Os AGEs são diretamente neurotóxicos para os neurônios (Yan et al., 1994; Takeuchi et al., 2000), pois estes aumentam a agregação e citotoxicidade de fragmentos carboxiterminais dos peptídeos beta-amilóide (Aβ), cujo acúmulo é característico da DA (Woltjer et al., 2003). Como o próprio peptídeo Aβ também é ligante para os RAGEs (Arancio et al., 2004), a presença DM e DA juntas pode acelerar o aparecimento e progressão da demência. Apesar desses achados em neurônios, pouco se sabe a respeito dos mecanismo pelos quais o DM predispõe à neurodegeneração e tampouco se sabe sobre o envolvimento de outras células nervosas, como os astrócitos nesse mecanismo.
Os AGEs estão envolvidos em um ciclo vicioso de inflamação e geração de ERO, que culmina na amplificação da produção dos mesmos (Yan et al., 1997; Obrosova, 2002; Jiang et al., 2004). A mitocôndria é uma das principais fontes de ERO, que são produzidas principalmente pelos complexos I e III da cadeia respiratória (Halliwell, 1998) e como visto anteriormente, ERO estão associadas com doenças neurodegenerativas.
Além disso, em estudos anteriores realizados pelo nosso grupo de pesquisa, verificou-se que os AGEs alteram a fisiologia mitocondrial e prejudicam a autofagia em células astrogliais, permitindo o acúmulo de mitocôndrias disfuncionais e a perpetuação da geração de ERO (Glaser, 2014). Outros estudos, por sua vez, indicam que em doenças neurodegenerativas há uma redução na eficiência do processo de autofagia, com o acúmulo de vacúolos autofágicos (Martinez-Vincente
et al., 2005). Dessa forma, levando em conta o grande envolvimento da
mitocôndria nas fisiopatologias do DM e na neurodegeneração, neste trabalho, focalizou-se em estudar essa organela.
1.2.3. Ativação da PKC clássicas
A família das PKCs clássicas (α, γ, βI e βII) consiste de proteínas com atividade cinase distribuídas amplamente em tecidos de mamíferos. Para sua atividade, estas enzimas dependem de íons cálcio e de fosfatidilserina, além do diacilglicerol, o qual aumenta significativamente a capacidade desta enzima para fosforilar suas diversas proteínas-alvo em resíduos de serina e treonina (Geraldes & King, 2010).
A hiperglicemia crônica, leva à ativação persistente e excessiva da PKCs clássicas, resultando em um dano tecidual decorrente da produção de ERO. A ativação da PKC nestas condições é oriunda da síntese de novo do diacilglicerol, que é produzido a partir de trioses fosfato. Ainda, existem evidências que sugerem que a ativação da PKC também pode ser o resultado da interação de AGEs com seus receptores localizados na superfície celular (RAGEs) (Figura 3 B), os quais estão presentes em vários tipos celulares como as células endoteliais, neurônios, monócitos e macrófagos (Brownlee, 2001; Derubertis & Craven, 1994; Giacco & Brownlee, 2010; Liu et al., 2009).
1.2.4. Via das hexosaminas
A hiperglicemia crônica também contribui para a patologia observada no DM por aumentar o fluxo de frutose-6-fosfato pela via das hexosaminas (Chen et al., 1998; Du et al., 2000; Kolm-Litty et al., 1998; Sayeski e Kudlow, 1996). A hiperglicemia aumenta o fluxo pela via glicolítica e consequentemente, aumenta os níveis de frutose-6-fosfato formada, esta serve como substrato para a enzima glutamina:frutose-6-fosfato aminotransferase para a formação de glicosamina-6-fosfato, a qual é então convertida a
UDP-N-acetilglicosamina (UDP-GlcNAc) (Giacco & Brownlee, 2010). Por sua vez, esta pode ser utilizada para formar, por exemplo, proteoglicanas e
O-glicoproteínas (Brownlee, 2001; Wells et al., 2001).
A via das hexosaminas é conhecida por desempenhar um papel na apoptose mediada por altas concentrações de glicose (Fülöp et al., 2007), visto que a O-glicação de certas proteínas pela N-acetilglicosamina, pode levar à apoptose, como por exemplo a O-glicação da proteína p53 e da proteína pró-apoptótica BAD, o que aumenta a apoptose (Fiordaliso et al., 2001; Rajamani & Essop, 2010; Rajamani et al., 2011).
O aumento na via das hexosaminas está envolvido com o aumento da expressão de genes relacionados com o desenvolvimento das complicações vasculares que ocorrem no diabetes e/ou no desenvolvimento da resistência à insulina (Gabriely et al., 2002; Marshall & Monzon, 1989).
1.2.5. Metilglioxal (MG)
O MG é um α-oxoaldeído muito reativo, produzido principalmente pela oxidação da glicose, a partir das trioses-fosfato, mas, também, pelo catabolismo de ácidos graxos, através da acetona e do aminoácido treonina (Figura 4) (Koop & Casazza, 1985; Lyles & Chalmers, 1992; Reichard et al., 1986; Thornalley, 1996).
A via glicolítica é a principal fonte endógena de MG através da fragmentação espontânea ou enzimática pela metilglioxal sintase das trioses-fosfato, gliceraldeído-3-fosfato e diidroxiacetona-fosfato (Richard, 1993). De acordo com Kalapos (2008), de 0,1-0,4 % do fluxo glicolítico resulta na produção de MG. A formação não enzimática de MG ocorre em todas as células, sendo que cerca de 0,1% do metabolismo de trioses-fosfato resultam na formação de MG em condições normoglicêmicas (Phillips & Thornalley, 1993; Thornalley, 1988). A formação de MG a partir de acetonas formadas durante o metabolismo de ácidos graxos é realizada pelas isoenzimas do citocromo P450IIE (acetona e acetol monooxigenase) (Gonzalez, 1988), utilizando NAD(P)H como cofator (Gonzalez, 1988; Koop & Casazza, 1985). Outras fontes de MG são os corpos cetônicos acetoacetato e β-hidroxibutirato, os quais são espontaneamente convertidos em acetona, sendo esta convertida a MG de acordo com o mecanismo acima descrito (Beisswenger et al., 2005). As aminoacetonas formadas durante o catabolismo da treonina podem resultar na formação de MG pela ação da enzima amina oxidase sensível à ação de semicarbazida (SSAO), a
qual realiza a desaminação das aminoacetonas formadas a partir da treonina à MG (Figura 4). A SSAO está localizada na superfície da membrana mitocondrial externa e no citoplasma do tecido adiposo, células da musculatura lisa vascular e em células endoteliais (Yu et al., 2003).
Figura 4. Principais vias metabólicas envolvidas na síntese do metilglioxal (Modificada de Sartori & Bechara, 2010).
O MG é um dos mais potentes agentes de glicação presente na célula, reagindo prontamente com lipídeos, ácido nucleicos e resíduos de lisina e arginina de proteínas para formar AGEs, como argpirimidina, hidroimidazolona (MG-H1), dímeros de lisina-MG e Nε -(1-carboxietil)-lisina (Thornalley, 2005; Thornalley 2007; Rabbani & Thornalley, 2010). Cerca de 90-95 % do MG celular encontra-se ligado a macromoléculas, sugerindo que as concentrações de MG intracelular (livre + ligado) podem ser superiores a 300 μM em normoglicemia (Thornalley, 1996; Chaplen et al., 1998), porém esse número pode ser muito superior em situações de hiperglicemia ou intolerância à glicose (Ahmed et al., 2003). Em um experimento realizado por Thornalley (2005), verificou-se que a adição de 1 μM de MG marcado com 14C ao
plasma humano ex vivo leva à ligação completa e irreversível do mesmo às proteínas plasmáticas em 24 h a 37 °C, mostrando o MG como um potente agente de glicação.
Em indivíduos saudáveis, o MG se acumula pelo simples envelhecimento. No entanto, em diabéticos, o acúmulo deste metabólito no plasma progride proporcionalmente com o grau e a duração da hiperglicemia (Strachan et al., 2011). A concentração de MG no plasma de indivíduos normais está abaixo de 500 nM. Em pacientes com DM1 com glicemia descontrolada e alta, essa taxa pode ser de cinco a seis vezes superior. No DM1, concentração de MG é correlacionada com a duração do DM, podendo aumentar a uma taxa de 10% ao ano em relação aos controles devido aos episódios de hiperglicemia descontrolada (McLellan et al., 1994). Nos pacientes com DM2 com glicemia descontrolada e alta, a concentração do MG fica em torno de duas a três vezes os níveis normais de MG (McLellan et al., 1994; Thornalley, 1996).
Por outro lado, pacientes afetados por DA com ausência de DM, apresentam níveis elevados de MG no líquido cerebrospinal, sendo até duas vezes maior que em indivíduos saudáveis, que apresentam concentrações de MG no fluido cerebroespinal entre 10 μM e 20 μM, o que mostra a importância dessa molécula no desenvolvimento da neurodegeneração. Nesses pacientes também se observa um aumento de AGEs nos fluídos biológicos, especialmente em estágios mais tardios da doença (Kuhla et al., 2005).
A citotoxicidade do MG tem sido atribuída, principalmente à formação dos AGEs, os quais ligam-se nos seus receptores (RAGEs), desencadeando uma série de eventos patológicos em diversas células que levam às complicações de caráter vascular da diabetes e à neurodegeneração (Thornalley, 1990; Wells-Knecht et al., 1995; Shinohara et al., 1998; Yan et al., 2009; Wautier & Guillausseau, 2001; Munch et al.,2010; 2012).
O MG modifica a função e estrutura proteica e, afeta a transcrição do RNA e síntese proteica através de formação de adutos com o DNA (Kang et al., 1996), dessa forma, o MG é mutagênico. No entanto, a citotoxicidade dessa molécula não está limitada à glicação de macromoléculas, haja vista que vários estudos mostram que o MG induz o estresse oxidativo e inflamação em vários tipos celulares. Akhand et
al. (2001) e Fukunaga et al. (2006) verificaram que o MG ativa a via
pró-oxidante das MAPKs, respectivamente, em células endoteliais humanas e células de Schwann de nervos periféricos de ratos, portanto, essa via pode fazer parte da fisiopatologia das modificações vasculares e
neuropatia presentes no DM. Di Loreto et al. (2004) mostrou que o MG aumenta o estresse oxidativo através da indução das citocinas pró-inflamatórias interleucina 1β (IL-1β) e interleucina 6 (IL-6) em cultura de neurônios hipocampais. Chu et al. (2016) verificou que o MG ativa a via JNK e aumenta o conteúdo de citocinas pró-inflamatórias em cultura de linhagem de astrócitos e no hipocampo de animais tratados com essa molécula, resultando em astrogliose e neuroinflamação, isso implica que o MG tem uma papel fundamental para a neurodegeneração.
Para evitar os efeitos deletérios do MG, as células possuem diferentes mecanismos de detoxificação, como as glioxalases, aldose redutases, aldeído desidrogenases e carbonil redutases (Thornalley, 1993; Kalapos, 1999; Vander Jagt & Hunsaker, 2003). Apesar desses vários mecanismos, o principal sistema de detoxificação de MG é o das glioxalases (Figura 5), onde a detoxificação do mesmo ocorre através da reação espontânea com a glutationa (GSH), formando hemitioacetal, que é posteriormente convertido pela glioxalase I a S-d-lactoilglutationa (Kuhla et al., 2005). Esta última é hidrolisada em d-lactato pela ação da glioxalase II (GLO2), regenerando a GSH (Rabbani et al., 2016). Em altas concentrações de MG essas duas enzimas (GLO1 e GLO2) são reguladas negativamente (Dafre et al., 2015), o que pode prejudicar a defesa antioxidante celular.
Além disso, apesar de a GSH ser reciclada no passo catalisado pela GLO2 no sitema das glioxalases, a exposição a altas concentrações de MG leva a uma depleção de GSH, já que a atividade da GLO2 é muito menor que da GLO1. Essa depleção acarreta importantes consequências para o estado redox celular, aumentando as razões GSSG/GSH e NADP+/NADPH, o que culmina no estresse oxidativo, já que GSH e NADPH são importantes para os sistemas antioxidantes (Dringen, 2000). A glutationa oxidada (GSSG) inativa diretamente a GLO1 através de modificação covalente (Birkenmeier et al., 2010).
Em um estudo usando culturas corticais primárias de camundongo realizado por Bélanger et al. (2011b), verificou-se que a capacidade intrínseca do sistema das glioxalases é maior em astrócitos que em neurônios. Neste modelo, as atividades das GLO1 e GLO2 são, respectivamente 9,8 e 2,5 vezes maior em astrócitos que em neurônios. Além disso, em um estudo realizado por Hansen et al. (2012), verificou-se que a expressão das glioxalaverificou-ses em linhagem celular de astroglioma de rato (C6) é semelhante à observada nos astrócitos, haja vista que estas células em passagens elevadas (mais de 100) são muito similares aos astrócitos.
Os neurônios são muito mais sensíveis à toxicidade do MG que os astrócitos devido à baixa atividade do sistema das glioxalases neuronal. Enquanto concentrações de MG a partir de 250 μM diminuem a viabilidade de células neuronais, a viabilidade celular dos astrócitos ainda não é afetada com concentrações de MG superiores a 1 mM. Quando altas concentrações de MG (acima de 2 mM) são incubadas em uma co-cultura de astrócitos e neurônios, os últimos são significativamente protegidos da toxicidade do MG pelos astrócitos (Bélanger et al., 2011b).
1.3. MITOCÔNDRIA
1.3.1. Morfologia e fisiologia mitocondrial
A mitocôndria é a organela celular responsável pela maior produção líquida de energia em organismos eucariotos não fotossintetizantes. Eugene Kennedy e Albert Lehninger descreveram há mais de 70 anos que a mitocôndria contém proteínas envolvidas com a oxidação de nutrientes, bem como, com a respiração celular com concomitante geração de ATP (Kennedy & Lehninger, 1950, 1951;
Lehninger & Smith, 1949). O surgimento desta organela teria se dado pela endossimbiose de um organismo procarionte aeróbico com uma célula eucariótica ancestral anaeróbica há milhões de anos atrás. No interior desta última, a digestão intracelular do material fagocitado não foi realizada, e o procarionte teria permanecido no interior da célula pré-eucarionte, e ao longo do tempo, houve a transferência de genes desse procarioto endossimbionte para o núcleo, dando origem às mitocôndrias modernas (Margulis, 1981; Alberts et al., 2010).
A mitocôndria possui duas membranas: uma externa (MME) e uma interna (MMI); e a matriz mitocondrial. A membrana externa é permeável a pequenas moléculas e íons, enquanto que a membrana interna é impermeável à maior parte das pequenas moléculas e íons, esta última, possui várias invaginações denominadas de cristas, e abriga os cinco complexos da cadeia respiratória (complexos I-IV e ATP sintase, Figura 6). A matriz mitocondrial, um componente solúvel, contém as enzimas responsáveis pelo TCA, pela β-oxidação e oxidação de aminoácidos; além de ribossomos e DNA mitocondrial, o qual codifica para treze das subunidades proteicas que constituem a cadeia respiratória (Nelson & Cox, 2011).
Figura 6. Estrutura mitocondrial e cadeia respiratória. Estrutura mitocondrial (A) (Adaptado de “Mitochondrion mini” – Wikimedia Commons, 2013). Complexos proteicos da cadeia respiratória (B) (Retirado de Pereira et al., 2012).
A oxidação dos principais substratos energéticos (glicose, aminoácidos, ácidos graxos, lactato e corpos cetônicos), converge para a cadeia respiratória através das coenzimas ricas em equivalentes de redução, NADH e FADH2. Cada uma dessas coenzimas reduzidas transfere um par de elétrons ao longo dos complexos da cadeia respiratória até o oxigênio molecular (aceptor final de elétrons), o qual é convertido em água metabólica (Nelson & Cox, 2011).
O complexo I catalisa a transferência dos elétrons do NADH, formado principalmente na glicólise e no TCA, para a ubiquinona (UQ). O complexo I contém como grupos prostéticos uma molécula de flavina mononucleotídeo (FMN) e 6-7 centros ferro-enxofre que participam do processo de transferência de elétrons. FMN e UQ podem admitir três estados de oxidação, embora o NADH possa transferir dois elétrons simultaneamente, FMN e UQ são capazes de aceitar um elétron de cada
