CURSO DE ENGENHARIA DE PESCA
TATIANE CARVALHO FARIAS
ATIVIDADE ANTIMICROBIANA DE EXTRATO ALCOÓLICO DE CAROÇO DE MANGA (Mangifera indica L.) NO CONTROLE DE MICRO-ORGANISMOS
CONTAMINANTES DO PESCADO
PIÚMA 2018
TATIANE CARVALHO FARIAS
ATIVIDADE ANTIMICROBIANA DE EXTRATO ALCOÓLICO DE CAROÇO DE MANGA (Mangifera indica L.) NO CONTROLE DE MICRO-ORGANISMOS
CONTAMINANTES DO PESCADO
Trabalho de Conclusão de Curso apresentado à Coordenadoria do Curso de Engenharia de Pesca do Instituto Federal do Espírito Santo, Campus Piúma, como requisito parcial para a obtenção do título de Bacharel em Engenharia de Pesca.
Orientador: Profª. Drª. Flávia Regina Spago de Camargo Gonçalves
PIÚMA 2018
Dados internacionais de catalogação na publicação (CIP) Bibliotecária responsável Maria de Lourdes Cardoso CRB-6/3242
F866a Farias, Tatiane Carvalho. 1993-
Atividade antimicrobiana de extrato alcoólico de caroço de manga
(Mangifera indica L.) no controle de micro-organismos contaminantes do pescado / Tatiane Carvalho Farias -- 2018.
59 f. : il. ; 30 cm.
Orientador: Flávia Regina Spago de Camargo Gonçalves
Monografia (graduação) - Instituto Federal do Espírito Santo, Campus Piúma, Coordenadoria de Curso Superior de Engenharia de Pesca, 2018.
1. Alimentos - Microbiologia. 2. Pescados - Conservação. 3. Alimentos -
Cconservação. 4.Pescados - Contaminação. I. Gonçalves, Flávia Regina Spago de Camago. II. Instituto Federal do Espírito Santo, Campus Piúma. III. Título.
AGRADECIMENTOS AGRADECIMENTOS
AGRADECIMENTOS
Primeiramente agradeço a Deus, pela oportunidade da vida, por me conceder esperança para nunca desistir, força para continuar, acreditar e recomeçar.
Em segundo, aos meus pais Ana Carla Neto Carvalho Ozório e Reginaldo Farias Ozório, que mesmo distantes, se fizeram presentes. Em terceiro agradeço ao meu namorado Higor Julian da Cunha Andrade pela força e por nunca me deixar desistir nos momentos mais difíceis e a minha sogra Arlete da Cunha Andrade que sempre foi como uma segunda mãe para mim e nunca me deixou desanimar. Sempre me encorajando e me dizendo que eu seria capaz. Por mais que a caminhada não fosse fácil, eu sabia que no final viria a recompensa. A vocês, meu muito obrigado! Pois sem o apoio de vocês tudo seria mais difícil.
Agradeço a minha orientadora, doutora e professora Flávia Regina Spago de Camargo Gonçalves pela oportunidade de crescimento profissional e pessoal, confiança, apoio e amizade.
Aos professores membros da banca, Monique Lopes e Carlos Eduardo Araújo Barbosa por aceitarem o convite e pela importante contribuição neste trabalho.
Aos colegas do laboratório de microbiologia, pelo prazer da convivência diária, pela amizade e principalmente pela ajuda para a realização de minha pesquisa. Cada momento foi marcante, com muitas risadas, alegrias e muitas músicas que jamais vou me esquecer. Agradeço especialmente a Suzana Bianquini Menegardo, Daniella Alves Sant’ana, André Luiz, Bruna Morales, Juliane Ribeiro e Caroline Bindele, tenho vocês em meu coração.
Aos Professores do curso de Bacharel em Engenharia de Pesca, que contribuíram para minha formação acadêmica.
Ao IFES campus Piúma pela ótima faculdade e ao Cnpq, por financiar este estudo.
Agradeço a todos que por ventura tenha me esquecido de citar, mas que de algum modo torceram e contribuíram para esta importante conquista, O MEU MUITO OBRIGADA!
“Você ganha força, coragem e confiança através
de cada experiência em que você realmente para e
encara o medo de frente”.
RESUMO
A carne de pescado é uma das mais susceptíveis ao processo de deterioração, devido a atividade de água elevada, composição química, teor de gordura insaturadas facilmente oxidáveis e pH próximo a neutralidade, podendo atuar como veículo de microrganismos patogênicos para o homem. Este trabalho teve como objetivo avaliar o potencial antimicrobiano do extrato alcoólico de caroço de manga sobre os micro-organismos contaminantes do pescado. As frutas de Mangifera indica L. foram adquiridas no comércio local (Piúma, ES) e levadas ao laboratório de Ecologia Microbiana do IFES – Piúma para retirada dos resíduos e desinfecção. A preparação do extrato bruto foi realizada através do método de maceração com álcool 95%, utilizando-se a proporção de 80 mL/10g entre solvente/soluto. Os ensaios microbiológicos in vitro para avaliação da atividade antimicrobiana foram realizados por difusão em meio sólido utilizando discos de papel filtro. O fracionamento do extrato vegetal foi realizado através do método de cromatografia líquida a vácuo e as frações obtidas foram testadas quanto à sua atividade antimicrobiana e posteriormente avaliado seu potencial sinérgico. Para a avaliação da atividade antimicrobiana dos extratos alcoólicos no controle de patógenos deterioradores de alimentos em produtos a base de pescado refrigerado, foram realizadas contagens de coliformes totais e termotolerantes em NMP/g, Staphylococcus coagulase positiva em ufc/g, detecção de
Salmonella e determinação de micro-organismos mesófilos e psicrotróficos. Para as análises
físico-químicas do pescado, foram realizados testes de determinação de bases nitrogenadas voláteis e umidade. O extrato alcoólico de caroço de manga, mostrou grande potencial inibitório contra as bactérias testadas. As frações acetato de etila, etanol, metanol e água foram capazes de inibir as bactérias avaliadas, sendo a fração acetato de etila a que obteve maior potencial de inibição. Para o teste de sinergismo, as mesmas continuaram apresentando atividade antimicrobiana contra as bactérias testadas, porém seu potencial não aumentou quando testadas juntas. Os resultados obtidos das análises microbiológicas de todas as amostras de filés com 14 dias de refrigeração encontram-se em acordo com os padrões estabelecidos pela ANVISA, segundo a Resolução n° 12 de 02 de janeiro de 2001. Os resultados demonstraram o grande potencial para a utilização do extrato alcoólico de caroço de manga na conservação do pescado.
Palavras-chave: Conservação do pescado. Potencial antimicrobiano. Bactérias patogênicas. Bactérias deterioradoras
ABSTRACT
Fish meat is one of the most susceptible to the deterioration process, due to the high water activity, chemical composition, unsaturated fat content easily oxidizable and pH close to neutrality, being able to act as a vehicle of microorganisms pathogenic to man. The aim of this work was to evaluate the antimicrobial potential of the mango seed extract on the microorganisms contaminating the fish. The fruits of Mangifera indica L. were purchased at the local trade (Piúma, ES) and taken to the Microbial Ecology Laboratory in IFES - Piúma for waste removal and disinfection. The preparation of the crude extract was carried out using 95% alcohol maceration method, using 80 mL/10g solvent/solute. In vitro microbiological assays for the evaluation of antimicrobial activity were performed by solid media diffusion using filter paper discs. The fractionation of the vegetable extract was carried out by the liquid chromatography method and the fractions obtained were tested for antimicrobial activity and later evaluated its synergistic potential. To evaluate the antimicrobial activity of alcoholic extracts in the control of food deteriorating pathogens in refrigerated fish products, total and thermotolerant coliforms were counted in NMP / g, coagulase positive coagulase in cfu / g, Salmonella detection and determination mesophilic and psychrotrophic microorganisms. For the physicochemical analyzes of the fish, tests were carried out to determine volatile nitrogen bases and moisture. The alcoholic extract of mango, showed great inhibitory potential against the bacteria tested. The ethyl acetate, ethanol, methanol and water fractions were able to inhibit the bacteria evaluated, with the ethyl acetate fraction having the highest inhibition potential. For the synergism test, they continued to present antimicrobial activity against the tested bacteria, but their potential did not increase when tested together. The results obtained from the microbiological analyzes of all the fillet samples with 14 days of refrigeration are in agreement with the standards established by ANVISA, according to Resolution n ° 12 of January 2, 2001. The results demonstrated the great potential for utilization of alcoholic extract of mangoes in fish conservation.
Keywords: Fish conservation. Antimicrobial potential. Pathogenic bacteria. Deteriorating bacteria.
LISTA DE FIGURAS
Figura 1 – Cromatografia líquida a vácuo do extrato alcoólico de caroço de manga ... 29 Figura 2 – Atividade antimicrobiana do extrato alcoólico de caroço de manga contra os patógenos, através do teste de difusão em disco: a) Staphylococcus aureus, b)
Escherichia coli, c) Vibrio parahaemolyticus, d) Bacilus cereus e Salmonella enteritidis ... 33
Figura 3 – Quantidade de bactérias mesófilas presentes no pescado, ao longo de 14 dias, sob refrigeração ... 43 Figura 4 – Quantidade de fungos mesófilos presentes no pescado, ao longo de 14 dias, sob refrigeração ... 44 Figura 5 – Quantidade de bactérias psicrotróficas presentes no pescado, ao longo de 14 dias, sob refrigeração ... 45 Figura 6 – Quantidade de fungos psicrotróficos presentes no pescado, ao longo de 14 dias, sob refrigeração ... 46 Figura 7 – Quantidade de Bases Nitrogenadas Voláteis Totais (mg/100g) ... 47 Figura 8 – Teor de umidade (g/100g) no pescado, ao longo de 14 dias, sob refrigeração ... 48
LISTA DE TABELAS
Tabela 1 – Composição química aproximada (%) de algumas espécies de pescado ... 15 Tabela 2 – Bactérias patogênicas presentes no pescado ... 20 Tabela 3 ̶ Atividade antimicrobiana do extrato alcoólico de caroço de manga frente aos patógenos testados pelo teste de difusão em disco ... 34 Tabela 4 – Atividade antimicrobiana das frações obtidas do extrato alcoólico de caroço de manga frente aos patógenos testados ... 36 Tabela 5 – Teste de sinergismo das frações obtidas na semi-purificação do extrato de caroço de manga frente aos patógenos testados ... 39 Tabela 6 – Número Mais Provável (NMP) de coliformes totais e termotolerantes em filés de Sarda (Sarda sarda) armazenados em geladeira durante 14 dias ... 41
LISTA DE ABREVIATURAS, SIGLAS
NA Ágar Nutriente
BDA Batata Dextrose Ágar
BNV Bases nitrogenadas voláteis
BP Baird Parker Base
CIM CL Cm
Concentração Mínima Inibitória Caldo Lactosado
Centímetros
°C Graus Celsius
EC Caldo E. coli
ES Espírito Santo
FAO Organização das Nações Unidas para Alimentação e Agricultura G Gramas HCL H L Ácido clorídrico Horas Litro M Metros Mg Miligramas
MgO Óxido de Magnésio
mL µg µm Mililitros Microgramas Micrômetro µL NaCl NMP Microlitros Cloreto de sódio Número Mais Provável
PCA Plate Count Agar
pH Potencial hidrogeniônico
RP Caldo Rapaport Vassiliadis
SC Caldo Selenito Cistina
TCA Ácido tricloroacético
Ufc Unidade formadora de colônia VBBL Verde Brilhante e Bile Lactose XLD Ágar Xilose Lisina Descarboxilase
SUMÁRIO 1 INTRODUÇÃO ... 12 2 OBJETIVOS ... 14 2.1 OBJETIVO GERAL ... 14 2.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS...14 3 REVISÃO DE LITERATURA ... 15 3.1 COMPOSIÇÃO DO PESCADO ... 15 3.2 DETERIORAÇÃO DO PESCADO ... 16
3.3 BACTÉRIAS CONTAMINANTES DO PESCADO E SEUS RISCOS A SAÚDE HUMANA ... 18
3.3.1 Bactérias indígenas do pescado ... 21
3.3.2 Bactérias não-indígenas do pescado ... 24
3.4 MANGA (Mangifera indica L.)...26
4 MATERIAIS E MÉTODOS ... 27
4.1 MATERIAL VEGETAL ... 28
4.2 OBTENÇÃO DO EXTRATO BRUTO ... 27
4.3 MICRO-ORGANISMOS ... 27
4.4 AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE ANTIMICROBIANA DO EXTRATO BRUTO...28
4.5 FRACIONAMENTO DO EXTRATO ALCOÓLICO DE MANGA ... 28
4.6 SINERGISMO ENTRE AS FRAÇÕES DOS EXTRATOS OBTIDOS NA SEMI PURIFICAÇÃO ... 29
4.7 TESTES DE CONTROLE DOS PATÓGENOS E PARÂMETROS FÍSICO-QUÍMICO DOS FILÉS DE PESCADO REFRIGERADO, VISANDO AUMENTAR A VIDA DE PRATELEIRA ... 29
4.7.1 Contagem de Staphylococcus aureus ... 30
4.7.2 Pesquisa de Salmonella ... 30
4.7.3 Determinação do número mais provável de coliformes totais e termotolerantes .... 30
4.7.4 Determinação de micro-organismos mesófilos e psicrotróficos ... 31
4.7.5 Determinação de bases nitrogenadas voláteis (BNV) ... 31
4.7.6 Umidade (método gravimétrico) ... 32
4.8 ANÁLISE ESTATÍSTICA ... 32
5 RESULTADOS E DISCUSSÃO ... 33
5.2 FRACIONAMENTO DO EXTRATO ALCOÓLICO DE MANGA ... 35
5.3 SINERGISMO ENTRE AS FRAÇÕES DOS EXTRATOS OBTIDOS NA SEMI-PURIFICAÇÃO ... 38
5.4 TESTES DE CONTROLE DOS PATÓGENOS E PARÂMETROS FÍSICO-QUÍMICOS EM FILÉS DE PESCADO REFRIGERADO ... 39
5.4.1 Contagem de Staphylococcus aureus ... 39
5.4.2 Análise de Salmonella sp. ... 40
5.4.3 Determinação do número mais provável de coliformes totais e termotolerantes .... 41
5.4.4 Determinação de micro-organismos mesófilos e psicrotróficos ... 42
5.4.5 Determinação de bases nitrogenadas voláteis (BNV) ... 46
5.4.6 Umidade (método gravimétrico) ... 48
6 CONCLUSÃO ... 49
1 INTRODUÇÃO
O pescado é um dos alimentos mais suscetíveis à decomposição por enzimas e bactérias devido à menor quantidade de tecido conjuntivo, elevada atividade de água, gordura facilmente oxidável e pH próximo da neutralidade, levando a alterações de natureza física e química, ocasionando riscos a saúde do consumidor (OLIVEIRA et al., 2008). Pode atuar como potencial veiculador de micro-organismos patogênicos para o homem, como as bactérias Staphylococcus coagulase positiva, Escherichia coli, Salmonella spp., Clostridium
perfringens, entre outros (RIBEIRO et al., 2009).
As bactérias patogênicas geralmente não alteram a aparência, odor, nem sabor do alimento; portanto, na maioria das vezes é impossível saber se o alimento oferece risco em termos de contaminantes sem que se realize uma análise microbiológica (MARTINS, 2006). Porém, se em grandes quantidades, essas bactérias podem comprometer a qualidade e o grau de frescor do pescado, causando sérios danos à saúde do consumidor, que vão desde uma simples intoxicação até a morte (RIBEIRO et al., 2009).
A deterioração de alimentos por origem microbiana é um problema constante nas indústrias alimentícias. Para contornar esse problema, os fabricantes têm utilizado aditivos do tipo conservante, a fim de aumentar o prazo de validade dos produtos alimentícios e conservá-los. Devido aos problemas de toxicidade na composição dos conservantes de origem química, os consumidores têm evitado este tipo de produto (DEGÁSPARI et al., 2005).
Nos últimos anos, há uma intensa preocupação pela disponibilidade de uma alimentação de qualidade e natural, pois os alimentos que contêm altos níveis de conservantes para redução da carga microbiana são indesejáveis. Desse modo, a pressão por parte dos consumidores se volta para uma maior produção de alimentos frescos, com conservantes naturais e maior garantia de segurança (MACIEL et al., 2012). O crescente interesse dos consumidores por este tipo de alimentação tem incentivado pesquisadores a buscar tecnologias de processamento que atendam a essa demanda (RAMOS et al., 2005). Vários aditivos naturais têm sido estudados para serem utilizados como agentes conservadores e antimicrobianos em alimentos. O uso de extratos vegetais surge como uma alternativa promissora neste campo, uma vez que o uso de vegetais já é comum entre a alimentação humana. Vale ressaltar que, a
maioria dos produtos de pescado não permitem o uso de aditivos, assim o extrato alcoólico de manga apresenta-se como uma alternativa a ser disponibilizada.
Os extratos de plantas constituem importantes fontes de compostos biologicamente ativos, que podem apresentar importantes propriedades antimicrobianas. Atualmente, o uso de extratos de plantas como agentes com atividade antioxidante e antimicrobiana tem sido de extrema importância, em especial para alimentos, pois podem ser utilizados como aditivos alimentares, fornecendo proteção contra reações oxidativas, além de proteger contra micro-organismos deteriorantes e patogênicos (AZEVEDO, 2011).
As frutas são fontes ricas em substâncias bioativas, como compostos fenólicos e ácidos orgânicos, que apresentam atividade antimicrobiana. Alguns autores estudam as propriedades antimicrobianas de compostos fenólicos, extratos de plantas e frutas contra bactérias patogênicas transmitidas por alimentos, evidenciando que os compostos fenólicos são alguns dos principais componentes que fornecem atividade antimicrobiana, muitas vezes agindo sinergicamente entre eles e com outras moléculas extraídas, como carotenóides e ácido ascórbico (AZEVEDO, 2011).
Taninos e compostos fenólicos vêm sendo amplamente reconhecidos por possuírem alto potencial antibiótico. Tal afirmação encontra respaldo ao confirmar-se o uso de plantas medicinais ricas em polifenóis para obtenção de efeito anti-séptico (FILHO, 2005). Taninos são tóxicos para fungos e bactérias e esta atividade é devido a algumas de suas propriedades, como a inibição de enzimas extracelulares, deprivação de substrato, inibição da fosforilação oxidativa, além de mecanismos que envolvem deprivação de ferro (SANCHES, 2004).
Apesar da grande diversidade de antimicrobianos que agem sobre diversos micro-organismos patogênicos, estudos buscam por um antimicrobiano ideal, ou seja, aquele que apresenta maior espectro de ação, menor toxicidade, menor custo e menor indício de resistência bacteriana, haja vista que já existe resistência bacteriana a alguns produtos antimicrobianos (ALVARENGA et al., 2007). Sendo assim, faz-se necessária a busca por antimicrobianos naturais de amplo espectro, que não seja tóxico e possua um custo menor que os outros tipos de conservantes.
2 OBJETIVOS
2.1 OBJETIVO GERAL
O presente trabalho teve como objetivo avaliar as propriedades antimicrobianas do extrato alcoólico de caroço de manga (Mangifera indica L.) no controle de micro-organismos contaminantes do pescado.
2.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS
• Preparar o extrato alcoólico de caroço de manga;
• Avaliar a atividade antimicrobiana do extrato alcoólico contra as bactérias
Staphylococcus aureus, Escherichia coli, Vibrio parahaemolyticus, Bacillus cereus e Salmonella enteritidis;
• Semi-purificar o extrato obtido utilizando solventes orgânicos de polaridade crescente; • Determinar o potencial antimicrobiano das frações obtidas na semi-purificação, contra
as bactérias S. aureus, E. coli, V. parahaemolyticus, B. cereus e S. enteritidis;
• Testar o extrato alcoólico no controle dos patógenos e na manutenção dos parâmetros físico-químicos dos filés de pescado refrigerado, visando aumentar a vida de prateleira;
3 REVISÃO DE LITERATURA
3.1 COMPOSIÇÃO DO PESCADO
A composição química do pescado varia de espécie para espécie, assim como entre peixes da mesma espécie. Segundo Gurgel e Freitas (1972) os fatores responsáveis por esta variação, tem relação com o tamanho, a alimentação, a estação do ano e o local de captura do peixe. Em um mesmo exemplar, a composição química vai depender da parte do corpo analisada.
O peixe constitui uma fonte de proteínas de alto valor biológico, tão importante quanto a carne bovina, sendo a água o componente que apresenta maior variação relacionada à espécie e à época do ano em que o pescado é coletado, podendo compreender de 53% a 80% da composição química total (GONÇALVES, 2011). Em geral, a composição do pescado varia numa proporção de 8 a 23% de proteína; 0,5 a 25% de lipídeos; 1 a 2% de cinzas e menos que 1% de carboidratos. O pescado contém proteínas de alto valor biológico e alta digestibilidade. (ANDRADE; BISPO; DRUZIAN, 2009). A composição química de algumas espécies de pescado está descrita na Tabela 1.
Tabela 1. Composição química aproximada (%) de algumas espécies de pescado.
Espécie Água Proteína total Gordura total Sais minerais
Atum 70,4 24,7 3,9 1,3 Bacalhau 80,8 17,3 0,4 1,2 Cavala 67,5 18,0 13,0 1,5 Merluza 79,2 17,9 1,5 1,3 Truta 78,2 18,3 3,1 1,4 Lagostim 78,0 19,0 2,0 1,4 Ostra 83,0 9,0 1,2 2,0 Mexilhão 83,0 10,0 1,3 1,7 Fonte: GONÇALVES (2011).
O valor calórico dos peixes como alimento depende do teor de gordura. Assim, temos: peixes magros, com menos de 1% de gordura: bacalhau (0,14%), carpa (0,5%), pescada (0,6%), truta (0,7%), linguado (0,8%) e outros; peixes meio gordos, com 7% a 8% de gordura: salmão,
arenque, cavala, congrio e outros; peixes gordos, com mais de 15% de gordura: atum, enguia e outros (MACHADO, 1984; LEDERLE, 1991; OGAWA; MAIA, 1999).
3.2 DETERIORAÇÃO DO PESCADO
O pescado é um dos alimentos mais perecíveis e mais susceptíveis ao processo de deterioração. Isso se deve a elevada atividade de água dos tecidos, ao teor elevado de nutrientes que podem facilmente ser utilizados pelos micro-organismos, à rápida ação destrutiva das enzimas naturais presentes nos tecidos, à alta taxa de atividade metabólica da microbiota, à grande quantidade de lipídeos insaturados e pH próximos à neutralidade (SOARES; GONÇALVES, 2012).
O pescado assim como qualquer outro animal, após a sua morte, sofre uma série de alterações que contribuem para sua deterioração. Por isso exige cuidados e técnicas adequadas de conservação e higiene para assegurar que o produto chegue com qualidade até o consumidor final. Essas técnicas são regidas pela legislação federal, em toda a cadeia produtiva, desde a sua captura até sua chegada ao consumidor. A maneira como o pescado será manipulado nesse intervalo de tempo, irá determinar a intensidade das alterações enzimáticas, oxidativas e microbiológicas (GONÇALVES, 2011; SILVA, 2008).
Os passos iniciais do processo de deterioração do pescado começam com a liberação de muco em sua superfície, seguido do rigor mortis, autólise e decomposição bacteriana (BEIRÃO et al., 2004). Entretanto, estas fases não seguem uma ordem estrita. Seus inícios, fins e durações variam, e geralmente se sobrepõem dependendo das condições de manuseio e armazenagem (ARAÚJO et al., 2010).
A liberação do muco pelas glândulas situadas sob a pele dos peixes ocorre como uma reação do organismo às condições desfavoráveis do meio que o cerca. A maior parte do muco é constituída pela mucina, uma glicoproteína, que é um excelente meio de desenvolvimento de micro-organismos (FERREIRA, 2002). No entanto o muco pode entrar em decomposição mesmo com o peixe ainda fresco, atuando assim, como veículo para a penetração de bactérias na carne (ARAÚJO et al., 2010).
Segundo Argenta (2012) o rigor mortis pode ser definido como a perda de elasticidade e extensibilidade dos músculos, como resultado da alteração dos ciclos de contração e
relaxamento dos músculos, e pode ser dividido em três fases: o período de pré rigor mortis, que é compreendida entre a morte do animal e o início da contração muscular; o rigor mortis, que é caracterizada pela redução do pH da carne, enrijecimento do músculo por contração extrema e irreversível de suas fibras; e o pós-rigor mortis, que é quando ocorre a resolução do
rigor mortis, caracterizado pela perda da rigidez muscular, onde o músculo torna-se macio e
recupera muitas das propriedades que tinha no pré rigor (VIÉGAS; SOUZA, 2004; GONÇALVES, 2011).
O tempo que durará a etapa anterior ao rigor mortis vai depender de como o pescado foi capturado. O processo de rigor mortis pode iniciar em até cinco horas após a morte do animal e durar aproximadamente 30 horas quando o pescado for estocado em temperatura próxima ao ponto de fusão do gelo (VIÉGAS; SOUZA, 2004; MOREIRA et al., 2001). A partir do término da fase de rigor mortis, que é curta, as alterações microbiológicas se iniciam, determinando uma vida de prateleira menor que em qualquer outra espécie animal (VELLOSO, 2004). O RIISPOA estabelece que o pH da carne externa de peixes frescos deve ser inferior a 6,8 e, para a carne interna, inferior a 6,5 (BRASIL, 1952).
O intervalo entre o começo e a resolução do rigor varia segundo a espécie e é afetada pela temperatura, manipulação, tamanho e condições físicas do pescado. Ao terminar essa fase, iniciam-se as fases de deterioração por autólise e bacteriana (HUSS, 1997).
A autólise é o processo de quebra das proteínas devido à ação das enzimas proteolíticas, uma vez que os tecidos são constituídos basicamente de compostos proteicos. A hidrólise das proteínas permite a criação de um ambiente favorável para a multiplicação bacteriana, possibilitando a deterioração. Em temperaturas próximas de 0°C, a autólise tem sua velocidade sensivelmente diminuída (BEIRÃO; TEIXEIRA; MEINERT, 2000).
As alterações autolíticas são responsáveis pela perda inicial da qualidade do peixe fresco, mas contribuem muito pouco para a deterioração do peixe refrigerado e de outros produtos da pesca. Porém, o rápido desenvolvimento de cheiros desagradáveis e o aparecimento de manchas devido à ação das enzimas digestivas em alguns peixes não eviscerados constituem exceções (HUSS, 1997).
Traumas mecânicos originados na captura, no manuseio e durante a estocagem do pescado contribuem para que as enzimas contidas nas vísceras penetrem no músculo, deteriorando-o
(BEIRÃO; TEIXEIRA; MEINERT, 2000). A partir de então o processo deteriorativo se intensifica, pois a multiplicação de micro-organismos proteolíticos gera suprimento adicional de nutrientes para o crescimento bacteriano. A carne muda de consistência tornando-se amolecida, o que favorece também a deterioração por bactérias (BEIRÃO et al., 2004).
O desenvolvimento bacteriano no pescado é um dos principais fatores que levam à deterioração. As bactérias em sua maioria apresentam atividades proteolíticas e lipolíticas que contribuem para a desintegração dos tecidos, levando a uma série de reações bioquímicas indesejáveis, com subsequentes formações e acúmulo de substâncias de odor desagradável, repugnantes e tóxicas (CARVALHO, 2000).
3.3 BACTÉRIAS CONTAMINANTES DO PESCADO E SEUS RISCOS A SAÚDE HUMANA
Vários são os agentes responsáveis pelas doenças que têm sido associados ao consumo do pescado, como bactérias, vírus, biotoxinas, aminas biogênicas (histamina), parasitas, produtos químicos e deterioração (oxidação, microbiológica, autolítica) (HUSS, 1997). As doenças transmitidas por alimentos representam um grande e importante problema de saúde pública, por acometerem milhões de pessoas em todo o mundo. A análise de risco é de grande importância no setor pesqueiro, pois são muitas as etapas que vão do processamento à comercialização. Os patógenos são os grandes responsáveis pelas doenças transmitidas por alimentos e, além disso, o risco microbiológico é um dos itens mais avaliados pela indústria de processamento do pescado visando a segurança alimentar (SOARES; GONÇALVES, 2012).
O peixe é muito suscetível à deterioração microbiana devido a sua elevada atividade de água, com teor de gorduras facilmente oxidáveis e ter ph próximo da neutralidade (ph 6,6-6,8), que são fatores que favorecem o desenvolvimento das bactérias que podem causar doenças no homem (SILVA et al., 2008).
As bactérias presentes nos peixes de águas temperadas são, na sua maioria, Gram negativas psicrotróficas pertencentes aos gêneros: Pseudomonas, Moraxella, Acinetobacter,
Shewanella, Flavobacterium e as famílias Vibrionaceae e Aeromonadaceae, mas organismos
Gram positivos também podem se desenvolver em diferentes proporções (GONÇALVES, 2011). O peixe capturado em águas tropicais pode transportar uma carga ligeiramente mais
elevada de organismos Gram-positivos e bactérias entéricas. Durante a armazenagem, desenvolve-se uma microbiota característica, mas apenas parte dela contribui para a deterioração (HUSS, 1997).
As bactérias dos peixes de águas temperadas são classificadas de acordo com a sua faixa de temperatura de crescimento. As psicrófilas são bactérias com crescimento na temperatura máxima de 20º C com o ótimo de temperatura a 15 ºC. As pscicrotolerantes são bactérias que crescem a 0º C, mas com ótimo crescimento a 25º C (VIEIRA et al., 2004).
Segundo Germano e Germano (2003), o muco que recobre a superfície externa do peixe e brânquias, contém bactérias dos gêneros Pseudomonas, Achromobacter, Micrococcus,
Flavobacterium, Vibrio, Bacillus, Clostridium e Escherichia coli. Estes e outros
micro-organismos, inclusive os patogênicos, podem estar presentes no pescado devido à sua extensa cadeia produtiva - beneficiamento, conservação, distribuição, transporte e armazenamento, até alcançar o consumidor final, comprometendo a qualidade do produto disponível.
Bactérias como os coliformes, Clostridium sp., Salmonella sp., Staphylococcus aureus e
Vibrio podem ser encontradas no pescado, estando relacionadas com a matéria-prima, com o
ambiente ou, ainda, serem consequências de manuseio e/ou estocagem incorretos durante o processamento e a comercialização (HOFFMAN et al., 1999). Estas bactérias contaminam o pescado, não só através da água, mas também pela manipulação dos pescadores, do modo com que são arrumados em recipientes e locais inapropriados e pelo longo tempo que levam os produtos para serem submetidos ao processo de frio (EVANGELISTA, 1994). Se o pescado for capturado em locais contaminados, ele chegará à indústria com altos índices dessas bactérias. Entretanto, é necessário pensar nas contaminações cruzadas que acontecem na indústria, provenientes de facas, das mãos dos manipuladores, dos equipamentos a despeito de todo cuidado e do uso de desinfetantes (GONÇALVES, 2011).
A maioria das bactérias patogênicas é heterotrófica, pois são capazes de transformar matéria orgânica em energia e substratos de carbono, incluindo aminoácidos, lipídios, glicolipídios e carboidratos (RECHE; FIUZA, 2010).
Alguns micro-organismos que podem contaminar o pescado são patogênicos, enquanto outros não causam enfermidades nos seres humanos, mas são indicadores de condições higiênicas inadequadas, sendo sua presença sugestiva da existência de micro-organismos patogênicos.
Entre os micro-organismos indicadores de qualidade higiênica estão os coliformes totais e coliformes termotolerantes. Apesar de alguns trabalhos relatarem a presença de coliformes no trato intestinal de peixes, estes não são considerados habitantes naturais da sua microbiota intestinal, permitindo, assim, correlação com as condições microbiológicas da água onde o peixe se encontra (BASTI et al., 2006). Na Tabela 2, podemos ver a classificação dos patógenos em dois grupos bacterianos.
Tabela 2. Bactérias patogênicas presentes no pescado.
Bactérias
Modo de atuação Estabilidade térmica da toxina Dose infectante mínima Infecção Toxina pré-formada Bactérias indígenas (Grupo 1)
Clostridium botulinum + Baixa -
Vibrio sp. + Alta
V. cholerae -
V. parahaemolyticus (>10⁶ /g)
Outros víbrios ¹ -
Aeromonas hydrophila + Não
conhecida
Plesiomonas shigelloides + Não
conhecida
Listeria monocytogenes + Não
conhecida/ Variável Bactérias não indígenas (Grupo 2) Salmonella sp. + Desde <10² até >10⁶ Shigella + 10¹ - 10² E. coli + 10¹ - 10³ ²
Staphylococcus aureus + Alta -
¹ Outros víbrios são: V. vulnificus, V. hollisae, V. furnsii, V. mimicus, V. fluvialis. ² Para a estirpe 0157:H7 produtora de verotoxina.
3.3.1 Bactérias indígenas do pescado
As bactérias indígenas são frequentes e encontram-se amplamente distribuídas nos ambientes aquáticos de várias partes do mundo. A temperatura da água tem, naturalmente, um efeito seletivo (HUSS, 1997).
O Clostridium botulinum é um bacilo gram positivo, se desenvolve em meio anaeróbio, produz esporos e é encontrado com frequência no solo, em legumes, verduras, frutas, sedimentos aquáticos e em fezes humanas (CERESER et al., 2008). É um micro-organismo muito comum no ambiente e no trato intestinal de animais e que se divide em subgrupos ou cepas, produzindo vários metabólitos tóxicos de ação farmacológica similar (JULIANO; CARDOSO, 2014). Existem sete toxinas imunologicamente distintas, designadas com as letras A até G, que se distinguem pelas características antigênicas da neurotoxina que produzem, embora tenham ação farmacológica similar. Os tipos A, B, E e F causam a maioria dos casos no homem (TORNESE et al., 2008).
As espécies que constituem o gênero Vibrio são bacilos Gram-negativos, curvos ou retos, móveis, não formadores de esporos, mesófilos, catalase e oxidase positiva, fermentadores de glicose sem produção de gás, sensíveis às temperaturas superiores a quarenta e cinco graus centígrados e medem entre 0,5 – 1,0 μm de largura e entre 1,4 – 3,0 μm de comprimento, são anaeróbicas facultativas e não esporulados (HUSS, 1997; CORTINA, 2015). Pertencem à família Vibrionaceae, que agrupa inúmeras bactérias patogénicas para o ser humano (HUSS, 1997). Habitam ambientes tipicamente marinhos e estuarinos, necessitando de cloreto de sódio para o seu crescimento. São comumente isoladas de peixes e crustáceos, sendo capazes também de se multiplicar sem hospedeiro em águas marinhas (TALL et al., 2013).
O gênero Vibrio inclui mais de 30 espécies, das quais ao menos 14 são reconhecidas patogênicas para o homem (IWAMOTO, 2010). A maioria das espécies patogênicas é móvel, possuindo flagelo único e polar, fermentam glicose sem produção de gás e são catalase positivos. (KONEMAN et al. 2008). As espécies patogênicas são principalmente mesófilas, isto é, ocorrem, em geral, em águas tropicais e em número mais elevado em águas temperadas nos finais do Verão ou princípios do Outono (HUSS, 1997).
A bactéria Gram-negativa Vibrio cholerae é o agente etiológico da cólera, que é caracterizada por uma diarréia aquosa que pode causar desidratação grave e ter alta letalidade. Esta espécie
é constituída de 206 sorogrupos, sendo que destes, somente dois sorogrupos, O1 e O139, são os causadores da cólera epidêmica (ULLOA et al., 2011; CORTINA, 2015).
É uma espécie causadora de surtos, epidemias e pandemias relacionados com ambientes estuarinos. O reservatório comprovado da cólera é o homem, no entanto, a presença desse micro-organismo no habitat aquático e sua associação à quitina, zooplânctons e peixes, pode favorecer a contaminação dos moluscos bivalves durante o processo de filtração. Sua infecção é decorrente da ingestão de água e alimentos contaminados. Essa espécie produz a toxina colérica, responsável pelos sintomas clínicos da doença no hospedeiro. Novas variantes patogênicas do V. cholerae surgiram e se espalharam pela Ásia e por muitos países africanos, onde o saneamento é precário (CALIXTO, 2010; SILVEIRA et al., 2016). A dose infectante da bactéria necessária para causar as manifestações clínicas vai variar de acordo com a via, se for ingerida com água, a dose infecciosa é de 103 a 106 células e se for ingerida com alimentos 102 a 106 células são necessários (CORTINA, 2015).
Vibrio parahaemolyticus são bacilos Gram-negativos, halofílicos, anaeróbico facultativo,
pertencente à família das Vibrionaceae (SANTIAGO et al., 2013). Seu crescimento ocorre em temperaturas de 10 e 48ºC, sendo que a temperatura ótima é de 35-37ºC e o melhor pH para seu crescimento é alcalino que varia entre 7,5 e 8,5. Apresenta halofilismo restrito, exigindo um mínimo de 1% de NaCl e a concentração favorável para o desenvolvimento de V.
parahaemolytcius é de 2 a 4% sendo 8% a concentração máxima tolerada (CORTINA, 2015).
Por possuir ocorrência sazonal, é encontrado principalmente em estações mais quentes (SILVEIRA et al., 2016).
Os sintomas mais comuns de doença provocada por V. parahaemolyticus são: diarreia, dores abdominais, náusea, vômito e enxaqueca, febre e calafrios pouco frequentes. O período de incubação varia de 4 a 96 horas, e em média 12 horas, os sintomas podem persistir por 2 a 10 dias (CORTINA, 2015). A dose infectante mínima de aproximadamente 10⁵ UFC (JAY, 2005). Esta bactéria tem sido responsável por casos de gastroenterites associadas ao consumo de peixes, moluscos e crustáceos do mar, crus ou mal cozidos (SILVEIRA et al., 2016).
Aeromonas hydrophila é uma bactéria Gram negativa, anaeróbica facultativa, não esporulante,
que está presente naturalmente em ambiente aquático de criação e fazem parte da flora microbiana normal dos organismos aquáticos. Podem causar enfermidades em animais
pecilotérmicos e homeotérmicos, incluindo o homem. Causa septicemia hemorrágica em peixes de água doce e, ocasionalmente, marinhos. Em seres humanos, podem causar diarréias, septicemia, inflamação do tecido conjuntivo e síndrome hemolítica urêmica, especialmente em indivíduos imunossuprimidos (COSTA, 2003; PEREIRA JÚNIOR et al., 2003). A A.
hydrophila é adquirida pelos humanos através da água ou através de alimentos contaminados
(PEREIRA JÚNIOR et al., 2003).
Plesiomonas shigelloides é um bacilo Gram-negativo, que mede 0,3 a 1,0 m de diâmetro por
2,0 a 3,0 m de comprimento, anaeróbio facultativo e apresenta motilidade por meio de dois a sete flagelos polares. Produz uma enzima chamada oxidase, fermenta o inositol, a glicose e outros poucos carboidratos sem produção de gás. Descarboxila a lisina e ornitina, dihidrolisa a arginina e é sensível ao agente Vibriostático O/129. Sua temperatura de crescimento varia entre 8 e 44°C, sendo considerada ótima em torno de 37 a 38°C. As P. shigelloides apresentam pH ótimo de crescimento na faixa de 4,0 a 8,0 e é capaz de crescer em concentrações de sais que variam de 0 a 5%, sendo bem tolerante às concentrações de 3,0 a 3,5% de NaCl (FALCÃO et al., 2007).
As listérias são bastonetes Gram positivos, não produtoras de esporo e não ácido resistente que antigamente foram denominadas como Listerella (JAY, 2005). Dentre as espécies de
Listeria, a L. monocytogenes é inquestionavelmente patogênica para o homem. Listeriose é a
denominação de um grupo geral de desordens causadas por L. monocytogenes que incluem septicemia, meningite (ou meningoencefalite), encefalite e infecção cervical ou intrauterina em gestantes, que podem provocar aborto (no segundo ou terceiro trimestre) ou nascimento prematuro (SILVA et al., 2010).
As listerias crescem em temperatura de 1 a 45°C, sendo a faixa ótima de 30 a 37°C, embora existam relatos sobre o crescimento a 0°C. Suportam repetidos congelamentos e descongelamentos (MANTILLA et al. 2007).
Um importante aspecto a ser considerado nas indústrias de alimentos é o fato de existirem cepas de L. monocytogenes persistentes, as quais são capazes de permanecer meses, ou até anos, no ambiente de processamento, podendo assim provocar contaminações recorrentes no produto final (MARKKULA et al., 2005).
3.3.2 Bactérias não-indígenas do pescado
As bactérias não-indígenas estão presentes naturalmente nos ambientes. Podem, portanto, também ser encontrado contaminando peixes vivos e peixes cru (HUSS, 1997).
As bactérias mesófilas constituem um grupo capaz de se multiplicar entre 10ºC e 45ºC, sendo sua temperatura ideal em torno de 30ºC. Esse grupo é importante porque inclui a maioria dos contaminantes de alimentos de origem animal, podendo atingir altas contagens quando o alimento é mantido à temperatura ambiente. Segundo ICMS o número de micro-organismos aeróbios mesófilos encontrados em um alimento tem sido um dos indicadores microbiológicos da qualidade dos alimentos mais comumente utilizados, indicando se a limpeza, a desinfecção e o controle da temperatura durante os processos de tratamento industrial, transporte e armazenamento foram realizados de forma adequada. Esta determinação permite também obter informação sobre a alteração incipiente dos alimentos, sua provável vida útil, a falta de controle no descongelamento dos alimentos ou desvios na temperatura de refrigeração estabelecida (SILVA, 2012).
Micro-organismos psicrotróficos são aqueles que conseguem crescer em alimentos sob refrigeração em torno de 7°C, independente de sua temperatura ótima de crescimento (20°C e 30°C). Podem ser bastonetes, cocos, víbrios, formadores ou não de esporos, aeróbios ou anaeróbios (ZENI et al., 2009).
Entre as bactérias mesófilas e psicrotróficas existem aquelas que oferecem algum risco à saúde humana, quando ingeridos. Pode-se citar como exemplo o Staphylococcus aureus e as enterobactérias dos gêneros Salmonella, Shiguella e coliformes totais e termotolerantes.
As bactérias do gênero Salmonella são bastonetes Gram-negativos, móveis, anaeróbios facultativos, não formadores de esporos (normalmente com dimensões de 0.7-1.5 x 2-5 μm), pertencentes à família Enterobacteriaceae. São frequentemente encontradas no trato intestinal de diversos animais, incluindo pássaros e homens (FRANCO; LANDGRAF, 2003).
Para o controle das doenças transmitidas por alimentos, a legislação vigente no Brasil impõe a ausência de Salmonella para qualquer amostra aleatória de 25g do alimento (BRASIL, 2001). Pois a Salmonella quando em pequeno número em pescado ou outro alimento já é capaz de
causar danos ao consumidor, bem antes de causar odor amoniacal no alimento (MOHAMEDHATHA; LAKHMANAPERUMALSAMY, 1997).
O gênero Shigella pertence à família Enterobacteriaceae, é um bacilo Gram-negativo, não formador de esporo, anaeróbio facultativo e imóvel e é composto por quatro espécies que são
Shigella sonnei, Shigella flexneri, Shigella boydii e Shigella dysenteriae (NATARO et al.,
2011).
Dentre os patogénos causadores da gastroenterite no Brasil, a Shigella spp. está entre as quatro bactérias mais isoladas de fezes diarréicas em regiões distintas do país, sendo as crianças mais afetadas (SERIBELLI, 2016). A Shigella é geralmente encontrada em águas poluídas com esgotos humano e é transmitida pela rota fecal-oral (MAIER, 2009).
Escherichia coli são bacilos Gram negativos pertencentes à família Enterobacteriaceae,
anaeróbios facultativos que colonizam o trato gastrintestinal infantil dentro de poucas horas de vida, tornando-se um hospedeiro mutualista, embora em pacientes debilitados ou imunossuprimidos, possam causar infecção (SANTIAGO et al., 2013).
A presença de Escherichia coli é relacionada à contaminação de origem fecal, pois essa bactéria é a principal representante dos coliformes termotolerantes e a principal causadora de doenças diarreicas via ingestão de água e alimentos contaminados (SANTIAGO et al., 2013). Segundo o Ministério da Saúde (Brasil, 2000), essa bactéria é considerada como a indicadora mais específica de contaminação fecal recente e da eventual presença de organismos patogênicos.
O Staphylococcus. aureus é uma bactéria patogênica que não faz parte da microbiota normal dos peixes. São habitantes usuais da pele, das membranas mucosas, do trato respiratório superior e do intestino de homem e animais de sangue quente. Geralmente, este micro-organismo é transmitido aos alimentos por seus manipuladores e são responsáveis por aproximadamente 45% das toxinfecções do mundo, cuja contaminação pode ocorrer durante os estágios de produção ou estocagem do alimento, por cepas de origem ambiental ou humana, sendo um dos agentes patogênicos mais comuns em surtos de origem alimentar. Algumas cepas de Staphylococcus aureus produzem uma enterotoxina termoestável, responsável pelos quadros de intoxicação alimentar no homem (GONÇALVES et al., 2011; NETO et al., 2002).
A intoxicação alimentar provocada por S. aureus ocorre devido à ingestão de enterotoxinas produzidas e liberadas pela bactéria durante sua multiplicação no alimento, representando um risco para a saúde pública. A enterotoxina estafilocócica está presente no alimento mesmo após o cozimento, possibilitando, desta forma, a instalação de um quadro de intoxicação de origem alimentar. Seus sintomas são caracterizados por vômito, dor abdominal, e diarreia, que podem ocorrer de 2-6 h após a ingestão do alimento contaminado (NETO et al., 2002).
No Brasil, o Regulamento Técnico sobre padrões microbiológicos para alimentos RDC n° 12 de 2001, da ANVISA, que define os padrões microbiológicos para alimentos expostos a venda e a exportação, preconiza um limite de 103 ufc/g para S. aureus em alimentos (BRASIL, 2001).
3.4 MANGA (Mangifera indica L.)
A manga (Mangifera indica L.) conhecida popularmente como mangueira é uma dicotiledônea pertencente à família Anacardiaceae originária da Ásia austro-oriental. Hoje, a mangueira é naturalizada em todas as regiões intertropicais. Trata-se de uma árvore de elevado porte, às vezes, com mais de 20 m de altura e até 2,50 m de diâmetro, esgalhada, formando densa e frondosa copa, em cuja sombra não cresce planta alguma (CRUZ, 2010). É uma fruta muito apreciada por apresentar características agradáveis, tais como sabor, aparência e aroma (CAJADO; ARAGÃO; OLIVEIRA, 2016; SOUZA, 2015).
Dentre as principais cultivares de manga, no mercado nacional, destaca-se a Bourbon, Carabao, Rubi, Rosa, Tommy Atkins, Haden entre outras (CRUZ, 2010).
A manga, além de ser uma fruta bastante apreciada, constitui uma importante fonte de fitoquímicos, dentre os quais se destacam os polifenóis, os carotenóides e a vitamina C. O teor destes compostos em vegetais varia, em função das condições edafoclimáticas do cultivo, variedade e grau de maturação da fruta. Sendo que algumas frutas podem potencialmente conter maior teor de compostos antioxidantes nos caroços e cascas do que na polpa, ou ainda, o perfil dos fitoquímicos antioxidantes ser diferenciado nestas partes do vegetal (MELO; ARAÚJO, 2011).
4 MATERIAIS E MÉTODOS
4.1 MATERIAL VEGETAL
As frutas de Mangifera indica L. conhecidas regionalmente como Manga Rosa, foram adquiridas no comércio local da cidade de Piúma, estado do Espírito Santo, durante o ano de 2017 e encaminhadas ao laboratório de Ecologia Microbiana do Instituto Federal do Espírito Santo, IFES – Campus Piúma, para as análises. As frutas foram lavadas com água corrente para retirada dos resíduos e desinfetadas com solução de hipoclorito de sódio 10 mL/L por 15 minutos e submetidas à remoção dos caroços (endocarpo + semente). Os caroços foram lavados em água destilada estéril para remoção dos restos de polpas e açúcares solúveis provenientes das frutas e então pesadas e secas a 60 ºC em estufa (Lucadema/Modelo Luca-81/100). Após a estabilização do peso seco, as amostras foram moídas utilizando um liquidificador gourmet (Spolu/ SPL-020) e guardadas em geladeira a 7°C, para etapas subseqüentes.
4.2 OBTENÇÃO DO EXTRATO BRUTO
O extrato bruto foi preparado através do método de maceração com álcool 95%, utilizando-se a proporção de 80 mL/10g entre solvente/soluto. O homogeneizado foi transferido para um vidro âmbar e estocado em geladeira (7°C), protegido da luz, por um período de 2 dias. Após esse tempo, a mistura foi agitada com o auxílio do agitador magnético (Marconi/Modelo MA 085/CT) durante 15 minutos e o sobrenadante foi filtrado em papel filtro qualitativo 0,6 mm (Whatman). O extrato foi armazenado em frasco âmbar e colocado na capela de exaustão para evaporação da fase alcoólica e posteriormente armazenados a -18°C até a sua utilização.
4.3 MICRO-ORGANISMOS
Cinco cepas bacterianas foram usadas nos testes de inibição in vitro: Staphylococcus aureus,
Escherichia coli, Vibrio parahaemolyticus, Bacillus cereus e Salmonella enteritidis incubadas
por 24 horas a 37°C em Ágar Muller Hinton. Estes micro-organismos são mantidos como culturas puras criopreservadas em glicerol 20%, no Laboratório de Ecologia Microbiana do Instituto Federal do Espírito Santo – Campus Piúma, Brasil.
4.4 AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE ANTIMICROBIANA DO EXTRATO BRUTO
Os inóculos bacterianos, com densidades ajustadas para 10⁸ ufc/mL, foram semeados na superfície das placas de Ágar Muller-Hinton, com auxílio de um swab estéril, de modo a se obter crescimento uniforme. Estes inóculos foram obtidos a partir de culturas recentes dos micro-organismos (24h a 37°C). Em seguida, foram colocados sobre o meio, discos de papel filtro estéreis Whatman® com 6 mm de diâmetro, embebidos com 10 μL do extrato bruto diluído com álcool na concentração de 1000 μg. Para o controle, foram utilizados discos de papel embebidos com 10 μL de álcool. As placas foram incubadas a 35°C durante 24 horas. A inibição do crescimento microbiano foi avaliada pelo diâmetro do halo de inibição ao redor dos discos após 24 horas de incubação a 35°C. Os testes foram realizados em triplicata e os resultados foram expressos em mm pela média aritmética do diâmetro dos halos de inibição formado ao redor dos discos nas três repetições.
4.5 FRACIONAMENTO DO EXTRATO ALCOÓLICO DE MANGA
O extrato vegetal de caroço de manga foi fracionado por cromatografia líquida a vácuo (Figura 1). As separações cromatográficas foram realizadas utilizando: coluna de vidro (15 x 200 mm), sílica gel 60 (230-400 mesh) como fase estacionária e bomba de vácuo. A coluna foi montada com cerca de 30 g de sílica gel 60 (30 cm de altura) e foram adicionados cerca 0,2 g do extrato bruto macerado junto com 1,5 de sílica gel. Como fase móvel, foram utilizados solventes orgânicos de polaridade crescente (hexano, diclorometano, clorofórmio, acetato de etila, etanol, metanol e água). Cada fração foi separada do solvente por rota-evaporação. Os extratos semi-purificados obtidos, foram testados no controle dos micro-organismos (S. enteritidis, E. coli, V. parahaemolyticus, B. cereus e S. aureus) através da técnica de inibição em disco.
Figura 1 – Cromatografia líquida a vácuo do extrato alcoólico de caroço de manga.
Fonte: A autora.
4.6 SINERGISMO ENTRE AS FRAÇÕES DOS EXTRATOS OBTIDOS NA SEMI PURIFICAÇÃO
As frações obtidas através da separação cromatográfica que apresentaram atividade antimicrobiana foram testadas quanto a sinergismo. O sinergismo foi verificado pelo método de difusão em disco. As frações foram diluídas na concentração de 1000 μg e 5 μL de cada 2 frações diferentes foram colocados em um microtubo e em seguida misturados e adicionados aos discos de papel Whatman 0,6mm. Com um swab estéril, o inóculo bacteriano (10⁸ ufc/mL) foi distribuído uniformemente sobre a superfície do Ágar. Os discos contendo o antimicrobiano foram adicionados às placas em triplicata. As placas foram incubadas a 35°C durante 24 h. Os resultados foram expressos em mm pela média aritmética seguida do desvio padrão do diâmetro dos halos de inibição formados ao redor dos discos nas três repetições.
4.7 TESTES DE CONTROLE DOS PATÓGENOS E PARÂMETROS FÍSICO-QUÍMICOS DOS FILÉS DE PESCADO REFRIGERADO, VISANDO AUMENTAR A VIDA DE PRATELEIRA
Utilizou-se para essa avaliação, filés de Sarda (Sarda sarda) pulverizado apenas com 5 mL de água estéril (controle) e filés pulverizados com 5 mL do extrato bruto diluído em água estéril
na concentração de 1000 μg (teste). Ambas as amostras foram estocadas em sacos plásticos hermeticamente fechados em geladeira durante 14 dias a 10°C. A cada três dias de armazenagem, eram realizados os testes microbiológicos e físico-químicos dos filés de Sarda até os 14 dias de armazenagem. Todas as análises foram realizadas de acordo com a IN 62/2003 do Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento (MAPA), com modificações.
4.7.1 Contagem de Staphylococcus aureus
As alíquotas de 25g de cada amostra de peixe foram adicionadas a 225 mL de solução salina 0,85% com peptona a 0,1% e posteriormente homogeneizadas por 1 minuto. 50 μL de cada amostra foram semeados com o auxílio da alça de Drigalski em placas de Petri contendo meio Ágar Baird Parker (BP) com adição de gema de ovo e telurito de potássio. As placas foram incubadas a 35°C por 48 horas. Passado o período de incubação realizou-se a contagem das colônias características do gênero Staphylococcus e as mesmas foram submetidas a testes bioquímicos confirmativos.
4.7.2 Pesquisa de Salmonella
As alíquotas de 25g de cada amostra de peixe foram adicionadas a 225 mL de solução salina 0,85% com peptona a 0,1% e posteriormente homogeneizadas por 1 minuto. Incubou-se a 35°C por 24 horas para pré-enriquecimento. Posteriormente, foi realizado o enriquecimento seletivo, com 1 mL da amostra transferida para o tubo de ensaio contendo 10 mL de caldo selenito cistina (SC) e 0,1 mL da amostra transferida para o tubo de ensaio contendo 10 mL de Caldo Rappaport Vassiliadis (RP), incubados a 35° C durante 24h. Para o isolamento das colônias foram realizadas estrias em Ágar Verde Brilhante e Bile Lactose (VBBL) e em Ágar Xilose Lisina Descarboxilase (XLD) incubados a 35°C por 48 horas. Após a incubação, foi verificado o desenvolvimento de colônias típicas e as mesmas foram submetidas a testes bioquímicos confirmativos.
4.7.3 Determinação do número mais provável de coliformes totais e termotolerantes
As alíquotas de 25g de cada amostra de peixe foram adicionadas a 225 mL de solução salina peptonada 0,85% e posteriormente homogeneizadas por 1 minuto. Para os testes presuntivos foram inoculados, em 3 séries de 3 tubos contendo Caldo Lactosado (CL) 10 mL, 1mL e 0,1 mL de cada homogeneizado. Incubou-se a 35°C por 48h. Os tubos que apresentaram
formação de gás no Caldo Lactosado, tiveram alíquotas semeadas em tubos com Caldo Verde Brilhante e Bile Lactose (VBBL) contendo tubos de Durham invertidos para o crescimento de coliformes totais. O período de incubação foi de 48 horas a 35°C. Para a confirmação de coliformes termotolerantes, foi transferida uma alçada de cada tubo positivo das análises presuntivas para tubos contendo caldo com E. coli (EC). Os mesmos foram incubados a 45°C por 24 horas. A confirmação da presença de coliformes totais e termotolerantes se dá pela presença de gás nos tubos de Durhan e turvação do meio. As culturas dos tubos que apresentaram gás foram estriadas em meio AN para posterior teste de confirmação, pelo método de Coloração de Gram.
4.7.4 Determinação de micro-organismos mesófilos e psicrotróficos
As alíquotas de 25g de cada amostra de peixe foram adicionadas a 225 mL de solução salina 0,85% com peptona a 0,1% e posteriormente homogeneizadas por 1 minuto. Para micro-organismos mesófilos e psicrotróficos, 100 μL, da diluição 10ˉ⁶ de cada amostra foi semeada com o auxílio da alça de Drigalski em placas de Petri contendo meio de cultura seletivo para fungos, Batata Dextrose Ágar (BDA) e meio de cultivo seletivo para bactérias, Ágar Padrão para Contagem (PCA). As placas para a contagem de fungos mesófilos foram incubadas em estufa a temperatura de 25 °C, durante 5 dias, e as placas para a contagem das bactérias mesófilas, foram incubadas em estufa a temperatura de 35 °C, durante 48 horas.Todas as placas para a contagem tanto de fungos quanto de bactérias psicrotróficas, foram incubadas na geladeira a 7°C, durante 10 dias.
4.7.5 Determinação de bases nitrogenadas voláteis (BNV)
Alíquotas de 20g de filés de pescado triturado foram adicionadas a 120 mL de TCA e homogeneizadas por 5 minutos. Após a homogeneização, o mesmo ficou em repouso por 30 minutos até que o processo de decantação estivesse concluído. Em seguida, o homogeneizado foi filtrado em funil de vidro com filtro de papel. Mediu-se 20 mL do filtrado e o mesmo foi transferido para um tubo digestor de proteínas com 1g de MgO. Colocou-se em um erlenmeyer de 250 mL, 20 mL de solução receptora e destilou-se aproximadamente 70 mL no aparelho micro-kjeldahl. O destilado foi titulado com HCL (0,05 N) até a cor azul virar rosa claro e em seguida, anotado o volume de ácido gasto.
A BNV é expressa em mg N/100g de músculo. Para tanto, utiliza-se a fórmula representada pela Equação 1:
Equação 1: BNV = mL de HCL x N x 14 x 100 x 134 20 x 20
Onde:
*mL de HCl é o volume de ácido clorídrico gasto para a titulação. *N = normalidade do HCl
*134 corresponde à fração líquida total que estaria contida em 20 g de peixe extraídos com 120 mL de TCA. Considera-se que em média a carne de peixe tenha 70 % de água, logo, 20 g contribuiriam com 14g de água, que somada a 120 mL resulta em 134 de fração líquida total (CONTRERAS-GÚZMAN, 1988).
4.7.6 Umidade (método gravimétrico)
Os cadinhos foram enumerados e colocados em estufa a 105 ºC por 40 minutos para retirar a umidade. Após este procedimento, os cadinhos foram retirados da estufa e esfriados em dessecador por uma hora. Os cadinhos foram pesados em balança analítica e seus pesos anotados. Com a balança tarada, pesou-se aproximadamente 5,0 gramas de amostra, as quais foram colocadas em estufa a 105 ºC por 24 horas. Após a retirada total de água das amostras, estas foram resfriadas em dessecador e em seguida pesadas (INSTITUTO ADOLFO LUTZ, 2008).
4.8 ANÁLISE ESTATÍSTICA
Os dados foram analisados utilizando-se o programa de análises estatísticas Sisvar 5.3 (FERREIRA, 2010), desenvolvido pela Universidade Federal de Lavras - UFLA. Foram analisadas a normalidade e a homogeneidade dos dados e os resultados foram submetidos à análise de variância, seguido de teste de Tukey em nível de 5% de significância.
5 RESULTADOS E DISCUSSÃO
5.1 AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE ANTIMICROBIANA
A atividade antimicrobiana do extrato de caroço de manga, analisada pelo método de difusão em disco, mostrou halos de inibição de crescimento contra as bactérias gram-positivas (S.
aureus e B. cereus) e gram-negativas (S. enteritidis, E. coli e V. parahaemolyticus) analisadas
(Figura 2).
Figura 2 – Atividade antimicrobiana do extrato alcoólico de semente de manga contra os patógenos, através do teste de difusão em disco: a) Staphylococcus aureus, b) Escherichia
coli, c) Vibrio parahaemolyticus, d) Bacilus cereus e e) Salmonella enteritidis.
Fonte: A autora.
Os maiores halos de inibição de crescimento bacteriano na concentração testada (1000 μg /disco) foram obtidos contra os patógenos V. parahaemolyticus e E. coli com seus halos de inibição de crescimento de 26,6 mm e 24,3 mm de diâmetro, respectivamente (Tabela 3).
a) b) c)
Tabela 3 – Atividade antimicrobiana do extrato alcoólico de semente de manga contra os patógenos testados pelo teste de difusão em disco.
Halos de inibição (mm) S. aureus B. cereus E. coli V.
parahaemolyticus Salmonella enteritidis Extrato alcoólico de semente de Manga 18,6±0,57 12±0 24,3±0,57 26,6±1,52 17±0
Os valores estão expressos como a média dos halos de inibição seguido do desvio padrão. Fonte: A autora.
Arbos et al. (2013), avaliando a ação antimicrobiana dos extratos hidroalcoólicos de semente de manga por método de difusão em disco, obteve halos de inibição contra quatro cepas patogênicas: E.coli (15,5 mm), Salmonella sp (16,1 mm) e S. aureus (14,9 mm). Os resultados obtidos por estes autores foram menores quando comparados com o presente estudo. Essa diferença pode estar relacionada à mistura de solventes utilizados, ao tempo de extração ou então à concentração de compostos no fruto. No estudo de Arbos e colaboradores (2013) a extração foi realizada com uma mistura de etanol e água em centrífuga por 15 minutos, tempo muito menor que o utilizado nesse trabalho.
Segundo Mothana e Lindequist (2005), halos de inibição de 8 a 13 mm são considerados extratos com poder de ação moderadamente ativos, já halos de inibição entre > 14 mm são extratos muito ativos. Com base nesse critério, o extrato alcoólico de semente de manga, obtido nesse trabalho apresentou elevada atividade antimicrobiana contra as bactérias avaliadas, exceto para o B. cereus que apresentou um diâmetro menor que 14 mm.
Garcia e Orlanda (2014) ao estudarem o extrato bruto hidroalcoólico da folha de Mangifera
indica, verificaram a atividade antimicrobiana in vitro contra a cepa de Staphylococcus aureus. Entretanto, não apresentou atividade antimicrobiana contra as bactérias
Gram-negativas (Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa e Salmonella typhi). A divergência de resultados para algumas espécies pode ser justificada pela ausência de alguns compostos antimicrobianos existentes na folha da manga e que estão presentes na semente.
Atualmente, tem-se verificado compostos antimicrobianos naturais em resíduos de manga (KHAMMUANG; SARNTHIMA, 2011; ABDULLAH et al., 2011), que podem inibir algumas bactérias Gram-positivas e Gram-negativas, incluindo Escherichia coli, Clostridium sp. e Salmonella sp. (KABUKI et a.l, 2000), como pode ser confirmado com o presente
trabalho, que foi capaz de inibir bactérias positivas (S. aureus e B. cereus) e Gram-negativas (S. enteritidis, E. coli e V. parahaemolyticus). Compostos fenólicos, lipídios, proteínas e fibras são os componentes mais importantes das cascas e sementes das mangas por possuem propriedades antioxidantes e antibactericida (VIEIRA et al., 2009). E com isso, o aumento no interesse de seu reaproveitamento por causa de seus componentes presentes na sua composição vem crescendo (OLIVEIRA, 2013). Dessa forma, é possível observar que a ação antimicrobiana do extrato proveniente do caroço de manga pode ser em parte atribuída ao seu alto teor de compostos fenólicos, taninos, galatos, galotaninos, taninos condensados, mangiferina, catequina, epicatequina e ácido benzóico. A presença desses compostos antimicrobianos vem sendo descritos em diversos trabalhos.
Segundo Abdalla et al. (2007) a ação antimicrobiana da amêndoa do caroço de manga deve-se ao fato da presença de compostos fenólicos e lipídeo estável rico em ácidos graxos insaturados. Os principais compostos fenólicos presentes na semente de manga são os ácidos gálico e elágico, bem como galatos, galotaninos, taninos condensados, mangiferina, catequina, epicatequina e ácido benzóico, e na casca a mangiferina e quercetina, na forma de aglicona e de glicosídios, evidenciando um maior potencial antioxidante nesta em relação à semente (HUBER et al., 2012). Jiamboonsri et al. (2011) afirmaram que o extrato de etanol de amêndoa de manga e seus princípios fenólicos exibiram potencial inibitório para
Staphylococcus aureus. Kabuki et al. (2000), comprovaram a atividade antimicrobiana do
extrato etanólico da semente de manga contra patógenos de origem alimentar. Verificaram que o extrato em questão apresentou ação contra bactérias gram-positivas e gram-negativas e associaram a relevante atividade antimicrobiana do resíduo de manga ao alto teor de polifenóis.
Engels et al. (2009) e Mirghani et al. (2009) relataram o significante potencial antimicrobiano da amêndoa da manga, associando a ação antimicrobiana ao teor de taninos hidrolisados, os quais possuem capacidade de interação com as proteínas.
5.2 FRACIONAMENTO DO EXTRATO ALCOÓLICO DE MANGA
Das frações obtidas, as frações acetato de etila, etanol, metanol e água foram as únicas capazes de inibir o crescimento de alguns patógenos testados. A fração acetato de etila foi a única capaz de inibir quatro patógenos: S. aureus, E. coli, V. parahaemolyticus e S.
enteritidis. As frações etanol e metanol foram capazes de inibir apenas três patógenos: S. aureus, E. coli, V. parahaemolyticus e a fração água inibiu apenas um patógeno: V. parahaemolyticus. As frações hexano, diclorometano e clorofórmio, não foram capazes de
inibir nenhum dos patógenos testados. Os dados da atividade antimicrobiana das frações obtidas por cromatografia líquido-líquido estão representados na tabela 4.
Tabela 4 - Atividade antimicrobiana das frações obtidas do extrato alcoólico de caroço de manga frente aos patógenos testados.
Halos de inibição (mm) S. aureus B. cereus E. coli V.
parahaemolyticus Salmonella enteritidis Fração hexano 0 0 0 0 0 Fração diclorometano 0 0 0 0 0 Fração clorofórmio 0 0 0 0 0
Fração acetato de etila 15,3±0,57 0 30,6±1,15 20,3±0,57 16±1
Fração etanol 16±0 0 20±0 20,6±1,15 0
Fração metanol 14,6±0,57 0 19,6±0,57 24,6±0,57 0
Fração água 0 0 0 14,3±1,15 0
Os valores estão expressos como a média dos halos de inibição seguido do desvio padrão. Fonte: A autora.
Diversos métodos e sistemas de solventes vêm sendo utilizados para semipurificar e/ou purificar os diversos compostos presentes em extratos alcoólicos vegetais visando determinar a capacidade antimicrobiana (ROCKENBACH et al., 2008). Para a extração desses compostos, diferentes sistemas de solventes são utilizados (CHAVAN et al., 2001). A extração em materiais sólidos ou semi-sólidos tem sido focada na maceração utilizando solventes orgânicos, enquanto a extração em amostra líquida é obtida pela extração líquido-líquido (ELL). Ambos os métodos requerem caros e perigosos solventes orgânicos (metanol, etanol, propanol, acetona, acetato de etila, e suas combinações, com diferentes proporções de água) (GARCIA-SALES et al., 2010).
Andreo e Jorge (2006), afirmam que a extração dos compostos fenólicos dependem da polaridade do solvente empregado. Neste trabalho foi observado a extração dos compostos com atividade antimicrobiana presentes na caroço de manga através de solventes mais polares (acetato de etila, etanol, metanol e água), que podem ser compostos fenólicos ou taninos. Segundo Marinho (2004), os taninos podem ser retirados dos vegetais por diferentes tipos de solventes tais como água, etanol, acetona ou por soluções aquosas, entre outros.
