AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE ANTIMICROBIANA

A atividade antimicrobiana do extrato de caroço de manga, analisada pelo método de difusão em disco, mostrou halos de inibição de crescimento contra as bactérias gram-positivas (S.

aureus e B. cereus) e gram-negativas (S. enteritidis, E. coli e V. parahaemolyticus) analisadas

(Figura 2).

Figura 2 – Atividade antimicrobiana do extrato alcoólico de semente de manga contra os patógenos, através do teste de difusão em disco: a) Staphylococcus aureus, b) Escherichia

coli, c) Vibrio parahaemolyticus, d) Bacilus cereus e e) Salmonella enteritidis.

Fonte: A autora.

Os maiores halos de inibição de crescimento bacteriano na concentração testada (1000 μg /disco) foram obtidos contra os patógenos V. parahaemolyticus e E. coli com seus halos de inibição de crescimento de 26,6 mm e 24,3 mm de diâmetro, respectivamente (Tabela 3).

a) b) c)

Tabela 3 – Atividade antimicrobiana do extrato alcoólico de semente de manga contra os patógenos testados pelo teste de difusão em disco.

Halos de inibição (mm) S. aureus B. cereus E. coli V.

parahaemolyticus Salmonella enteritidis Extrato alcoólico de semente de Manga 18,6±0,57 12±0 24,3±0,57 26,6±1,52 17±0

Os valores estão expressos como a média dos halos de inibição seguido do desvio padrão. Fonte: A autora.

Arbos et al. (2013), avaliando a ação antimicrobiana dos extratos hidroalcoólicos de semente de manga por método de difusão em disco, obteve halos de inibição contra quatro cepas patogênicas: E.coli (15,5 mm), Salmonella sp (16,1 mm) e S. aureus (14,9 mm). Os resultados obtidos por estes autores foram menores quando comparados com o presente estudo. Essa diferença pode estar relacionada à mistura de solventes utilizados, ao tempo de extração ou então à concentração de compostos no fruto. No estudo de Arbos e colaboradores (2013) a extração foi realizada com uma mistura de etanol e água em centrífuga por 15 minutos, tempo muito menor que o utilizado nesse trabalho.

Segundo Mothana e Lindequist (2005), halos de inibição de 8 a 13 mm são considerados extratos com poder de ação moderadamente ativos, já halos de inibição entre > 14 mm são extratos muito ativos. Com base nesse critério, o extrato alcoólico de semente de manga, obtido nesse trabalho apresentou elevada atividade antimicrobiana contra as bactérias avaliadas, exceto para o B. cereus que apresentou um diâmetro menor que 14 mm.

Garcia e Orlanda (2014) ao estudarem o extrato bruto hidroalcoólico da folha de Mangifera

indica, verificaram a atividade antimicrobiana in vitro contra a cepa de Staphylococcus aureus. Entretanto, não apresentou atividade antimicrobiana contra as bactérias Gram-

negativas (Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa e Salmonella typhi). A divergência de resultados para algumas espécies pode ser justificada pela ausência de alguns compostos antimicrobianos existentes na folha da manga e que estão presentes na semente.

Atualmente, tem-se verificado compostos antimicrobianos naturais em resíduos de manga (KHAMMUANG; SARNTHIMA, 2011; ABDULLAH et al., 2011), que podem inibir algumas bactérias Gram-positivas e Gram-negativas, incluindo Escherichia coli, Clostridium sp. e Salmonella sp. (KABUKI et a.l, 2000), como pode ser confirmado com o presente

trabalho, que foi capaz de inibir bactérias Gram-positivas (S. aureus e B. cereus) e Gram- negativas (S. enteritidis, E. coli e V. parahaemolyticus). Compostos fenólicos, lipídios, proteínas e fibras são os componentes mais importantes das cascas e sementes das mangas por possuem propriedades antioxidantes e antibactericida (VIEIRA et al., 2009). E com isso, o aumento no interesse de seu reaproveitamento por causa de seus componentes presentes na sua composição vem crescendo (OLIVEIRA, 2013). Dessa forma, é possível observar que a ação antimicrobiana do extrato proveniente do caroço de manga pode ser em parte atribuída ao seu alto teor de compostos fenólicos, taninos, galatos, galotaninos, taninos condensados, mangiferina, catequina, epicatequina e ácido benzóico. A presença desses compostos antimicrobianos vem sendo descritos em diversos trabalhos.

Segundo Abdalla et al. (2007) a ação antimicrobiana da amêndoa do caroço de manga deve-se ao fato da presença de compostos fenólicos e lipídeo estável rico em ácidos graxos insaturados. Os principais compostos fenólicos presentes na semente de manga são os ácidos gálico e elágico, bem como galatos, galotaninos, taninos condensados, mangiferina, catequina, epicatequina e ácido benzóico, e na casca a mangiferina e quercetina, na forma de aglicona e de glicosídios, evidenciando um maior potencial antioxidante nesta em relação à semente (HUBER et al., 2012). Jiamboonsri et al. (2011) afirmaram que o extrato de etanol de amêndoa de manga e seus princípios fenólicos exibiram potencial inibitório para

Staphylococcus aureus. Kabuki et al. (2000), comprovaram a atividade antimicrobiana do

extrato etanólico da semente de manga contra patógenos de origem alimentar. Verificaram que o extrato em questão apresentou ação contra bactérias gram-positivas e gram-negativas e associaram a relevante atividade antimicrobiana do resíduo de manga ao alto teor de polifenóis.

Engels et al. (2009) e Mirghani et al. (2009) relataram o significante potencial antimicrobiano da amêndoa da manga, associando a ação antimicrobiana ao teor de taninos hidrolisados, os quais possuem capacidade de interação com as proteínas.

5.2 FRACIONAMENTO DO EXTRATO ALCOÓLICO DE MANGA

Das frações obtidas, as frações acetato de etila, etanol, metanol e água foram as únicas capazes de inibir o crescimento de alguns patógenos testados. A fração acetato de etila foi a única capaz de inibir quatro patógenos: S. aureus, E. coli, V. parahaemolyticus e S.

enteritidis. As frações etanol e metanol foram capazes de inibir apenas três patógenos: S. aureus, E. coli, V. parahaemolyticus e a fração água inibiu apenas um patógeno: V. parahaemolyticus. As frações hexano, diclorometano e clorofórmio, não foram capazes de

inibir nenhum dos patógenos testados. Os dados da atividade antimicrobiana das frações obtidas por cromatografia líquido-líquido estão representados na tabela 4.

Tabela 4 - Atividade antimicrobiana das frações obtidas do extrato alcoólico de caroço de manga frente aos patógenos testados.

Halos de inibição (mm) S. aureus B. cereus E. coli V.

parahaemolyticus Salmonella enteritidis Fração hexano 0 0 0 0 0 Fração diclorometano 0 0 0 0 0 Fração clorofórmio 0 0 0 0 0

Fração acetato de etila 15,3±0,57 0 30,6±1,15 20,3±0,57 16±1

Fração etanol 16±0 0 20±0 20,6±1,15 0

Fração metanol 14,6±0,57 0 19,6±0,57 24,6±0,57 0

Fração água 0 0 0 14,3±1,15 0

Os valores estão expressos como a média dos halos de inibição seguido do desvio padrão. Fonte: A autora.

Diversos métodos e sistemas de solventes vêm sendo utilizados para semipurificar e/ou purificar os diversos compostos presentes em extratos alcoólicos vegetais visando determinar a capacidade antimicrobiana (ROCKENBACH et al., 2008). Para a extração desses compostos, diferentes sistemas de solventes são utilizados (CHAVAN et al., 2001). A extração em materiais sólidos ou semi-sólidos tem sido focada na maceração utilizando solventes orgânicos, enquanto a extração em amostra líquida é obtida pela extração líquido- líquido (ELL). Ambos os métodos requerem caros e perigosos solventes orgânicos (metanol, etanol, propanol, acetona, acetato de etila, e suas combinações, com diferentes proporções de água) (GARCIA-SALES et al., 2010).

Andreo e Jorge (2006), afirmam que a extração dos compostos fenólicos dependem da polaridade do solvente empregado. Neste trabalho foi observado a extração dos compostos com atividade antimicrobiana presentes na caroço de manga através de solventes mais polares (acetato de etila, etanol, metanol e água), que podem ser compostos fenólicos ou taninos. Segundo Marinho (2004), os taninos podem ser retirados dos vegetais por diferentes tipos de solventes tais como água, etanol, acetona ou por soluções aquosas, entre outros.

Abdullah (2011) testou diferentes solventes: etanol, metanol, acetona e água destilada para a preparação de extratos de diferentes tipos de sementes de manga, e avaliando quatro tipos cepas bacterianas (Staphylococcus aureus, Bacillus subtillis, Escherichia coli e Pseudomonas

aeruginosa), na qual se observou zona de inibição de todos os extratos estudados frente às

quatro cepas, comprovando o potencial antibacteriano da amêndoa do caroço de manga. No presente estudo podemos observar que apenas os solventes de alta polaridade (acetato de etila, etanol, metanol e água) foram capazes de extrair os compostos antimicrobianos dos extratos com potencial inibitório para as bactérias S. aureus, E.coli, V. parahaemolyticus e Salmonella

enteritidis. Entretanto, a água pura como solvente extrator não foi tão eficiente quando

comparado com os demais solventes testados, apresentando potencial inibitório apenas para a bactéria V. parahaemolyticus. Esta é considerada o solvente universal e em combinação com outros solventes orgânicos contribui para criar um meio moderadamente polar, o que favorece a extração de polifenóis (LAPORNIK et al., 2005; LIYANA-PATHIRANA; SHAHIDI, 2005). No entanto, o uso de água pura resulta em extratos com alta impureza (ácidos orgânicos, açúcares, proteínas solúveis), podendo interferir na ação destes compostos (CHIRINOS et al., 2007).

Segundo Liu et al. (2000), sugerem que solventes com alta polaridade, como a água, e solventes com polaridade muito baixas, ou apolares, como hexano ou diclorometano, não são bons extratores.

Para verificar o melhor solvente extrator de compostos fenólicos, Vizzotto e Pereira (2011), testaram diferentes solventes com pouca, intermédia e alta polaridade. O solvente hexano (de menor polaridade), ao ser utilizado não apresentou resultados satisfatórios, uma vez que não foi capaz de extrair os compostos fenólicos da amora-preta. Ao contrário do hexano, os solventes de alta polaridade (acetona, metanol e etanol) foram os mais eficientes na extração dos polifenóis.

No presente estudo, os solventes com alta polaridade (acetato de etila, etanol e metanol) também foram capazes de extrair os compostos com atividade antimicrobiana do extrato de caroço de manga contra as cepas dos patógenos testados. Os solventes com baixa polaridade (hexano, diclorometano e clorofórmio) não foram capazes de extrair os compostos com atividade antimicrobiana do extrato de caroço de manga, portanto não apresentaram nenhum resultado satisfatório quando testado contra os patógenos.

O acetato de etila foi o solvente mais eficiente na extração dos compostos contra o S. aureus,

E. coli e V. parahaemolyticus, seguido do etanol e metanol. Desta forma, os compostos de

caroço de manga apresentam características moderadamente polares.

Apesar de, neste estudo, o acetato, o metanol e o etanol terem se mostrado mais eficientes, alguns destes podem apresentar incovenientes. Diversas pesquisas vêm utilizando soluções de metanol para a extração de compostos fenólicos; entretanto, na análise de alimentos a solução de metanol deve ser substituída por etanol, uma vez que o mesmo apresenta menor grau de toxicidade em contrapartida ao metanol (MARÇO et al., 2008). O metanol pode ser confundido pelo etanol, uma vez que também é transparente, apresenta um cheiro semelhante e é entorpecente, além de apresentar um baixo custo. Porém, o uso deste pelos seres humanos pode ser letal (BARCELOUX, 2002). Mesmo o metanol sendo rotaevaporado, não podemos garantir a eliminação total de resíduos ou fragmentos deste nos compostos extraídos. Sendo assim, a utilização do etanol se torna mais segura.

5.3 SINERGISMO ENTRE AS FRAÇÕES DOS EXTRATOS OBTIDOS NA SEMI-