Produção de poli 3-hidroxibutirato-co-3-hidroxivalerato por escherichia coli recombinante a partir de glicose e ácido propiônico

(1)

Danielle Godinho de Araújo

Produção de

Poli[3-hidroxibutirato-co-3-hidroxivalerato] por Escherichia coli recombinante a

partir de Glicose e Ácido Propiônico

FLORIANÓPOLIS-SC

2005

(2)

UNIVERSIDADE FEDERAL DE SANTA CATARINA

CENTRO TECNOLÓGICO

DEPARTAMENTO DE ENGENHARIA QUÍMICA E ENGENHARIA DE ALIMENTOS

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM ENGENHARIA DE ALIMENTOS

Produção de

Poli[3-hidroxibutirato-co-3-hidroxivalerato] por Escherichia coli recombinante a

partir de Glicose e Ácido Propiônico

Dissertação apresentada ao Curso de

Pós-Graduação em Engenharia de Alimentos do

Centro Tecnológico da Universidade

Federal de Santa Catarina como requisito

parcial à obtenção do título de Mestre em

Engenharia de Alimentos.

Orientador: Profa. Regina Vasconcellos Antônio, Dr.

(3)

(4)

Este trabalho foi desenvolvido no Laboratório de

Bioquímica e Biologia Molecular de Microrganismos

Departamento de Bioquímica do Centro de Ciências

Biológicas da Universidade Federal de Santa Catarina.

(5)

Tudo é possível para quem tem coragem.

J.K. Rowling

(6)

Com todo carinho para as pessoas que

mais amo na vida: meus pais, Walter e

Vera, e meus irmãos, Fernando e Tinos.

(7)

A

GRADECIMENTOS

Agradeço a Prof. Dra_{Regina Vasconcellos Antônio pela orientação, amizade e}

apoio oferecido na realização deste trabalho.

Às professoras Dra_{Gláucia Maria Falcão de Aragão e Dr}a_{Valéria Reginatto Spiller}

por aceitarem a participar da banca de defesa dessa dissertação.

Minha gratidão ao pessoal do laboratório de engenharia bioquímica (ENGEBIO) pela ajuda nas análises cromatográficas.

Aos colegas do Intelab, Claudimir e Derce pelo ombro amigo nos momentos de dificuldades.

Agradeço com muito carinho aos meus colegas de laboratório, Ana Kelly, Cauê, Cristiene e Cássila pelo incentivo, ajuda e paciência.

À minha família aqui em Floripa: Lílian e Jeovana. Minha eterna gratidão a vocês por ouvirem meus desabafos, pela paciência, amizade e carinho.

Ás pessoas que mesmo distantes fisicamente se fizeram presentes nessa etapa da minha vida: Vovó Cecília, “Madinha”, Mariana, minha grande amiga e Welder.

Também agradeço todas as pessoas que passaram pela minha vida na minha estada em Floripa, em especial ao Paulinho por me acolher e incentivar nos momentos mais difíceis.

(8)

S

UMÁRIO

XI ÍNDICE DE FIGURAS XII ÍNDICE DE TABELAS XIII RESUMO XVI ABSTRACT CAPÍTULO I - INTRODUÇÃO 1 5

CAPÍTULO II – REVISÃO BIBLIOGRÁFICA

2.1 DEFINIÇÃO DE POLIHIDROXIALCANOATOS 5 2.2 HISTÓRICO DOS POLIHIDROXIALCANOATOS 5

2.3 ESTRUTURA E PROPRIEDADES 6

2.4 APLICAÇÕES DOS PHA’s 9

2.5 BIOSSÍNTESE DOS POLIHIDROXIALCANOATOS 11 2.5.1 Biossíntese de poli[3-hidroxibutirato] 11 2.5.1.1 Enzimas envolvidas na biossíntese de P[3HB] 12

2.5.1.1.1 3-β-Cetotiolase 12 2.5.1.1.2 Acetoacetil-CoA redutase 13

2.5.1.1.3 PHA sintase 13 2.5.1.2 Genes responsáveis pela biossíntese de P[3HB] 14

2.5.2 Biossíntese de poli[3-hidroxibutirato-co-3-hidroxivalerato] 14 2.5.2.1 Ácido propiônico 16

2.5.2.2 Enzima propionil-CoA carboxilase (PCC) 17

2.5.2.3 Estratégias para produção de P[3HB-co-3HV] 18 2.5.2.3.1 Ácido itacônico 19

2.6 MICRORGANISMOS PRODUTORES DE PHA’s 20

(9)

Sumário

2.6.3 Pseudomonas 22

2.6.4 Ralstonia eutropha 22 2.6.5 Produção a partir de plantas 23

2.6.6 Escherichia coli recombinante 24

2.7 DEGRADAÇÃO DE PHA’s 25

2.8 BIODEGRADABILIDADE 26

28

CAPÍTULO III – MATERIAL E MÉTODOS

3.1 LINHAGENS E PLASMÍDIOS EMPREGADOS 28

3.1.1 Microrganismo 28

3.1.2 Plasmídio 28

3.2 MEIOS DE CULTIVO E SOLUÇÕES EMPREGADOS 29 3.2.1 Meio Luria Bertani - LB 29 3.2.2 Solução de ampicilina 29 3.2.3 Tampão Tris-HCl, 1M, pH 8,0 30 3.2.4 Solução de EDTA, 0,5M, pH 8,0 30 3.2.5 Tampão Tris-EDTA (TE) 30

3.2.6 Solução de Cloreto de Cálcio (CaCl2) 30

3.2.7 Solução estoque de glicose 30

3.2.8 Suplementos 30

3.1.9 Inibidor Enzimático 31

3.3 METODOLOGIAS EMPREGADAS 31

3.3.1 Obtenção de Escherichia coli recombinante 31 3.3.1.1 Preparação de células competentes 31 3.3.1.2 Transformação de células competentes 31 3.3.1.3 Seleção dos recombinantes 32 3.3.1.4 Extração do DNA plasmidial 32 3.3.2 Experimento preliminar: Efeito do ácido propiônico sobre o crescimento

de Escherichia coli JM101 32

3.3.3 Etapas da produção de polihidroxialcanoatos por Escherichia coli

recombinante 33

3.3.3.1 Preparo do pré-inóculo 34 3.3.3.2 Preparo do inóculo 34 3.3.4 Produção de P[3HB-co-3HV] 34 3.3.4.1 Produção sem utilização de suplementos 34 3.3.4.2 Produção com utilização de suplementos 34

3.3.4.3 Efeito do ácido itacônico sobre o crescimento de E. coli 35 3.3.4.4 Inibição química da atividade da propionil-CoA carboxilase pelo

ácido itacônico 35

(10)

Sumário

3.3.9 Determinações Analíticas 36 3.3.9.1 Concentração da biomassa 36 3.3.9.2 Extração dos PHA’s produzidos 36 3.3.9.3 Avaliação do PHA produzido 36 38

CAPÍTULO IV – RESULTADOS E DISCUSSÃO

4.1 Influência da concentração de ácido propiônico no crescimento de E. coli 38 4.2 Influência da concentração de ácido itacônico no crescimento de E. coli 39 4.3 Produção de P[3HB-co-3HV] por E. coli recombinante utilizando ácido

propiônico como precursor de valerato 40

4.4 Influência da utilização de azeite de oliva na produção de P[3HB-co-3HV] 41 4.5 Influência da utilização de ácido acético na produção de P[3HB-co-3HV] 43 4.6 Influência da combinação de suplementos na produção de P[3HB-co-3HV] 45

4.7 Efeito do ácido itacônico sobre a produção de P[3HB-co-3HV] 46 49

CAPÍTULO V - CONCLUSÕES

51

CAPÍTULO VI – SUGESTÕES

52

CAPÍTULO VII – REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

59

(11)

Í

NDICE DE

F

IGURAS

Figura 2.1 – Estrutura geral dos polihidroxialcanoatos 6

Figura 2.2 – Estrutura do P[3HB-co-3HV] 9

Figura 2.3 – Frasco de shampo e aparelho de barbear produzidos com

P[3HB-co-3HV] 10

Figura 2.4 – Esquema da via metabólica de produção de P[3HB] 12

Figura 2.5 – Genes responsáveis pela biossíntese de P[3HB] em R. eutropha 14 Figura 2.6 – Esquema da via metabólica da produção de P[3HB-co-3HV] 15 Figura 2.7 – Metabolismo do ácido propiônico 16

Figura 2.8 – Fontes de propionil-CoA 17 Figura 2.9 – Fórmula estrutural do ácido itacônico 19 Figura 2.10 – Células de E. coli recombinante produzindo P[3HB] 25

Figura 3.1 – Plasmídio pBHR68 29

Figura 3.2 – Etapas da produção de PHA’s 33 Figura 4.1 – Composição de 3HB e 3HV no copolímero obtido na cultura sem

suplementação com azeite de oliva 43

Figura 4.2 – Composição de 3HB e 3HV no copolímero obtido na cultura com

suplementação de azeite de oliva 43

Figura 4.3 – Comparação do crescimento celular entre as culturas com e sem

adição de ácido itacônico 47

Figura 4.4 - Comparação do crescimento celular entre as culturas com e sem

adição de ácido itacônico utilizando azeite de oliva como suplemento 47

(12)

Í

NDICE DE

T

ABELAS

Tabela 2.1 – Propriedades de P[3HB-co-3HV] conforme incorporação de valerato 8 Tabela 2.2 – Produção de PHA por diversas bactérias 21 Tabela 2.3 – Biodegradação de um filme de P[3HB-co-3HV] em diversos

ambientes 27

Tabela 4.1 – Efeito da concentração de ácido propiônico sobre o crescimento

celular de E. coli JM101 após 18 h de cultivo 38

Tabela 4.2 – Efeito da concentração de ácido itacônico sobre o crescimento

celular de E. coli JM101 após 18 h de cultivo 40

Tabela 4.3 - Efeito da utilização de ácido propiônico no crescimento celular e na

produção de PHA por E. coli recombinante 41

Tabela 4.4 – Efeito da suplementação do meio com ácido oléico no crescimento

celular e produção de PHA por E. coli recombinante 42

Tabela 4.5 – Efeito da suplementação do meio com ácido acético no crescimento

celular e produção de PHA por E. coli recombinante 44

Tabela 4.6 – Efeito da combinação de suplementos no crescimento celular e

produção de PHA por E. coli recombinante 45

(13)

R

ESUMO

Os polihidroxialcanoatos (PHA’s) são substâncias naturais acumulados no interior das células como forma de reserva de carbono e energia em condições particulares de crescimento. Há um significativo interesse no estudo dos PHA’s devido a seu valor comercial como termoplástico biodegradável sendo uma potencial alternativa para substituição da utilização dos plásticos derivados do petróleo. O poli[3-hidroxibutirato] é o PHA mais bem caracterizado e diversas bactérias são capazes de sintetizá-lo, porém, este biopolímero não apresenta propriedades industriais interessantes (duro e quebradiço). A incorporação de monômeros de valerato e produção do copolímero poli[3-hidroxibutirato-co-3-hidroxivalerato] (P[3HB-co-3HV]), resulta na formação de um polímero com características industriais mais interessantes. O precursor das unidades de valerato mais empregado é o ácido propiônico e este é adicionado ao meio de cultivo a fim de se produzir o copolímero. Entretanto, grande parte do ácido propiônico não é incorporado na forma de valerato, visto que este é utilizado em outras vias metabólicas. Com a finalidade de aumentar a conversão de ácido propiônico em valerato, foi estudado o efeito da adição de suplementos (azeite de oliva e ácido acético) e de um inibidor enzimático (ácido itacônico) na incorporação de valerato no copolímero P[3HB-co-3HV]. Foi utilizada para produção de P[3HB-co-3HV] a bactéria Escherichia coli JM101, abrigando os genes de biossíntese de PHA’s de Ralstonia eutropha (plasmídio pBHR68). Os cultivos foram realizados em agitador orbital por 48 horas a temperatura de 37ºC e agitação de 150 rpm em meio Luria Bertani contendo 20 g. L-1_{de glicose, 100mg.L}-1_de

ampicilina com ou sem a adição de ácido propiônico, suplementos ou inibidor. Os resultados mostram que a E.coli JM101 recombinante, contendo os genes de biossíntese de PHA’s de R. eutropha acumulou 61% de PHB. Na presença de ácido propiônico, foi acumulado 8,4% de PHA, com 20% de valerato incorporado no copolímero P[3HB-co-3HV]. Quando azeite de oliva foi utilizado como suplemento, a biomassa celular e o acúmulo de polímero aumentaram em 49% e 82% respectivamente, porém a porcentagem de valerato incorporada no polímero diminuiu. A adição de ácido acético no

(14)

Resumo

meio de cultivo diminuiu drasticamente a biomassa e o acúmulo de polímero não pode ser detectado. Nos cultivos onde se empregou o ácido itacônico como inibidor químico da enzima propionil-CoA carboxilase (PCC), principal enzima atuante no catabolismo do ácido propiônico, o crescimento bacteriano diminuiu e não se teve acúmulo de PHA. Os resultados sugerem que os ácidos: propiônico, acético e itacônico, são tóxicos para E. coli JM101. No entanto, o ácido propiônico ainda continua sendo o principal precursor das unidades de valerato no copolímero.

(15)

A

BSTRACT

Polyhydroxyalkanoates (PHA's) are polymeric compounds naturally accumulated inside bacterial cells, as carbon and energy storage. These polymers are produced by a number of wild bacterial strains under nutrient limitation. There is great interest in PHA’s, since their biodegradability and thermoplastic characteristics make then useful as an alternative to petrol derivated plastics. Poly-3-hydroxybutyrate (P3HB) is the most studied and characterized PHA. However, this biopolymer does not present. Incorporation of valerate monomers into polymer, results production of a copolymer poly [3-hydroxybutyrate-co-3-hydroxyvalerate] [P[3HB-co-3HV]] with more interesting industrial characteristics. Copolymer production demands for a 3-hydroxyvalerate (3HV) precursor. Propionic acid is usually added to cultivation media as precursor of 3HV units. Nevertheless, great part of propionic acid is utilized in others metabolic pathway than polymer biosynthesis. Aiming to increase the conversion of propionic acid in 3HV and as a consequence its incorporation the copolymer, it were studied the effect of the addition of supplements (olive oil and acetic acid) and enzymatic inhibitor (itaconic acid), over P[3HB-co-3HV] production by recombinant Escherichia coli JM101 strain, sheltering the plasmid pBHR68. The plasmid pBHR68 harbors the PHA biosynthesis genes (phaA, phaB and phaC) from Ralstonia eutropha. All cultivations were carried out in flasks shaken through an orbital shaker for 48 hours, at 37 ºC and 150 rpm, in LB medium, containing 20 g. L-1 glucose, and 100 mg.L-1_{ampicilin, with or without addition of propionic acid, supplements}

or inhibitor. The results showed that recombinant E. coli harboring PHA genes from R. eutropha were able to accumulate up to 61g% of the homopolymer P[3HB].in the biomass, in absence of precursor or supplementation. In presence of propionic acid (10 mM), 8,4 g% of the copolymer P[3HB-co-3HV], containing 20 mol% of 3HV, were produced. The supplementation of the medium containing propionic acid with olive oil, increased the biomass production and copolymer accumulation in 49% and 82%, respectively, but valerate molar percentage into copolymer decreased. Addition of acetic acid to cultivation medium sharply decreases biomass and no polymer could be detected. When the itaconic acid, a chemical inhibitor of propyonyl-CoA carboxilase (PCC), main

(16)

Abstract

operating enzyme in the catabolism of the propionic acid, was added to cultivation medium the bacterial growth diminished and no PHA accumulation was observed. The results suggest that propionic acid, acetic acids and itaconic acid are quite toxic to E. coli JM101. Anyway, propionic acid was effective in as precursor of valerate units into copolymer.

(17)

Capítulo

1

I

NTRODUÇÃO

Os polihidroxialcanoatos (PHA’s) são poliésteres biológicos acumulados por uma grande variedade de microrganismos, em condições desbalanceadas de crescimento, como reserva de carbono e energia (ANDERSON; DAWES, 1990, LEE, 1996a, POIRIER et al, 1995, STENBÜCHEL; FÜCHTENBUSCH, 1998, TSUGE, 2002).

Os PHA’s possuem importantes propriedades que permitem sua aplicação em diversas áreas. São termoplásticos, insolúveis em água, enantioméricos puros, não tóxicos, biocompatíveis e biodegradáveis (STENBÜCHEL; EVERSLOH, 2002). Esses poliésteres são uma alternativa para substituição da utilização dos plásticos derivados do petróleo.

Os plásticos de origem petroquímica são amplamente empregados devido fácil moldabilidade e alta resistência química, porém, são um problema ambiental. Devido ao alto peso molecular e a conformação da cadeia carbônica desses polímeros, a ação dos microrganismos no processo degradativo é dificultada, permanecendo no meio ambiente por um longo período de tempo.

A incineração e a reciclagem de plásticos não biodegradáveis são alternativas para se dar uma disposição final a esse material. Porém, essas alternativas não são muito viáveis, visto que o processo de combustão de plásticos é caro e perigoso, e a reciclagem se torna um processo difícil devido à diversidade de plásticos comercializados (JOHNSTONE, 1990).

O Brasil consome cerca de 7 milhões de toneladas de plásticos por ano (Revista Pharmanews, 2003). Esse consumo ainda é muito baixo quando comparado ao consumo nos países desenvolvidos, como os Estados Unidos que consomem cerca de 54 milhões de toneladas por ano, mas esse índice tende a aumentar. Em vista disso, muitos países

(18)

Introdução

estão investindo em programas para diminuir o lixo plástico, bem como no desenvolvimento de plásticos biodegradáveis (LEE, 1996a).

A substituição dos plásticos não biodegradáveis por polímeros biológicos é uma alternativa interessante para esse problema ambiental, mas requer estudos com a finalidade de aumentar a produção e diminuir custos do processo.

Os PHA’s são alvo de diversos estudos devido a suas propriedades materiais similares aos termoplásticos sintéticos usados atualmente e serem completamente degradados a água e dióxido de carbono por microrganismos presentes no ambiente.

Um dos inconvenientes na produção de PHA’s para aplicação comercial na produção de embalagens é o alto custo de produção. Estudos no desenvolvimento de melhores cepas produtoras, na utilização de substratos de baixo custo, na melhoria da eficiência dos processos fermentativos e de recuperação estão sendo realizados com o intuito de diminuir este custo.

A bactéria Escherichia coli, abrigando os genes de biossíntese de PHA’s de Ralstonia eutropha, é uma excelente opção para potencializar a produção destes biopolímeros. A E. coli recombinante apresenta características interessantes quando comparadas a outras bactérias como: crescimento acelerado a altas temperaturas, célula de fácil lise, poder de acúmulo de até 80% de seu peso seco em biopolímeros e ausência de despolimerases.

Dentre os diversos PHA’s produzidos, o mais bem caracterizado é o poli(3-hidroxibutirato) P[3HB]. Este foi o primeiro PHA a ser descoberto e diversos microrganismos são capazes de sintetizá-lo. O P[3HB] não apresenta propriedades industriais interessantes. Este polímero é duro e quebradiço, além de apresentar alta temperatura de fusão (MADISON e HUISMAN, 1999).

A incorporação de monômeros de valerato e produção do copolímero poli(3-hidroxibutirato-co-3-hidroxivalerato) P[3HB-co-3HV], resulta na formação de um polímero com características industriais mais interessantes, o qual é menos duro e quebradiço. O copolímero também é mais fácil de ser moldado, visto que apresenta menor temperatura de fusão, e pode ser usada para produção de filmes resistentes ao vapor d’água e gases, propriedade similar ao polipropileno (MARCHESSAULT, 1996).

(19)

Introdução

A composição do PHA depende do substrato e do microrganismo empregado. O precursor de valerato mais empregado é o ácido propiônico. A condensação de propionil-CoA e acetil-propionil-CoA forma cetovaleril-propionil-CoA, o qual sofre uma redução formando hidroxivaleril-CoA que juntamente com butiril-CoA, oriundo do metabolismo do carbono, são substratos para formação do copolímero poli(hidroxibutirato-co-hidroxivalerato).

O ácido propiônico em determinadas concentrações é tóxico para a bactéria, além de contribuir para o aumento do custo do processo fermentativo. O custo do ácido propiônico é o dobro do custo da glicose, em vista disso os custos relacionados a produção do copolímero é bem mais alta que a produção do homopolímero de butirato (LEE, 1996a).

Além disso, na produção do copolímero grande parte do ácido propiônico adicionado ao meio não é incorporada na forma de valerato. Parte do ácido é desviada para via catalítica do ácido propiônico e este é degradado a succinil-CoA, o qual é um composto intermediário do ciclo de Krebbs seguindo normalmente a via metabólica para produção de ATP.

A eficiência da conversão de substrato a polímero é muito importante. Estratégias metabólicas estão sendo utilizadas para atuar diretamente nas vias de produção do polímero e aumentar a conversão de substrato em biopolímero. Neste trabalho empregou-se como uma estratégia metabólica, a inibição de uma via metabólica capaz de desviar parte do ácido propiônico para a produção de energia, visando aumentar a conversão deste precursor de unidades de 3HV e como conseqüência sua incorporação ao copolímero.

Baseado nessa estratégia metabólica este trabalho apresenta como objetivo geral:

• Aumentar a incorporação de valerato no copolímero P[3HB-co-3HV], produzido por Escherichia coli recombinante, utilizando como substrato glicose e como precursor das unidades de valerato o ácido propiônico;

Objetivos específicos:

• Estudar a produção de copolímero P[3HB-co-3HV], em E. coli (recombinante) abrigando os genes de biossíntese de PHA’s de R. eutropha, utilizando como precursor o ácido propiônico;

(20)

Introdução

• Avaliar o efeito da adição de suplementos sobre a incorporação de valerato por E. coli recombinante;

• Alterar a via metabólica responsável pelo catabolismo de ácido propiônico através da utilização de um inibidor enzimático químico, a fim de se aumentar à incorporação de valerato no copolímero.

(21)

Capítulo

2

R

EVISÃO BIBLIOGRÁFICA

2.1 Definição de Polihidroxialcanoatos

Substâncias naturais acumuladas no interior das células, na forma de grânulos, como forma de reserva de carbono e energia em condições particulares de crescimento (Dawes e Senior, 1973).

2.2 Histórico dos Polihidroxialcanoatos

O primeiro polihidroxialcanoato a ser estudado foi o poli-3-hidroxibutirato P(3HB), o qual foi descoberto por Lemoigne por volta de 1926. Wallen e Rohdwedder em 1974 observaram a presença de P(3HB) e poli-3-hidroxivalerato em águas residuárias a partir de extração com clorofórmio (ANDERSON e DAWES, 1990).

Em 1983, Smet et al. relataram que Pseudomonas oleovorans cultivada em meio contendo n-octano acumulava grânulos parecidos com P(3HB), vistos em microscópio eletrônico, no entanto, os grânulos correspondiam a poliésteres de ácido 3-hidroxioctanóico.

As propriedades desses termoplásticos biodegradáveis permaneceram arquivadas até 1982, quando a Imperial Chemical Industrie (ICI) iniciou a primeira produção em escala industrial de PHA, o qual foi comercializado com o nome de Biopol.

Em meados da década de 90, teve início no Brasil o desenvolvimento de tecnologia para a produção de plásticos biodegradáveis e biocompatíveis empregando matéria-prima renovável pela agricultura, em especial derivada da cana-de-açúcar, a partir de um projeto cooperativo desenvolvido pelo Instituto de Pesquisas Tecnológicas (IPT), Copersucar e Universidade de São Paulo. Após um levantamento de

(22)

Revisão Bibliográfica

oportunidades, foi selecionado um grupo de polímeros da família dos polihidroxialcanoatos (PHA) que podem ser produzidos por bactérias em biorreatores a partir de alguns carboidratos (SILVA; RODRIGUES; GOMEZ, 2001).

2.3 Estrutura e Propriedades

Os PHA’s são poliésteres de vários hidroxiácidos sintetizados por bactérias gram-positivas e negativas de diferentes gêneros. A estrutura química geral desses poliésteres é mostrada na figura 2.1.

O CH (CH

C

₂

)

_n

C

R

O

100 - 30000

N = 1 R = hidrogênio Poli (3-hidroxipropionato) R = metil Poli (3-hidroxibutirato) R = etil Poli (3-hidroxivalerato) R = propil Poli (3-hidroxihexanoato) R = pentil Poli (3-hidroxioctanoato) R = nonil Poli (3-hidroxidodecanoato) N = 2 R = hidrogênio Poli (4-hidroxibutirato)

R = metil Poli (4-hidroxivalerato) N = 3 R = hidrogênio Poli (5-hidroxivalerato)

R = metil Poli (5-hidroxihexanoato) N = 4 R = hexil Poli (6-hidroxidodecanoato)

Figura 2.1 – Estrutura geral dos polihidroxialcanoatos.

Fonte: LEE, 1996a.

A polimerização acontece devido à ligação entre o grupamento carboxila de um monômero e o grupamento hidroxila de outro monômero, formando um éster.

Diferentes unidades monoméricas podem ser identificadas como constituintes de PHA’s em várias bactérias, no entanto, poucos polihidroxialcanoatos são produzidos em

(23)

quantidades suficientes para a caracterização e desenvolvimento de potenciais aplicações (LEE, 1996a).

Atualmente, aproximadamente 150 diferentes monômeros de PHA’s são conhecidos e estes se encontram formando homopoliésteres ou copoliesteres (STEINBÜCHEL; EVERSLOH, 2003), sendo que os copoliésteres são oriundos da ligação entre unidades monoméricas diferentes.

Os monômeros que constituem os PHA’s são divididos em duas classes: monômeros de cadeia curta (short-chain-length –-HAscl) e monômeros de cadeia média

(medium-chain-length –HAmcl). Unidades monoméricas de 3 a 5 carbonos são

classificadas como de cadeia curta e unidades de 6 a 14 carbonos como de cadeia média (TSUGE, 2002).

As variações no tamanho da cadeia polimérica e dos monômeros constituintes ampliam as propriedades dos PHA’s e suas potenciais aplicações (MADISON e HUISMAN, 1999). As propriedades físicas e mecânicas dos polihidroxialcanoatos, como: elasticidade, rigidez, temperatura de fusão, resistência à extensão, resistência a solventes orgânicos entre outras estão relacionadas com a composição monomérica dos polímeros (DU e YU, 2002).

Os PHA’s são termoplásticos biodegradáveis, insolúveis em água, enantioméricos puros, não tóxico, biocompatíveis, piezoelétricos e apresentam alto índice de polimerização. De acordo com essas características, esses biopolímeros podem ser aplicados em diferentes áreas (HOCKING e MARCHESSAULT, 1994).

A similaridade estrutural do PHB com o polipropileno atraiu a atenção de diversas indústrias visando sua potencial aplicação em substituição aos plásticos de origem petroquímica e na área médica, em que biodegrabilidade e biocompatibilidade são fatores importantes. O PHB e o polipropileno apresentam graus de cristalinidade semelhantes, porém o PHB apresenta menor resistência a solventes e maior resistência aos raios UV (HOLMES, 1985).

O PHB é um material rígido e quebradiço, o que o caracteriza como um polímero com propriedades elásticas pouco satisfatórias. Por outro lado, polímeros de cadeia média (mcl-PHA) são altamente elásticos. Estudos recentes nesta área vem desenvolvendo um novo tipo de copolímero, com unidades monoméricas de cadeia curta

(24)

e média, a partir de bactérias recombinantes (TSUGE, 2002). Esses copolímeros são mais dúcteis e de fácil moldagem quando comparados ao homopolímero PHB.

O poli (3-hidroxibutirato-co-3-hidroxihexanoato) (PHBHHx) é um exemplo de copolímero contendo unidades monoméricas de cadeia curta e média. Este composto apresenta propriedades similares ao polietileno de baixa densidade (DOI et al., 1995). Aeromonas caviae foi a primeira bactéria capaz de produzir tal polímero utilizando como substrato ácido alcanóico e diferentes óleos (KOBAYASHI et al., 1994).

A incorporação de unidades de valerato (3HV) ao P(3HB) resulta na formação do copolímero poli[3-hidroxibutirato-co-3-hidroxivalerato] (P[3HB-co-3HV]). O copolímero apresenta propriedades mais interessantes do ponto de vista comercial (BYROM, 1987), visto que a incorporação de valerato diminui os níveis de cristalinidade e o ponto de fusão do polímero. Tais mudanças acarretam na diminuição da rigidez e aumento da resistência ao impacto. A incorporação de 3HV entre 17 a 20 mol% permite a obtenção de um copolímero com melhor flexibilidade e resistência ao impacto (HOLMES, 1985). A tabela 2.1 apresenta algumas propriedades dos copolímeros conforme o índice de incorporação de valerato.

Tabela 2.1: Propriedades de P[3HB-co-3HV] conforme a incorporação de valerato

P(3HB-co-3HV) Ponto de

Fusão (ºC) Rigidez (GPA)

Resistência à pressão (Mpa) Resistência ao impacto (J/m) 3% mol de HV 170 2,9 38 60 9% mol de HV 162 1,9 37 95 14% mol de HV 150 1,5 35 120 20% mol de HV 145 1,2 32 200 25% mol de HV 137 0,7 30 400 P[3HB] 179 3,5 40 50 Polipropileno 170 1,7 34,5 45 Poliestireno 110 3,1 50 21

(25)

O copolímero P[3HB-co-3HV] é mais facilmente manuseado industrialmente, devido maior elasticidade e resistência à extensão, quando comparado ao homopolímero de 3HB, o que acarreta na utilização desse copolímero na confecção de diferentes produtos. A estrutura do copolímero é apresentada na figura 2.2.

igura 2.2 – Estrutura P[3HB-co-3HV].

Fonte: LEE, 1996a.

Hidroxibutirato (HB) Hidroxivalerato (HV) O C CH2 CH CH2 O CH3 O C CH2 CH CH3 O F

2.4 Aplicações dos PHA’s

Existe um significativo interesse no estudo dos PHA’s devido seu valor comercial como t

á um grande interesse industrial no copolímero P[3HB-co-3HV], visto que suas proprie

ermoplástico biodegradável (LUIZIER, 1992). Biopolímeros como P[3HB], P[3HB-co-3HV], P[4HB] entre outros, são considerados uma alternativa para substituição dos plásticos não biodegradáveis, oriundos de combustíveis fósseis e apresentam como vantagem o fato de serem produzidos por fontes de carbono renováveis (LEE e PARK, 2002).

H

dades físicas são bastante similares ao polipropileno (BYROM, 1987). Esse copolímero, conhecido comercialmente como Biopol, foi desenvolvido pela empresa “ZENECA Bio Products” (ICI) entre os anos de 1960 e 1970. Este foi utilizado na manufatura de filmes plásticos para revestimento de papel cartão, embalagens de alimentos e produtos moldados, como garrafas (LEE, 1996a). A companhia Monsanto adquiriu o processo de produção do copolímero em 1996 e recentemente este foi vendido a empresa Metabolix, Inc.

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Com a descoberta de novas características dos PHA’s ampliaram-se as áreas de aplicação e este está sendo utilizado na confecção de produtos como fraldas, absorventes femininos, frascos para cosméticos e copos, como é mostrado na figura 2.3.

Figura 2.3 – Frasco de shampoo e aparelho de barbear produzidos com P[3HB-co-3HV].

Fonte: http://www.designinsite.dk/htmsider/m0955.htm

Na área química, os PHA’s são utilizados como precursores da síntese de compostos opticamente ativos, uma vez que apresentam carbono quiral (DAWES e SENIOR, 1973).

Devido sua biodegrabilidade, os polihidroxialcanoatos podem ser utilizados na liberação controlada de drogas, hormônios, inseticidas e herbicidas. Devido sua biocompatibilidade, podem ser empregados no feitio de materiais osteossintéticos, suturas cirúrgicas e reparos de vasos sanguíneos (WANG e BAKKEN, 1998).

A partir das despolimerizações dos polihidroxialcanoatos são produzidos hidroxiácidos opticamente ativos. O ácido R-3-hidroxibutírico, produzido a partir de PHB, é utilizado na síntese de um medicamento antiglaucoma pela empresa Merck’s (REDDY et al. , 2003).

É relatado também a utilização de PHA’s como matéria prima para produção de tintas, verniz e solventes (REDDY et al. , 2003).

A aplicação de PHA’s em substituição aos plásticos de origem petroquímica ainda não é muito viável economicamente. O uso de plantas transgênicas seria uma opção para se diminuir o custo de produção, visto que produziriam alta biomassa e conseqüentemente altos índices de PHA’s.

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Na área médica é interessante o uso de PHA’s, visto que este “nicho” de mercado não consome o biopolímero em larga escala e o preço não é um fator limitante, como na indústria em geral.

Os PHA’s são mais utilizados no desenvolvimento de produtos aplicados ao setor cardiovascular. O P[3HB] está sendo empregado em cirurgias cardiovasculares para sutura do pericárdio sem formação de adesões entre o coração e o esterno (REDDY et al., 2003).

2.5 Biossíntese dos Polihidroxialcanoatos

Os polihidroxialcanoatos são sintetizados por uma variedade de microrganismos como forma de reserva de carbono e energia quando estes se encontram em um meio rico em carbono e deficiente em algum outro nutriente como: nitrogênio, fósforo, potássio e oxigênio (DAWES e SENIOR, 1973).

O tipo de PHA produzido depende da espécie da bactéria, das condições de cultura e da fonte de carbono (BYROM, 1987).

Geralmente, o substrato para produção de PHA’s é acetil-CoA. Tomando como exemplo a Ralstonia eutropha, em condições normais de crescimento essa bactéria catabolisa os carboidratos a piruvato, o qual é desidrogenado e convertido a acetil-CoA. Acetil-CoA entra no ciclo dos ácidos tricarboxílicos (TCA) e segue-se normalmente o catabolismo para produção de energia. Na limitação de algum nutriente, a entrada de acetil-CoA no ciclo dos ácidos tricarboxílicos tende a diminuir e esta é utilizada como substrato para produção de PHA’s (BRAUNEGG et al., 1998).

2.5.1 Biossíntese de P[3HB]

Um esquema da via de biossíntese de P[3HB], pode ser observada na Figura 2.4. Esta consiste de três reações catalisadas por enzimas distintas. A primeira reação, consiste na condensação de duas moléculas de acetil-CoA formando acetoacetil-CoA. A segunda reação é uma redução da acetoacetil-CoA a hidroxibutiril-CoA. A última reação é a polimerização dos monômeros de hidroxibutiril-CoA (MADISON e HUISMAN,1999).

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2.5.1.1 Enzimas envolvidas na Biossíntese de P[3HB]

2.5.1.1.1 3 –ß- Cetotiolase

A 3-ß- Cetotiolase catalisa a primeira reação da biossíntese de P[3HB], que consiste na condensação de duas moléculas de acetil-CoA originando acetoacetil-CoA (MADISON e HUISMAN,1999).

2 acetil – CoA acetoacetil – CoA + CoASH

Estudos feitos por Oeding e Schelegel em 1973 revelaram a existência de dois tipos de 3-ß-cetotiolase, cujas atividades estariam relacionadas com o substrato. Um tipo de enzima é ativa somente para substratos com quatro e cinco carbonos, já o outro tipo de enzima é ativa para substratos com cadeia carbônica variando de quatro a dez átomos. Os dois tipos de enzimas podem ser utilizados na biossíntese de P(3HB) (ANDERSON e DAWES, 1990). Glicose Acetil-CoA 3-Hidroxibutiril-CoA P(3HB) Acetoacetil-CoA ß-cetotiolase CoASH NADPH NADP Acetoacetil-CoA redutase PHA sintase CoASH

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2.5.1.1.2 Acetoacetil-CoA redutase

A conversão de acetoacetil-CoA a hidroxibutiril-CoA, segundo passo da síntese de P[3HB], é catalisada pela enzima acetoacetil-CoA redutase dependente de NAPH (MADISON e HUISMAN, 1999).

Acetoacetil-CoA + NADPH + H+_{hidroxibutiril-CoA + NADP}+

Como pode ser visto, a reação é NADPH dependente e este pode ser recuperado pela via das pentoses 6-fosfato ou pela reação envolvendo a isocitrato desidrogenase, enzima do ciclo dos ácidos tricarboxílicos (TCA).

2.5.1.1.3 PHA Sintase

Essa enzima é responsável pela polimerização das unidades de hidroxiacidos. A PHA sintase de Ralstonia eutropha é específica para D-enantiômeros e é ativa somente para incorporação de monômeros hidroxiácidos com quatro ou cinco carbonos (DOI et al., 1990).

A PHA sintase pode ser isolada em uma forma solúvel, quando não se tem acúmulo de PHA, e em forma insolúvel (grânulos de PHA) quando se tem um acúmulo de polímero (HAYWOOD et al., 1989). Na fase de acúmulo de PHA, a PHA sintase juntamente com outras proteínas atua na interface entre a superfície dos grânulos de PHA e o citoplasma celular (STEINBÜCHEL et al., 1995).

De acordo com a especificidade pelo substrato, são descritas três diferentes classes de PHA sintases do tipo I, II e III. As PHA sintases do tipo I incorporam unidades monoméricas, hidroxiácidos (HA) contendo 3 a 5 unidades de carbono; as do tipo II de 6 a 12 átomos de carbono; enquanto que as do tipo III incorporam HA de 3 a 5 átomos de carbono, porém difere estruturalmente da primeira no peso molecular (STEINBÜCHEL et al., 2003).

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2.5.1.2 Genes responsáveis pela Biossíntese de P[3HB]

As enzimas 3-ß-Cetotiolase, acetoacetil-CoA redutase e PHA sintase, responsáveis pela biossíntese de P[3HB], são codificadas pelos genes estruturais phbA, phbB e phbC, respectivamente. Em Ralstonia eutropha, esses genes estão organizados em um único operon (phbCAB), de acordo com a figura 2.5.

PHB polimerase Acetoacetil CoA

redutase ß-cetotiolase

Figura 2.5 – Genes responsáveis pela biossíntese de P[3HB] em Ralstonia eutropha.

Fonte: Adaptado de MADISON e HUISMAN, 1999

De acordo com a diversidade das vias de biossíntese de P[3HB], não é de se impressionar com as diversas organizações dos genes de biossíntese de PHA’s (pha) em diferentes microrganismos. Em bactérias como: Paracoccus denitrificans, Rhizobium meliloti e Z. ramigera, os genes phbAB e phbC se encontram separados (LEE, 1996c).

2.5.2 Biossíntese de P[3HB-co-3HV]

O copolímero de butirato e valerato é sintetizado a partir dos substratos: acetil-CoA e propionil-acetil-CoA (ALDOR et al, 2002). A produção de P[3HB-co-3HV] por R. eutropha requer a presença de substratos como propionato e valerato, precursores deste polímero. Estes compostos são degradados a propionil-CoA ou hidroxivaleril-CoA e na presença de outras fontes de carbono, como glicose ou frutose, formam P[3HB-co-3HV] (STEINBÜCHEL & PIEPER, 1992). A via de produção do copolímero utilizando como substrato glicose e como precursor ácido propiônico é apresentada pela Figura 2.6.

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Revisão Bibliográfica Glicose Propionato propionil-CoA 3-cetovaleril-CoA Acetil-CoA CoASH 3-hidroxibutiril-CoA acetoacetil-CoA acetoacetil-CoA redutase P[3HB] P[3HB-co-3HV] β-cetotiolase PHA sintase CoASH CoASH NADPH NADP NADPH NADP 3-hidroxivaleril-CoA TCA

Figura 2.6 – Esquema da via Metabólica da Produção de P[3HB-co-3HV].

Fonte: DOI et al, 1990.

A primeira etapa da via corresponde à condensação de duas moléculas de acetil-CoA ou a condensação de uma molécula de acetil-acetil-CoA com propionil-acetil-CoA, reação catalisada pela enzima ß-cetotiolase. O produto da reação são os compostos acetoacetil-CoA e cetovaleril-acetoacetil-CoA, os quais são reduzidos pela acetoacetil-acetoacetil-CoA redutase NADPH dependente a 3-hidroxibutiril-CoA e hidroxivaleril-CoA, respectivamente. Esses compostos são incorporados na cadeia polimérica pela PHA sintase ou polimerase (ALDOR et al., 2002).

O ácido valérico também é utilizado como precursor de valerato (unidades 3HV), sendo este incorporado ao polímero diretamente via valeril-CoA, o qual é oxidado a hidroxivaleril-CoA. O uso de ácido valérico proporciona uma maior incorporação de unidades 3HV ao copolímero quando comparado ao precursor ácido propiônico (DOI et al., 1987). No entanto, o ácido valérico é pouco utilizado devido seu odor desagradável.

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2.5.2.1 Ácido Propiônico

O ácido propiônico é o precursor de valerato mais empregado na biossíntese de poli [3HB-co-3HV]. Porém, este precursor apresenta algumas desvantagens. Uma primeira desvantagem é o fato do ácido propiônico ser mais caro que outras fontes de carbono, como a glicose. Uma outra desvantagem está relacionada à sua toxicidade, razão pela qual esse ácido é empregado na conservação de alimentos (STEINBÜCHEL e EVERSLOH, 2003).

Grande parte do ácido propiônico adicionado no meio de cultura não é convertida a monômeros de valerato, visto que esse ácido é catabolisado a ácido pirúvico ou succinil-CoA, os quais são compostos intermediários do metabolismo central. O ciclo do ácido metilcítrico (MCC) e a via do metilmalonil-CoA são as vias mais utilizadas para a oxidação do ácido propiônico em bactérias aeróbicas (LIU e STEINBÜCHEL, 2000). A Figura 2.7 apresenta esquematicamente a via de oxidação do ácido propiônico a succinil-CoA. Propionil CoA Metilmalonil CoA ATP ADP + Pi CO2

Propionil CoA carboxilase Biotina

BirA

Metilmalonil CoA mutase Coenzima Vitamina B12

Succinil CoA TCA

Figura 2.7 – Metabolismo do Ácido Propiônico.

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O ácido propiônico é convertido a propionil-CoA por diferentes enzimas, conforme a Figura 2.8.

Figura 2.8 – Fontes de propionil-CoA.

Fonte: STEINBÜCHEL e EVERSLOH, 2003.

Enzimas do tipo tioquinases, como: propionil-CoA sintetase de Salmonella entérica serovar Typhimurium, acetil-CoA sintetase de R. eutropha (VALENTIN et al., 2000) ou diversas coenzimas-A transferases, como: propionil-CoA transferase de Clostridium propionicum (SCHWEIGER e BUCKEL, 1984) podem catalisar a conversão do ácido propiônico a propionil-CoA. Algumas destas enzimas são utilizadas em técnicas de engenharia metabólica a fim de se potencializar a produção de P[3HB-co-3HV] a partir unicamente de ácido propiônico ou este combinado à outra fonte de carbono.

2.5.2.2 Enzima Propionil-CoA Carboxilase (PCC)

A enzima propionil-CoA carboxilase catalisa a conversão do propionil a metilmalonil-CoA de acordo com a reação abaixo:

Propionil-CoA + HCO3- + ATP Metilmalonil-CoA + ADP + Pi

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Essa enzima atua no catabolismo de ácidos graxos com número ímpar de carbono e alguns aminoácidos (RAWN, 1983). A propionil-CoA carboxilase participa também da assimilação de CO2 em organismos autotróficos, como Chloroflexus

aurantiacus (STRAUSS e FUCHS, 1993). Além disso, esta enzima é utilizada por alguns organismos para assimilação de propionato. A participação dessa enzima na assimilação de propionato em Rhodospirillum rubrum é bem descrita, sendo que nesse microrganismo a PCC está envolvida também no ciclo do citramalato (BERG et al., 2000). Em M. extorquens a PCC é requerida para oxidação de acetil-CoA a glioxilato (KOROTKOVA et al., 2002). Em humanos, a deficiência da PCC causa distúrbios no metabolismo dos ácidos graxos e aminoácidos (VARGAS et al., 2002).

Estruturalmente, a propionil-CoA carboxilase é composta de duas subunidades: α e ß. É na subunidade alfa de 74 kDa que ocorre a ligação covalente do cofator biotina à enzima. A subunidade ß tem peso molecular de 55 kDa e não tem sua função descrita (VARGAS et al., 2002).

A vitamina solúvel biotina atua como cofator da propionil-CoA carboxilase, assim como das enzimas piruvato carboxilase (PC), metilcrotonil-CoA carboxilase (MCC) e acetil-CoA carboxilase. A eficiência da atuação dessas enzimas é dependente da presença da vitamina. A adição da biotina a essas enzimas é catalisada por biotinas ligases, as quais são conhecidas como BirA em procariotos e holocarboxilase sintetase (HCS) em eucariotos (VARGAS et al., 2002).

A proteína BirA é a catalisadora da ligação da vitamina biotina à enzima propionil-CoA carboxilase em Escherichia coli, conforme pode ser visualisado na Figura 2.7.

2.5.2.3 Estratégias para produção de P[3HB-co-3HV]

Como foi descrito anteriormente, para biossíntese do copolímero, se faz necessário à utilização de um precursor, como o ácido propiônico. Contudo, grande parte do ácido propiônico adicionado ao meio é utilizado para a produção de energia. Por esta razão, estratégias metabólicas são utilizadas com a finalidade de desviar o fluxo do ácido propiônico proporcionando uma maior incorporação do mesmo ao polímero na forma de valerato. Dentre as estratégias metabólicas mais empregadas está a utilização de suplementos no meio, como ácido oleico e acético. Sabe-se que o ácido itacônico é

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inibidor da propionil-CoA carboxilase (PCC), principal enzima responsável pelo catabolismo do ácido propiônico (BERG et al., 2002).

2.5.2.3.1 Ácido Itacônico

Ácido itacônico ou metileno succinato é um composto insaturado, cuja fórmula estrutural é apresentada na figura 2.9 abaixo.

CH2

COOH CH2

C COOH

Figura 2.9 – Fórmula estrutural do ácido itacônico.

Diversas são as aplicações do ácido itacônico e dos ésteres originados a partir do mesmo. Estes podem ser usados como desodorantes já que reagem com odores alcalinos ou ácidos, produzidos por amônio, amina ou hidrogênio sulfídrico. Baseado nessa propriedade desodorante, o ácido itacônico pode ser utilizado na confecção de filmes de papéis ou plásticos (Jinan huaming biochemistry homepage).

Ésteres derivados do ácido itacônico podem ser usados como lubrificantes, plasticidas, selantes, resinas e tintas. Outros derivados desse ácido são usados na medicina, na indústria de cosméticos e na indústria agrícola como herbicidas (Jinan huaming biochemistry homepage).

Experimentos realizados Berg et al, 2002, revelaram que o itaconato inibiu a atividade da enzima propionil-CoA carboxilase (PCC) quando adicionado ao extrato celular da bactéria Rhodospirillum rubrum . A PCC é responsável pela primeira etapa do catabolismo do ácido propiônico.

O itaconato também inibe o ciclo do glioxilato, o qual é responsável pela assimilação de acetato, quando este é fornecido como fonte de carbono para a bactéria. O itaconato atua como inibidor competitivo da isocitrato liase (ICL), enzima responsável pela clivagem do isocitrato em glioxilato e succinato, primeira etapa do ciclo do glioxilato (WILLIAMS et al., 1971).

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2.6 Microrganismos Produtores de PHA’s

Dentre as mais de 300 bactérias diferentes, capazes de sintetizar PHA's, apenas poucas estão sendo empregadas para produção destes biopolímeros. Dentre essas bactérias estão: Ralstonia eutropha, Alcaligenes latus, Azotobacter vinelandii, algumas cepas de bactérias metilotrófias, Pseudomonas oleovorans, Escherichia coli recombinante e Klebsiella aerogenes recombinante (LEE, 1996a).

Estas bactérias foram selecionadas para produção por que acumulam quantidades elevadas de sua massa celular seca em PHA em um período curto de cultivo, o que resulta em uma alta produtividade (LEE, 1996a).

O microrganismo escolhido para produção industrial do biopolímero tem uma influência crítica sobre os custos de produção (BYROM, 1987). A seleção do microrganismo deve levar em consideração a capacidade do mesmo em utilizar fontes baratas de carbono, ter alta velocidade de crescimento e síntese de polímero, além de alto acúmulo de PHA, em relação à massa celular seca (LEE, 1996b).

O elevado custo de produção de PHA também se deve ao processo de extração do mesmo. Para que o processo seja viável, é necessário que a cepa seja capaz de acumular pelo menos 60% de sua massa celular em polímero. Isto elimina as bactérias Gram-positivas e aquelas que não são capazes de acumular porcentagens elevadas de polímero (RAMSAY et al, 1990). Na Tabela 2.2 apresenta-se a produção de PHA's por diversas bactérias.

As bactérias empregadas na produção de PHA's podem ser divididas em 2 grupos, baseado nas condições de cultivo requeridas para produção. O primeiro grupo de bactérias requer excesso de carbono e limitação de algum nutriente como nitrogênio, fósforo, magnésio, potássio, oxigênio ou enxofre para a síntese do polímero. Fazem parte desse grupo Ralstonia eutropha, Protomonas extorquens, Pseudomonas oleovorans e outras. O outro grupo de bactérias não requer limitação de nutriente para síntese de PHA e tem-se como exemplo Escherichia coli recombinante, cepa mutante de Az. Vinelandii (LEE, 1996a).

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Tabela 2.2: Produção de PHA por diversas bactérias

Microrganismo Fonte de Carbono PHA Conteúdo de PHA (%w/v)

Gluconato PHB 46-85 Propionato PHB 26-36 Octanoato PHB 38-45 Bacillus megaterium QMB 1551 Glicose PHB 20 Klebsiella aerogenes recombinants Melaço PHB 65

Methylobacterium rhdesianum

MB1267 Frutose/ metanol PHB 30 M extorquens(ATCC5566) Metanol PHB 40-46 Pseudomonas aeruginosa Eutorbio e óleo de ricínia PHA 20-30 Metanol P(3HB) 0.02 Pentanol P(3HB) 55 Gluconato PHB 1.1 - 5.0 Octanoato PHB 50-68 P.putida Gp104 Octanoato PHB 14-22 Óleo de Palma PHA 37

Ácido laurico PHA 25 Ácido Miristíco PHA 28 Ácido Óleico PHA 19 P.putida BM01 Ácido decanoico 5POHV 15-35 Sphaerotilus natans Glicose PHB 40

P.oleovorans

P. putida Alcaligenes eutrophus

P.denitrificans

Fonte: Adaptado de REDDY et al., 2003

2.6.1 Alcaligenes

Alcaligenes latus sintetiza PHA associada ao crescimento, no entanto esta cepa é capaz de acumular uma maior quantidade de PHA em condições de limitação de algum nutriente (CHOI e LEE, 1999). A desvantagem desse microrganismo é sua sensibilidade aos precursores utilizados na produção de poli [3HB-co-3HV] (Ramsay et al., 1990).

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2.6.2 Azotobacter

Microrganismos desse gênero são capazes de utilizar sacarose e glicose como substrato. Page (1992) produziu P[3HB-co-3HV] utilizando como substrato uma combinação de sais e melaço de beterraba a partir de uma cepa mutante de Azotobacter vinelandii. A utilização do melaço de beterraba como fonte de carbono reduziria a metade o custo de produção quando comparado à utilização da glicose como fonte de carbono. Uma desvantagem das bactérias desse gênero é que, paralelamente à produção de PHA ocorre a síntese de um polissacarídeo, diminuindo a produtividade do polímero (BYROM, 1987).

2.6.3 Pseudomonas

As bactérias desse gênero são capazes de acumular PHA’s de cadeia média. Pseudomonas oleovorans é um exemplo de bactéria que sintetiza PHA’s de cadeia média utilizando as mais variadas fontes de carbono, incluindo álcoois e ácidos alcanóicos. O tipo de substrato empregado interfere no crescimento celular, formação de PHA e composição do copolímero (DU e YU, 2002).

Estudos relatam que P. putida e P. aeruginosa são capazes de acumular PHA’s a partir de glicose e outros açúcares visto que elas são capazes de sintetizar monômeros de cadeia media a partir de acetil-CoA. P. oleovorans é uma exceção dentre o gênero Pseudomonas devido ser incapaz de sintetizar PHA’s, a partir de carboidratos (HUIJBERTS et al., 1992).

2.6.4 Ralstonia eutropha

A Ralstonia eutropha é um dos microrganismos mais estudados e aplicados para produção de PHA’s, pela sua facilidade de utilização de fontes renováveis de carbono e habilidade de acumular até 80% de seu peso seco em polímero. A produção de polímero por R. eutropha é realizada em duas fases, uma fase inicial de crescimento não limitado visando a produção de massa celular, seguida de uma fase limitada em algum nutriente, exceto carbono, com acúmulo de polímero (BYROM, 1987).

Industrialmente, a R. eutropha é uma bactéria amplamente empregada para produção de PHA’s, em especial P[3HB] e P[3HB-co-HV] (LEE et al., 1999). Na produção de copolímero, ácido propiônico é adicionado no meio durante a fase de acúmulo e a

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proporção de valerato incorporada depende da razão de alimentação ácido propiônico/açúcar. Essa bactéria também é capaz de acumular polímero contendo monômeros de 4 hidroxibutirato [4HB] e 5 hidroxivalerato [5HV], conforme o substrato utilizado (ANDERSON e DAWES, 1990).

A cepa nativa de R. eutropha H16 não utiliza glicose nem sacarose como fontes de carbono. A cepa utilizada para produção industrial de PHA’s é a mutante DSM545, a qual consome glicose como fonte de carbono (MADISON e HUISMAN, 1999). A R. eutropha 290/sac, também mutante, é capaz de consumir sacarose (FAVA, 1997).

Diversos estudos estão sendo realizados a fim de se diminuir o custo de produção dos PHA’s utilizando R.eutropha como microrganismo produtor. MARANGONI (2000) testou diversas fontes de carbono na produção de P[3HB-co-3HV], dentre as fontes testadas estão: lactose hidrolisada, galactose, frutose, glicose e açúcar invertido. O crescimento celular em açúcar invertido, glicose e frutose foram semelhantes e mostraram ser as fontes de carbono nas quais se tem as maiores velocidades de crescimento específica. SQUIO e colaboradores (2003) utilizaram suplementos para a produção de copolímero e observaram que a suplementação com ácido linoleico/oléico (2:1) aumentou em 11% a produção de polímero.

2.6.5 Produção a partir de Plantas

Recentemente, estudos variados estão sendo realizados a fim de se implementar a produção de P[3HB] em plantas. A produção de PHA em escala agronômica aumentaria a síntese dos biopolímeros para milhões de toneladas sendo infinitamente vantajosa quando se compara à produção por processo fermentativo. Potencialmente, os PHA’s poderiam ser produzidos a um custo de US$ 0,20 a 0,5/kg, caso fossem sintetizados por plantas a uma porcentagem variando entre 20 a 40% de seu peso seco, podendo competir com os plásticos oriundos do petróleo (REDDY et al., 2003).

Arabidopsis thaliana foi a primeira planta escolhida para estudos da expressão dos genes de biossíntese de PHA’s (MADISON e HUISMAN, 1999). Como a enzima 3-cetoacil-CoA tiolase está presente na A. thaliana, somente os genes phaB e phaC de R. eutropha foram inseridos na planta, o que resultou em acúmulo de grânulos de PHB no citoplasma , vacúolo e núcleos, porém, a crescimento da planta foi afetado. A expressão de todos os genes phaCAB no plastídeo de A. thaliana melhorou o sistema de produção. O máximo acúmulo de PHA foi 14% em peso seco (NAWRATH et al., 1994). Nos

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plastídeos o fluxo de carbono á alto e conseqüentemente tem-se alta concentração de acetil-CoA, o que seria uma hipótese para se ter melhorado a produção de PHB sem causar defeitos na planta (MADISON e HUISMAN, 1999; REDDY, 2003).

As plantas oleaginosas são interessantes para a síntese de PHA’s, visto que o PHB e o óleo são derivados da acetil-CoA. Estratégias utilizando engenharia metabólica podem ser empregadas para deslocar a acetil-CoA apenas para produção de PHB, diminuindo a produção de óleo. Outras plantas testadas para produção de PHA’s são Gossypium hirsutum (algodão) e Zea mays (milho). Empresas como Monsanto (USA) e Zeneca (UK) estão investindo em estudos para produção de PHA’s a partir de plantas, como soja (REDDY, 2003).

2.6.6 Escherichia coli recombinante

Cepas de Escherichia coli abrigando os genes de biossíntese de PHA’s de Ralstonia eutropha são empregadas com freqüência para produção de P[3HB] com alto conteúdo de PHA e alta produtividade. Diversos plasmídios foram desenvolvidos a fim de se produzir PHA em E. coli (LEE, 1996a).

A produção de P[3HB-co-3HV] por E. coli recombinante é considerada difícil visto que essa bactéria não utiliza o ácido propiônico com eficiência. Entretanto estudos recentes empregando cepas mutantes de E. coli ou ácido acético e oléico como indutor na cultura têm sido bem sucedidos (LEE, 1999).

E. coli é capaz de utilizar diversas fontes de carbono, incluindo glicose, sacarose, lactose e xilose. Isso representa uma potencial redução no custo de produção de PHA’s pela utilização de substratos baratos, como: melaço, soro de leite e hemicelulose hidrolisada (LEE e CHANG, 1995).

FONSECA (2003) utilizando E. coli abrigando os genes de biossíntese de PHA’s de R. eutropha (plasmídio pBHR68), testou diferentes combinações de fontes de carbono em diversas concentrações, através de planejamento fatorial, e verificou que a combinação de substratos soro de leite (5%), óleo de soja (1,5%) e amido de milho hidrolisado (5%), fornecem uma massa celular em torno de 1,9 g.L-1_{, sendo que 50% da}

massa era de PHB.

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dos grânulos de PHA é menor a medida que as células são facilmente lisadas (STEINBÜCHEL e SCHLEGEL, 1991; WANG e BAKKEN, 1998; MADISON e HUISMAN, 1999). A Figura 2.10 mostra células de E. coli produzindo P[3HB].

Figura 2.10 – Células de E. coli recombinante produzindo P[3HB].

Fonte: Metabolix homepage

Uma outra vantagem da E. coli é o fato desta bactéria ter seu genoma e fisiologias bem caracterizadas. Isso oferece vantagens para manipulação genética e desenvolvimento de estratégias de engenharia metabólica (ESCHENLAUER et al., 1996).

O custo da produção de PHA usando a produtora natural R. eutropha é de US$16/kg. Alguns estudos mostram que utilizando E. coli recombinante o custo de produção pode ser reduzido para US$ 4/kg. Sendo assim, o emprego de E.coli recombinante pode ser considerado promissor para se minimizar custos na produção de PHA (LEE, 1996a).

2.7 Degradação de PHA’s

Além da síntese, a degradação intracelular dos polihidroxialcanoatos é de fundamental importância para o metabolismo dos microrganismos produtores (KAWAGUCHI et al, 1992). A PHA despolimerase é a enzima que catalisa a primeira etapa da degradação, tendo sido estudada em microrganismos como: Bacillus megaterium, Zoogloea ramigera e Ralstonia eutropha (SAITO et al, 1995).

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O gene que codifica para PHA despolimerase em Pseudomonas aeruginosa (phaD) se encontra entre dois genes phaC1 e phaC2 (TIMM e STEINBÜCHEL, 1992). Em R. eutropha, o gene phaZ, codifica para PHA despolimerase. A expressão deste gene em Escherichia coli resultou na degradação de grânulos de PHA (SAEGUSA et al, 2001).

Sugere-se que o mecanismo de degradação dos grânulos de PHA em R. eutropha é o seguinte: inicialmente a enzima PHA despolimerase, catalisa a despolimerização do polímero P[3HB] a ácido D(-)-3-hidroxibutírico. Em seguida, este composto é oxidado a acetoacetato pela enzima 3-hidroxibutirato desidrogenase NAD+ dependente. A molécula de acetoacetato é convertida a acetoacetil-CoA pela acetoacetil-CoA sintase. Em condições de cultivo balanceada, os altos níveis de NADH e acetoacetato podem inibir a ação da enzima 3-hidroxibutirato desidrogenase, cessando a despolimerização do P(3HB) (STEINBÜCHEL e SCHLEGEL, 1991).

Quando o microrganismo encontra-se em meio rico em energia (excesso de carbono), o alto nível de NADH inibe o ciclo dos ácidos tricarboxílicos bem como a despolimerização de PHA. A diminuição da concentração de coenzima A livre (CoA) favorece a atividade da β-cetotiolase e a síntese de P[3HB] (BYROM, 1987).

2.8 Biodegradabilidade

Biodegradabilidade significa capacidade de um material ser degradado sob a ação de organismos vivos. A "degradação" (passagem de um estado de referência a um estado degradado) leva uma modificação estrutural do material caracterizado por uma diminuição de suas qualidades e desempenho.

Na realidade, além dos organismos vivos, é necessário levar em consideração o biótopo do conjunto (orgânico, mineral e climático) necessário para que a biodegradação ocorra. Biótopo é o meio complexo onde ocorrem as reações de biodegradação. Nele, devem ser considerados todos os parâmetros físicos (temperatura, pressão, ação mecânica dos ventos, chuva e neve, de alagamentos, ação da luz), a composição química da água, do ar e do solo, além dos parâmetros biológicos (ação dos animais, vegetais e microorganismos). Todos os parâmetros são interdependentes. Por exemplo, os microrganismos não podem estar ativos a não ser em condições físicas, químicas e biológicas bem particulares.

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Os microrganismos presentes em diversos ambientes na natureza excretam enzimas extracelulares como PHA-hidrolases e PHA-despolimerases, as quais são responsáveis pela degradação do PHA (MADISON e HUISMAN, 1999). A degradação enzimática do polímero é uma reação heterogênea que envolve duas etapas: adsorção e hidrólise. A etapa inicial consiste na adsorção da enzima na superfície do polímero, a etapa subseqüente consiste na hidrólise das cadeias poliméricas pelo sítio ativo das enzimas (SUDESH et al., 2000).

A degradação de P[3HB] e P[3HB-co-3HV] ocorre em sistemas aeróbios e anaeróbios, sendo que em ambientes aeróbios os produtos finais da degradação são dióxido de carbono, água e húmus. Em condições anaeróbias, metano também é produzido (LUIZIER, 1992).

A velocidade de biodegradação dos polímeros depende de fatores como: área superficial, atividade microbiana, ambiente disponível, pH, temperatura, nível de mistura e presença de outros materiais nutrientes (SUDESH et al., 2000).

A Tabela 2.3 apresenta o tempo necessário para a degradação completa de um filme de 1mm de P[3HB-co-3HV] em diferentes ambientes.

Tabela 2.3: Biodegradação de um filme de P[3HB-co-3HV] em diversos ambientes.

Ambiente Número de semanas necessárias para 100% de perda de massa Ambiente anaeróbio 6 Sedimentos estuários 40 Ambiente aeróbio 60 Solo 75 Agua do mar 350 Fonte: LUZIER, 1992.

A degradação microbiana de PHA’s no solo é favorecida com o aumento da temperatura, sendo que o copolímero P[3HB-co-3HV] tende a degradar mais rapidamente do que o homopolímero P[3HB] (MERGAERT et al., 1993).

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Capítulo

3

M

ATERIAL E

M

ÉTODOS

3.1 Linhagens e plasmídios empregados

3.1.1 Microrganismo

Foi utilizada para os cultivos a bactéria Escherichia coli linhagem JM101. Esta linhagem foi escolhida devido a sua capacidade de acumular polímero ser maior que outras linhagens comerciais já testadas por FONSECA (2003).

A bactéria sem plasmídio foi estocada em solução 0,9% de NaCl à temperatura ambiente. As bactérias ancorando o plasmídio foram estocadas em meio Luria Bertani (LB) sólido, acrescido de uma solução de ampicilina, à temperatura de 4 ºC. Conforme a utilização, essas colônias eram repicadas em meio LB líquido contendo ampicilina.

3.1.2 Plasmídio

O plasmídio utilizado foi o pBHR68, o qual possui as seguintes características relevantes para este estudo: ancora o gene de resistência a ampicilina (Ampr_{) e os genes}

de biossíntese de polihidroxialcanoatos de Ralstonia eutropha (phaA, phaB e phaC), esboçado na Figura 3.1. Este plasmídio foi cedido pelo Dr. Alexander Steinbüchel, do Instituto de Microbiologia da Westfälische Wilhelms Universität Münster, Münster, Alemanha. A suspensão estoque do plasmídio foi armazenada à temperatura de -20 ºC.

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Material e Métodos

Figura 3.1 – Plasmídio pBHR68, ancorando os genes Ampr e phaA, phaB e phaC de R.

eutropha.

3.2 Meios de cultivos e soluções empregados

3.2.1 Meio Luria Bertani – LB

Para os cultivos, preparação do inoculo, preparação de células competentes e estocagem da E. coli foram utilizados o meio Luria Bertani (LB) sólido e líquido, cuja composição é a seguinte: 10 g.L-1_{de triptona, 5g.L}-1_{de extrato de levedura, 5 g.L}-1_de

NaCl, com adição de 15 g.L-1_{de agar para o meio sólido (BERTANI,1951). Quando}

apropiado foi adicionado o antibiótico ampicilina ao meio na concentração descrita para cada ensaio.

3.2.2 Solução de ampicilina

Para seleção e cultivo da E.coli recombinante contendo o plasmídio pBHR68 foi acrescido ao meio LB uma solução de ampicilina na concentração de 100 mg. L-1_{. Foram}

preparados 10 mL de uma solução estoque de ampicilina, na concentração de 100 g.L-1_.

O antibiótico foi dissolvido em água ultra pura esterilizada, sob condições assépticas, e a solução foi estocada em microtubos esterilizados à temperatura de -20 ºC.

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3.2.3 Tampão Tris-HCl, 1M, pH=8,0

Foram pesados 12,1 g de tris (hidroximetil) amino metano e dissolvidos em 50 mL de água destilada e filtrada. A solução resultante foi levada ao pHmetro. Com agitação constante foi adicionado ácido clorídrico concentrado, gota a gota, até que a solução alcançasse o pH=8,0. Completou-se o volume da solução para 100 mL, com água destilada e filtrada.

3.2.4 Solução de EDTA 0,5M, pH=8,0

Pesou-se 18,6 g do sal dissódico do ácido etileno diamino tetraacético Na2EDTA e

completou-se o volume até 100 mL com uma solução de NaOH 0,5M. O pH final deverá ser aproximadamente igual a 8,0.

3.2.5 Tampão Tris-EDTA (TE)

Foram misturados 1 mL de tampão tris-HCl (1 M, pH=8,0) e 0,2 mL de EDTA (0,5 M, pH=8,0). O volume da mistura foi completado com água destilada filtrada até 100 mL e posteriormente esterilizada, em autoclave, a 121º C / 1atm/ 15 min.

3.2.6 Solução de cloreto de cálcio (CaCl2)

Foram pesados 1,11 g de CaCl2, dissolvidos em 100 mL de água destilada filtrada

e esterilizada.

3.2.7 Solução estoque de glicose

Como fonte de carbono foi utilizada glicose, a qual foi adicionada ao meio LB na concentração de 20g.L-1_{. A solução estoque de glicose adicionada ao meio, foi preparada}

na concentração de 400 g. L-1 e esterilizada separadamente em autoclave (temperatura e 121º C / 1atm/ 15 min.), a fim de se evitar a caramelização da mesma.

3.2.8 Suplementos

Com o objetivo de avaliar o efeito da adição de suplementos sobre a incorporação de valerato no copolímero foram empregados o ácido acético e ou azeite de oliva, os quais foram adicionados ao meio LB antes da esterilização do mesmo. Nos experimentos realizados neste estudo utilizou-se 10 mM de ácido acético no meio de cultura.

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3.2.9 Inibidor Enzimático

O ácido itacônico (Sigma I29204) foi empregado nos estudos de inibição enzimática “in vivo” da PCC, responsável pelo catabolismo do ácido propiônico. A concentração de ácido utilizada nos cultivos para produção de PHA’s foi de 5 mM.

3.3 Metodologias Empregadas

3.3.1 Obtenção de Escherichia coli recombinante

Para obtenção da bactéria recombinante, a linhagem nativa de E. coli JM101 foi submetida à preparação de células competentes, transformação e seleção. Essas etapas estão descritas nos itens a seguir.

3.3.1.1 Preparação de Células Competentes

O procedimento empregado para preparação das células está baseado no método descrito por HANAHAN (1983). Uma alçada de suspensão estoque de E. coli foi transferida para meio agar LB e cultivada por aproximadamente 18 h a 37º C. Com o auxílio de um palito de madeira estéril foi transferida uma única colônia isolada da bactéria para um tubo contendo 5 mL de meio LB. O tubo foi incubado por aproximadamente 3 h, ou até o caldo de cultivo atingir a absorbância entre 0,5 e 0,6, sob agitação de 150rpm e temperatura de 37ºC. Transferiu-se 1 mL do caldo de cultivo para um microtubo plástico (2 mL) estéril e centrifugou-se a 4000 rpm, 4 ºC por 10 min. O precipitado foi ressuspenso em 1 mL de uma solução de CaCl2 0,1 M gelado e repetiu-se

a centrifugação nas mesmas condições. Novamente o precipitado foi ressuspenso com 0,1 mL de CaCl2 0,1 M gelado.

3.3.1.2 Transformação de Células Competentes

A transformação das células (E.coli) foi realizada de acordo com metodologia descrita por SAMBROOK e colaboradores (1989). Em 200 μL de suspensão de células competentes, preparadas conforme foi descrito no item 3.3.1, foi adicionado 2 μL da solução de DNA plasmidial (5 a 10 μM). O recipiente contendo células e plasmídio foi incubado em banho de gelo por 30 min e em seguida em banho Maria a 42 ºC por 45 segundos. Novamente resfriou-se a mistura em banho de gelo por 5 min e adicionou-se 800 μL de meio LB. Incubou-se a 37 ºC, sob agitação de 150 rpm, durante uma hora, para recuperação das células. Centrifugou-se a 4000 rpm por 10 min à temperatura