UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS INSTITUTO DE BIOLOGIA
KAREN CAROLINE MINORI VIEIRA
MODULAÇÃO DOS NÍVEIS DA PROTEÍNA LIGANTE DE ÁCIDOS GRAXOS TIPO 4 (FABP4) DE MACRÓFAGOS INFECTADOS COM Leishmania (Leishmania)
amazonensis
CAMPINAS (2018)
KAREN CAROLINE MINORI VIEIRA
MODULAÇÃO DOS NÍVEIS DA PROTEÍNA LIGANTE DE ÁCIDOS GRAXOS TIPO 4 (FABP4) DE MACRÓFAGOS INFECTADOS COM Leishmania (Leishmania)
amazonensis
Dissertação apresentada ao Instituto de Biologia da Universidade Estadual de Campinas como parte dos requisitos exigidos para a obtenção do Título de Mestra em Biologia Animal na área de Relações Antrópicas, Meio Ambiente e Parasitologia.
Orientador: Prof. Dr. Danilo Ciccone Miguel
CAMPINAS (2018) ESTE ARQUIVO DIGITAL CORRESPONDE À VERSÃO FINAL DA DISSERTAÇÃO DEFENDIDA PELA ALUNA KAREN CAROLINE MINORI VIEIRA E ORIENTADA PELO PROF. DR. DANILO CICCONE MIGUEL.
Ficha catalográfica
Universidade Estadual de Campinas Biblioteca do Instituto de Biologia Mara Janaina de Oliveira - CRB 8/6972
Informações para Biblioteca Digital
Título em outro idioma: Modulation of levels of fatty acid binding proteins type 4
(FABP4) from macrophages infected with Leishmania (Leishmania) amazonensis
Palavras-chave em inglês: Leishmania
Macrophages
Fibroblasts Adipocytes A-FABP
Área de concentração: Relações Antrópicas, Meio Ambiente e Parasitologia Titulação: Mestra em Biologia Animal Banca examinadora:
Danilo Ciccone Miguel Denise Costa Arruda Fernanda Janku Cabral
Data de defesa: 26-01-2018
Programa de Pós-Graduação: Biologia Animal
Identificação e informações acadêmicas do(a) aluno(a)
Agência(s) de fomento e nº(s) de processo(s): FAPESP, 2015/17902-2 ORCID: http://orcid.org/0000-0003-2604-5250
Campinas, 26 de janeiro de 2018.
COMISSÃO EXAMINADORA
Prof. Dr. Danilo Ciccone Miguel
Profa. Dra. Denise Costa Arruda
Profa. Dra. Fernanda Janku Cabral
A Ata de defesa com as respectivas assinaturas dos membros da Comissão Examinadora encontra-se no SIGA/Sistema de Fluxo de Dissertação/Tese e na Secretaria do Programa de Pós-Graduação em Biologia Animal.
Dedico esta dissertação de mestrado à minha mãe, Rosana, que sempre fez de tudo para que eu pudesse chegar mais longe do que meus sonhos me permitiam...
AGRADECIMENTOS
Ao fim dessa jornada, não posso escrever uma palavra sequer dessa dissertação sem agradecer à minha mãe. Bem mais do que uma progenitora, você sempre foi minha amiga, companheira e a mulher mais guerreira que eu já conheci, sempre tirando dinheiro de onde não tinha para investir na minha educação e formar uma profissional em um mundo novo na nossa família, de origem humilde. Obrigada mamãe! Se hoje eu consigo escrever tudo isso aqui, é graças a você, à sua força de vontade de viver e à sua gana de sempre me proporcionar tudo o que você não teve.... Enfim, sem você, nada disso seria possível. Te amo muito!
Ao meu orientador Danilo, eu só posso agradecer a oportunidade de crescer ao teu lado. Você foi uma das pessoas mais importantes da minha vida, confiando em mim, no meu trabalho e me dando a chance de começar o LEBIL ao teu lado, aprendendo com você coisas que eu nunca tinha visto na vida! Sempre muito paciente e atencioso, você praticamente pegou na minha mão e me ensinou a pipetar, estava sempre pronto para receber minhas dúvidas, a puxar minha orelha quando foi necessário e sempre me incentivar a realmente falar o que eu estava pensando, a não guardar tanta opinião só para mim... E eu só tenho a te agradecer por tudo isso! Você me ajudou a moldar uma versão totalmente diferente de mim, uma melhorada e crítica quanto à ciência que fazemos e vemos por aí em tantos artigos. Eu adorei a chance de poder trabalhar com alguém tão ético, inteligente e de coração tão grande! Vou sentir muitas saudades do LEBIL! Obrigada mesmo, do fundo do coração, por tudo!
À Profª Silmara, meu muito obrigada pela orientação no Estágio Docente e por sempre estar disponível quando precisei de socorro. E por estar sempre disposta a comer meus bolos! Tinha que ter muita coragem mesmo!
À Profª Marlene, o que seria do nosso departamento sem os seus chocolatinhos da tarde? Na verdade, o que seria do nosso departamento sem a senhora? Vou sentir muita falta de lhe mandar beijinhos e dos tapas/socos que levei! Me tornaram uma pessoa mais forte.
À Profª Fernanda Gadelha, que, com muita paciência e cuidado, me ensinou a fazer Western blot e contribuiu diretamente para que hoje eu chegasse até aqui! Obrigada pelos ensinamentos, não somente práticos, que levarei para a vida toda!
À Profª Fernanda Cabral, que sempre estava a postos para tirar minhas dúvidas, ver meus géis correndo e minhas bandas borradas! Aquela acrilamida maravilhosamente santa salvou minha vida, viu?? Muito obrigada pelos materiais emprestados, pelos puxões de orelha e pelos elogios que sempre me deixavam sem graça... Obrigada por tudo, “Fer”!
Ao Profº Adriano, agradeço por sempre nos ajudar quando tivemos dúvidas sobre nossas culturas e nosso trabalho. Muito obrigada por ser esse profissional solícito e disponível.
À Profª Heidi, meu muito obrigada vai para todas as técnicas de trabalho em microscopia eletrônica que aprendi e todos os ensinamentos valiosíssimos de como trabalhar em “tempos de vacas magras”. Obrigada por todos os momentos e pela ajuda valiosíssima que nos deu quando não sabíamos muito bem como proceder com nosso material.
Aos colegas e amigos que fiz em disciplina, obrigada por terem contribuído para meu enriquecimento pessoal e profissional. Cris, Ianny, Ariane, Michel, Talitha, Tiago e Jhonne, seu lindo, vou sentir muitas saudades de todos vocês!
Tábata, Giulia e Isa, suas lindas! Era sempre muito bom chegar no Labdat e ver que vocês estavam lá, todas lindonas, para a gente fofocar e dar muitas risadas. Vou sentir saudades de vocês e das nossas lamentações!
Danilo Guarnier, seu véio rabugento! Obrigada por dividir comigo aquele laboratório novinho, cheirando a tinta e álcool 70%. Obrigada por sempre pegar tudo o que estava no alto pra mim... Evitou muitas possíveis quedas da escada que a retardada aqui teria levado.
Vinícius, meu miguxo gaúcho! Vou sentir saudades de ti, especialmente da contagem maravilinda no Conds e o famoso SETE! Vê se não come mais amendoim, tá?
À Adriane, obrigada pela disponibilidade, atenção e carinho que sempre teve comigo na microscopia. Queria que a Unicamp fosse cheia de funcionários como você! Stelinha e Laís, mais que auxílio técnico, vocês me deram momentos maravilhosos de muitas risadas e alguns almoços muito prazerosos. Obrigada por tudo, suas lindas <3
Aos meus amigos de Belém, Amanda e Felipe, obrigada pelo meu mais novo presentinho, pacotinho da dindinha, Luna Lunosa! Vou mostrar para ela isso aqui quando ela entender o que é uma dissertação de mestrado!
E agora, finalmente, a parte que mais dói no coração mas ao mesmo tempo, a que mais me enche de alegria: Poder agradecer às mulheres mais lindas que tive ao meu lado nesses dois anos de mestrado. Podem entrar, as melhores amigas que a UNICAMP me deu:
Amanda Piffer, a Mulher Maravilha cospobre mais linda que já conheci! Eu não tenho como colocar em palavras a falta que vais fazer na minha vida, amiga.... Nunca pensei que em tão pouco tempo eu faria uma amizade tão forte, que significaria tanto na minha vida! Obrigada por todas as risadas, todos os momentos em que me amparaste, que cê me ouviu falar da vida, dos embustes, dos contatinhos... enfim, de tudo! Obrigada por me levar para esportes maravilhosos e por me apresentar o Conds, que se tornou uma parte maravilhosa no meu dia a dia, assim como sei que é no teu! Nos unimos por muitas coisas em comum, algumas delas não tão boas, mas outras são simplesmente maravilhosas como os nossos amados memes, o nosso amor por comida e a Anira nossa de cada dia. Eu poderia escrever infinitas folhas te agradecendo por tudo o que fizeste por mim e por todos os momentos memoráveis que passei ao teu lado mas vou resumir tudo em uma só frase: TÁ DE PARABÉNS, PARABÉNS MAS PRECISO DE VOCÊ, PRO ROLÊ VALER!! Te amo, lagartinho <3
Viviaaaaan, sua coisinha linda e fofínea! O que seria de mim nesse começo de mestrado sem a minha quase gêmea de sobrenome! O que seria das nossas vidas sem o “Karen Midori e Vivian Minori”?? Lembro que no começo éramos só nós duas no lab, sempre fazendo alguma coisa juntas, fosse trabalhar ou comer uma promoção no Bello! Miga, eu queria te agradecer por todos os momentos épicos que passamos dentro daquele laboratório e por todas as gargalhadas que cê me proporcionou! Vou sentir tua falta pra caraamba aqui, minha japinha lindja! Te amo <3
Tábata, Tabatinha, Tbt ou Ariana Grande hahahahahahaha. Chegou fofínea e dominou nossos corações com esse jeito todo fofo e lindo de ser! Miga, te admiro muito e fico orgulhosa pela pesquisadora que estás te tornando.... Teu progresso pessoal e profissional é um mérito teu e ninguém pode tirar isso! Fico feliz em ter contribuído nem que seja um pouquinho para que você pudesse brilhar! Te amo muito, fofínea <3
Andressa, minha bichona! Quantos Westerns e varreduras, hein? Tudo muito bem acompanhado de inúmeros bolos da feirinha e hambúrgueres que fizeram a
gente aliviar o estresse do dia e ganhar uns quilos a mais de felicidade no coração hahahahahhahaha Vou morrer de saudade dos nossos mashups maravilhosos e do bom e velho “ÊÊÊTA BICHÃÃÃO!”. Obrigada por sempre estar a postos para me acudir e por ser essa profissional maravilhosa que és! Te amo muitão, dona do bichão <3
Marília, sua comedora de batata doce, quantas lâminas a gente separou juntas, miga? Quantas reviradas de olho já rolaram? hahahahahahahahaha’ Tuas dancinhas repentinas e teus acessos de loucura vão fazer falta na minha vida... Como vai ser minha vida agora sem te ver enjaulada gritando “pruu”?? Te amo, atletínea <3
Beth, a ocasião formal da situação não me permite usar os nossos pronomes de tratamento mais usuais... Apenas quero te dizer que sem a tua presença naquele laboratório, minhas tardes teriam sido felizes, tranquilas e produtivas... BRINCADEIRA, MIGA! Te amo muito e queria te dizer que fizeste uma diferença enorme nos dias em que eu estava meio down, sempre me acompanhando naquele sorvetinho de ninho trufado! Vou sentir tua falta, professor Xavier <3
Nathalia, fico feliz em poder ter contribuído com um pouco do grande conhecimento que você adquiriu no LEBIL.... Obrigada por toda a ajuda que você sempre estava disposta a dar e por aliviar o estresse que tínhamos com os experimentos sempre tendo uma piada ou uma tirada pronta para zoar.
Rapha, meu amor, espero que você tenha uma IC de muito sucesso no LEBIL, viu? Você viu que a gente é louca, mas nos amamos muito e trabalhamos sempre juntas.... Tenho certeza que vai dar tudo certo para você e espero ter deixado um pouquinho do meu trabalho dentro do teu coração bom.... Vou sentir falta de uma pessoa tão meiga do meu lado <3
Bibi e Vivi, suas lindas.... Nosso contato foi tão pouco, mas a zoeira never
ends! Espero que vocês aproveitem muito o que tem para aprender ali e não
esqueçam de mim senão eu esgano vocês e descarto junto com o brometo pq eu sou bem loka!
Aos amigos com os quais eu dividi um teto, muitas risadas e zoações, meu muito obrigada por todos os momentos de diversão, pelas fextinhas, pelo cuidado com meu filhote canino e pela paciência que tiveram com ele. Gabriel, Talitha, Ângelo, Suzy, Laisa, Arthur e Matheus, vocês foram minha família por 4 meses e eu
só consigo resumir tudo isso em uma palavra: SAUDADES! Muito obrigada por me receberem nessa rep mega amorzinho que é a IELOW <3
Aos amigos do Conds, obrigada por serem muito mais que colegas de treino.... Vocês mudavam completamente as minhas manhãs e eu só tenho a agradecer por todo o carinho e zoação que tivemos ao longo do pouco tempo que passei ao lado de vocês... Eu poderia continuar agradecendo até a falha mas vou ficar por aqui desejando o bom e velho “MUITO CONDS PRA VOCÊS”.
Ao meu grande amorzinho que já está no céu dos cachorrinhos na ocasião dessa publicação, eu deixo meu mais sincero obrigada. Você foi luz nos dias em que eu só enxergava escuridão; você me deu um carinho, um apoio e um amor incondicional que eu nunca havia experimentado com outro animal. Você foi meu grande amor, Zerinho, meu filhote!
E a você, provável desconhecido que está lendo isso, obrigada pelo simples fato de fazer isso. Você está acreditando no meu trabalho e na orientação e colaboração de muitas pessoas para que este projeto se tornasse realidade. Obrigada.
O presente trabalho foi realizado com apoio da Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior – Brasil (CAPES) – Código de Financiamento 001.
À FAPESP, agradeço pelo auxílio financeiro que me forneceu no processo nº 2015/17902-2, Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP), em forma de bolsa e reserva técnica para que eu pudesse adquirir reagentes e materiais necessários para a continuidade deste projeto e a manutenção do laboratório no qual estava inserida. Sem esse apoio, este estudo seria inviável. É importante ressaltar que as opiniões, hipóteses e conclusões ou recomendações expressas neste material são de responsabilidade da autora e não necessariamente refletem a visão da FAPESP.
RESUMO
A leishmaniose é, atualmente, a doença por protozoário mais negligenciada no mundo, sendo a segunda causa de morte por protozoários, precedida apenas pela malária. A infecção ocorre quando o vetor flebotomíneo realiza seu repasto sanguíneo e regurgita as formas infectantes de Leishmania ao hospedeiro vertebrado que são então preferencialmente fagocitadas por macrófagos. Outros tipos celulares como células dendríticas, neutrófilos e fibroblastos podem também desempenhar importante papel na infecção. Além disso, adipócitos diferenciadas de fibroblastos embriônicos podem também representar um tipo celular capaz de hospedar este parasito. A infecção para este modelo seria, portanto, uma ferramenta importante para estudo do papel de ácidos graxos no curso do parasitismo por
Leishmania. Sabe-se que a captação de ácidos graxos se faz necessária para as
formas amastigotas sobreviverem no meio fagolisossomal. Com base nas informações acima, propusemos avaliar os níveis de proteínas ligantes de ácidos graxos (FABPs – Fatty Acid Binding Proteins) em macrófagos infectados por
Leishmania (Leishmania) amazonensis, já que os mesmos apresentam níveis
abundantes da FABP tipo 4 (FABP4). Nossos achados permitem concluir que infecções prolongadas de macrófagos murinos derivados de precursores de medula óssea com Leishmania (Leishmania) amazonensis apresentam níveis aumentados de FABP4. Estudos para estabelecimento de modelos de infecção, diferenciação de adipócitos, avaliação de cargas parasitárias nas infecções experimentais e análises morfológicas por microscopia de eletrônica de varredura foram conduzidos no presente trabalho. Nossos achados permitirão a busca de novos caminhos para a compreensão da patogênese da leishmaniose cutânea e potencialmente servir para identificação de potenciais alvos quimioterápicos direcionados ao desenvolvimento de fármacos anti-Leishmania.
ABSTRACT
Leishmaniasis is currently the most neglected protozoan disease in the world, being the second leading cause of death by protozoan, preceded by malaria. Infection occurs when the phlebotomine vector performs its blood meal and regurgitates the infecting forms of Leishmania to the vertebrate host which are, rather, phagocytosed by macrophages. Other cell types such as dendritic cells, neutrophils, and fibroblasts may also play an important role in infection. In addition, differentiated adipocytes of embryonic fibroblasts may also represent a cellular type capable of harboring this parasite. The infection for this model would therefore be an important tool for studying the role of fatty acids in the course of parasitism by Leishmania. It is known that the uptake of fatty acids is necessary for the amastigote forms to survive in the phagolisosomal environment. Based on the above information, we evaluated the levels of Fatty Acid Binding Proteins (FABPs) in macrophages infected with
Leishmania (Leishmania) amazonensis, since they have abundant levels of FABP
type 4 (FABP4). Our results show that long-term Leishmania (L.) amazonensis infections of bone marrow macrophages present increased levels of FABP4. In addition, studies to establish infection protocols in our laboratory, adipocyte differentiation, evaluation of parasitic loads in experimental infections and morphological examination by scanning electron microscopy were conducted in the present study. Our findings may open new avenues for understanding the pathogenesis of cutaneous leishmaniasis and potentially serve to identify potential chemotherapeutic targets for the development of anti-Leishmania drugs.
LISTA DE ILUSTRAÇÕES
Figura 1 – Morfologia de amastigotas de Leishmania sp. ... 24 Figura 2 – Morfologia de promastigotas de Leishmania sp. ... 25 Figura 3 – Esquema da modificação morfológica sofrida por Leishmania sp. durante infecção no hospedeiro invertebrado... 25 Figura 4 - Ciclo biológico de Leishmania sp. em diferentes hospedeiros... 26 Figura 5 – Esquema evidenciando células hospedeiras e possivelmente hospedeiras de Leishmania sp. durante infecção... 27 Figura 6 – Macrófago infectado com Leishmania (Leishmania) amazonensis com amastigotas evidentes em vacúolos parasitóforos... 28 Figura 7 – Processo de diferenciação in vitro de fibroblastos 3T3-L1 em adipócitos... 29 Figura 8 – Esquema do transporte de ácidos graxos para o citosol por meio da proteína ligante de ácidos graxos (FABP4) ... 31 Figura 9 – Curva de crescimento de promastigotas de L. (L.) amazonensis cultivados em cultura ... 51 Figura 10 – Evolução de lesão na pata de camundongo Balb/C infectado com promastigota de L. (L.) amazonensis ... 52 Figura 11 – Infiltrado tecidual oriundo de aposição de pata de Balb/C infectado com
L. (L.) amazonensis ... 53
Figura 12 – Gráfico ilustrando resultado de contagem de número amastigotas por macrófago em infecção nos tempos de 1, 24 e 72h ... 54 Figura 13 – Macrófagos infectados com L. (L.) amazonensis derivados de infecção nos tempos de 1, 24 e 72h ... 58 Figura 14 – Detecção da proteína FABP4 em macrófagos infectados e não infectados com L. (L.) amazonensis nos tempos de 1 e 72h ... 60 Figura 15 – Detecção da proteína FABP4 em macrófagos infectados e não infectados com L. (L.) amazonensis, na presença e ausência do inibidor de FABP4 nos tempos de 1 e 24h ... 61 Figura 16 - Detecção da proteína FABP4 em macrófagos infectados e não infectados com L. (L.) amazonensis, na presença e ausência do inibidor de FABP4 nos tempos de 1, 24 e 72h ... 63
Figura 17 - Gráfico ilustrando resultado de contagem de número amastigotas por macrófago em infecção nos tempos de 1 e 72h ... 64 Figura 18 - Macrófagos infectados com L. (L.) amazonensis derivados de infecção nos tempos de 1 e 72h ... 66 Figura 19 – Microscopia eletrônica de varredura de macrófagos infectados com L.
(L.) amazonensis durante 1 e 72h ... 68
Figura 20 – Processo de diferenciação de fibroblastos 3T3-L1 em adipócitos ... 69 Figura 21 – Fibroblastos 3T3-L1 infectados e não infectados com L. (L.)
amazonensis durante o tempo de 24h ... 71
Figura 22 – Adipócitos diferenciados de fibroblastos 3T3-L1 infectados com L. (L.)
LISTA DE TABELAS
Tabela 1 – Quimioterápicos utilizados no tratamento da Leishmaniose atualmente no Brasil... 37
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
cm Centímetro
cm² Centrímetro quadrado
DMEM Dulbecco’s Modified Eagle Medium (Meio de Eagle modificado de Dulbecco)
DMSO Dimetilsulfóxido
EDTA Ácido etilenodiamino tetracético FABP Proteína ligante de ácido graxo FABP4 Proteína ligante de ácido graxo tipo 4 FABP5 Proteína ligante de ácido graxo tipo 5
g Força g (gravidade)
h Hora
IBMX Isobutil-1-metilxantina
iFABP4 Grupos incubados com inibidor de FABP4
IFNγ Interferão gama
IL-4 Interleucina 4
IL-12 Interleucina 12
kDa Quilodalton
kDNA DNA mitocondrial presente no cinetoplasto kg kHz Quilograma Quilohertz kV Quilovolt L. Leishmania
MOI Multiplicity of infection (Multiplicidade de infecção)
MØ Macrófago mA Miliampère mg Miligrama ml Mililitro mM Milimolar mm Milímetro N Número de parasites
NO Óxido nítrico
PBS Solução salina em tampão fosfato
PBST Solução salina em tampão fosfato + Tween 20
pH Potencial hidrogeniônico
PMSF Fenilmetanosulfonilfluoruro
PPARγ Receptores ativados por proliferador de peroxissomo PVDF Fluoreto de polivinilideno
RIPA Tampão de ensaio de radioimunoprecipitação SDS Dodecil sulfato de sódio
SDS-PAGE Eletroforese em gel de acrilamida contendo SDS
SFB Soro Fetal Bovino
TA Tecido Adiposo
Tris-HCl Hidroximetilaminometano contendo ácido clorídrico
V. Viannia
V Volts
μg Micrograma
μL Microlitro
LISTA DE SÍMBOLOS
β Beta
°C Graus Celsius % Porcentagem
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO ... 23
1.1 PARASITO LEISHMANIA SP... 24
1.2CÉLULASHOSPEDEIRAS ... 27
1.2.1CÉLULAS POTENCIALMENTE HOSPEDEIRAS:ADIPÓCITOS ... 29
1.3FABPS ... 30
1.4LEISHMANIOSE ... 32
1.4.1 LEISHMANIOSE CUTÂNEA OU TEGUMENTAR ... 32
1.4.1.1 Aspectos Clínicos ... 32 1.4.1.2 Epidemiologia ... 33 1.4.2 LEISHMANIOSE VISCERAL ... 34 1.4.2.1 Aspectos Clínicos ... 34 1.4.2.2 Epidemiologia ... 35 1.4.3 TERAPIA E PROFILAXIA ... 35 2 JUSTIFICATIVA ... 38 3 OBJETIVOS ... 40 3.1 OBJETIVO GERAL ... 41 3.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS ... 41 4 MATERIAL E MÉTODOS ... 42 4.1 CULTURA DE PROMASTIGOTAS ... 43 4.2 INFECÇÕES INVIVO ... 43 4.3 INFECÇÕES INVITRO ... 44 4.3.1PLACAS DE 24 POÇOS ... 44 4.3.2PLACAS DE 6 POÇOS ... 45 4.4CONDIÇÕESDEINCUBAÇÃO ... 45 4.5WESTERNBLOT ... 46
4.6 FIBROBLASTOS 3T3-L1 E DIFERENCIAÇÃO DE ADIPÓCITOS ... 47
4.7 INFECÇÃO DE 3T3-L1 E ADIPÓCITOS ... 47
4.8 MICROSCOPIA ELETRÔNICA DE VARREDURA ... 47
5 RESULTADOS E DISCUSSÃO ... 49
5.1 ESTABELECIMENTOS DE MODELO BIOLÓGICO NO LABORATÓRIO DE ESTUDOS DE BIOLOGIA DA INFECÇÃO POR LEISHMANIA (LEBIL) ... 50
5.1.2 INFECÇÃO A (1H, 24H E 72H) ... 53
5.1.3 INFECÇÃO B (1H E 72H) ... 63
5.2DIFERENCIAÇÃODEFIBROBLASTOS3T3-L1EMADIPÓCITOS ... 68
5.2.1INFECÇÃO DE 3T3-L1 ... 69
5.2.2INFECÇÃO DE ADIPÓCITOS ... 72
6 CONSIDERAÇÕES FINAIS ... 74
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ... 76
ANEXOS ... 81
ANEXO A – IMAGEM DIGITAL DO BLAST DA FABP4 ... 82
ANEXO B - TERMO DE APROVAÇÃO DA PESQUISA PELA COMISSÃO DE ÉTICA NO USO DE ANIMAIS DA UNICAMP ... 83
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1.1 PARASITO Leishmania sp.
Os parasitos do gênero Leishmania pertencem à família Trypanosomatidae e caracterizam-se por apresentar um flagelo que emerge de um bolso flagelar próximo à estrutura denominada cinetoplasto, onde está presente o kDNA, composto de dois tipos de DNA circulares mitocondriais [1]. O gênero Leishmania apresenta duas formas durante seu ciclo de vida: uma forma amastigota (Fig. 1A), arredondada e com flagelo reduzido, presente no hospedeiro vertebrado (Fig. 1B), e a promastigota (Fig. 2), estágio fusiforme flagelado presente no trato digestório do vetor flebotomíneo [2].
Figura 1 – Morfologia de amastigotas de leishmania. (A) Forma amastigota de Leishmania sp. apresentando flagelo reduzido, encontrada em infecções no hospedeiro vertebrado; (B) Imprinting de camundongo Balb/C infectado com Leishmania (Leishmania) amazonensis onde estão presentes diversos amastigotas no infiltrado tecidual; notar cinetoplasto, estrutura característica da ordem Kinetoplastida, evidenciado pelas setas. A grande quantidade de amastigotas encontrada na infecção do hospedeiro vertebrado é uma característica do complexo mexicana, no qual está inserida a espécie L. (L.) amazonensis.
(A) Adaptado de: https://biorender.com/.
(B) Histopatológico obtido após aposição de pata de camundongo Balb/C infectado, em lâminas posteriormente coradas com Kit Panóptico Rápido (Newprov) (Fonte: Karen Minori, 2016).
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Figura 2 – (A) Forma promastigota, flagelada e móvel de Leishmania, encontrada no trato digestório do inseto vetor; (B) Promastigotas provenientes de cultura de L. (L.) amazonensis cultivada em Meio 199 suplementado com 10% de soro fetal bovino; notar cinetoplasto evidenciado nas duas figuras por setas pretas e o flagelo indicado por setas vermelhas.
(A) Adaptado de: https://biorender.com/.
(B) Promastigotas encontrados em gota de cultura depositada em lâmina, posteriormente corada com Kit Panóptico Rápido (Newprov) (Fonte: Karen Minori, 2016).
Durante seu ciclo de vida, o parasito alterna entre as formas mencionadas a depender do hospedeiro, sendo um deles o vetor (hospedeiro invertebrado) e um hospedeiro vertebrado. A forma amastigota, presente nas células hospedeiras dos vertebrados, é tomada pelo vetor durante seu repasto sanguíneo, no qual irá transformar-se em promastigota procíclico, ainda divisível reprodutivamente, e colonizar o intestino médio do flebotomíneo [3]. Dentro do intestino do vetor (Fig. 3), as formas promastigotas passam por mudanças morfológicas e bioquímicas até atingirem a forma promastigota metacíclica, indivisível e infectiva a novos hospedeiros vertebrados [2].
Figura 3 – Esquema das sucessivas alterações morfológicas sofridas por Leishmania sp. durante a infecção no hospedeiro invertebrado no qual o parasito amastigota transforma-se em promastigota procíclico no intestino médio do vetor, passando por diferentes estágios de desenvolvimento até atingir a forma de promastigotas metacíclicos e estarem aptos para a infecção no próximo repasto sanguíneo.
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Os flebotomíneos, conhecidos popularmente como mosquitos-palha, são insetos diminutos e pilosos que apresentam em seu organismo condições especiais para a continuidade do ciclo de vida do parasita (Fig. 4) [3]. Quando a fêmea do flebotomíneo realizar um novo repasto sanguíneo, regurgitará junto da sua saliva os promastigotas infectivos, que no hospedeiro vertebrado se transformarão em amastigotas no interior de células fagocíticas mononucleares do hospedeiro infectado [5].
Figura 4 – Ciclo biológico heteroxeno de Leishmania sp. evidenciando alterações morfofisiológicas do parasito durante a infecção em ambos os hospedeiros, vertebrado e invertebrado. Durante a infecção, outras células, além dos macrófagos, são infectadas (sendo estas, porém, as células alvo da infecção) e apresentam papel fundamental na evasão do sistema imune pelo parasito. Notar a diversidade de hospedeiros vertebrados e a importância de cães infectados na epidemiologia da doença.
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1.2 CÉLULAS HOSPEDEIRAS
Diversas células estão envolvidas no processo de infecção por Leishmania sp. (Fig.5) e muitas delas são ativadas como defesas do organismo contra a infecção, porém, acabam sendo subvertidas pelo parasito durante o processo, auxiliando no estabelecimento do mesmo dentro de seu hospedeiro. Está bem estabelecido na literatura que a principal célula- alvo para a infecção são os macrófagos, capazes de fagocitar as formas promastigotas de maneira eficiente e rápida, porém, neutrófilos podem atuar também como primeiras células de defesa capazes fagocitar alguns parasitos [7].
Figura 5 – Exemplos de células hospedeiras e/ou potencialmente hospedeiras (fibroblastos e adipócitos) de Leishmania sp. durante a infecção. Estudos mostram que neutrófilos atuam como transportadores de parasitas, de forma a mascarar a infecção e driblar o sistema imune do hospedeiro recrutando macrófagos para o sítio de morte destas e de outras células intermediárias na infecção.
Adaptado de: Kaye, P; Scott, P (2011) [6]
Neutrófilos são células de vida relativamente curta e acredita-se que atuem no ciclo como células hospedeiras transitórias, as quais agem como “transportadores de parasitas”, escondendo-os do sistema imune do hospedeiro, até conseguirem ser silenciosamente fagocitados por macrófagos [2]. Estas mediações de resposta à infecção ainda não são completamente compreendidas. Porém, sabe-se até então que essa infecção de neutrófilos causa um atraso na morte dessas células, iniciando
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uma resposta inflamatória e fazendo com que uma quantidade maior de macrófagos migre para essa região, onde irão fagocitar parasitas livres e neutrófilos infectados, tornando-se assim, as células hospedeiras finais da infecção [2]. Dentro dos macrófagos, as formas amastigotas - diferenciadas de promastigotas metacíclicos - encontram-se em vacúolos parasitóforos (Fig. 6) ou vacúolos fagolisossômicos, onde irão se proliferar resistindo ao meio ácido presente nesses vacúolos [8].
Figura 6 – Macrófago infectado com L. (L.) amazonensis, onde podem ser vistos diversos vacúolos parasitóforos (setas vermelhas) apresentando vários amastigotas em seu interior, indicados pelas setas pretas. Esta quantidade de amastigotas presentes na infecção, evidencia a característica de L.
(L.) amazonensis, formar grandes vacúolos parasitóforos com uma grande quantidade de amastigotas
inseridos, inerente ao complexo mexicana, ao qual pertence. (Lâmina corada com Kit Panóptico Rápido (Newprov) e visualizada em microscópio óptico sob aumento de 100x)
Segundo Liu e Uzonna (2012), a progressão da infecção e a colonização dos macrófagos dependerá da resposta imune gerada, ou seja, caso ocorra uma resposta imune natural do hospedeiro, o sistema responde produzindo IL-12 que irá influenciar na síntese de IFN-γ, aumentando a produção de óxido nítrico, tóxico à cadeia respiratória dos amastigotas. Já a subversão do sistema imune do hospedeiro, que facilita a sobrevivência dentro dos vacúolos parasitóforos, ocorre quando a citocina IL-4 é produzida, levando à produção de arginase, enzima responsável por catalisar substâncias que auxiliam na sobrevivência do parasita, resultando em uma resposta imune adaptativa. Outro mecanismo de subversão do organismo hospedeiro por Leishmania é a alteração dos sinais de ativação das células dendríticas, responsáveis por apresentar aos linfócitos T informações que
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auxiliem na resposta imune inata, evitando assim que estes sinais sejam ativados e inibindo a produção de NO pela célula hospedeira [2].
1.2.1 Células potencialmente hospedeiras: Adipócitos
Sabe-se que outras células podem ter papel na infecção, como os fibroblastos [9], células precursoras de adipócitos. Os adipócitos são formadores primordiais do tecido adiposo, contendo em seu interior grandiosos vacúolos lipídicos para armazenamento de ácidos graxos (Fig. 7) [10]. Segundo Tanowitz e colaboradores, o tecido adiposo foi, até recentemente, ignorado em estudos morfofuncionais devido à sua imaginada natureza estável e imutada, porém isso vem mudando com o crescente aumento de pesquisas correlacionando-o a doenças cardiovasculares e diabetes [10].
Figura 7 – Fibroblastos da linhagem 3T3-L1 em processo de diferenciação in vitro para adipócitos registrados ao 9º dia, após aplicação de coquetel de diferenciação. Notar a presença de gotículas lipídicas, indicadas pelas setas pretas; fibroblastos não diferenciados podem ser vistos indicados pelas setas vermelhas. O coquetel de diferenciação inclui componentes com alto fator de crescimento e adipogênico, necessários para a indução da diferenciação. (Imagem fotografada por câmera Leica em microscópio invertido, sob aumento de 40x.)
Muitos autores buscam entender qual o papel do tecido adiposo em sinalizações inflamatórias na ocorrência de possíveis desregulações no transporte de ácidos graxos e de que maneira isso resulta em comorbidades vasculares e hormonais. A pesquisa deste tecido em infecções parasitárias não possuía grande expressividade até 2011, quando Allahverdiyev e colaboradores demonstraram
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experimentalmente a possibilidade de o tecido adiposo ser um novo local de colonização para Leishmania utilizando, para isso, quatro espécies diferentes do protozoário. Uma hipótese que poderia explicar a colonização dos adipócitos por
Leishmania poderia envolver a utilização de ácidos graxos por amastigotas,
necessários para a sobrevivência dentro dos vacúolos parasitóforos e a continuidade da infecção. [9].
Até o momento ainda não há evidências científicas do envolvimento de adipócitos em infecções naturais por Leishmania. Para infecções experimentais, não foram avaliadas respostas de infecções para espécies do Novo Mundo. Baseado nisso, acreditamos que seja possível o estabelecimento de infecções in vitro em células adiposas com Leishmania (Leishmania) amazonensis, espécie causadora de leishmaniose tegumentar americana, estudo este que pode representar um precedente importante no estudo das relações parasita- hospedeiro utilizando para isso uma célula hospedeira não classicamente fagocítica.
1.3 FABPS
As proteínas ligantes de ácidos graxos (FABPs – Fatty Acid Binding Proteins) têm demonstrado papel importante na via metabólica de adipócitos, sendo amplamente estudadas no envolvimento da obesidade e doenças cardiovasculares [11,12]. Estas proteínas da família das chaperonas possuem cerca de 15 kDa e coordenam o tráfego de lipídios intracelular (Fig. 8), modulando respostas inflamatórias em adipócitos e macrófagos [13]. Sua transcrição é induzida pelo Receptor Ativado por Proliferadores de Peroxissoma Gama (Peroxisome Proliferator-activated-receptor gamma - PPARγ) e possui diversas funções, baseadas sempre no local onde é encontrada (Ex: L-FABP, abundantemente expressa em tecido hepático e H-FABP, abundantemente expressa em tecido cardíaco). A FABP-4, foco do nosso estudo, é também conhecida como A-FABP (ou aP2 – adipocyte protein 2) e é encontrada em adipócitos e macrófagos. Vale salientar que a FABP-5 (ou E-FABP, expressa na epiderme) também é expressa nestes tipos celulares, porém, em níveis bastante reduzidos [12,14].
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Figura 8 – Esquema do transporte de ácidos graxos para o citosol por meio da proteína ligante de ácidos graxos (FABP4). Os ácidos graxos, após ligarem-se às proteínas ligantes, possuem papel de auxiliar em diversas cadeias metabólicas dentro do citosol, sendo utilizados nos processos de oxidação energética, constituição e síntese de membranas e até mesmo na composição de gotículas lipídicas encontradas em adipócitos.
Adaptado de: Furuhashi, M and S Hotamisligil, G (2008) [14].
Estudos mostram que a diminuição da expressão de FABPs em adipócitos leva à redução da resposta inflamatória nos macrófagos por meio da diminuição na produção de citocinas [13]. Estes estudos, porém, não avaliaram a atividade destas proteínas em infecções parasitárias, sendo assim pouco conhecido seu papel na resposta à presença de patógenos em células hospedeiras. Essa atividade poderia estar associada, no caso da infecção por Leishmania, com a progressão parasitária dentro dos macrófagos já que o mesmo poderia apresentar resposta imune deficitária, além da necessidade de recrutamento de ácidos graxos para a manutenção e organização do vacúolo parasitóforo. Dessa forma, é plausível supor que a progressão do processo patológico da leishmaniose poderia ser modulada de acordo com os níveis de FABP4. Os aspectos patológicos dessa doença são
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bastante complexos e variáveis. A seguir serão apresentados, resumidamente, seus aspectos clínicos, epidemiológicos e terapêuticos.
1.4 LEISHMANIOSE
A leishmaniose é uma doença que apresenta manifestações clínicas variadas de acordo com a espécie causadora, o estado imunológico do hospedeiro e a localização geográfica. Tais manifestações são caracterizadas, primordialmente, como: leishmaniose cutânea (ou tegumentar) e visceral (ou calazar) [15].
1.4.1 Leishmaniose Cutânea ou Tegumentar
Os primeiros registros no Brasil da forma tegumentar, foco deste estudo, datam de 1909, porém, registros nas Américas datam de 400 a 900 anos d.C em cerâmicas pré- colombianas que ilustravam características da espúndia, conhecida hoje como leishmaniose muco-cutânea [16]. Estima-se que haja cerca de 30 espécies circulantes de Leishmania [17] sendo sete dessas, causadoras de leishmaniose cutânea no Brasil: Leishmania (Viannia) braziliensis, Leishmania (V.)
guyanensis, Leishmania (V.) lainsoni, Leishmania (V.) naiffi, Leishmania (V.) shawi, Leishmania (V.) lindenberg e Leishmania (L.) amazonensis [18]. De maneira geral, a
leishmaniose cutânea leva a quadros de lesões em áreas frequentemente expostas, como pernas, braços e rosto. Em alguns casos, há a auto cura com cicatrização das lesões.
1.4.1.1 Aspectos Clínicos
Leishmaniose cutânea localizada (LCL): Provoca lesões indolores e sem prurido, com ausência de sintomas sistêmicos, podendo apresentar espectros diferentes de acordo com a espécie causadora. Espécies de Leishmania do Velho Mundo podem causar múltiplas lesões localizadas enquanto espécies do Novo Mundo causam lesões únicas, podendo evoluir para o quadro mucocutâneo; o desaparecimento das lesões pode ocorrer de forma espontânea em cerca de 2 a 12 meses;
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Leishmaniose cutânea difusa (LCD): Caracterizada por uma lesão única que lentamente se espalha por diversas áreas do corpo, a LCD é desfigurativa pois o paciente infectado desenvolve lesões em diversas áreas da face, primordialmente, que se espalham para outas áreas do corpo sem que haja, contudo, infecção sistêmica no organismo; comumente associada a espécies do Novo Mundo, a infecção é crônica e o paciente pode apresentar recaídas mesmo após o tratamento;
Leishmaniose mucocutânea (LMC): Provoca lesões cutâneas persistentes que progridem lentamente e afetam a mucosa oral/nasal, causando mutilações e desfiguração destas áreas bem como da orofaringe e traqueia; como a progressão é lenta (existem casos de infecções recorrentes por décadas), o indivíduo está suscetível a infecções bacterianas concomitantes, o que leva o mesmo à morte, na grande maioria dos casos, devido à sepse sistêmica;
Leishmaniose recidivante: Como o nome sugere, a recidiva ou recaída da infecção ocorre geralmente anos após a cura da primeira lesão localizada, de forma que novas ulcerações são encontradas ao redor do local da primeira; este quadro clínico tende a ser resistente a novas tentativas de tratamento e deve-se à possibilidade da reativação parasitária ou uma nova infecção por uma espécie diferente.
1.4.1.2 Epidemiologia
A situação epidemiológica mundial da leishmaniose cutânea é um caso grave de saúde pública, visto que o parasito está bem distribuído geograficamente e apresenta uma variedade grande de espécies que causam variadas formas clínicas. A Organização Mundial da Saúde (OMS/WHO) [19] monitora anualmente os casos novos, elaborando informes epidemiológicos (INFORME EP. Nº 03, 2015) [20] com frequência para informar os profissionais da saúde, tanto para leishmaniose cutânea quanto visceral.
No Brasil, o Ministério da Saúde monitora e recolhe anualmente o número de casos de leishmaniose cutânea no Brasil, fornecendo dados importantes para o país sobre redução ou aumento de casos. Durante o ano de 2015, ocorreram 19.395 casos dessa forma clínica no Brasil enquanto que em 2014, foram registrados
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20.296 casos [21]. Tais informações auxiliam no planejamento e execução de medidas de controle, prevenção e tratamento, principalmente visando áreas de maior endemicidade, onde os casos também são notificados, ainda que de maneira precária. Esses números trazem consigo uma realidade mundial que é impossível de ser ignorada. A leishmaniose é uma das protozooses mais negligenciadas no mundo [19] e mesmo com a realidade mundial da infecção demonstrada em números consideravelmente altos, as opções de quimioterápicos ainda são escassas e muitas enfrentam a limitação de provocarem efeitos colaterais importantes [22].
1.4.2 Leishmaniose Visceral
Até o século XIX, não havia notícias concretas sobre casos de leishmaniose visceral (LV) no mundo; segundo Steverding (2017), apenas em 1827 um artigo publicado pelo militar William Twining trouxe à tona relatos de pacientes com aumento do baço, febre intermitente e grave anemia. Após esses casos, Twining seguiu seu trabalho e publicou um livro descrevendo com maior exatidão os sintomas de calazar, outro nome dado à leishmaniose visceral; derivado do hindi “kala-azar”, que significa febre negra e refere-se à hiperpigmentação adquirida em algumas áreas da pele do paciente durante a infecção [23].
1.4.2.1 Aspectos Clínicos
Conhecida como a forma mais grave da leishmaniose, a LV apresenta um espectro clínico amplo, variando de uma infecção assintomática até casos severos de infecção, que levam o paciente à óbito. Diferentemente da leishmaniose cutânea, a forma visceral leva a quadros de febre, acentuada perda de peso, hipergamaglobulinemia, pancitopenia e hepatoesplenomegalia e, em alguns casos, pacientes também relatam suores noturnos, diarreia e fraqueza. No Brasil, a espécie responsável pela LV é L. (L.) infantum e na ausência de tratamento, a infecção progride para óbito em aproximadamente 2 anos e além dos sintomas apresentados acima, a forma visceral apresenta dois outros espectros clínicos, apresentados abaixo:
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Leishmaniose viscerotrópica: variante da leishmaniose visceral, é frequentemente associada à uma baixa carga parasitária e provoca febre, diarreias intermitentes, dores de cabeça, náusea, dor abdominal, fadiga e hepatoesplenomegalia transitória. Encontrada em soldados americanos que lutaram na Guerra do Golfo, esta forma é causada pela espécie Leishmania (L.) tropica, comumente associada à forma cutânea.
Leishmaniose dérmica pós-calazar (PKDL): Este espectro clínico difere de todos os outros mencionados pois ocorre somente após o tratamento da leishmaniose visceral; os pacientes, após o tratamento da forma visceral (dentre 2 a 20 anos), apresentam múltiplas lesões eritematosas que se transformam em nódulos, recobrindo todo o corpo do paciente, as quais desaparecem espontaneamente após alguns meses.
1.4.2.2 Epidemiologia
De acordo com a Organização Mundial de Saúde, são estimados 400.000 a 500.000 novos casos de LV por ano no mundo [19]. Cerca de 90% dos casos de LV ocorrem na Índia, Bangladesh, Nepal, Sudão e Brasil [22]. Com relação às Américas, 12 países apresentam grande incidência de casos, totalizando uma média anual de 3.499 casos entre 2001 e 2013 sendo que, destes países, o Brasil aporta 96% dos casos com maior incidência em estados da região Nordeste do país.
1.4.3 Terapia e Profilaxia
Atualmente não estão disponíveis vacinas para uso humano como medida para profilaxia contra infecções por Leishmania. O tratamento medicamentoso é realizado somente com fármacos que apresentam alta toxicidade para o paciente que, além de levar a sérios efeitos colaterais, requerem administração parenteral obrigatória. Somando-se a isso, há relatos de casos de resistência aos antimoniais por algumas linhagens de parasitos [24].
O tratamento no Brasil é feito com base nas diretrizes preconizadas pelo Ministério da Saúde e pela Organização Mundial de Saúde, a qual disponibiliza
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informações sobre dosagens de medicamentos, possíveis combinações farmacológicas e valores dos tratamentos bem como sua eficácia para as variadas formas clínicas da leishmaniose (Tabela 1).
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Tabela 1 – Quimioterápicos utilizados no tratamento da Leishmaniose atualmente no Brasil. Estas informações encontram-se no site da Organização Mundial de Saúde, como forma de informação e orientação para médicos e para a comunidade científica acerca do tratamento dos pacientes acometidos pela leishmaniose.
Adaptado: Organização Mundial de Saúde. Disponível em http://www.who.int/leishmaniasis [25].
Avaliando a epidemiologia da Leishmaniose no Brasil, os críticos aspectos clínicos e a necessidade de novos quimioterápicos que possam ser utilizados em tratamentos via oral e que apresentem baixa toxicidade ao paciente, buscamos com este estudo analisar o potencial do inibidor de modular a infecção parasitária, fazendo-a progredir ou regredir, sem alterar a morfofisiologia da célula hospedeira, tornando-o assim um possível alvo quimioterápico nos estudos com Leishmania.
Espécie LC/LV Região/País Fármaco Dosagem/Administração
L. amazonensis; L. peruviana; L. venezuelensis
LC Novo Mundo Antimonial pentavalente
20 mg/kg, por dia por 20 dias; intramuscular ou intravenosa
L. braziliensis LC Novo Mundo
Antimonial pentavalente
20 mg/kg, por dia por 20 dias; intramuscular ou intravenosa Desoxicolato de
Anfoterecina B
0,7 mg/kg, por dia até atingir 30 doses; infusão
Anfoterecina B lipossomal
2 a 3 mg/kg, por dia até atingir a dose total de 20 a 40 mg/kg; infusão
L. guyanensis;
L. panamensis LC Novo Mundo
Isotionato de pentamidina
Injeções intramusculares ou infusões de 4 mg/kg por dose
Antimonial pentavalente
20 mg/kg, por dia por 20 dias; intramuscular ou intravenosa Miltefosina 2,5 mg/kg, por dia por 28 dias; via oral
L. infantum LV Mediterrâneo, Oriente Médio, Ásia Central e América do Sul Anfoterecina B lipossomal
3 a 5 mg/kg, por dia por 3 a 6 dias; infusão
Antimonial pentavalente
20 mg/kg, por dia por 28 dias; intramuscular ou intravenosa Desoxicolato de
Anfoterecina B
0,75 a 1 mg/kg, por dia (diário ou alternadamente) até atingir 30 doses;
infusão
L. mexicana LC Novo Mundo Cetoconazol
Dose adulta: 600 mg por dia, por 28 dias; via oral
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Baseados em estudos recentes que caracterizaram aspectos relevantes da modulação da infecção por Leishmania sobre o mecanismo de resposta imune do hospedeiro, há a crescente necessidade pela busca de mais informações acerca destes processos, além da compreensão do papel das células ou vias metabólicas que podem auxiliar no estabelecimento dessa infecção. A hipótese da utilização de ácidos graxos pelas formas amastigotas abre um leque de oportunidades para o estudo e a compreensão de como o parasita subverte nosso sistema imune e o utiliza para sua sobrevivência intracelular. Assim, o entendimento destes aspectos pode abrir novas perspectivas para identificação de potenciais alvos quimioterápicos direcionados ao desenvolvimento de fármacos anti-Leishmania. Portanto, torna-se relevante e justificável compreender o papel da FABP4 no processo infectivo de
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3.1 OBJETIVO GERAL
Avaliar a capacidade de protozoários do gênero Leishmania de modular os níveis de proteínas ligantes de ácidos graxos tipo 4 (FABP4) de macrófagos durante o curso da infecção in vitro.
3.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS
Estabelecer culturas Leishmania (Leishmania) amazonensis e verificar o potencial de infectividade em culturas de macrófagos primários;
Estabelecer culturas de adipócitos diferenciados de fibroblastos 3T3-L1 para avaliação do potencial infectivo de Leishmania;
Avaliar a abundância de proteínas ligantes de ácidos graxos tipo 4 (FABP4) em adipócitos diferenciados e macrófagos não infectados e infectados com
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4.1 CULTURA DE PROMASTIGOTAS
Para a realização dos cultivos de Leishmania in vitro, foi utilizada a espécie Leishmania (Leishmania) amazonensis, das cepas MHOM/BR/73/M2269 e IPLA/BR/67/PH8. O cultivo foi realizado em garrafas de cultura de 25 cm2 contendo 5 mL de meio 199 (Sigma- Aldrich) completo, suplementado com penicilina 50 unidades/mL, estreptomicina 50 µg/mL, HEPES 40 mM, pH 7,4, adenina 0,1 mM, biotina 0.0001%, hemina 0.0005% e 10% de soro fetal bovino - SFB (Vitrocell). As culturas foram mantidas a 26 °C e repiques semanais foram realizados para a manutenção dos parasitos. Foram realizadas contagens diárias das culturas utilizando-se câmara de Neubauer para a quantificação parasitária aproximada em cada garrafa, com inóculos iniciais de 1 x 105/mL. Para isso, alíquotas de 10 μL da cultura foram adicionadas a 90 μL de paraformaldeído 0,1% em PBS 1X. A partir dessas quantificações, foram obtidas curvas de crescimento para cada espécie.
4.2 INFECÇÕES IN VIVO
Os parasitos da cepa MHOM/BR/73/M2269 provenientes de culturas em fase estacionária que não eram congelados ou repicados em novas garrafas foram inoculados em camundongos fêmeas da linhagem Balb/C. Todos os animais foram mantidos em gaiolas apropriadas, higienizadas duas vezes por semana, com comida e água ad libitum (n = 5 animais por isolador (Alesco®). O projeto possui Aprovação da Comissão de Ética no Uso de Animais (CEUA/UNICAMP: 4047-1). Para a inoculação no animal, utilizou-se seringas de insulina de 1 mL contendo 1 x 106 ou 2 x 106/50 μL de PBS 1X por pata. Em cada infecção, foram inoculados parasitos nas patas esquerdas, servindo as patas direitas como controles não infectados.
A cada semana, a espessura das patas dos animais foi medida com paquímetro digital (Mitutoyo, Japan) e a diferença entre as duas patas indicava o tamanho da lesão (mm). No decorrer das semanas pós-inóculo, os animais que apresentavam sinais de inchaço ou até mesmo lesão evidente na pata infectada eram eutanasiados para a retirada de parasitos na forma amastigota, prontamente transferidos para novas garrafas de cultura contendo meio 199 completo, conforme descrito anteriormente. Foram mantidos tais ciclos de infecção animal para cultura in vitro na tentativa de obtermos parasitos mais virulentos. No momento da retirada de
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parasitos, também foram preparadas lâminas com aposição de material de lesão das patas infectadas, pressionando-as levemente contra a lâmina para posterior secagem à temperatura ambiente e fixação e coloração com o kit panóptico rápido (Newprov, Pinhais – PR) para a visualização de amastigotas em células do hospedeiro.
4.3 INFECÇÕES IN VITRO
Concomitante a essas atividades, infecções com macrófagos foram realizadas partindo da extração e cultivo in vitro de precursores dessas células. Os macrófagos utilizados foram diferenciados de células precursoras da medula óssea obtida de tíbia e fêmur de camundongos Balb/C fêmeas, cultivadas em placas de 7,5 cm de diâmetro, contendo 10 mL meio R2030, modificado do meio RPMI Lonza contendo: 475 mL de RPMI, 20% de soro fetal bovino, 30% de sobrenadante de fibroblastos L929 e gentamicina.
As placas foram mantidas em estufa a 37°C, com atmosfera de 5% CO2. Após 4 dias, as placas foram analisadas em microscópio invertido (Leica) e adicionou-se mais 5 mL do meio R2030. Ao fim de uma semana, as células estavam confluentes e diferenciadas para serem plaqueadas e infectadas. Os macrófagos diferenciados foram recolhidos em meio RPMI após delicada raspagem com raspador de células estéril (Corning®) e centrifugados a 1000 x g por 5 minutos a 4 °C, resuspendidos em meio R105 (RPMI + 10% de SFB + 5% de sobrenadante de L929) e quantificados em câmara de Neubauer para que, posteriormente, fossem plaqueados.
4.3.1 Placas de 24 poços
Os macrófagos obtidos foram plaqueados sobre lamínulas de 13 mm de diâmetro, inseridas em placas de 24 poços (1 lamínula estéril por poço). A cada poço, foram acrescentados 100 μL de meio R105 e colocadas as lamínulas, seguido pela adição de volume de cultura necessário para que houvesse 4 x 105 macrófagos por poço.
A seguir, as placas de 24 poços foram mantidas em estufa a 37 °C, 5% CO2
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acrescentou-se em cada poço uma quantidade pré-estabelecida de promastigotas de fase estacionária de L. (L.) amazonensis IPLA/BR/67/PH8 respeitando a proporção de 5 parasitos por macrófago. Após a adição dos parasitos, a placa foi incubada a 34 °C, 5% CO2, para que o parasito estivesse em condições semelhantes às de infecção na derme de um hospedeiro vertebrado. Uma hora pós- infecção, retirou-se o sobrenadante de cada poço e foi acrescentado PBS 1X pré-aquecido para lavagem e retirada dos parasitos não fagocitados. Ao final de diferentes períodos, a depender do ensaio, as infecções foram interrompidas e as lamínulas fixadas com metanol e coradas com kit panóptico rápido Newprov. Após secagem das mesmas, as lamínulas foram coladas em lâminas com Entelan® (Sigma-Aldrich) e analisadas ao microscópio. Todas as lamínulas foram contadas para se estabelecer a quantidade de parasitos por macrófago infectado.
4.3.2 Placas de 6 poços
As infecções em placas de 6 poços foram realizadas plaqueando-se o triplo da quantidade de macrófagos utilizados nas placas de 24 poços. O processo seguiu o mesmo protocolo descrito acima (plaqueamento, infecção, lavagem com PBS e estabelecimento da infecção) utilizando-se a mesma cepa, exceto que nessas placas não utilizamos lamínulas, sendo o processo inteiro realizado diretamente na placa, visto que as células seriam lisadas diretamente ao final dos períodos de infecção para extração de proteínas, conforme descrito no item 4.5.
4.4 CONDIÇÕES DE INCUBAÇÃO
Todas as infecções foram realizadas seguindo um padrão de identificação de incubação estabelecido por nós, necessário para a orientação e organização de todos os experimentos. Todas as placas utilizadas eram identificadas na tampa com data, nome do experimento e nome da aluna; em seguida, cada condição estabelecida era anotada na placa, as quais eram: MØ (macrófago não infectado), MØ + inib. (macrófago não infectado tratado com inibidor de FABP4), MØ + Leish. (macrófago infectado com L. (L.) amazonensis) e MØ + Leish.+ inib. (macrófago infectado com L. (L) amazonensis tratado com inibidor de FABP4). Neste caso, o inibidor específico de FABP4 utilizado foi adquirido comercialmente: SC202606
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(Santa Cruz Biotechnology) e preparado a partir do composto concentrado com massa igual a 5 mg utilizando DMSO (Sigma Aldrich) como diluente. Assim sendo, foi preparada uma solução estoque a 42 mM, que foi armazenada em a -20°C. A concentração de uso foi de 20 µM, a depender do ensaio.
4.5 WESTERN BLOT
As infecções utilizadas nestes ensaios foram realizadas em placas de 6 poços, onde as células foram lavadas com PBS à temperatura ambiente e posteriormente lisadas com tampão de extração de proteínas RIPA contendo Tris-HCl (pH 8.0) 50 mM, NaCl 150 mM, EDTA 1 mM, SDS 0,1%, Nonidet- P40 1%, desoxicolato de sódio 0,1%, 10 mM ortovanadato (Na3VO4), 30 mM fluoreto de sódio (NaF), 40 mM β-Glicerol fosfato (C3H9O6P), PMSF 1% e 0,5% de coquetel de inibidor de protease (AMRESCO).
Após a adição de 100 μL do tampão de lise por poço, o conteúdo foi raspado com raspador de células e o lisado recuperado foi coletado em eppendorfs identificados com data e código da amostra. Cada amostra foi homogeneizada em banho ultrassônico Unique USC 4800 a 40 kHz, a 154W de potência por 5 minutos em banho maria com gelo e posteriormente centrifugadas a 500 x g por 15 minutos para que fosse realizada a retirada do sobrenadante a fim de realizarmos a quantificação de proteínas extraídas em Nanodrop.
As amostras foram então homogeneizadas em tampão de amostra contendo β- mercaptoetanol e aplicadas 100 μg por canaleta, em gel de poliacrilamida SDS-PAGE 12% para eletroforese a 60 V. O processo de transferência ocorreu a 120 mA por 90 minutos em membrana de PVDF. Após a transferência, a membrana foi bloqueada com 5% de leite desnatado (Molico, Nestlé) por 1 hora a temperatura ambiente ou a 4 °C overnight e incubada com os anticorpos primários: anti-FABP4 (Cell Signalling), (1:200); anti-B-actina (Sigma- Aldrich), (1:1000) overnight. Após este período, as membranas foram lavadas com PBST 1X 3 vezes por 15 minutos cada e incubadas com anticorpo secundário-HRP (1:1000) para visualização por quimioluminescência em leitor MicroChemi 4.2 (Uniscience) após 3 lavagens sequenciais de 15 minutos com PBS.
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4.6 FIBROBLASTOS 3T3-L1 E DIFERENCIAÇÃO DE ADIPÓCITOS
Paralelamente aos cultivos in vitro de promastigotas de Leishmania, foram realizados descongelamentos e cultivos de fibroblastos da linhagem 3T3-L1, gentilmente cedidos pelo Prof. William Festuccia do ICB-USP, objetivando a obtenção de adipócitos em cultura.
O cultivo de 3T3-L1 foi realizado em garrafas de 75 cm2, em meio DMEM
(Sigma- Aldrich) acrescido de 10% de SFB e penicilina e estreptomicina. Ao atingirem cerca de 70 a 80% de confluência na garrafa, as culturas foram repicadas utilizando-se tripsina (Sigma- Aldrich) aquecida. Ainda que houvesse garrafas com fibroblastos para serem repicadas, as que já apresentavam alto grau de confluência seguiram para a diferenciação em adipócitos. A indução para diferenciação ocorreu no 6º dia pós-repique, onde as células estavam confluentes o suficiente sem, contudo, estarem sobrepondo-se. Neste dia, o meio da cultura foi substituído por meio fresco, sendo acrescido somente 1 μM de dexametasona, 0,5 mM de isobutil-1-metilxantina (IBMX) e 1 μg/mL de insulina, tornando este o meio padrão para diferenciação de fibroblastos em adipócitos. No dia 9, o meio da cultura foi trocado para o meio padrão acrescido de 1 μg/mL de insulina e posteriormente, no dia 12, o meio foi substituído para o meio padrão inicial.
4.7 INFECÇÃO DE 3T3-L1 E ADIPÓCITOS
A infecção de fibroblastos e adipócitos ocorreu da mesma maneira descrita no item 4.3.1, com pequenas diferenças. A cepa utilizada foi L. (L). amazonensis (MHOM/BR/73/M2269), a carga parasitária foi de 50 promastigotas de fase estacionária por célula hospedeira, em meio DMEM suplementado com 10% de soro fetal bovino. Após 24h de infecção a 34 °C, as infecções foram encerradas, lavadas com PBS aquecido, fixadas com metanol e seguiram para coloração com panóptico rápido.
4.8 MICROSCOPIA ELETRÔNICA DE VARREDURA
Concomitante às infecções em placas de 24 e 6 poços, foram realizadas infecções com IPLA/BR/67/PH8 em novas placas de 24 poços para a realização de
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microscopia de varredura, para avaliarmos a morfologia dos parasitos e a integridade das células infectadas, na presença e/ou ausência do inibidor de FABP4. As infecções foram realizadas conforme protocolo descrito no tópico 4.3.1, porém, as amostras foram submetidas a distintos processos de fixação.
Após a lavagem das lamínulas com PBS aquecido, as amostras foram fixadas com glutaraldeído 2,5 % e mantidas a 4 °C para fixação overnight. No dia seguinte, as mesmas foram desidratadas em concentrações crescentes de etanol (50%, 70%, 80%, 90%, 95% e 100%), sendo deixadas imersas em etanol absoluto até a secagem em Ponto Crítico.
Os equipamentos utilizados para a preparação de amostras e visualização estrutural das mesmas são pertencentes ao Laboratório de Microscopia Eletrônica do Instituto de Biologia da UNICAMP, sendo eles: Ponto Crítico Balzers CPD-030 (secagem das amostras por CO2), Sputter Coater Balzers SCD-050 (metalização
com ouro) e Microscópio Eletrônico de Varredura JEOL JSM 5800LV. As imagens oriundas do microscópio de varredura foram obtidas através do sistema de captura SemAfore 5.21 e posteriormente analisadas.
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A proteína ligante de ácidos graxos do tipo 4 (FABP4; "Fatty Acid-Binding
Protein 4") está presente no citosol de macrófagos e adipócitos e participa do tráfego
de ácidos graxos para diferentes compartimentos celulares. A investigação do seu papel no curso da infecção por protozoários do gênero Leishmania é o principal objetivo do projeto intitulado "O papel das proteínas ligantes de ácidos graxos na infecção de macrófagos por Leishmania: um alvo potencial para novas drogas contra leishmaniose" (Auxílio à Pesquisa - Apoio a Jovens Pesquisadores/FAPESP, 14/21129-4). Inicialmente, foi estabelecido em nosso laboratório o perfil de toxicidade de dois inibidores específicos da atividade desta proteína frente:
1) a macrófagos diferenciados a partir de precursores da medula extraída de fêmur e tíbia e a macrófagos residentes de peritônio, ambos de camundongos Balb/C;
2) a culturas de promastigotas de fase logarítmica de Leishmania spp. Assim, foi possível determinar concentrações ideais para cada um destes inibidores para posterior avaliação da atividade dos mesmos frente à infecção de macrófagos com
Leishmania (Midori V., bolsa IC Fapesp 2015/26408-1).
Este trabalho inicial forneceu subsídios para nossa compreensão acerca do papel da FABP4 no processo infectivo de Leishmania que, a depender da espécie, acaba por se estabelecer de maneira distinta em suas células hospedeiras. Logo, a investigação de sua expressão consistiu no principal objetivo da presente dissertação.
5.1 ESTABELECIMENTOS DE MODELO BIOLÓGICO NO LABORATÓRIO DE ESTUDOS DE BIOLOGIA DA INFECÇÃO POR LEISHMANIA (LEBIL)
Para a realização deste trabalho, foram padronizadas as condições de cultivo de células hospedeiras e parasitos a serem utilizados na rotina de pesquisa no LEBIL, um novo laboratório estabelecido ao final de 2015 e início de 2016 no Departamento de Biologia Animal do Instituto de Biologia da Universidade Estadual de Campinas.
Inicialmente, foram obtidas curvas de crescimento de promastigotas de
Leishmania (Leishmania) amazonensis com o objetivo de avaliarmos o perfil de
crescimento dos parasitos em nossas condições laboratoriais recém-implantadas. Além disso, o conhecimento do perfil de crescimento de nossas culturas é crucial
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para o delineamento de futuros experimentos de infecção, já que a infectividade de
Leishmania é diretamente influenciada pelo estágio da metaciclogênese em que se
encontra [26]. A partir da curva de crescimento obtida (Fig. 9), pode-se verificar que o período de cultivo mais adequado para realizar os ensaios de infecção de células (por ex., macrófagos) e de animais de experimentação está entre o sexto e sétimo dia para L. (L.) amazonensis, início de fase estacionária, no qual é sabido que há maior quantidade de formas metacíclica [26].
Figura 9. Curva de crescimento de promastigotas para L. (L.) amazonensis. As contagens de promastigotas foram realizadas em câmara de Neubauer diariamente utilizando-se microscópio óptico. Notar progressão parasitária contínua até o 6º dia; a partir do 8º dia, a cultura inicia sua fase de decaimento parasitário, configurando o 7º dia como o melhor dia para a realização de infecções in
vitro/in vivo.
Sacks e Kamhawi (2001) [26] afirmam em seu estudo de relação parasita- hospedeiro, que o sétimo dia após o repasto sanguíneo do flebotomíneo é o momento em que os parasitas provenientes do intestino médio do vetor encontram-se em faencontram-se infectiva, na forma metacíclica, apreencontram-sentando-encontram-se mais alongados, com alta motilidade e indivisíveis. Isto corrobora a utilização de nossas culturas no mesmo período infectivo.
Com base nas informações referentes ao crescimento das culturas de promastigotas mantidas no LEBIL, foi possível obter parasitos em fase estacionária para utilização posterior em infecções de animais de experimentação. Após serem inoculados promastigotas de L. (L.) amazonensis na pata esquerda de camundongos Balb/C, a evolução das lesões foi monitorada semanalmente (Fig. 10). O resultado das medições das patas mostra que após 4 semanas houve aumento progressivo das lesões, atingindo a espessura máxima após 9 semanas sem, no entanto, observarmos ulceração no coxim plantar ou no dorso das patas inoculadas (dados não mostrados).
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Figura 10. Evolução de lesão na pata posterior esquerda de camundongos Balb/C infectados com promastigotas de L. (L.) amazonensis (n = 5); Carga parasitária: 1x106 promastigotas por pata.
Gráfico obtido após medição das patas infectadas de camundongos Balb/C infectados com L. (L.)
amazonensis.
Estudos semelhantes são realizados para avaliar a presença de amastigotas no hospedeiro e analisar as mudanças teciduais provocadas pelo parasito, seja a nível celular ou de resposta imunológica frente à infecção [27,28]. Neste projeto, o material de lesão de camundongos infectados foi também avaliado para observação de amastigotas de L. (L.) amazonensis. Para isso, foram realizadas aposições teciduais em lâminas de vidro para posterior fixação, coloração das amostras e visualização de parasitos por microscopia óptica. Numerosos amastigotas puderam ser visualizados em infiltrados inflamatórios repletos de macrófagos, além da presença de parasitos em vacúolos parasitóforos comunais expandidos, característica de infecções pela espécie de Leishmania estudada neste caso (Fig.
