CENTRO UNIVERSITÁRIO UNIVATES
PRÓ-REITORIA DE PESQUISA, PÓS-GRADUAÇÃO E EXTENSÃO PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM BIOTECNOLOGIA
CARACTERIZAÇÃO MOLECULAR DE ENTEROBACTÉRIAS e
Pseudomonas spp. PRODUTORAS DE ESBL, ISOLADAS EM UM
HOSPITAL DO INTERIOR RIO GRANDE DO SUL
Johan Prediger
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Johan PredigerCARACTERIZAÇÃO MOLECULAR DE ENTEROBACTÉRIAS e
Pseudomonas spp. PRODUTORAS DE ESBL, ISOLADAS EM UM
HOSPITAL DO INTERIOR RIO GRANDE DO SUL
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia, do Centro Universitário UNIVATES, como parte da exigência para a obtenção do grau de Mestre em Biotecnologia, na linha de pesquisa Aspectos Moleculares em Processos Fisiopatológicos.
Orientadora: Prof. Dra. Adriane Pozzobon
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AgradecimentosAo Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia da UNIVATES pela oportunidade de aprendizagem através deste curso com docentes muito bem qualificados.
À UNIVATES e ao Prof. Me. Jairo Luís Hoerlle pela oportunidade de trabalhar como monitor docente durante o curso.
Ao setor de Biologia Molecular e seus funcionários, principalmente aos mestrandos e bolsistas Henrique Sulzbach de Oliveira e Bruna Cristina Jordon, o bolsista de iniciação cientifica João Pedro Kipper. E a também mestranda Geórgia Murccillo Dexheimer.
Ao setor de Análises Clínicas e seus funcionários.
Aos responsáveis pelo acervo de amostras de microrganismos da FIOCRUZ do Rio de Janeiro, e do Hospital de Clínicas de Porto Alegre por terem cedido amostras contendo os genes estudados nesta pesquisa.
À Dra. Luciana Weidlich pelo auxílio no projeto.
À minha orientadora Prof. Dra. Adriane Pozzobon pelo empenho, dedicação e paciência neste trabalho.
À toda minha família, principalmente meus pais, que me incentivaram a todos os momentos durante o curso.
À minha namorada Gabriela, pelo apoio nos momentos difíceis.
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SUMÁRIO 1 INTRODUÇÃO ... 11 2.OBJETIVOS ... 14 2.1Objetivo Geral ... 14 2.2 Objetivos Específicos ... 14 3 JUSTIFICATIVA ... 15 4 REFERENCIAL TEÓRICO ... 17 4.1 Infecções hospitalares ... 174.2 Resistência bacteriana e antimicrobianos ... 18
4.3 Mecanismos de Resistência Bacteriana ... 20
4.4 Beta-lactamase de espectro estendido (ESBL) ... 22
4.5 Epidemiologia de produção de ESBL no Brasil ... 24
4.6 Análise dos mecanismos de resistência bacteriana... 25
4.7 Bactérias multirresistentes ... 26
4.7.1 Escherichia coli ... 26
4.7.2 Klebsiella spp. ... 27
4.7.3 Pseudomonas spp. ... 27
4.8. Diversidade de enzimas beta-lactamases e ESBL ... 29
4.8.1 Beta-lactamase tipo TEM ... 29
4.8.2 Beta-lactamase tipo SHV ... 30
4.8.3 Beta-lactamase tipo CTX-M ... 31
4.8.4 Beta-lactamase tipo AmpC ... 32
4.9 Métodos para a identificação de bactérias ESBL ... 32
5. MATERIAIS E MÉTODOS ... 35 5.1 Tipo de Pesquisa ... 35 5.2 População do Estudo ... 35 5.3 Ambiente de Pesquisa ... 35 5.4 Aspectos Éticos ... 36 5.5 Critérios de Inclusão ... 36
5.6 Identificação, antibiograma e método de aproximação de discos das bactérias .... 36
5.7 Análise da presença dos genes TEM, SHV, CTX-M e dos genes pertencentes às famílias CTX-M1, CTX-M2 e CTX-M9 ... 37
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5.8 Controles Positivos ... 38 5.9 Análise estatística ... 39 6. RESULTADOS ... 40 7. DISCUSSÃO ... 44 8. CONCLUSÃO ... 50 REFERÊNCIAS ... 52 APÊNDICES ... 70B
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RESUMODoenças infecciosas são uma das principais causas de morbidade no mundo inteiro, sendo que o uso indiscriminado de antibióticos favorece o desenvolvimento de mecanismos de resistência bacteriana, dificultando o combate às infecções. O número de pacientes infectados por microrganismos resistentes vem aumentando consideravelmente e por isso tem chamado atenção dos serviços de saúde. A presente pesquisa teve como objetivo de verificar a infecção bacteriana e sua resistência aos antibióticos, além da presença de genes produtores de beta-lactamases em um hospital do interior do Rio Grande do Sul. Realizou-se a análise retrospectiva das infecções por bactérias multirresistentes durante o período de janeiro de 2011 a junho de 2012. O isolamento e a identificação das bactérias foram realizados por laboratório terceirizado, e para a avaliação de suscetibilidade aos antimicrobianos foi utilizado o método de difusão de disco, padronizado pelo Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI). A análise retrospectiva de 374 amostras mostrou que diferentes bactérias apresentaram resistência a um grande número de antibióticos. Dentre as mais prevalentes no estudo e que também apresentaram maior percentual de resistência estavam: Klebsiella
spp., Enterobacter spp., Escherichia coli e Pseudomonas spp. Foram coletadas
62 amostras para análise pelo método de triagem para detecção de beta-lactamases de espectro estendido (ESBL), por aproximação de discos, onde 45% foram classificadas com produtoras de ESBL. A caracterização molecular feita nestes mesmos isolados, realizada pela técnica de Reação em cadeia da polimerase (PCR) identificou o gene TEM em 70,96% dos isolados, o gene SHV em 56,45% e, o gene CTX-M em 91,93%, dos quais 24,19% confirmaram a presença de gene pertencente ao grupo CTX-M1, 14,51% ao grupo CTX-M2 e 22,58% ao grupo CTX-M9. Com o presente estudo conclui-se que os genes CTX-M e TEM foram os mais prevalentes entre os genes dos isolados avaliados. Além disso, também se observa a presença de outros genes produtores de ESBL nas amostras analisadas fato que pode estar relacionado ao alto nível de resistência a antimicrobianos das bactérias estudadas.
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Palavras-chave: Resistência a antimicrobianos, Antibióticos, Infecção Bacteriana, Infecção Nosocomial, Hospitais, Beta-Lactamases, Enterobactérias, Genes de resistências.
ABSTRACT
Infectious diseases are a major cause of morbidity worldwide, and the indiscriminate use of antibiotics promotes the development of mechanisms of bacterial resistance, making it difficult to fight infection. The number of patients infected by resistant microorganisms has increased considerably, drawing the attention from health services. The present study aimed to verify the bacterial infection and its resistance to antibiotics, and the presence of genes producing the enzyme beta-lactamase in a hospital from Rio Grande do Sul’s inland city. A retrospective analysis of infections with multidrug-resistant bacteria was conducted during the period from January 2011 to June 2012. The isolation and identification of bacteria were performed by an outsourced laboratory, through the method standardized by the Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI) and for the evaluation of the antimicrobial susceptibility was used the disc diffusion method. The retrospective analysis of 374 bacterial samples showed that different bacteria presented resistance to a large number of antibiotics. Among the more prevalent were: Klebsiella spp, Enterobacter spp,
Escherichia coli and Pseudomonas spp. with a higher percentage of resistance.
62 samples were collected for molecular analysis by the disc diffusion method, where 45 % were classified as producing beta-lactamase (ESBL). The molecular characterization of these same isolated genes, made through the technique of polymerase chain reaction (PCR) identified TEM gene in 70.96 % of the samples, the gene SHV in 56.45 %, CTX-M1 gene in 24.19%, CTX-M2 gene in 14.51 %, CTX -M9 gene in 22.58%, CTX -M gene in 91.93 %. With the present study it was concluded that the CTX -M and TEM genes were the most prevalent genes among the ESBL of the evaluated sample. Besides, it was also observed the presence of other producers of ESBL genes in the samples and this may be related to the high level of antibiotic resistance of the studied bacteria.
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Keywords: Antimicrobial Resistance, Antibiotics, Bacterial Infection, Nosocomial Infection, Hospitals, Beta-Lactamases, Enterobacteria, Resistance Genes.
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LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
ANVISA Agência Nacional de Vigilância Sanitária
CCIH Centro de Controle de Infecção Hospitalar
CESP Citrobacter, Enterobacter, Serratia providencia
CONAMA Conselho Nacional do Meio Ambiente
CTX-M β–lactamase tipo Cefotaximase
DNA Ácido desoxirribonucleico
dNTP Desoxirribonucleotideos fosfatados
EMB ESBL
Eosin Methylene Blue
extended spectrum ß-lactamase
KCl Cloreto de potássio
MYSTIC Meropenem Yearly Susceptibility Test Information
Collection
mm Milímetro
mM Milimolar
OMS Organização mundial de saúde
pb Pares de bases
PCR Polymerase Chain Reaction
PCR-RFLP Fragment Leng Polymorphism
PCR-SSCP Single-Strand Conformational Polymorphism
PFGE Pulsed Field Gel Electrophoresis
SENTRY
Programa de monitoramento de patógenos e resistência em infecções hospitalares e adquiridas na comunidade SHV β–lactamase tipo Sulfhydryl reagent variable
TEM β–lactamase tipo Temoniera UTI Unidade de terapia intensiva
X2 Qui-quadrado
ºC Graus Celsius
μL Microlitro
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LISTA DE TABELASTABELA 1 - Sequência dos primers utilizados no presente estudo...37
TABELA 2 - Programas utilizados para amplificação dos genes analisados....38
TABELA 3: Prevalência dos genes e teste de aproximação de discos em
Klebsiella spp. e Escherichia coli...42
TABELA 4: Resultados de sensibilidade e especificidade da comparação da técnica de PCR e a técnica de aproximação de discos...43
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LISTA DE FIGURASFIGURA 1: Gráfico com o percentual de distribuição dos genes TEM, SHV, CTX-M1, CTX-M2, CTX-M9 e CTX-M nos isolados analisados ...41
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1 INTRODUÇÃOAs bactérias são as principais causadoras de infecções hospitalares. A infecção hospitalar é definida como aquela patologia infecciosa adquirida após a internação do paciente e que se manifesta com sintomas clínicos durante a internação ou mesmo após a alta quando puder ser relacionada com a internação ou procedimentos hospitalares (PEREIRA et al., 2005).
No século XIX, com o surgimento dos hospitais, surgiu a infecção hospitalar, que na época, estava relacionada às condições de higiene e saneamento básico precários nos quais a população se encontrava (MOURA et
al., 2008). Com a ascensão da bacteriologia por Pasteur, os ambientes
insalubres dos hospitais começaram a ser modificados. Outra mudança importante foi imposta por Semmelweis, em 1847, o qual sugeriu a lavagem das mãos com água clorada a todos os profissionais de saúde (ANDRADE et
al., 1999). Nos últimos anos, o número de pacientes infectados por
microrganismos resistentes tem chamado atenção dos serviços de saúde, destacando-se pela diversidade clínica de cada paciente e pelas diferentes condutas dos profissionais de saúde (FERRAREZE et al., 2007; MASTERTON
et al. 2003).
Segundo a Organização Mundial da Saúde (OMS) (2000), os fatores que contribuem para o aumento da multirresistência microbiana são: pobreza, acesso de forma inadequada aos agentes antimicrobianos, prescrição errônea e falha terapêutica, falsificação de medicamentos, maior utilização de medicamentos de amplo espectro, profissionais sem conhecimento técnico, alimentos contaminados e ainda, deficiência na vigilância epidemiológica dentro e fora dos hospitais.
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As doenças infecciosas são uma importante causa de óbito, provocando a morte de cerca de 20 milhões de pessoas por ano no mundo. Destas, cerca de 10 milhões adquirem infecção hospitalar, e 300 mil vão a óbito. Com a introdução de antibióticos nos tratamentos, as bactérias passaram a adquirir mecanismos de defesa contra os mesmos, o que pode ser chamado de multirresistência bacteriana (FERRAREZE et al., 2007, AHLUWALIA, 2007).
Os riscos de infecção hospitalar podem aumentar pelos seguintes fatores: tempo de permanência do paciente no hospital, condições imunológicas por doenças (AIDS, câncer) ou por utilização de imunossupressores, utilização de antibióticos, procedimentos invasivos como entubação traqueal, cateterização venosa ou urinária, endoscopia, traqueostomia, sondagem entre outros, condições nutricionais do paciente, idade, e demais aspectos (FERRAREZE, 2007; SANTOS, 2004).
O isolamento de bactérias Gram-negativas resistentes aos antibióticos carbapenêmicos vem sendo descrito em diversas partes do mundo. No Brasil, em 2003, o primeiro isolado de metalo-beta-lactamase produzida por Klebsiella
pneumoniae foi identificado, o qual foi o precursor de várias outras infecções
similares, mudando o padrão de resistência a antibióticos das bactérias no país (LINCOPAN et al., 2006; PAVEZ et al., 2008; PEIRANO et al., 2008 ZAVAZCKI, et al., 2009).
Um dos mais eficazes mecanismos de defesa das Enterobactérias é a produção de beta-lactamases de espectro estendido (ESBL, do inglês extended
spectrum beta-lactamase), as quais obtiveram maior destaque a partir da
década de 80, quando as cefalosporinas de amplo espectro, como ceftazidima, cefotaxima e ceftriaxona foram usadas exaustivamente no tratamento de infecções causadas por bactérias Gram-negativas. A partir disto as Enterobactérias adquiriram resistência aos antibióticos que antes eram usados como primeira opção no tratamento das mesmas (BONNET, 2004). No Brasil, pesquisas apontam Klebsiella pneumoniae e Escherichia coli como as espécies bacterianas produtoras de ESBL mais frequentes. Contudo, outras bactérias como Pseudomonas spp., Enterobacter spp., Proteus spp. e Providencia spp.
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também são amplamente diagnosticadas como produtoras de ESBL (AMARANTE, 2002; TOFTELAND et al., 2007).
Considerando que estes microrganismos são tão hábeis na aquisição de novas resistências e estando cada vez mais presentes no meio hospitalar, a presente pesquisa foca na análise de genes que possam estar envolvidos com a produção de ESBL e, consequentemente com os mecanismos de resistência. Estudos nessa área podem contribuir para o conhecimento aprofundado da epidemiologia local, com a identificação de mecanismos de defesa bacteriana e consequentemente com a escolha do melhor tratamento.
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2.OBJETIVOS 2.1Objetivo GeralVerificar a prevalência dos genes TEM, SHV e família CTX-M em isolados clínicos em enterobactérias e Pseudomonas spp. provenientes de um hospital do interior do Rio Grande do Sul.
2.2 Objetivos Específicos
- Avaliar os materiais clínicos mais prevalentes relacionados às infecções bacterianas em um hospital de médio porte do interior do Rio Grande do Sul.
- Avaliar a presença dos genes TEM, SHV e família CTX-M em enterobactérias e Pseudomonas spp. resistentes a antimicrobianos.
- Relacionar a presença dos genes codificadores de enzimas beta-lactamase de espectro estendido com o resultado obtido no teste de aproximação de discos.
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3 JUSTIFICATIVAA luta contra infecções bacterianas surge nos tempos da Segunda Guerra Mundial e até hoje continua. A resistência bacteriana continua emergindo e se tornando cada vez mais grave, pois a indústria farmacêutica não segue no mesmo ritmo para a criação de novos fármacos capazes de controlar infecções bacterianas resistentes. Juntamente com o uso excessivo de antimicrobianos, automedicação e prescrições equivocadas de profissionais da saúde, a resistência bacteriana despontou ainda mais.
O uso de antibióticos vem merecendo atenção no mundo inteiro. Autoridades, inclusive do Brasil, desenvolveram políticas para a racionalização do uso destes medicamentos. Cautela essa adotada uma vez que antimicrobianos são os medicamentos mais utilizados na atenção primária e, por se tratar do medicamento mais prescrito erroneamente. Além de aumentar a resistência antimicrobiana através do método de seleção microbiana de antibióticos, o uso indiscriminado eleva os custos para a sociedade (ABRANTES et al, 2008).
O Ministério da Saúde (MS) elaborou um documento em 2001 denominado de Consenso sobre o uso racional de antimicrobianos, o qual visa orientar o diagnóstico de uma infecção, avaliar a necessidade da terapia antimicrobiana, escolher o fármaco correto e como fazer associações entre antimicrobianos (BRASIL, 2001).
Além de conter o uso equivocado de antibióticos, é importante monitorar as diferentes resistências bacterianas, para que seja possível adotar estratégias de prevenção e controle de infecções, já que este é considerado um problema de saúde pública mundial. A partir da tecnologia de análise
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genética, é possível determinar qual é o mecanismo de resistência a antimicrobianos que determinado isolado bacteriano possui, além do perfil fenotípico que é realizado rotineiramente em todos os hospitais. A genotipagem de bactérias que apresentam multirresistência a antimicrobianos pode ser muito útil para o monitoramento da resistência em determinado serviço hospitalar, determinação de relação epidemiológica entre os casos, caracterização de surtos hospitalares e desenvolvimento de estratégias e medidas para aperfeiçoar o controle destas infecções a nível institucional (BONNET, 2004).
Nos últimos anos as bactérias Gram-negativas têm adquirido um papel importante nas infecções hospitalares. Bactérias produtoras de ESBL são classificadas como urgências hospitalares, principalmente em Unidades de terapias intensiva, onde Klebsiella pneumoniae, Escherichia coli, Pseudomonas
spp. e Enterobacter spp. são os principais motivos de preocupação dos
serviços de combate de infecções (BELL et al., 2007; DESHPANDE et al., 2006). A Klebsiella spp. é uma das bactérias mais frequentes em infecções hospitalares, muito associada a pneumonias e infecções urinárias. Está entre os cinco patógenos mais frequentes na América Latina (SADER et al., 2004).
A região da América Latina é um dos principais focos de prevalência de bactérias produtoras de ESBL. Essa porcentagem pode chegar a 40% dos isolados, por outro lado 5% das bactérias são diagnosticadas como produtoras de ESBL em outros locais do mundo (FEDLER et al., 2006). O tratamento de infecções causadas por bactérias produtoras de ESBL é através de carbapenêmicos, que por sua vez é considerada a última alternativa terapêutica se tratando de antibióticos (WOODFORD et al., 2000).
Diante do exposto destaca-se que estudos moleculares para avaliação de genes relacionados à produção de ESBL são de extrema importância epidemiológica, pois fornecem dados que indicam quais genes são mais prevalentes e desta forma podem contribuir para o conhecimento da evolução da multirresistência e auxiliar no seu controle e tratamento.
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4 REFERENCIAL TEÓRICO 4.1 Infecções hospitalaresAs infecções hospitalares desenvolvem-se normalmente em 48 a 72 horas após a internação hospitalar, não estando presentes, nem em incubação, no momento da admissão (TIERNEY et al., 2006).
A infecção hospitalar é uma das complicações mais frequentes que ocorrem nos doentes internados nas Unidades de Terapia Intensiva (UTI), sendo que a ocorrência destas infecções pode levar a um aumento do risco de mortalidade, principalmente em pacientes em estado grave e em casos de internações de tempo prolongado. Deste modo, aumentam também o tempo de permanência do paciente na UTI e os custos hospitalares (FLOROS e ROUSSOS, 2001; COUTO et al, 2003).
Pacientes internados nas UTI adquirem infecções hospitalares com uma frequência muito superior aos demais pacientes do hospital, sendo o risco de 5 a 10 vezes maior do que os internados em enfermarias e centros cirúrgicos (WEBER et al., 1999). Os pacientes internados em UTI abrangem um pequeno grupo dos pacientes hospitalizados, representando cerca de 5 a 10% do total, mas contam com mais de 20% dos episódios de infecções hospitalares (LIMA
et al., 2007).
O aumento do risco está intimamente relacionado com o estado e a gravidade da condição clínica do doente, com o tempo de exposição aos procedimentos e dispositivos invasivos, com o tempo de permanência na UTI e também com as características físicas do local, tais como as limitações de espaço. Ainda assim, estima-se que cerca de um terço das infecções
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hospitalares possam ser evitadas através de programas de prevenção (RICHARDS et al., 2003; FLOROS e ROUSSOS, 2001).
Dentre as principais causas de infecção nos hospitais, temos o paciente susceptível, ou seja, com algum grau de imunodepressão, métodos diagnósticos e terapêuticos não utilizados ou equivocadamente utilizados, e a má utilização de métodos de assepsia realizados pelo serviço de saúde (CAETANO et al., 2011).
As infecções hospitalares representam um dos maiores problemas de saúde pública, sendo responsáveis por diversos óbitos ou prolongamento de internações e com isso aumentando os gastos com a saúde (JACOBY, 2008; BORGES, 2009).
Os avanços na área microbiológica têm favorecido a identificação de bactérias e ajudado a relacionar casos com: infecções, contaminação ambiental e mudança do padrão de sensibilidade de antibióticos (ANDRADE et
al., 2006).
4.2 Resistência bacteriana e antimicrobianos
Com a introdução dos antibióticos para o tratamento de infecções bacterianas, as bactérias desenvolveram formas de resistência a estes fármacos. Além disso, algumas espécies bacterianas são consideradas naturalmente resistentes aos antimicrobianos, que é chamada resistência intrínseca, como por exemplo, a Klebsiella spp. que é considerada resistente ao antibiótico Ampicilina. Já outras podem adquirir esta resistência com uma exposição prolongada, através dos seus mecanismos de defesa. Estes mecanismos adquiridos resultam em alterações na fisiologia celular e na estrutura microbiana devido a alterações genéticas (O’BRIEN, 2002).
Entre as principais bactérias que adquirem resistências a antimicrobianos atualmente, estão as enterobactérias, as quais se tornaram um dos principais grupos de patógenos em se tratando de Infecções Hospitalares,
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além de estarem frequentemente associadas à mortalidade, graças aos altos índices de resistência. Estudos realizados pelo SENTRY (Programa de monitoramento de patógenos e resistência em infecções hospitalares e adquiridas na comunidade) ou MYSTIC (Meropenem Yearly Susceptibility Test
Information Collection) têm destacado a participação de alguns gêneros da
família Enterobacteriaceae, definindo assim os grupos CESP (Citrobacter,
Enterobacter, Serratia providencia) produtores de ESBL como uma urgência
clínica e epidemiológica (KIFFER et al., 2005; BELL et al., 2007).
Além do crescente aumento de casos de ESBL, a presença da enzima AmpC veio a dificultar ainda mais os tratamentos e diminuir as opções de antimicrobianos possíveis de serem utilizados. O Enterobacter spp. é um exemplo clássico de hiperprodutor de AmpC cromossomoal (SEREFHANOGLU
et al, 2009; TURNER et al., 2009).
Os beta-lactâmicos representam a classe de antimicrobianos mais variada e mais amplamente utilizada na rotina médica (BERTONCHELI e HÖRNER, 2008). Sua baixa toxicidade e a atividade modulada de acordo com as características moleculares do anel beta-lactâmico, justificam a sua utilização (KUBOYAMA, 2009).
No tratamento de infecções causadas por enterobactérias produtoras de ESBL e AmpC, estão entre as poucas alternativas de antibióticos úteis os carbapenêmicos, os quais se tornaram a última alternativa de terapia para essas bactérias, uma vez que resistem à degradação da maioria das enzimas beta-lactamases. Além disso, apresentam elevada afinidade pelas proteínas ligadoras de penicilina e uma excelente permeabilidade na membrana externa (SADER, et al., 2004; DESHPANDE et al. 2006; SEREFHANOGLU et al, 2009).
Os carbapenêmicos são antibióticos beta-lactâmicos com amplo espectro de atividade. Assim como todo beta-lactâmico, esses agem inibindo a síntese da parede bacteriana pela sua ligação e inativação das proteínas ligadoras de penicilinas. Os beta-lactâmicos atuam na fase extracitoplasmática da síntese da parede bloqueando a transpeptidação, ligação covalente das
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cadeias lineares de fragmentos precursores do peptidoglicano catalisada pelas transpeptidases. O fármaco é um análogo estereoquímico do segmento ativo das proteínas ligadoras de penicilina, o que torna essas enzimas indisponíveis para o funcionamento, desestruturando a camada de peptidoglicano da célula bacteriana e predispondo a bactéria à lise celular (SAMPAIO, 2007; NETO et
al., 2007; SHIJU et al, 2010).
Os carbapenêmicos como meropenem e imipenem possuem um amplo espectro de ação in vitro, com atividade inibitória a cocos Gram-positivos, bacilos Gram-negativos e bactérias anaeróbias, com exceção de Enterococcus
spp., Staphylococcus meticilina resistentes e Stenotrophomonas maltophila
(MOHR, 2008; SHIJU et al, 2010).
4.3 Mecanismos de Resistência Bacteriana
A resistência bacteriana aos antimicrobianos e outros compostos podem se apresentar sob diferentes fenômenos bioquímicos. Geneticamente, a resistência pode ser adquirida por mutações ou pela aquisição de genes, situados em elementos extracromossomais, tais como plasmídeos ou, ainda, como os transposons e os íntegrons (RANG et al., 2012; SERRANO, 2005).
Os plasmídeos são elementos extracromossomais de DNA circulares, encontradas livremente no citoplasma, que podem se replicar. A sua origem não é conhecida, porém grande parte da resistência a fármacos se deve a presença desses plasmídeos. A presença destes elementos pode conferir vantagens genéticas, como resistência a um metal tóxico ou antibiótico ou degradação de alguns substratos. Em situações adversas como, altas temperaturas ou falta de nutrientes, os plasmídeos podem ser eliminados das células (RANG et al., 2012).
Nas enterobactérias, a permeabilidade de membrana é a chave na sensibilidade aos antibióticos. A primeira linha de defesa contra compostos tóxicos é a membrana externa, na qual substâncias ingressam, sendo
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controladas pelas porinas, as quais são proteínas que formam canais constituídos de água no seu interior, permitindo a difusão passiva de solutos hidrofílicos através da membrana externa (NIKAIDO, 2003).
Mecanismos de impermeabilidade também estão presentes na membrana da bactéria. Mecanismos de impermeabilidade também estão presentes na membrana da bactéria. Nas bactérias Gram negativas, a membrana externa é constituída por lipídios e a membrana interna por fosfolipídios. Esta constituição atribui uma lenta penetração do fármaco e a passagem pela membrana externa é realizada através das porinas, as quais formam canais hidrofílicos. Os fármacos podem penetrar através da membrana celular de três diferentes formas: Através da difusão pela porinas, por difusão na bicamada fosfolipídica ou por self promoted uptake. A penetração na bactéria depende das características intrínsecas das moléculas de antibiótico. Desta forma os compostos hidrofílicos penetram através das porinas. Os antibióticos como os beta-lactâmicos e tetraciclinas penetram no interior da célula através de porinas presentes na membrana externa. Qualquer diminuição na função ou quantidade de porinas levará à resistência da bactéria ao antibiótico, baixando o nível de antibiótico no interior da bactéria (DECLOUR, 2009).
Outro mecanismo são as bombas de efluxo, que são responsáveis por expulsar as drogas de dentro do citoplasma, produzindo uma hiperexpressão de sistemas de bombas de efluxo. Este mecanismo de efluxo contribui para a resistência intrínseca e adquirida em Enterobactérias (PIDDOCK, 2006, DAVIN-REGLI et al., 2008). Os sistemas de efluxo são normalmente formados por três proteínas de membrana: a bomba de efluxo presente na membrana citoplasmática, canal expulsador presente na membrana externa e a proteína de fusão que liga os outros dois componentes (PIDDOCK, 2006). Em
Pseudomonas aeruginosa, o sistema Mex tem sido descrito como mecanismo
de resistência a diversos antimicrobianos, entre eles, ao meropenem. Porém, em enterobactérias, nenhum sistema de efluxo descrito contribui com a expulsão dos antibióticos beta-lactâmicos (PATTERSON, 2006).
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A resistência de Enterobactérias a carbapenêmicos vem crescendo nos últimos anos. As Enterobactérias têm desenvolvido sofisticados mecanismos de resistência contra os antibióticos beta-lactâmicos, como: limitação do acesso intracelular do fármaco através da sua membrana externa, por meio da impermeabilidade ao antibiótico associada a uma produção de enzimas de tipo AmpC e ou ESBL. A degradação do antibiótico por meio de enzimas hidrolisadoras como a produção de carbapenemases do tipo serina e metalo-beta-lactamases. E também há proteção dos alvos por meio da alteração das proteínas ligadoras de penicilina (DAVIN-REGLI et al., 2008).
As lactamases são enzimas que catalisam a hidrólise do anel beta-lactâmico, impossibilitando, desta maneira, a sua atividade antimicrobiana através de dois possíveis mecanismos de ação que são: a utilização de zinco como cofator para a atividade enzimática e a via éster de serina. A maioria apresenta a via serina como o mecanismo de ação, poucas beta-lactamases possuem o mecanismo de utilização do zinco. As metalo beta-lactamases atacam o anel beta-lactâmico pela hidroxila livre da cadeia lateral do resíduo de zinco localizado no sítio ativo da enzima, produzindo um éster acil covalente, que sofre uma hidrólise e libera a enzima ativa e o hidrolizado resultante. Este último é a droga inativada (WALEY, 1987).
4.4 Beta-lactamase de espectro estendido (ESBL)
Beta-lactamases de espectro estendido, também conhecidas como ESBL (extended-spectrum beta-lactamase), são enzimas capazes de hidrolisar cefalosporinas de terceira geração (oximino-cefalosporinas) 10% a mais do que hidrolisam as benzilpenicilinas. Possuem sítio de ação contendo o aminoácido serina como resíduo catalítico principal, e normalmente são inibidas por compostos como ácido clavulânico, sulbactam e tazobactam, presentes em antibióticos (BRADFORD 2001; STÜRENBURG e MACK 2003; PFALLER & SEGRETI 2006).
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A primeira bactéria produtora de ESBL foi diagnosticada em 1982 na cidade de Liverpool na Inglaterra, em uma cepa de Klebsiella oxytoca (PAYNE et al. 1990). Hoje em dia mais de 200 tipos de ESBL são conhecidas e a alta prevalência dessa enzima é refletida na expansão clonal, localizando-se no plasmídeo ela tem uma característica de ser amplamente disseminável (LIVERMORE & WOODFORD, 2006).
Este primeiro relato de beta-lactamases capazes de hidrolisar as cefalosporinas de espectro estendido mediada por plasmídeos, foi de um gene que codifica a beta-lactamase, o qual mostrou uma mutação de um único nucleotídeo comparado com o gene que codifica SHV-1. Outras beta-lactamase foram logo descobrindo que estavam intimamente relacionados com TEM-1 e TEM-2, mas que tinham a capacidade de conferir resistência às cefalosporinas de espectro estendido. Portanto, essas novas beta-lactamases foram cunhados de espectro estendido beta-lactamase (SIROT et al.,1987; BRUN-BUISSON et al., 1987).
O esquema de Ambler divide beta-lactamases em quatro classes principais (A a D). A base deste esquema de classificação repousa sobre homologia de proteínas (similaridade de aminoácidos), e não as características fenotípicas. No esquema de classificação Ambler, beta-lactamases das classes A, C, e D são serina beta-lactamase. Em contraste, as enzimas da Classe B são metalo-beta-lactamases. Os Bush-Jacoby-Medeiros grupos esquema de classificação beta-lactamases de acordo com semelhanças funcionais (substrato e perfil inibidor). Existem quatro grupos principais e vários subgrupos neste sistema. Este sistema de classificação é de relevância muito mais imediata ao médico ou microbiologista em um laboratório de diagnóstico, pois considera inibidores beta-lactamase e substratos beta-lactâmicos que são clinicamente relevantes (AMBLER et al., 2003; BUSH et al., 1995).
A definição de ESBL mais utilizada é que são beta-lactamases capazes de conferir resistência bacteriana às penicilinas, primeiro, cefalosporinas de segunda e terceira geração, e aztreonam (mas não cefamicinas ou carbapenemos) por hidrólise destes antibióticos, e que são inibidos pelos
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inibidores da beta-lactamase tais como ácido clavulânico. O termo ESBL se aplica nas lactamases do grupo 2be de Bush-Jacoby-Medeiros e as beta-lactamases do grupo 2d que compartilham a maioria das propriedades fundamentais de enzimas do grupo 2be. O grupo 2be mostra que estas enzimas são derivadas de grupo 2b beta-lactamase (por exemplo, TEM-1, TEM-2, e SHV-1). A letra ―e‖ de 2be indica que as beta-lactamases tem um espectro alargado. Enzimas do grupo 2b hidrolisam penicilina e ampicilina, e a um menor grau carbenicilina ou cefalotina. Eles não são capazes de hidrolisar cefalosporinas de espectro estendido ou aztreonam em qualquer grau significativo (BUSH et al., 1995).
A facilidade de mutação leva ao desenvolvimento de novas beta-lactamases. Muitas das enzimas hoje conhecidas pertencem a famílias com graus de relacionamento e semelhanças funcionais. O diagnóstico correto dessas bactérias é importante, pois está relacionado ao uso indiscriminado de antibióticos pela população. Entretanto, a importância clínica das beta-lactamases está relacionada a uma combinação de fatores que, em especial, leva a aspectos funcionais e não estruturais, tendo importância a especificidade de hidrólise e o nível de expressão da atividade enzimática (BUSH, 2001).
A grande maioria das enzimas beta-lactamases é derivada dos genes: TEM (150 variedades) e SHV (88 variedades). Outros tipos de beta-lactamases são: CTX-M, OXA, PER, VEB, CME, TLA, SFO, GES e BES. (BRADFORD 2001).
4.5 Epidemiologia de produção de ESBL no Brasil
A primeira enzima do tipo CTX-M identificada foi em 1990 (BONNET et
al., 2000). Apesar disto, existem poucos dados epidemiológicos sobre
infecções de bactérias produtoras de ESBL no Brasil. A maioria destes estudos avaliam a presença destas multirresistências em Unidades de terapia intensiva.(UTIs) (SUPERTI et al, 2009).
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As principais pesquisas se realizam nas regiões sul e sudeste do Brasil. As beta-lactamases mais frequentemente isoladas no país incluem os grupos CTX-M2, CTX-M8 e CTX-M9 (SILVA & LICOPAN, 2012).
O isolamento de enterobactérias produtoras de ESBL é realizado em diversos sítios de infecções, e diversas espécies são isoladas com a presença do gene, como: Klebsiela spp., Escherichia coli, Salmonella enterica, Citobacter
spp., Proteus mirabillis e Serratia marcescensi. Mas as cepas que levam maior
urgência do ponto de vista clínico são a Klebsiella spp. e a Escherichia coli devido a maior prevalência dos genes encontrados nestas espécies (SILVA & LICOPAN, 2012).
A identificação de isolados produtores de enzimas ESBL varia muito de região para região, sendo mais alta na América Latina (KIFFER et al., 2005; FEDLER et al., 2006). Nos Estados Unidos a prevalência de amostras de
Klebsiella pneumoniae produtoras de enzimas ESBL não ultrapassa 5%. Na
Europa varia entre 20 e 25 % e na América Latina a prevalência varia entre 35 e 40% (FEDLER et al., 2006). Na África cepas produtoras de ESBL chegam a prevalências de 15% (TANSARLI et al., 2014). No Brasil tem sido relatado que 12,1% a 16,9% das infecções em UTI’s são causadas por Klebsiella
pneumoniae (OPLUSTIL et al., 2005).
4.6 Análise dos mecanismos de resistência bacteriana
Ensaios moleculares/genotípicos para a detecção de resistência bacteriana podem oferecer vantagens em relação a ensaios fenotípicos, como ocorre para a detecção da resistência à meticilina mecA para Staphylococos
spp., resistência a rifampina para Mycobacterium tuberculosis. Porém, estes
ensaios moleculares também apresentam algumas limitações, pois além de ter um valor elevado para sua realização, novos mecanismos de resistência bacteriana podem ser perdidos. Para diagnóstico de rotina, o método de escolha ainda é o ensaio fenotípico. Desta forma, a determinação da resistência antimicrobiana de um isolado clínico é de extrema importância para
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um tratamento adequado para os pacientes infectados (FLUIT et al., 2000; LIVERMORE & WOODFORD, 2006).
Os genes CTX-M estão geralmente associados à plasmídeos, de tamanhos que variam de 7kb a 160kb, e estão inseridos em transposons ou em integrons. Genes como o TEM, OXA e SHV, que conferem resistência a antibióticos beta-lactâmicos, são frequentemente encontrados no mesmo plasmídeo. Esses plasmídeos podem carrear junto com eles outros genes de resistência a antibióticos como: aminoglicosídeos, cloranfenicol, sulfonamidas, trimetoprim e tetraciclina. Fato que diminui a chance de inibição por diversos antibióticos e leva a um processo de seleção natural, onde estas bactérias levam vantagem (CANTÓN et al., 2006; LIVERMORE & WOODFORD, 2006).
4.7 Bactérias multirresistentes 4.7.1 Escherichia coli
Pertencente ao grupo de enterobactérias, a bactéria Escherichia coli é um agente patogênico muito comum, tanto no ambiente em geral quanto no ambiente hospitalar. É a principal bactéria do gênero Escherichia, sendo descoberta em 1895, pelo pediatra alemão Theodor Escherich (EISENSTEIN & ZALEZNIK, 2000). Possui grande importância microbiológica e médica devido a infecções causadas e principalmente ao surgimento de cepas multirresistentes aos antibióticos utilizados na terapêutica (MURRAY et al., 2007).
Sempre presente no trato intestinal, a Escherichia coli é muitas vezes responsável por infecções intra e extra intestinais (PROCOP & COCKERILL III, 2004). Em casos de infecção do trato urinário, a Escherichia coli é a causa mais frequente da patologia, chegando a ser identificada em 85% dos casos (RONALD et al., 2001).
Em crescimento nos meios de cultura seletivos, a Escherichia coli apresenta diferentes características, produzindo colônias negras esverdeadas com brilho metálico em ágar EMB (do inglês, Eosin Methylene Blue) ou
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colônias rosadas (lactose positivas) em Agar MacConkey. As cepas de
Escherichia coli são associadas pelas propriedades bioquímicas entre elas: fermenta a lactose, produz indol a partir do triptofano, fermenta a glicose pela
via de ácidos mistos e Voges-Proskauer negativo. Não produz ácido sulfídrico (H2S), DNase, urease ou fenilalanina desaminase e não utiliza citrato como
fonte de carbono (BOPP et al., 2003).
4.7.2 Klebsiella spp.
O gênero Klebsiella se divide em três espécies: K. pneumoniae, K.
oxytoca e K. granulomatis. A mais comumente identificada é a Klebsiella pneumoniae e seus principais sítios de infecção são: trato urinário, pulmão,
trato biliar e ferida operatória (ZAOUTIS et al., 2005).
A Klebsiella spp. tem uma alta virulência graças a sua cápsula de polissacarídeos, a qual tem mais de 70 antígenos diferentes. Essa cápsula confere à bactéria a característica mucóide quando isolada no laboratório (SCWABER et al., 2006). A Klebsiella spp., como todas as enterobactérias, pode se tornar multirresistente a antibióticos, tornando-se um microrganismo constantemente combatido no ambiente hospitalar (ARCHIBALD, 2004).
Isolados de Klebsiella spp. são as espécies mais identificadas como produtoras de ESBL, sendo que 2 a 5% das infecções hospitalares, principalmente respiratórias e urinárias, estão associadas a esta espécie. Dados mostram uma prevalência de aproximadamente 50% de identificação de produção de ESBL em Klebsiella pneumoniae (MARTINS-LOUREIRO et al., 2001; PFALLER & SEGRETTI, 2006)
4.7.3 Pseudomonas spp.
Surtos de infecções hospitalares têm sido provocados por Pseudomonas
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principalmente em ambientes hospitalares. Pseudomonas aeruginosa multirresistente, por exemplo, é uma das principais causas de pneumonia relacionadas à infecção hospitalar em diversas UTI do país (GALES et al., 2003; ROSSI, 2011).
Pseudomonas aeruginosa possui diversas resistências intrínsecas como:
sistemas de bombas de efluxo, impermeabilidade da membrana externa e produção de enzimas AmpC cromossomal (FLAHERTY & STOTON, 2004). Também se destacando como produtoras de Metalo-beta-lactamases (JACOBY et al., 2005)
A Pseudomas spp. é um bacilo Gram-negativo não fermentador da glicose, e é isolado nos mais diversos materiais. Atualmente é um dos principais agentes de infecção hospitalar e um dos microrganismos mais isolados nos laboratórios de microbiologia. Devido a sua grande versatilidade nas necessidades nutricionais, pode ser encontrado em praticamente todos os meios de cultura em temperaturas de 4ºC a 42ºC (MURRAY et al., 2003). Dificilmente causa infecção em indivíduo imunocompetente, porém é um dos principais agentes infecciosos em casos de imunodepressão (TRABULSI et al., 2003, HOSOGLU et al., 2011).
4.7.4 Enterobacter spp.
O gênero Enterobacter ocupa o terceiro lugar de prevalência na família
Enterobacteriaceae no mundo. Os membros do gênero Enterobacter são o
quinto patógeno mais isolado em pacientes pediátricos (FEDLER et al., 2006; TURNER, 2009). Enterobacter spp., também são amplamente identificados em ambientes hospitalares e como a Pseudomonas spp, estão relacionado a um aumento de casos de produção de ESBL (SCHWABER et al., 2003).
A produção de ESBL em Enterobacter spp. e Pseudomonas spp. não são identificados pelo método de aproximação de discos, pois são produtores de enzimas AmpC. Já em organismos que produzem ESBL, mas não
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produzem AmpC, o clavulanato irá inibir a actividade de ESBL, levando ao aumento da zona de inibição na área entre o disco de amoxicilina / clavulanato e qualquer um dos discos de cefalosporina de terceira geração. No entanto, em ambos os organismos que produzem ESBL e AmpC, clavulanato podem induzir a produção de beta-lactamase AmpC, levando à hidrólise de cefalosporina de terceira geração, mascarando qualquer sinergia resultante da inibição da ESBL.
4.8. Diversidade de enzimas beta-lactamases e ESBL 4.8.1 Beta-lactamase tipo TEM
A enzima TEM, foi assim denominada em homenagem ao primeiro isolado bacteriano ter sido obtido de uma menina grega chamada Temoniera.O gene TEM-1 é capaz de hidrolisar a ampicilina a uma taxa maior do que a carbenicilina, a oxacilina, ou cefalotina, e tem uma baixa atividade contra as cefalosporinas de largo espectro. É inibido pelo ácido clavulânico. TEM-2 tem o mesmo perfil hidrolítico como TEM-1, mas difere do mesmo por ter um promotor nativo mais ativo e por uma diferença em ponto isoeléctrico (5,6 comparado com 5,4). TEM-13 também tem um perfil semelhante ao hidrolítica TEM-1 e ao TEM-2. (JACOBY et al, 1991). Portanto os genes TEM-1, TEM-2 e TEM-13 não são considerados produtores de ESBL (SIROT et al., 1987).
O gene TEM-1 localiza-se no transposon Tn3, que é pouco específico e permite diversos tipos de rearranjos, além de facilitar sua disseminação para outras espécies bacterianas. Este é o gene mais comumente presente em isolados produtores de enzima beta-lactamase e bactérias como Escherichia
coli, Klebsiella spp. e Proteus mirabillis (CAO et al., 2002; PAGANI et al.,
2002).
A substituição de aminoácidos que ocorreram nas enzimas do tipo TEM1 causaram diversas alterações nos fenótipos de enzimas beta-lactamases e formaram a enzima tipo TEM2, como a habilidade de hidrolisar
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cefalosporinas ou alterar seus pontos isoelétricos de 5,2 para 6,5, mas continuando não sendo produtora de ESBL (PFALLER & SEGRETI, 2006).
Em 1987, em um isolado de Klebsiella pneumoniae, foi relatada a primeira enzima tipo TEM3, a qual teve a modificação de dois aminoácidos a partir de uma enzima tipo TEM2, característica que possibilitou o isolado a expressão o fenótipo ESBL (DU BOIS et al., 1995). Mais de 150 tipos de enzimas TEM já foram descritas, algumas delas resistentes aos inibidores de beta-lactamase, mas, a maioria apresenta o fenótipo ESBL (BRADFORD, 2001)
4.8.2 Beta-lactamase tipo SHV
SHV é uma enzima encontrada principalmente em Klebsiella
pneumoniae e torna as bactérias mais resistentes aos antibióticos ampicilina,
amoxacilina e às carboxipenicilinas. Assim denominada em virtude da estrutura química sulfidirl variável em seu sítio ativo. Ocorre em diversas enterobactériase também em outras bactérias como Pseudomonas aeruginosa
e Acinetobacter spp. É uma enzima codificada por um gene plasmidial (ROSSI
& ANDREAZZI, 2005).
A SHV tem ponto isoelétrico entre 7,0 e 8,2, e não é capaz de hidrolisar as cefamicinas e carbapenêmicos, mas hidrolisa as oximinocefalosporinas e é inibida pelos inibidores de beta-lactamase. As formas mais prevalentes são a SHV-1 e a SHV-2, caracterizados pela substituição de serina por glicina na posição 238. (BRADFORD, 2001).
Atualmente há mais de 90 variantes da enzima SHV, sendo que a maioria possui o fenótipo ESBL. O gene SHV-1 não é considerado produtor de ESBL (KNOTHE et al., 1983; PATERSON & BONOMO, 2005).
