PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS
ANÁLISE TÉRMICA DE HORMÔNIOS BIOIDÊNTICOS: UMA ABORDAGEM QUANTITATIVA
GEOVANA QUIXABEIRA LEITE
NATAL-RN 2018
GEOVANA QUIXABEIRA LEITE
ANÁLISE TÉRMICA DE HORMÔNIOS BIOIDÊNTICOS: UMA ABORDAGEM QUANTITATIVA
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Ciências Farmacêuticas para obtenção do título de Mestre em Ciências Farmacêuticas.
ORIENTADOR: Prof. Dr. Cícero Flávio Soares Aragão CO-ORIENTADOR: Profa. Dra. Ana Paula Barreto Gomes
NATAL-RN 2018
CDU 615.011:577.17 RN/UF/BSCCS
1. Análise térmica - Dissertação. 2. Validação analítica - Dissertação. 3. Estradiol - Dissertação. I. Aragão, Cícero Flávio Soares. II. Gomes, Ana Paula Barreto. III. Título. Leite, Geovana Quixabeira.
Análise térmica de hormônios bioidêntico: uma abordagem quantitativa / Geovana Quixabeira Leite. - 2018.
85f.: il.
Dissertação (Mestrado em Ciências Farmacêuticas) -
Universidade Federal do Rio Grande do Norte, Centro de Ciências da Saúde, Programa de Pós-Graduação em Ciências Farmacêuticas.
―Para todos que já tiveram um momento de fraqueza. Não vai doer para sempre, então não deixe isso
Primeiramente a Deus. Toda honra e toda glória para ELE.
À minha mãe, meu pai e irmão por vibrarem pelas minhas conquistas e aceitarem as minhas ausências. Por acreditarem em meu sonho e permitir torná-lo realidade.
Ao professor Cícero Flávio Soares Aragão por mais uma vez contribuir com o meu crescimento profissional. Por todos os ensinamentos, paciência e compreensão.
À professora Ana Paula Barreto Gomes pela co-orientação no trabalho, mas especialmente pelas suas palavras de carinho e incentivo.
Ao professor Fernando Henrique Andrade Nogueira pelas orientações e auxilio para o desenvolvimento do trabalho.
À Nilma por tanto carinho, cuidado e amor durante todos esses anos de LCQMed.
À Thereza, Dayanne e Fátima por todo apoio desde o começo, sempre com muito carinho e incentivo. Pela a amizade conquistada durante os anos.
Às minhas amigas de pós-graduação, Jéssica e Fernanda. Vivenciamos está experiência juntas, nos apoiando e dividindo muitas alegrias e tristezas.
Aos amigos do Laboratório de Controle de Qualidade de Medicamentos pelo convívio diário, em especial Antônio Rodrigo, Juliana, Karlene, Gabriela, Jonh e Venâncio, por me ajudarem em muitos momentos.
Às colegas do LDM, Mariana, Judite e Silvana pela ajuda em vários momentos. Principalmente na reta final deste trabalho.
Ao professor Fábio Santos Souza pela disponibilidade do Laboratório de Controle de Qualidade de Produtos Naturais, na UFPB, pelas análises no DSC-fotovisual.
Aos meus amigos de graduação Elaine, Iago, Joaquim, Kimênia, Renata e Luciana por tornarem os meus dias mais felizes. Pela imensa amizade demonstrada no dia-a-dia.
Federal do Rio Grande do Norte. Natal, RN, 2018.
RESUMO
Os hormônios bioidênticos são compostos que possuem exatamente a mesma estrutura química e molecular dos hormônios humanos endógenos. Dentre os quais podem-se citar aqueles responsáveis pelos caracteres femininos que geralmente são prescritos na menopausa e que são desenvolvidos pela indústria farmacêutica, necessitando o desenvolvimento de métodos de controle de qualidade de medicamentos. Neste trabalho foi desenvolvido e validado um método de análise baseado na técnica de análise térmica diferencial (DTA). As análises do DTA foram realizadas em uma termobalança da Shimadzu, modelo DTG-60 (simultâneo TG/DTA), sob atmosfera de N2 com
50 mL min-1, utilizando panela de alumínio com cerca de aproximadamente 5 ±
0,5 mg de amostra em uma razão de aquecimento de 10 ºC min-1 entre 25-300 ºC. A validação do método analítico por DTA foi realizada com a determinação da seletividade, curva analítica e linearidade, precisão, limite de detecção e limite de quantificação, exatidão e robustez. Resultados satisfatórios foram obtidos na linearidade com coeficiente de correlação 0,9995, precisão, exatidão e robustez.
Palavras-chave: Validação; Metodologia Analítica; Análise Térmica; DTA; Estradiol;
Federal do Rio Grande do Norte. Natal, RN, 2018.
ABRSTRACT
Bioidentical hormones are compounds that have exactly the same chemical and molecular structure as endogenous human hormones. Among which may be mentioned those stakeholders female characters usually are prescribed House on menopause and are environmentally by the pharmaceutical industry, requiring the development of methods of quality control of medicines. In this work, we developed and validated a method of analysis based on the technique of reducing differential analysis (DTA). DTA analysis was performed on Shimadzu thermobalance, model DTG-60 (simultaneous TG/DTA), under dynamic atmosphere of N2 at 50 mL min-1, using aluminum pan with about
approximately 5 mg of samples and heating rate of 10 ºC min-1 in the from 25 -300 ºC. The validation of analytical method for DTA was carried out with the determination of selectivity, analytical curve and linearity, precision, limit of detection an limit of quantification, accuracy and robustness. The method exhibits good linearity from 1-5 mg with determination coefficient 0,995, precise (R.S.D < 2,0%), accuracy (recovery of 99,99%), selectivity and robustness. The LOD and LQ values were determined to be 0,07 and 0,22 mg, respectively. Using the DTA in the routine of pharmaceutical analysis will allow you to eliminate the use of organic solvents and reduce the time of analysis, when compared to the other methods.
Keywords: Validation; Analytical methodology; Thermal Analysis; DTA; estradiol.
LISTA DE FIGURAS
Figura 1 – Estrutura química do estradiol (1) e estriol (2) bioidênticos. ... 20 Figura 2 – Representação do forno (a) e uma curva típica de DSC (b), onde no forno R é o compartimento da referência e A da amostra. ... 24 Figura 3 – Curvas TG/DrTG, DTA e DSC do hormônio estradiol bioidêntico na razão de aquecimento de 10 ºC min-1. ... 41 Figura 4 – Curvas TG/DTG, DTA e DSC do estriol bioidêntico na razão de aquecimento de 10 ºC min-1. ... 42 Figura 5 – Curva DSC do hormônio estradiol bioidêntico na razão de aquecimento de 10 ºC min-1. ... 43 Figura 6 – Sobreposição das curvas DSC do Estradiol Bioidêntico dos Ciclos de Aquecimento até 190 °C na razão de aquecimento de 10 ºC min-1. ... 44 Figura 7 – Imagens do hormônio estradiol bioidêntico através do sistema de captura de imagens. Imagens obtidas durante o CICLO 01 na etapa de aquecimento (a) e resfriamento (b). ... 47 Figura 8 – Imagens do hormônio estradiol bioidêntico através do sistema de captura de imagens. Imagens obtidas durante o CICLO 02 na etapa de aquecimento. ... 48 Figura 9 – Sobreposição das curvas de DSC do hormônio estradiol bioidêntico recristalizado em MeOH na razão de aquecimento de 10 ºC min-1. ... 49 Figura 10 – Sobreposição das curvas de DSC do hormônio estradiol bioidêntico recristalizado em ACN na razão de aquecimento de 10 ºC min-1. ... 52 Figura 11 – Sobreposição das curvas DTA: estradiol; aerosil (aer); amido glicolato sódio (AGS); amido sem glúten (ASG); celulose microcristalina (CM) e croscarmelose sódica (CCS) na razão de aquecimento de 10 ºC min-1. ... 55 Figura 12 – Sobreposição das curvas DTA: estradiol; estearato de magnésio (EM); manitol (MAN); lactose monohidratada (LM); lauril sulfato de sódio (LSS) e talco (TAL) na razão de aquecimento de 10 ºC min-1. ... 56 Figura 13 – Sobreposição das curvas DTA: estradiol; MB aerosil (aer); MB amido glicolato sódio (AGS); MB amido sem glúten (ASG); MB celulose microcristalina (CM) e MB croscarmelose sódica (CCS) na razão de aquecimento de 10 ºC min-1. ... 57
Figura 14 – Sobreposição das curvas DTA: estradiol; MB estearato de magnésio (EM); MB manitol (MAN); MB lactose monohidratada (LM); MB lauril sulfato de sódio (LSS) e MB talco (TAL) na razão de aquecimento de 10 ºC min-1. ... 58 Figura 15 – Sobreposição das curvas DTA: estriol; aerosil (aer); amido glicolato sódio (AGS); amido sem glúten (ASG); celulose microcristalina (CM) e croscarmelose sódica (CCS) na razão de aquecimento de 10 ºC min-1. ... 59 Figura 16 – Sobreposição das curvas DTA: estriol; estearato de magnésio (EM); manitol (MAN); lactose monohidratada (LM); lauril sulfato de sódio (LSS) e talco (TAL) na razão de aquecimento de 10 ºC min-1. ... 60 Figura 17 – Sobreposição das curvas DTA: estriol; MB aerosil (aer); MB amido glicolato sódio (AGS); MB amido sem glúten (ASG); MB celulose microcristalina (CM) e MB croscarmelose sódica (CCS) na razão de aquecimento de 10 ºC min-1. ... 61 Figura 18 – Sobreposição das curvas DTA: estriol; MB estearato de magnésio (EM); MB manitol (MAN); MB lactose monohidratada (LM); MB lauril sulfato de sódio (LSS) e MB talco (TAL) na razão de aquecimento de 10 ºC min-1. ... 62 Figura 19 – Representação gráfica da curva analítica para determinação do hormônio estradiol bioidêntico. ... 64 Figura 20 – Gráfico de distribuição de resíduos baseado nos valores da curva analítica. ... 64
LISTA DE TABELAS
Tabela 1 – Matérias- primas utilizadas no desenvolvimento do estudo de quantificação e suas respectivas aplicações em formulação. ... 34 Tabela 2 – Condições analíticas por TG/DrTG e DTA para seleção e otimização do método termoanalítico. ... 36 Tabela 3 – Condições analíticas por DSC para seleção e otimização do método termoanalítico. ... 36 Tabela 4 – Lista de substâncias e respectivas proporções utilizadas na preparação farmacêutica para estudo de quantificação do Hormônio Estradiol Bioidêntico. ... 38 Tabela 5 – Caracterização dos eventos térmicos do hormônio estradiol bioidêntico nos cinco ciclos de aquecimento com β= 10 ºC min-1
. ... 45 Tabela 6 – Caracterização dos eventos térmicos do Estradiol recristalizado em metanol (MeOH) nos cinco ciclos de aquecimento com β= 10 ºC min-1
. ... 50 Tabela 7 – Caracterização dos eventos térmicos do Estradiol recristalizado em acetonitrila (ACN) nos cinco ciclos de aquecimento com β= 10 ºC min-1
. ... 53 Tabela 8 – Massas do Hormônio Estradiol Bioidêntico e os valores de entalpia para construção da curva analítica do método de quantificação em capsúla através de DTA. ... 63 Tabela 9 – Valores de entalpia, teor e DPR para avaliação da precisão do método de doseamento por DTA. ... 65 Tabela 10 – Valores de entalpia, teor de estradiol bioidêntico na formulação e DPR para avaliação da precisão do método de doseamento do por DTA. ... 66 Tabela 11 – Valores de entalpia e porcentagem de recuperação do hormônio estradiol bioidêntico para avaliação da exatidão do método de doeamento por DTA aplicado a formulações sólidas. ... 67 Tabela 12 – Resultados obtidos para seis experimentos realizados para avaliação da robustez do método DTA para doseamento hormônio estradiol bioidêntico. ... 69
LISTA DE ABREVIATURAS, SIGLAS E SÍMBOLOS
β Razão de Aquecimento ACN Acetonitrila
AER Aerosil
AGS Amido Glicolato Sódico
ANVISA Agência Nacional de Vigilância Sanitária AOAC Association Official Analytical Chemists ASG Amido Sem Glúten
CCS Croscarmelose Sódica CM Celulose Microcristalina DRX Difração de Raio X
DSC Calorimetria Exploratória Diferencial DTA Análise Térmica Diferencial
DTG Termogravimetria Derivada EM Estearato de Magnésio
FTIR Espectroscopia de Infravermelho com Transformada de Fourier
g Grama
IAF Ingrediente Ativo Farmacêutico
ICTAC INTERNATIONAL CONFEDERATION FOR THERMAL ANALYTICAL AND CALORIMETRY
J Joules
LAC Lactose Monohidratada LSS Lauril Sulfato de Sódio MAN MB Manitol Mistura Binária MeOH Metanol mg Miligrama N2 Nitrogênio T Temperatura TAL Talco TG Análise Termogravimétrica
TRH Terapia de Reposição Hormonal T inicial Temperatura Inicial
T pico Temperatura de pico ΔH Variação de Entalpia Δm Variação de Massa
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO ... 14
2 REVISÃO DA LITERATURA ... 16
2.1 TERAPIA DE REPOSIÇÃO HORMONAL NA MULHER ... 16
2.1.1 Síndrome do Climatério e Menopausa ... 16
2.1.2 Terapia de Reposição Hormonal ou Modulação Hormonal ... 17
2.1.3 Modulação Hormonal Bioidêntica ... 18
2.1.4 Hormônios Bioidênticos ... 19
2.2 DESENVOLVIMENTO DE MÉTODOS ANALÍTICOS PARA QUANTIFICAÇÃO DE FÁRMACOS ... 21
2.2.1 Técnicas Térmicas ... 23
2.2.1.1 Calorimetria Exploratória Diferencial e Análise Térmica Diferencial ... 24
2.2.1.2 Análise Termogravimétrica ... 26
2.2.1.3 Estudos de Quantificação por Técnicas Térmicas ... 27
2.3 VALIDAÇÃO DE MÉTODOS ANÁLITICOS ... 28
2.3.1 Seletividade ... 29
2.3.2 Linearidade ... 30
2.3.3 Precisão ... 30
2.3.4 Exatidão ... 30
2.3.5 Limite de Detecção e Quantificação ... 31
2.3.6 Robustez ... 31 3 OBJETIVOS ... 33 3.1 OBJETIVO GERAL ... 33 3.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS ... 33 4 MATERIAL E MÉTODOS ... 34 4.1 MATERIAL ... 34 4.2 MÉTODOS ... 35
4.2.1 Método Desenvolvido e Validado por DTA ... 35
4.2.1.1 Seleção e otimização das condições analíticas ... 35
4.2.1.2 Validação do Método Analítico por DTA ... 37
4.2.1.2.1 Seletividade ... 37
4.2.1.2.3 Precisão (Repetibilidade e Precisão Intermediária) ... 39
4.2.1.2.4 Exatidão ... 39
4.2.1.2.5 Limite de Detecção e Limite de Quantificação ... 39
4.2.1.2.6 Robustez ... 40
5 RESULTADOS E DISCUSSÃO ... 41
5.1 SELEÇÃO E OTIMIZAÇÃO DAS CONDIÇÕES ANALÍTICAS ... 41
5.2 VALIDAÇÃO ANALÍTICA DO MÉTODO POR DTA ... 53
5.2.1 Estudo de Seletividade dos Hormônios Estradiol e Estriol Bioidênticos .. 54
5.2.1.1 Estudo de Seletividade do Hormônio Estradiol ... 54
5.2.1.2 Estudo de Seletividade do Hormônio Estriol ... 58
5.2.2 Linearidade ... 62
5.2.3 Precisão ... 65
5.2.4 Exatidão ... 66
5.2.4 Limites detecção e quantificação ... 68
5.2.5 Robustez ... 68
5.3 CONTRIBUIÇÃO DO MÉTODO DE DOSEAMENTO PARA A FARMACOPEIA BRASILEIRA ... 69
6 CONCLUSÃO ... 72
7 REFERÊNCIA ... 73 ANEXO ... Erro! Indicador não definido.
1 INTRODUÇÃO
O controle de qualidade das matérias-primas e preparações farmacêuticas deve garantir qualidade física, química e microbiológica, assegurando que o medicamento chegará ao paciente respeitando os critérios de segurança e eficácia terapêutica. Para que isso possa ocorrer, o controle de qualidade precisa ser realizado durante todo o processo de produção e não só no produto acabado (PINTO, 2014).
Um dos desvios da qualidade do medicamento podem ser visualizados nas análises de doseamento, que tratam-se de ensaios analíticos imprescindíveis no que desrespeito a qualidade, visto que a quantidade de princípio ativo abaixo ou acima do efeito terapêutico pode acarretar em ineficiência ou toxicidade, respectivamente, levando a consequências desastrosas para o paciente (CARVALHO et al., 2014).
Cada vez mais a indústria farmacêutica busca o desenvolvimento de métodos analíticos que forneçam resultados rápidos e eficazes, com baixo consumo de solventes orgânicos e que gere poucos resíduos que venha a agredir a saúde do analista e do meio ambiente (AMORIM et al., 2017; PARISOTTO et al., 2005).
As técnicas cromatográficas, em especial a cromatografia líquida, são amplamente divulgadas e descritas em compêndios oficiais devido a sua aplicabilidade em estudos de separação e determinação de fármacos, identificação de impurezas e produtos de degradação, além de análises de quantificação do princípio ativo em formulação. Entretanto, possui como desvantagem desde o preparo de amostra elaborado e que desprende grande quantidade de tempo, até a utilização de uma quantidade considerável de solventes (MALDANER; JARDIM, 2012; SOLON et al., 2016).
Em meio ao debate no cenário mundial da busca por metodologias analíticas alternativas, as técnicas termoanalíticas merecem um destaque especial por não requerer preparo de amostra e utilizar poucas quantidades, além de não necessitar de solventes orgânicos.
Neste trabalho foram abordados os fármacos estradiol e estriol, como representantes do grupo de hormônios bioidênticos, característicos de fármacos de baixa dosagem. O estudo foi conduzido de acordo com a RDC nº 166/2017, publicada pela Agência Nacional de Vigilância Sanitária (ANVISA), e pelas normas propostas nas diretrizes da International Conference
Harmonization (ICH).
Assim, esse trabalho propõe fornecer subsídios para os laboratórios de proficiência e indústria farmacêutica, quanto à utilização das técnicas termoanalíticas para análise de doseamento de fármacos, tratando-se de uma alternativa vantajosa frente às técnicas espectroscópicas e cromatografia líquida.
2 REVISÃO DA LITERATURA
2.1 TERAPIA DE REPOSIÇÃO HORMONAL NA MULHER
2.1.1 Síndrome do Climatério e Menopausa
A Organização Mundial de Saúde define o climatério como um processo fisiológico natural na vida das mulheres, caracterizado como um período de transição da fase reprodutiva para a não-reprodutiva (NORMAS, 2008). O climatério é resultado da diminuição da atividade folicular ovariana causando uma redução na produção dos hormônios estrogênios, iniciando nas mulheres entre 35 e 45 anos podendo perdurar até os 65 anos de idade (DELLÚ et al., 2016).
A variabilidade de sintomas gerados durante o climatério possui origem complexa, podendo ser ocasionado por aspectos psicossociais, alterações hormonais ou do próprio envelhecimento natural da mulher (MIRANDA et al., 2014).
O conjunto de sintomas gerados no período do climatério decorrente do estado de hipoestrogenismo, pode vir a causar manifestações desde sudorese intensa, atrofia da musculatura vaginal, quadros depressivos e problemas motores que podem interferir significativamente a qualidade de vida (CRUZ; NINA; FIGUEREDO, 2017).
O quadro da menopausa possui duas subdivisões caracterizadas como perimenopausa e pós-menopausa. A perimenopausa representa o período em que o ciclo menstrual apresenta irregularidades ou com aspectos diferentes do observado nos ciclos menstruais do período reprodutivo (VERAS et al., 2006).
Passado o período da perimenopausa, entra-se na própria menopausa, onde conta-se com exatidão 12 meses ininterruptos em que houve a parada do ciclo menstrual. Durante essa fase, os sintomas decorrentes da diminuição da produção ovariana permanecem, tais como dificuldade de concentração, fogachos, secura da pele, baixa de libido e perda de humor (LUI FILHO et al., 2015; POLANINI, 2014).
A pós-menopausa, por sua vez, caracteriza-se pelo período após 5 anos em que há ausência de menstruação por mais de 12 meses. Durante a pós-menopausa, há aumento das doenças cardiovasculares associadas á alterações nos níveis de LDL-colesterol, colesterol total e apolipoproteínas B. Entretanto, existem controvérsias quanto às alterações no HDL-colesterol, considerado cardioprotetor, havendo estudos descrevendo que ocorre diminuição na produção, bem como aqueles que relatam produção inalterada durante o período da pós-menopausa (KHOUDARY et al., 2016; VERAS et al., 2006).
Além disso, presença de síndromes metabólicas, aumento dos marcadores de processos inflamatórios, obesidade e câncer de mama são manifestações comuns em mulheres após o período da menopausa (BROWN et al., 2017)
Visando suprir a deficiência da produção ovariana e aliviar os sintomas gerados pela síndrome do climatério e menopausa, utiliza-se formulações hormonais, desde a década de 1960, reconhecida na prática clínica como Terapia de Reposição Hormonal (TRH) ou Modulação Hormonal (MARQUES et al., 2015a).
2.1.2 Terapia de Reposição Hormonal ou Modulação Hormonal
A Terapia de Reposição Hormonal está comercialmente disponível em formulações e doses variadas, podendo ser por via oral, vaginal, transdérmica, cremes ou géis com estrógenos isolados ou combinados com progestogênios (MARJORIBANKS et al., 2017).
Desde o começo da sua utilização na década de 1960, a TRH tem demonstrado resultados significativos na qualidade de vida das mulheres, tanto a terapia estrogênica como a estroprogestagênica. Entretanto, tem sido foco de inúmeras discussões devido as suas complicações com uso à longo prazo e efeitos colaterais (GRAVENA et al., 2013; PARDINI, 2014).
Nas décadas dos anos 1980 e 1990 a Terapia de Reposição Hormonal obteve o seu auge de destaque, aumentando significativamente o número de prescrições dos hormônios conjugados devido os estudos demonstrarem
diminuição das doenças cardiovasculares e demência (FISHMAN; FLATT; SETTERSTEN, 2015; PARDINI, 2014).
Entretanto, com a publicação dos estudos de Heart and Estrogen/progestin Replacement Study (HERS) e da Women’s Health Initiative
(WHI) em 1998 e 2002, respectivamente, houve uma mudança nos paradigmas no que diz respeito às prescrições dos hormônios para alívios dos sintomas gerados (PARDINI, 2014).
Os autores do estudo de HERS realizaram uma pesquisa baseada em um estudo clínico randomizado, duplo-cego e controlado com o placebo no período de 1993 à julho de 1998, observando a influência da utilização de estrógenos/progestênios em mulheres pós-menopausa nas doenças coronarianas. O grupo obteve como resultado que a utilização desta terapia não causava redução dos riscos coronarianos como reportava em outros estudos, entretanto, observou-se um aumento de risco para os casos de tromboembolismo venoso (SPEROFF, 1998).
Já os estudos realizados por a Women’s Health Initiative (WHI) demonstrou que a utilização da TRH aumentava os riscos de acidente vascular cerebral e tromboembolismo, além do aumento na predisposição de câncer de mama e ovariano (TAYLOR; MANSON, 2015).
Após a publicação dos estudos da HERES e WHI inúmeras criticas surgiram sobre a terapia de reposição hormonal e a busca por alternativas que fossem consideradas mais seguras e eficazes para o tratamento (GOLD, 2012).
Nesse cenário da busca de terapias alternativas, a modulação hormonal bioidêntica recebeu um grande destaque. Recebendo essa denominação porque os hormônios bioidênticos apresentam a mesma estrutura química e molecular dos hormônios sintetizados pelo organismo humano, estando disponíveis nos Estados Unidos da América em formulações aprovadas e não-aprovadas pelo FDA (FILES et al., 2016).
A terapia de modulação hormonal bioidêntica é recomendada para utilização antes e após a menopausa, dependendo da necessidade característica de cada paciente, buscando o controle e ajuste de parâmetros hormonais, biológicos e metabólicos semelhantes ao de mulheres jovens entre 25 e 35 anos de idade (PEREIRA, 2013).
Entre as vantagens significativas da modulação hormonal bioidêntica tem-se a personalização da dose, além da capacidade de utilização de hormônios associados e adicionais à terapia. Sendo, a principal recomendação para utilização destes hormônios a menor dosagem possível pelo menor tempo de tratamento (MCBANE et al., 2014).
A duração da terapia depende da necessidade de cada paciente que irá ser tratado, entretanto estudos mostram que para as terapias com estrógenos isolados somente após utilização por 10 anos consecutivos existe um aumento no risco de desenvolver câncer de mama (JÓJÁRT et al., 2012).
Entre os vários benefícios clínicos relacionados à utilização dos hormônios bioidênticos, tem-se a melhoria dos sintomas gerados pela oscilação hormonal, prevenção de doenças cardiovasculares, diminuição na predisposição para desenvolvimento de câncer de mama, além de melhorias nos quadros de insônia e depressão (PEREIRA, 2013).
A principal desvantagem relacionada à utilização da modulação hormonal bioidêntica trata-se da falta de evidências que demonstrem a segurança e eficácia desta terapia. Além disso, não existem estudos clínicos que demonstrem qual a dose inicial deve ser adotada, desta forma, o início da terapia baseia-se no quadro clínico do paciente (MCBANE et al., 2014).
Os hormônios biodiênticos são comumente derivados da soja ou do inhame, sendo o principal deles o yam mexicano. Através da raiz do inhame isola-se a diosgenina que será convertida em progesterona, ao qual funcionará como precursora para síntese dos hormônios bioidênticos (SOOD et al., 2011; POLANINI, 2014).
2.1.4 Hormônios Bioidênticos
O organismo humano apresentam cinco classificações distintas dos hormônios esteroides, sendo elas os estrogénios, progestagénos,
mineralocorticoides, androgénos e glicocorticoides. Os hormônios sexuais são derivados a partir do colesterol, podendo ser subdivididos em hormônios sexuais femininos ou estrogênios, hormônios sexuais masculino ou androgênio, e os hormônios vinculados a gravidez sendo também conhecidos por progestógenos (REIS FILHO; DE ARAÚJO; VIEIRA, 2006).
A compreensão da modulação hormonal bioidêntica está baseada no metabolismo dos hormônios sexuais feminino. O folículo ovariano sintetiza os hormônios 17β- estradiol e a estrona, o estriol por sua vez é produto de uma reação de hidroxilação dos estrógenos sintetizados no ovário (GOLD, 2012).
A diferenciação dos hormônios estrogênios ocorre mediante substituições no anel D na posição do carbono 17, onde a estrona apresenta uma carbonila, o estradiol por sua vez possui um grupamento hidroxila, e por fim o estriol apresenta duas hidroxilas distribuídas no carbono 16 e 17(REIS FILHO; DE ARAÚJO; VIEIRA, 2006). A Figura 1 apresentam a estrutura química dos hormônios estradiol e estriol.
Figura 1 – Estrutura química do estradiol (1) e estriol (2) bioidênticos.
FONTE: AUTORIA PRÓPRIA, 2017
Os níveis dos hormônios estrogênios variam conforme o estágio de vida da mulher, sendo o 17β- estradiol que possui os maiores níveis circulantes. Entretanto, durante o período gestacional os níveis de estriol se elevam e após a menopausa os níveis de estrona encontram-se aumentado (CHERVENAK, 2009).
As formulações contendo os hormônios bioidênticos são preparadas de acordo com as indicações do médico, podendo ser apresentadas em diversas vias de administração (sublingual, transdérmica, oral) de acordo com as necessidades e limitações do paciente, existindo disponíveis comercialmente
de forma isolada ou em associações, sendo os principais representantes o estradiol, estrona e estriol, além da progesterona e testosterona (FISHMAN; FLATT; SETTERSTEN, 2015; MARQUES et al., 2015b).
Entre as formas farmacêuticas associadas mais comuns tem-se as biestrogênio (Biest) compostas por estradiol e estriol, ou as triestrogênio (Triest) que contém estradiol, estrona e estriol. As proporções dos hormônios tanto nas formulações Biest como na Triest irão variar conforme os valores de níveis hormonais obtidos em exames laboratoriais, além de correlacionar com os sintomas dos pacientes (POLONINI, 2014).
O estradiol bioidêntico, Figura 1, possui fórmula molecular C18H24O2
com ponto de fusão entre 173 ºC e 179 ºC, apresentando-se como pó branco ou quase branco, insolúvel em água e solúvel em álcool e acetona. Por sua ver o estriol bioidêntico (Figura 1), apresenta–se como pó branco com fórmula molecular C18H24O3 , sendo praticamente insolúvel em água e solúvel em
álcool. O aumento de um átomo de oxigênio, comparando com a fórmula molecular do estradiol, leva a uma elevação do ponto de fusão maior que 100 ºC, onde o estriol funde em 282 ºC (THE MERCK INDEX, 2006).
Os hormônios estrogênios são frequentemente mais prescritos, visto a sua afinidade com receptores apresentando melhor conformação e por consequência resposta máxima, sendo considerados biologicamente mais ativos que os outros hormônios esteroidais. Entretanto, dentro da classe dos estrogênios o estriol é biologicamente menos ativo do que o estradiol, necessitando de preparações com maior dosagem para obtenção de um efeito terapêutico desejável (COLLEGE et al., 2012; REIS FILHO; DE ARAÚJO; VIEIRA, 2006).
2.2 DESENVOLVIMENTO DE MÉTODOS ANALÍTICOS PARA QUANTIFICAÇÃO DE FÁRMACOS
O desenvolvimento de metodologias analíticas trata-se de uma ferramenta crucial para obtenção do produto acabado devido o seu papel assistencial no desenvolvimento do processo e no controle de qualidade das matérias-primas e produtos acabados. Nos últimos anos busca-se um design experimental baseado em processos de forma sistemática que forneça
resultados satisfatórios e confiáveis, reduzindo a carga experimental. Desta forma, diminuindo o tempo e os recursos utilizados para desenvolvimento de métodos (KOCHLING et al., 2016; SAHU et al., 2018).
A indústria farmacêutica e laboratórios analíticos de todo o mundo tem focado na qualidade, segurança e eficácia de seus produtos. Processos utilizados para minimizar os riscos, como o Quality by Design (QbD), recentemente tem sido atribuído ao desenvolvimento de métodos analíticos (YIP et al., 2014).
No contexto, do avanço e aprimoramento da indústria farmacêutica, cada vez busca- se novas metodologias baseadas nos preceitos estabelecidos pela Química Verde, visando um processo sustentável que seja seguro tanto para o homem como para o meio ambiente. Objetivando, um desenvolvimento analítico que utilize solventes menos nocivos, pouca quantidade de matéria- prima e que essa seja renovável, além de gerar a menor quantidade possível de produtos degradáveis sempre aliados a uma redução dos custos e um aumento de rendimento (ZORZANELLI; MURI, 2015).
Algumas técnicas são bastante exigidas por órgãos reguladores e fiscalizadores para o processo de produção dos medicamentos devido a preocupações nos aspectos técnicos e científicos, e uma das que se destacam nas linhas de pesquisa e aprimoramento, é a cromatografia líquida. Estudos mostram a aplicabilidade dessa técnica analítica na área farmacêutica para determinação e quantificação de substâncias, identificação de produtos de degradação (SHAH; AGNIHOTRI, 2011; MALDANER; CRISTINA; FONTES, 2012; SOLON et. al., 2016; LIU et. al., 2012; WANG et. al., 2015).
Entretanto, a cromatografia líquida apresenta como desvantagens o elevado consumo de solventes orgânicos usados na rotina, gerando resíduos considerados prejudiciais tanto para o analista/manipulador como para o meio ambiente, fugindo dos preceitos estabelecidos e pregados pela Química Verde (MALDANER; CRISTINA; FONTES, 2012).
As técnicas térmicas representam uma alternativa vantajosa para os estudos de quantificação por não requerer nenhum preparo de amostra e necessitar de uma pequena quantidade de material para inúmeras análises, sendo, portanto, uma metodologia simples e barata (CAMPANELLA et al., 2007)
2.2.1 Técnicas Térmicas
O conhecimento e utilização das técnicas térmicas são difundidos a mais de um século, sendo amplamente empregadas desde compostos minerais, cerâmicas, metais até substâncias farmacêuticas e materiais biológicos (OZAWA, 2000)
A Conferência Internacional de Análise Térmica e Calorimetria (ICTAC) define a análise térmica como ―um grupo de técnicas que estuda as relações entre as propriedades da amostra e sua temperatura à medida que a amostra é aquecida ou resfriada de forma controlada‖ (ICTAC, 2014).
Na análise térmica a amostra é colocada em um sistema que permite a visualização das alterações, de maneira direta ou indireta, em função de um programa controlado de temperatura ou de tempo. As mudanças sofridas pela amostra no decorrer da análise são acompanhadas por um transdutor de sinal, que gera uma informação elétrica que depende da mudança física ou química sofrida. Posteriormente, o sinal é ampliado para um dispositivo de leitura que registrará as informações (MOTHÉ; AZEVEDO, 2002).
Entre as técnicas térmicas mais utilizadas na área farmacêutica tem-se a calorimetria exploratória diferencial (DSC), análise térmica diferencial (DTA) e análise termogravimétrica (TG).
A literatura reporta inúmeros estudos com aplicabilidade da análise térmica na área farmacêutica, dentre as quais pode citar: caracterização térmica de substâncias com atividade terapêutica promissora (ALI et al., 2017), estudo de compatibilidade entre fármacos e excipientes farmacêuticos (LEDET; MARIUS; SORIN, 2017), avaliação de estruturas cristalinas (DJELLOULI; DAHMANI; HASSANI, 2017), determinação de parâmetros cinéticos que fornecem informações importantes para o desenvolvimento do processo através de modelos matemáticos (HERBRINK, 2017), além de caracterização de plantas medicinais (CORREIA et al., 2016).
Comumente, correlaciona-se as técnicas TG/DTG, DTA e DSC para uma melhor compreensão dos eventos térmicos característicos do material em estudo (SILVA; PAOLA; MATOS, 2007).
Além disso, com o avanço tecnológico tem-se a utilização das técnicas térmicas acopladas a outras técnicas analíticas que proporcionam resultados
mais robustos (OUDGHIRI et al., 2016; SONG et al., 2017; WANG et al., 2018), bem como frequentemente visto na literatura a utilização de técnicas complementares que auxiliam na compreensão do comportamento térmico (BRUNI et al., 2017; CENSI et al., 2014; SOUSA E SILVA; SOUSA LOBO, 2010; VERONEZ et al., 2013).
2.2.1.1 Calorimetria Exploratória Diferencial e Análise Térmica Diferencial
A calorimetria exploratória diferencial (DSC) permite avaliar características energéticas, físicas e químicas de uma amostra quando submetidas a um programa controlado de temperatura (aquecimento ou resfriamento). Dessa forma, mede-se a diferença entre o fluxo de calor da amostra e de um material de referência termicamente inerte (FARMACOPEIA, 2010; LIMA et al., 2014).
Existem dois tipos de calorímetros disponíveis para obtenção dos dados de DSC, sendo eles o calorímetro exploratório diferencial com fluxo de calor e o calorímetro exploratório diferencial com compensação de potência (IONASHIRO, 2005; MOTHÉ; AZEVEDO, 2002; CLAS; DALTON; HANCOCK, 1999). A Figura 2 apresenta uma representação de um forno de DSC onde realiza-se as análises e uma curva típica com os eventos característicos.
Figura 2 – Representação do forno (a) e uma curva típica de DSC (b), onde no forno R é o compartimento da referência e A da amostra.
Fonte: Adaptado de Aragão (2002)
No DSC com fluxo de calor a amostra e o material de referência são mantidos em um mesmo forno, porém com suportes separados e em seguida adicionadas sobre um sensor de metal, já o DSC com compensação de
potência a amostra e o material de referência são colocados em fornos separados onde as mesmas temperaturas são mantidos por meio de aquecedores individualizados (BERNAL et al., 2002).
A seleção das condições analíticas, bem como o preparo da amostra são fatores determinantes para o sucesso das análises por DSC. De maneira geral, necessita-se de aproximadamente 3-5 mg da amostra para obtenção de uma análise, entretanto, alguns estudos mostram que com até 1 mg pode-se obter resultados satisfatórios. Outros parâmetros como a calibração do equipamento, as condições do gás de purga, a razão de aquecimento, bem como, o porta amostra selado ou aberto, podem vir a interferir nos resultados desejados (CLAS; DALTON; HANCOCK, 1999).
Na literatura inúmeros trabalhos reportam a utilização da DSC para estudo de compatibilidade térmica, buscando investigar possíveis interações entre fármaco e excipientes (DANIEL et al., 2013; JÚLIO et al., 2013; MATOS et al., 2016; MENDONÇA et al., 2013; VERONEZ et al., 2013)
Oliveira e colaboradores (2016) desenvolveram um estudo de compatibilidade com fármacos comercialmente disponíveis para atividade antitérmica e antipirética conduzido por técnicas térmicas. Avaliou-se a presença de interações entre os fármacos paracetamol, maleato de clorfeniramina e cloridrato de fenilefrina com alguns excipientes de formas farmacêuticas sólidas. Os dados calorimétricos mostraram que o fármaco, maleato de clorfeniramina, possuía uma diminuição de temperatura do ponto de fusão com os excipientes lactose monohidratada, amido glicolato sódio e estearato de magnésio.
Blajovan e colaboradores (2016) investigaram a presença de interações entre compostos poliméricos álcool polivinílico (PVA) e polivinilpirrolidona (PVP) em associação com excipientes farmacêuticos amido, estearato de magnésio, manitol, sorbitol e hidroxietilcelulose através de técnicas térmicas e espectroscópicas a temperatura ambiente. As dez misturas binárias avaliadas não demonstraram nenhuma interação sob as condições propostas.
Por sua vez, a análise térmica diferencial (DTA) monitora as variações de temperatura da amostra e de um material de referência termicamente estável quando esses são submetidos a um programa controlado de
temperatura (SILVA; PAOLA; MATOS, 2007). Os dados térmicos obtidos pela curva DTA podem ser plotados por um gráfico de diferença de temperatura ou tensão termoelétrica em função da temperatura em que a amostra se encontra (CLAS; DALTON; HANCOCK, 1999).
A principal similaridade existente entre a DSC e o DTA trata-se da amostra ser avaliada em comparação com um material de referência, além de encontrarem-se em porta amostras separados. Entretanto, algumas diferenças significativas permitem a diferenciação de ambas as técnicas temoanaliticas. A análise realizada pelo DTA ocorre em cadinhos abertos fornecendo resultados em milivolts, já o DSC os porta amostra encontram-se hermeticamente fechados e os dados são expressos em milliwatt (LIMA et al., 2015).
2.2.1.2 Análise Termogravimétrica
A análise termogravimétrica mede as variações de massa de uma amostra em função do tempo e/ou temperatura, quando a mesma é submetida a um programa controlado de temperatura. Os processos característicos de perda de massa podem está relacionados a eventos de desidratação, decomposição e sublimação da amostra, entre outros eventos (FARMACOPEIA, 2010; PEREIRA et al., 2009).
Em algumas situações as variações de massa não são visualizadas com precisão na curva TG, fazendo-se necessário a utilização da termogravimetria derivada (DTG) que pode ser obtida quando ocorre uma inflexão na curva TG no ponto em que se ocorre maior variação de perda de massa (ARAÚJO et al., 2003; PAULIK; ARNOLD, 1990).
As análises termogravimétricas possuem duas formas de programação rotineiramente utilizadas, sendo elas a TG dinâmica e a TG isotérmica. O processo experimental realizado no modo TG dinâmico tem-se a amostra sendo aquecida ou resfriada de maneira linear, já no TG isotérmico mantém-se o tempo ou a temperatura constante enquanto a massa da amostra sofre variação (MENDONÇA, 2014).
Alguns parâmetros podem influenciar nas análises e consequentemente nos resultados obtidos das curvas termogravimétricas, entre eles pode-se citar fatores relacionados à instrumentação e as
características intrínsecas da amostra. No que diz respeito a fatores instrumentais, condições como a atmosfera do forno, características do suporte da amostra e do forno, bem como a razão de aquecimento pode vir a influenciar. Já as características da amostra está relacionado a densidade e tamanho de partícula, quantidade pesada, natureza da amostra e sua condutividade térmica (MATOS, 2009).
Correia e colaboradores (2015) avaliou a qualidade física da Tabebuia
caraiba (Mart.) Bur. na forma de pó em três lotes com tamanho de partículas
diferentes pelo método de Ozawa. As amostras foram analisadas por termogravimetria (TG) em atmosfera de nitrogênio e ar sintético com quatro diferentes razões de aquecimento. Observou- se que a TG permitia diferenciar os pós com diferentes granulometrias através dos parâmetros cinéticos obtidos pelo método de Ozawa.
Em um estudo realizado por Herbrink e colaboradores (2016), os parâmetros térmicos e termodinâmicos do pazopanibe, inibidor seletivo da angiogênese, foram avaliados por técnicas térmicas (TG e DSC) e não- térmicas (FTIR e DRX). Utilizando 3 modelos matemáticos para obtenção dos parâmetros termodinâmicos o estudou observou que pazopanibe possuía, independente do modelo calculado, energias de ativação próximas em uma mesma fase de degradação e diferentes nas demais fases.
O desenvolvimento de equipamentos termogravimétricos cada vez mais sofisticados tem contribuído com os avanços científicos, na literatura reposta-se com frequência a utilização de TG acoplada a outros métodos analíticos, tais com FTIR, espectrometria de massa e cromatografia gasosa (FENG et al., 2017; KAI et al., 2017; LUO et al., 2017; STRIŪGAS et al., 2017)
O acoplamento da TG com a espectroscopia de infravermelho acoplado a transformada de Fourier (TG-FTIR) proporciona uma análise em tempo real com alta sensibilidade, fornecendo informações a respeito dos materiais degradados ao serem aquecidos geram compostos ou voláteis que podem ser identificados com o FTIR (SI et al., 2018).
Na literatura existem relatos da utilização de técnicas térmicas, em especial a calorimetria exploratória diferencial, para os estudos de quantificação de amostras com atividade terapêutica desde a década dos anos 80 (CEIPIDOR et al., 1976; HOZEK, 1985; MARINO et al., 1981).
A utilização do DSC e DTA para os estudos de quantificação requerem uma caracterização prévia do analito, onde o fármaco de interesse deve ter os eventos térmicos bem definidos, quer ser seja endotérmico ou exotérmico, bem como não devem sofrer interferência dos constituintes da formulação (BUCCI; MAGRÌ; MAGRÌ, 2000; NOORDIN; CHUNG, 2004)
Campanella e colaboradores (2007) desenvolveram e validaram um método para determinação e quantificação de acetaminofeno em comprimidos por DSC, e posteriormente correlacionaram os valores com um método espectroscópico. Durante o desenvolvimento do método de quantificação Campanella e colaboradores realizaram caracterização térmica das matérias-primas, além de um estudo de compatibilidade com quatro excipientes que faziam parte das formulações escolhidas. Os pesquisadores encontraram valores de precisão significativos utilizando o método calorimétrico para quatro das cinco formulações utilizadas no estudo.
Noordin e Chung (2004) desenvolveram um método de quantificação por DSC para determinar o teor de paracetamol em supositórios. Os autores ressaltaram que o DSC fornecia resultados rápidos e confiáveis, sem requerer preparo de amostra e com uma quantidade entre 2,5-4,0 mg. Além disso, encontraram valores para limite de detecção com até 2,5 vezes menores que a quantidade de paracetamol na formulação, demonstrando assim, boa sensibilidade e reprodutibilidade.
Na literatura relata-se que o DSC é uma técnica amplamente utilizada para análises quantitativas, enquanto que o DTA apresenta-se com aplicações qualitativas por tratar-se de um sistema aberto e, portanto, dificultando a medida de transferência de calor do ambiente para a amostra e o material de referência. Entretanto, a utilização do DTA permite análises em temperaturas mais elevadas e com variações de massa (YANG; ROY, 1999).
De acordo com a RE nº 166, publicada em 24 de Julho de 2017, a validação de um método trata-se de uma avaliação sistemática por meio de ensaios que visa garantir que o método proposto atende os requisitos ao qual se destina (BRASIL, 2017).
A validação analítica está intimamente ligada ao desenvolvimento do método para demonstrar o seu desempenho e confiabilidade dos resultados obtidos, onde o método analítico desenvolvido deve ser previamente validado para posterior inserção na rotina do laboratório. Além disso, caso haja mudanças ao quais sejam diferentes das estabelecidas no método original deve-se realizar uma revalidação ou validação analítica (RAPOSO, 2016).
Em uma validação analítica é necessário garantir que o equipamento no qual será desenvolvido e validado o método analítico seja adequadamente projetado, bem como realizada calibrações prévias, afim de que prevenir que algumas alterações venham a interferir nos resultados obtidos. Tal procedimento é reconhecido na indústria farmacêutica como qualificação do sistema analítico (KAMINSKI et al., 2010).
Ao longo dos anos agências regulamentadoras nacionais e internacionais desenvolveram guias práticos que norteiam o processo de validação de um método analítico, entre elas temos a US FDA, Conferencial Internacional de Harmonização (ICH) e ANVISA.
Segundo à Association of Official Analytical Chemists (AOAC), os paramêtros de seletividade, linearidade e curva de calibração, precisão, exatidão, os limites de detecção (LD) e quantificação (LQ), além da robustez são os esperados para a validação de um método analítico.
2.3.1 Seletividade
A seletividade trata-se da capacidade que o método possui de identificar e quantificar o analito de interesse na presença de interferentes, que podem ser desde impurezas, excipientes ou componentes de uma matriz complexa (BRASIL, 2017). O parâmetro de seletividade está intimamente relacionado com a confiabilidade do método analítico.
2.3.2 Linearidade
É a capacidade que o método analítico possui de demonstrar uma resposta diretamente proporcional a concentração do analito na amostra em uma determinada faixa de trabalho (BRASIL, 2017).
O parâmetro de linearidade deve ser avaliado por métodos estatísticos, sendo o mais empregado o método dos mínimos quadrados que fornece resultados confiáveis com variância mínima e não tendenciosos (PIMENTEL; NETO, 1996). Entre os pontos que devem ser avaliados tem- se o coeficiente de determinação (r2), o intercepto do eixo y, a distribuição de resíduos e a inclinação da reta (ICH, 2005).
2.3.3 Precisão
Segundo a legislação em vigor no Brasil, RE nº 166, publicada em 24 de Julho de 2017, o parâmetro analítico da precisão caracteriza-se em medir a proximidade entre os resultados de uma análise com amostras preparadas que atendem os requisitos do método (BRASIL, 2017). Os resultados encontrados devem ser expresso através do desvio padrão relativo ou coeficiente de variação. A avaliação da precisão é subdividida em três formas: repetibilidade, precisão intermediária e reprotuditibilidade (BETZ; BROWN; ROMAN, 2011; SILVA et al., 2014).
A repetibilidade mostra a concordância dos resultados obtidos em um curto espaço de tempo, já a precisão intermediária avalia as variações existentes no ambiente em que se deseja validar o método, tais como analistas diferentes, análises em dias diferentes e consecutivos (GONZÁLEZ; HERRADOR; ASUERO, 2010).
A avaliação da reprodutibilidade deve ser desenvolvida quando o método proposto for utilizado em diferentes laboratórios (BRASIL, 2017).
2.3.4 Exatidão
O parâmetro de exatidão mede a proximidade dos resultados obtidos quanto à concentração teórico e a concentração real do analito na amostra.
Rotineiramente utilizam-se os valores de porcentagem de recuperação para avaliação da exatidão, onde se adiciona uma quantidade conhecida do analito na amostra e em seguida realiza a análise. Desta forma, a porcentagem de analito recuperada trata-se da somatória da quantidade já existem na matriz com a adicionada (BETZ; BROWN; ROMAN, 2011).
2.3.5 Limite de Detecção e Quantificação
O limite de detecção (LD) trata-se da menor concentração do analito de interesse que pode ser detectada sem necessariamente ser quantificada, podendo ser determinada através do método visual, por meio da relação sinal-ruído característico da resposta do analito e através dos parâmetros obtidos com avaliação da linearidade (RIBANI et al., 2004; BRASIL, 2017).
Por sua vez, o limite de quantificação relaciona-se com a menor concentração do analito encontrada em uma amostra que pode ser determinada com precisão e exatidão (BRASIL, 2017).
A determinação dos limites através dos parâmetros fornecidos pela curva analítica são calculados por meio das equações 1 e 2 para o LD e LQ respectivamente.
LD = 3,3 . σ (1) IC
LQ = 10 . σ (2) IC
Onde, IC trata-se da inclinação da curva analítica e σ refere-se ao desvio padrão do intercepto com o eixo Y (BRASIL, 2017).
2.3.6 Robustez
O parâmetro analítico da robustez mede a susceptibilidade ou vulnerabilidade do método a mudanças operacionais conhecidas e como elas
podem intervir nos resultados, que deve ser realizado ao final do desenvolvimento (KARAGEORGOU; SAMANIDOU, 2014; SAHU et al., 2018). Durante o desenvolvimento do método alguns questionamentos podem vir a surgir, tais como variação de concentração, alterações nos valores de pH, temperatura do equipamento em que se ocorre a análise, volume de solução utilizada e tempo de extração. Sendo, através do estudo da robustez em se propõe mudanças deliberativas que se obtém respostas para tais questionamentos (SAHU et al., 2018).
3 OBJETIVOS
3.1 OBJETIVO GERAL
Desenvolver e validar método para quantificação do hormônio estradiol bioidêntico em formulações sólidas por análise térmica diferencial (DTA).
3.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS
Caracterizar termicamente os hormônios estradiol e estriol bioidênticos por técnicas térmicas (TG/DrTG, DTA e DSC);
Caracterizar as diferentes formas cristalinas do hormônio estradiol bioidêntico;
Otimizar condições analíticas para estudos de quantificação por DTA de hormônios estradiol e estriol bioidênticos;
Validar método analítico por DTA para a determinação do hormônio estradiol bioidêntico em preparações farmacêuticas.
4 MATERIAL E MÉTODOS
4.1 MATERIAL
As matérias-primas utilizadas para o desenvolvimento e validação da metodologia para quantificação estão descritas na Tabela 1. Os hormônios estradiol e estriol bioidênticos possuem pureza de 98,80% e 99,85%, respectivamente.
Tabela 1 – Matérias-primas utilizadas no desenvolvimento do estudo de quantificação e suas respectivas aplicações em formulação.
Classe Terapêutica ou Classificação
Adjuvante
Fornecedor Lote
Estradiol Ingrediente Ativo
Farmacêutico
Iberoquímica ET160203
Estriol Iberoquímica 151103
Aerosil (AER) Adsorvente, deslizante Purifarma B5408LINBI
Amido Glicolato Sódico (AGS)
Diluente, aglutinante Valdequímica 027980
Amido Sem Glúten (ASG) Diluente, aglutinante Galena 1712011102
Celulose Microcristalia (CM) Aglutinante, desintegrante Purifarma C1508073 Croscarmelose Sódica (CCS)
Desintegrante Valdequímica ACRMC08020813
Estearato de Magnésio (EM)
Lubrificante ViaFarma MGST3A470
Lactose Monohidratada
(LAC)
Diluente, aglutinante AllChemesry ALL060581
Lauril Sulfato de Sódio (LSS)
Agente Molhante Mapric AUTO180398
Manitol (MAN) Diluente Gemini 301510040
Os excipientes farmacêuticos utilizados para o desenvolvimento do estudo foram previamente selecionados baseado em um levantamento realizado na farmácia de manipulação, FarmaFórmula, situada na cidade de Natal (Rio Grande do Norte), além de comprimidos vendidos em farmácias comerciais produzidos pela indústria farmacêutica, visto que no Formulário Nacional da Farmacopeia Brasileira não apresenta proposta de formulações com os hormônios estradiol e estriol bioidênticos.
Os solventes utilizados para recristalização do hormônio estradiol bioidêntico na seleção e otimização das condições analíticas foram metanol (MeOH) e acetonitrila (ACN),levando- se em consideração a solubilidade do fármaco.
Ambos os solventes utilizados são grau analítico, sendo o metanol da J.T.Baker (lot.: P34C04), e a acetonitrila da Honeywell (lot.: DQ452-BZ).
4.2 MÉTODOS
4.2.1 Método Desenvolvido e Validado por DTA
O desenvolvimento e validação procederam-se em uma termobalança da Shimadzu, modelo DTG-60, sob atmosfera de nitrogênio com razão de aquecimento (β) de 10 ºC min-1
; fluxo de 50 mL min-1; utilizando cadinho de alumínio. Os dados térmicos foram coletados em uma faixa de temperatura de 25 ºC a 300 ºC.
O método proposto foi validado seguindo as orientações da
International Conference on Harmonization of Technical Requirements for Registration of Pharmaceuticals for Human Use (ICH) guidelines Q2(R1) e a
RDC nº 166, publicada em 24 de julho de 2017.
4.2.1.1 Seleção e otimização das condições analíticas
Inicialmente os fármacos foram caracterizados termicamente por TG/DrTG, DTA seguindo as condições analíticas descritas na Tabela 2, em uma termobalança da Shimadzu, modelo DTG-60, para verificação das suas
temperaturas de fusão e respectivas entalpias. Previamente as análises, o equipamento foi calibrado utilizando padrão de oxalato de cálcio.
Tabela 2 – Condições analíticas por TG/DrTG e DTA para seleção e otimização do método termoanalítico.
Parâmetros Condições
Gás Nitrogênio
Fluxo do Gás 50 mL min-1
Razão de Aquecimento 10 ºC min-1 Faixa de Temperatura 25 ºC a 900 ºC
Amostra 5 mg ± 0,5
Porta Amostra Cadinho de Alumina
Posteriormente, o estradiol e estriol bioidênticos foram caracterizados por DSC utilizando um calorímetro modelo DSC-60A, marca Shimadzu, seguindo as condições descritas na Tabela 3. O equipamento foi calibrado utilizando um padrão de índio para observar o perfil térmico do ponto de fusão em 156,6 ºC, em seguida iniciou o desenvolvimento do estudo.
Tabela 3 – Condições analíticas por DSC para seleção e otimização do método termoanalítico.
Parâmetros Condições
Gás Nitrogênio
Fluxo do Gás 100 mL min-1
Razão de Aquecimento 10 ºC min-1 Faixa de Temperatura 25 ºC a 350 ºC
Amostra 2 mg ± 0,5
Porta Amostra Cadinho de alumínio
O hormônio estradiol bioidêntico apresentou na curva DSC um evento endotérmico próximo à faixa de quantificação do fármaco, sendo necessária a aplicação de métodos adicionais para elucidação do perfil térmico. Em um primeiro momento as amostras foram submetidas a 5 ciclos de aquecimento-resfriamento até 190 ºC (até pouco após a fusão) para investigar a presença de
polimorfismos ou impurezas. Subsequentemente, o processo de recristalização mediada por solventes orgânicos foi aplicada para complementação da elucidação.
O método de recristalização mediada por solventes foi empregado para obtenção dos cristais usados na investigação por técnicas térmicas e cromatográficas dos polimorfismos formados. No processo de recristalização pesou-se 25 mg de estradiol e transferiu- se para um tubo de ensaio e acrescentou 1 mL de metanol. Em outro tubo respeitou a mesma condição, porém o solvente foi a acetonitrila. Após secagem das amostras em temperatura ambiente, foram caracterizadas por DSC empregando ciclos de aquecimento-resfriamento.
Os dados obtidos tanto para TG/DrTG, DTA quanto para o DSC foram tratados utilizando o software da Shimadzu, o TASYS.
Após a caracterização térmica visando melhor seleção e otimização das condições analíticas e melhor visualizar os eventos térmicos, as amostras foram aquecidas em um sistema de aquecimento marca Quimis, modelo Q340S, até uma temperatura de 190 ºC. A captura de imagem foi realizada de maneira simultânea ao aquecimento com câmera Nikkon (modelo 5200) em temperaturas previamente selecionadas a partir dos eventos característicos da curva DSC do hormônio estradiol bioidêntico.
4.2.1.2 Validação do Método Analítico por DTA
4.2.1.2.1 Seletividade
A seletividade do método foi conduzida por análise térmica dos 10 excipientes isolados e das misturas binárias contendo os respectivos ingredientes ativos (estradiol e estriol bioidênticos) e excipiente farmacêutico.
A preparação das misturas físicas entre os hormônios estradiol e estriol bioidêntico com cada um dos excipientes farmacêuticos escolhidos foram realizadas utilizando a proporção 1:1 (m/m). Após a pesagem, as amostras foram homogenizadas por mistura simples com auxilio de um gral e pistilo por 5 minutos, em seguida realizada as análises.
Após determinação da seletividade do método foi proposta a formulação de trabalho com o hormônio estradiol bioidêntico, apresentada na Tabela 4, para avaliação dos demais parâmetros de validação. Devido à baixa seletividade do método para o estriol bioidêntico não houve continuidade da validação com esse farmáco.
Tabela 4 – Lista de substâncias e respectivas proporções utilizadas na preparação farmacêutica para estudo de quantificação do Hormônio Estradiol Bioidêntico.
Matéria- Prima Porcentagem (%)
Estradiol 50
Amido Glicolato Sódio 29
Celulose Microcristalina 10
Talco 9
Estearato de Magnésio 1
Lauril Sulfato de Sódio 1
4.2.1.2.2 Linearidade
A construção da curva analítica foi realizada com os valores de entalpia (J) referentes ao evento de fusão do fármaco, selecionando a faixa de temperatura entre 170 ºC e 200 ºC, para os cinco níveis de concentração diferentes com cada ponto em triplicata.
Foi pesado aproximadamente 1 mg, 2 mg, 3 mg, 4 mg e 5 mg do fármaco em cadinhos de alumínio e submetido a análise na termobalança da Shimaduz sob as condições analíticas descritas anteriormente. Os níveis de concentração selecionados baseou-se na concentração de trabalho do fármaco, sendo referente a 2 mg.
Para avaliação dos dados de linearidade o cálculo de regressão linear foi realizado pelo método dos mínimos quadrados através do software GraphPad Prism versão 5.01 (GraphPad Software Inc.). Além disso, os
parâmetros de coeficiente de correlação (r2), intercepto do eixo Y e a distribuição resíduos também foram avaliadas.
4.2.1.2.3 Precisão (Repetibilidade e Precisão Intermediária)
A avaliação da repetibilidade procedeu-se tanto para o padrão, referente a 100% da concentração nominal, como para a formulação, sendo efetuada 6 determinações para cada.
Foram efetuadas medições em dois dias consecutivos, referentes a avaliação da precisão intermediária, no qual a determinação ocorreu em sextuplicata para a amostra padrão referente à concentração nominal e para a preparação farmacêutica proposta que está descrita na Tabela 4. As amostras pesadas respeitaram a proporção equivalente à aproximadamente 2 mg do hormônio estradiol bioidêntico.
Posteriormente, os resultados de entalpia foram agrupados para avaliar a média do teor obtido e o desvio padrão relativo (DPR) das análises.
4.2.1.2.4 Exatidão
Foi determinada utilizando três níveis de concentração (baixa, média e alta, sendo elas respectivamente 80%, 100% e 120%), contemplando a faixa de concentração de trabalho. As formulações foram preparadas variando-se a quantidade do estradiol buscando contemplar cada nível de concentração, posteriormente realizou-se três determinações para cada nível selecionado.
As análises foram conduzidas seguindo as condições analíticas descritas anteriormente, onde pesou-se 5 mg em cadinho de alumínio para cada um dos níveis de concentração selecionado. Assim, as concentrações de ativo após pesagem iria variar conforme a formulação selecionada, onde obtém-se 1,6; 2,0 e 2,4 mg de ativo nos respectivos níveis 80%, 100% e 120%.
O limite de detecção do hormônio estradiol bioidêntico foi estabelecido baseado nos valores encontrados no parâmetro de linearidade, onde o LD trata-se da razão do desvio padrão do intercepto com o eixo Y (coeficiente linear) com a inclinação da curva (coeficiente angular), multiplicado por 3.
O limite de quantificação do hormônio estradiol bioidêntico foi estabelecido pela razão desvio padrão do intercepto com o eixo Y (coeficiente linear) com a inclinação da curva (coeficiente angular), multiplicado por 10.
4.2.1.2.6 Robustez
O parâmetro de robustez é avaliado através da capacidade de resistência do método a mudanças deliberativas (BRASIL, 2017). No estudo em questão, a robustez foi determinada causando mudanças discretas de 0,5 ºC min-1 na razão de aquecimento em um nível acima e abaixo da β nominal (10 ºC min-1), onde as amostras foram submetidas a análises em sextuplicatas. Posteriormente, avaliou-se a influência das mudanças sobre o método através dos valores de DPR das energias obtidas.
5 RESULTADOS E DISCUSSÃO
Um estudo realizado por Pereira (2013) identificou que para os hormônios estradiol e estriol bioidênticos o melhor evento endotérmico para quantificação de fármacos trata-se do característico do processo de fusão. O referente estudo avaliou os eventos presentes nas curvas DTA quando variava- se as massas em 1 mg, 2 mg, 4 mg, 6 mg, 8 mg e 10 mg, obtendo uma boa linearidade da curva analítica com valores de coeficiente de determinação 0,999 e 0,998 para o estradiol e estriol, respectivamente. Baseado nos dados preliminares fornecidos por Pereira (2013) foi desenvolvido e validado a metodologia de quantificação do hormônio estradiol bioidêntico em formulações propostas.
5.1 SELEÇÃO E OTIMIZAÇÃO DAS CONDIÇÕES ANALÍTICAS
Os dados térmicos dos hormônios estradiol e estriol bioidêntico obtidos seguindo as condições analíticas descritas na Tabela 2 e Tabela 3 estão demonstrados na Figura 3 e Figura 4, respectivamente.
Figura 3 – Curvas TG/DrTG, DTA e DSC do hormônio estradiol bioidêntico na razão
O dado termogravimétrico do hormônio estradiol bioidêntico (Figura 3) mostra a presença de duas etapas de decomposição, a primeira correspondente à desidratação ocorrendo entre 94 e 118 ºC com perda de massa 2,9% e a segunda etapa referente à decomposição iniciando em 208 ºC com perda de massa referente a 94,1%. Na curva DTA, Figura 3, nota- se a presença de 3 eventos endotérmicos, correspondentes à desidratação, fusão e decomposição do fármaco. A análise calorimétrica demonstrou o mesmo perfil térmico apresentado pela curva DTA, entretanto observa-se um evento endotérmico próximo a fusão, podendo ser característico da presença de polimorfismos ou impureza na amostra. Os dados obtidos corroboram com os descritos na literatura (VERONEZ et al., 2015; PEREIRA, 2013).
A Figura 4 ilustra a curva TG/DrTG, DTA e DSC do hormônio estriol bioidêntico na razão de aquecimento de 10 ºC min-1. A partir da análise termogravimétrica pode-se confirmar que o estriol bioidêntico que o fármaco apresenta uma única etapa de decomposição com perda de massa 98%, através dos dados fornecidos pela DTG pode-se observar que a temperatura de pico da etapa principal de decomposição do estriol bioidêntico é em 396 ºC.
Figura 4 – Curvas TG/DTG, DTA e DSC do estriol bioidêntico na razão de
Analisando a curva DTA apresentada na Figura 4 nota-se a presença de três eventos endotérmicos, o primeiro ocorrendo entre 282 e 293 ºC com temperatura de pico de 285 ºC característico da fusão do estriol, os outros dois eventos endotérmicos característicos de decomposição do material. Dados semelhantes foram encontrados por Pereira (2013). A curva DSC do hormônio estriol bioidêntico, observada na Figura 4, mostra a presença de um evento endotérmico intenso característico do processo de fusão do fármaco, com temperatura de pico em 285 ºC, corroborando com as informações obtidas na curva DTA.
Como reportado anteriormente, os dados calorimétricos do hormônio estradiol demonstraram a presença de duas transições endotérmicas ocorrendo de modo concomitante denominado de eventos 2’ e 2, sendo melhor visualizados na Figura 5.
Figura 5 – Curva DSC do hormônio estradiol bioidêntico na razão de aquecimento de
10 ºC min-1.
Inicialmente, nota-se o primeiro evento denominado de 1 referente a desidratação do fármaco, posteriormente o evento endotérmico 2’ que possui Tincial em 168 ºC e variação de energia (ΔH) -11,18 J g-1, seguido do 2 que
ser atribuído a uma provável presença de impureza na amostra ou a existência de polimorfismo.
Na literatura inúmeros estudos mostram a existência de diferentes formas cristalinas e solvatos do hormônio estradiol bioidêntico, bem como suas formas de caracterização e identificação por técnicas térmicas, DRX, ressonância magnética nuclear (RMN) e microscopia de Raman (GUGUTA et al., 2008; SMAKULA, 1957; VARIANKAVAL; JACOB; DINH, 2000; VERONEZ et al., 2015)
Entretanto para o desenvolvimento e validação do método analítico faz- se necessário uma compreensão da natureza química dos eventos 2’ e 2 para que não venha a interferir nos valores de entalpia utilizados no método quantitativos do fármaco. Estima-se que entre 80% a 90% dos compostos orgânicos podem apresentar diferentes estruturas cristalinas, sendo a investigação deste uma preocupação da indústria farmacêutica no cenário do desenvolvimento de formulações, buscando métodos analíticos para identificação. Os dados de DSC aplicados a ciclos de aquecimento e resfriamento representa uma ferramenta útil para esta finalidade.
A Figura 6 apresenta a sobreposição das curvas DSC dos 5 ciclos de aquecimento- resfriamento do hormônio estradiol bioidêntico até a temperatura de 190 ºC.
Figura 6 – Sobreposição das curvas DSC do Estradiol Bioidêntico dos Ciclos de
