UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO
NORTE
CENTRO DE TECNOLOGIA – CT
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM ENGENHARIA
MECÂNICA – PPGEM
FABIOLA FERNANDES DA SILVEIRA
EXTRAÇÃO E CARACTERIZAÇÃO DE QUITOSANA DO
EXOESQUELETO DA LAGOSTA - Palinurus elephas
NATAL – RN AGOSTO/2013
FABIOLA FERNANDES DA SILVEIRA
EXTRAÇÃO E CARACTERIZAÇÃO DE QUITOSANA DO
EXOESQUELETO DA LAGOSTA - Palinurus elephas
Dissertação apresentada a Universidade Federal do Rio Grande do Norte como requisito para obtenção do título de Mestre em Engenharia Mecânica na área de Tecnologia dos Materiais e ênfase em Engenharia Biomédica.
Orientador: Dsc. José Ubiragi de Lima Mendes
Co – orientador: Dsc. Rasiah Ladchumananandasivam
NATAL – RN AGOSTO/2013
FABIOLA FERNANDES DA SILVEIRA
EXTRAÇÃO E CARACTERIZAÇÃO DE QUITOSANA DO
EXOESQUELETO DA LAGOSTA - Palinurus elephas
Dissertação apresentada a Universidade Federal do Rio Grande do Norte como requisito para obtenção do título de Mestre em Engenharia Mecânica na área de Tecnologia dos Materiais e ênfase em Engenharia Biomédica..
Aprovada em: ___/____/______ Nota: ____________
BANCA EXAMINADORA
_____________________________
Prof. Dsc. José Ubiragi de Lima Mendes.
(Orientador - UFRN)
_____________________________
Prof.Dsc. Rasiah Ladchumananandasivam
(Co-orientador – UFRN)
_____________________________
Prof. Dsc. Roberto Silva de Souza – IFRN
(Examinador externo – IFRN)
_____________________________
Prof. Dsc. José Heriberto Oliveira do Nascimento – UFRN
(Examinador interno – UFRN)
NATAL – RN AGOSTO/2013
FICH CATALOGRÁFICA DA BILIBOTECA BIBLIOTECA
UFRN / Biblioteca Central Zila Mamede Catalogação da Publicação na Fonte
Silveira, Fabíola Fernandes da.
Extração e caracterização de quitosana do exoesqueleto da lagosta – Palinurus elephans. / Fabíola Fernandes da Silveira – Natal, RN, 2013. 60 f.: il.
Orientador: Prof. Dsc. José Ubiragi de Lima Mendes. Co-orientador: Prof. Dsc. Rasiah Ladchumananandasivam.
Dissertação (Mestrado) – Universidade Federal do Rio Grande do Norte. Centro de Tecnologia. Programa de Pós-Graduação em Engenharia Mecânica.
1. Quitosana – Dissertação. 2. Engenharia dos tecidos – Dissertação. 3. Estrutura cristalina – Dissertação. I. Mendes, José Ubiragi de Lima. II. Ladchumananandasivam, Rasiah. III. Universidade Federal do Rio Grande do Norte. IV. Título
DEDICATÓRIA
Ao meu pai, João Cavalcante da Silveira, pelo exemplo de bondade, hombridade e simplicidade. Com todo amor, DEDICO esta dissertação como mais um passo de minha vida. Tenho certeza de que estás olhando por mim.
EPÍGRAFE
"Tente uma, duas, três vezes e se possível tente a quarta, a quinta e quantas vezes for necessário. Só não desista nas primeiras tentativas, a persistência é amiga da conquista. Se você quer chegar aonde à maioria não chega, faça aquilo que a maioria
não faz.”
AGRADECIMENTOS
A Deus, por guiar minha vida e trazer cada vez mais certeza em minhas escolhas. Ao meu pai João Cavalcante da Silveira, um exemplo de vida e dedicação familiar. Obrigada por todo esforço a me proporcionar uma educação excepcional; por todo carinho que me fez sentir uma filha amada; e pela seus ensinamentos que deu origem a minha índole e caráter.
A minha mãe, Rose Meire Fernandes da Silveira e irmão, Francisco Fabio Fernandes da Silveira que sempre estiveram presentes em todas as etapas do meu crescimento. Ao meu irmão, obrigada pelos momentos de alegria, guardarei sempre comigo as suas piadas. E a minha mãe, agradeço principalmente a sua organização em tudo e pontualidade, hoje sou pontual e organizada devido seu exemplo. Amo muito vocês.
Ao meu orientador José Ubiragi de Lima Mendes e sua esposa Neuza Sales Mendes que sempre tiveram carinho e atenção durante todo meu caminho acadêmico e pessoal, apoiando e contribuindo para concretizar meus ideais. Vocês são os pais que a vida me ofertou. O muito que escrevesse aqui nessa dedicatória seria pouco para agradecer tudo que fizeram e continuam fazendo por mim. Obrigada por tudo!
Ao meu noivo Karllyammo Lennon de Souza pelo apoio, carinho, compreensão e força em todos os momentos difíceis por onde caminhei. Sua presença me transmite a certeza de nunca estar sozinha. Sou feliz por estar ao seu lado e tenho certeza que essa é mais uma das várias conquistas que teremos durante nossa vida. A nossa felicidade está na simplicidade de estarmos juntos o tempo todo.
Ao meu co-orientador Rasiah Ladchumananandasivam pelos constantes esclarecimentos, incentivo e amizade. Professor, conviver com uma pessoa boa e integra como o senhor ajuda não só no meu crescimento profissional, mas principalmente pessoal. Muito obrigada por me acolher e fornecer todo auxilio que necessitei.
Ao meu amigo Rodrigo Márcio da Silva, pelo apoio e incentivo durante o processo de ingresso na graduação. Obrigada por me levar ao primeiro contato com a engenharia mecânica, que posteriormente se tornaria minha vida acadêmica. Não estaria concluindo essa pós-graduação, sem sua ajuda. Obrigada pela amizade, conselhos e pelos vários dias de estudo.
A minha amiga de infância Lidiágina da Silva Gomes e Jayanne Balbino da Silva. Mesmo que a distância nos impeça de ter um convívio mais constante, saber que eis minha amiga me fortalece.
Aos meus amigos do CEFET-RN e da vida toda Diego Airam da Costa Lima, Fabíola Patrícia da Silva Rufino, Raoull Victor Bezerra da Cruz e Handerson Daniel Germano de Souza Gondim. Muito obrigada por caminharem comigo sempre.
As minhas amigas de graduação e companheiras para vida toda, Ana Raquel de França Souza, Dinara Filgueira Soares, Emeline Noronha Vilar de Souza e Luciana Maria Varela de Queiroz. Obrigada por estarem presente, por todos os conselhos e apoio. Os momentos de descontração são inigualáveis.
Aos amigos Aline Cristina Mendes de Farias e Álvaro César Pontes Galvão por toda ajuda, amizade e companheirismo.
Aos amigos José Antonio de Oliveira Leandro e Iranilda Maia de Lima por todo apoio nos momentos difíceis e pela alegria nos momentos de laser.
Ao meu amigo Antônio Nunes Filho pelos esclarecimentos e contribuições com esta pesquisa.
A todos os amigos do Laboratório de Mecânica dos Fluidos e Laboratório de Química Têxtil, em especial Rudson de Souza Lima, Fernanda Alves Ribeiro, Synara Lucien de Lima Cavalcanti, Danny Geraldo Kramer Cavalcanti e Silva e Brismark Goes da Rocha.
Ao restaurante Camarões que contribuiu gentilmente todas às vezes que solicitei matéria prima. Em especial, agradeço ao gerente Evilásio Cavalcante de Araújo.
A todos os professores e funcionários e que tanto me ensinaram durante essa trajetória. Em especial aos professores Eve Maria Freire de Aquino, João Telésforo Nobrega de Medeiros e Clodomiro Alves Júnior.
RESUMO
Devido ao aumento da expectativa de vida da população, inumeras pesquisas são realizadas no sentido de melhorar a qualidade de vida e conferir a essas pessoas alternativas de reparo e substituição de orgãos e tecidos taumatizados mecanicamente ou por patologias. Faz-se então necessário o constante desenvolvimento de biomateriais para otimizar a dinamica da vida. Para desenvolve-los vários tipos de materiais sinteticos e biogenos são testados, dentre eles encontram-se os polimeros que posssuem alta biocompatibilidade. Assim, um polímero natural, mais especificamente a quitosana, tem demonstrado ser uma alternativa que vêm despertando grande interesse de cientistas e tecnólogos como materiais poliméricos funcionais. Estudos comprovam suas propriedades na regeneração dos tecidos, proteção contra o ataque microbiano e na passagem do vapor de água, do ar e tem alto poder anti-séptico. A quitosana é o componente desacetilado da quitina, biopolimero mais encontrado na natureza depois da celulose, está presente na parede celular dos fungos, dos crustáceos (camarão, siri, lagosta). O processo de extração consiste em desmineralização (HCl 7% e 10%), desproteinização (NaOH – 7% e 10% - baixa concentração) e desacetilação (NaOH – 40% e 50% - alta concetração). Baseado nisso, esta pesquisa tem como objetivo extrair a quitosana a partir do exoesqueleto da lagosta - Palinurus elephas- e caracterizá-la. Foram realizados DRX, MEV e FTIR. Após os ensaios conclui-se que a quitosana extraída foi caracterizada de acordo com a literatura abordada.
ABSTRACT
Due to increased life expectancy of the population, numerous studies are conducted to improve the quality of life and provide these people alternate repair and replacement of organs and tissues taumatizados mechanically or pathologies. It is then necessary to the constant development of biomaterials to optimize the dynamics of life. To develop these various types of synthetic materials are tested biogenos and, among them are those polymers which posssuem high biocompatibility. Thus, a natural polymer, chitosan More specifically, it has been shown to be an alternative that would have aroused great interest of scientists and technologists as functional polymeric materials. Studies prove their properties in regeneration of tissues, protection from microbial attack and the passage of water vapor, air, and has high antiseptic power. Chitosan is the deacetylated chitin component, more biopolymer found in nature after cellulose, is present in the cell wall of fungi, crustaceans (shrimp, crab, lobster). The extraction process consists of demineralization (HCl 7% and 10%), deproteinization (NaOH - 7% and 10% - low concentration) and deacetylation (NaOH - 40% and 50% - high concetração). Based on this, this research aims to extract chitosan from the exoskeleton of the lobster - Palinurus elephas, and to characterize it. Were performed XRD, SEM and FTIR. After testing it was concluded that chitosan was characterized extracted according to the literature discussed.
LISTA DE FIGURAS E TABELAS
FIGURA 1 – Estrutura química da quitina ... 8
FIGURA 2 – Orientação polimórfica da quitina ... 9
FIGURA 3 – Estrutura química da quitosana ... 9
FIGURA 4 – Áreas de aplicação da quitosana... 11
FIGURA 5 – Processo de extração da quitosana ... 13
FIGURA 6 – Fluxograma representativo das amostras de desmineralização ... 16
FIGURA 7 - Processo de desmineralização ... 17
FIGURA 8 – Fluxograma representativo das amostras de desproteinização ... 18
FIGURA 9 – Processo de desproteinização Quitina ... 19
FIGURA 10 – Pó desproteinizado - Quitina ... 20
FIGURA 11 –Fluxograma representativo das amostras de desacetilação ... 21
FIGURA 12 – Lavagem das amostras ... 22
TABELA 01 – Processamento e rendimento da quitosana ... 24
FIGURA 13 – MEV quitina ... 25
FIGURA 14 - MEV quitina ... 26
FIGURA 15 - MEV quitina ... 26
FIGURA 16 - MEV quitina ... 27
FIGURA 17 - MEV quitina ... 27
FIGURA 18 - MEV quitina ... 28
FIGURA 19 – MEV quitosana ... 28
FIGURA 20 - MEV quitosana ... 29
FIGURA 21 - MEV quitosana ... 29
FIGURA 22 - MEV quitosana ... 30
FIGURA 23 - MEV quitosana ... 30
FIGURA 24 - MEV quitosana ... 31
FIGURA 25 – Difratograma do exoesqueleto da lagosta ... 33
FIGURA 26 – Difratograma de desmineralização ... 34
FIGURA 27 - Difratograma de desmineralização ... 34
FIGURA 29 – Difratograma de desproteinização ... 36
FIGURA 30 - Difratograma de desproteinização ... 36
FIGURA 31 - Difratograma de desproteinização ... 37
FIGURA 32 – Gaussiana de DRX ... 38
TABELA 02 – Icr e GD da quitosana ... 39
FIGURA 33 - Difratograma da quitosana ... 39
LISTA DE SIMBOLOS E ABREVIAÇÕES
C Celsius
Ca(OH)2 Hidróxido de cálcio
CH3COOH Ácido acético
CaHSO3 Sulfito de cálcio
DRX Difratograma de raio X
FTIR Espectro de infravermelho por transformada de Fourier
HCl Ácido clorídrico
HNO3 Ácido nítrico
H2SO3 Ácido sulfuroso
HCOOH Ácido fórmico
Ic Pico mais cristalino
Ia Pico mais amorfo
ICR Índice de cristalinidade
KOH Hidróxido de potássio
K2CO3 Carbonato de potássio
LABTEX Laboratório de Engenharia Têxtil
MEV Microscopia Eletrônica por Varredura
m/v Relação massa e volume
NaOH Hidróxido de sódio
Na2CO3 Carbonato de sódio
NaHCO3 Bicarbonato de sódio
Na2SO3 Sulfeto de sódio
NaHSO4 Bissulfato de sódio
Na2S Sulfeto de sódio
NH Nitrogênio e hidrogênio
NH2 Amina
NHCOCH3 Grupamento acetamino
OH Hidroxila
T Temperatura
t Tempo
v/v Relação volume e volume
SUMÁRIO
1.INTRODUÇÃO ... 1
1.1 Objetivo Geral ... 3
1.2 Objetivos Específicos ... 3
2. REVISÃO DE LITERATURA ... 4
2.1 ENGENHARIA DOS TECIDOS ... 4
2.2 BIOMATERIAIS ... 4
2.3 BIOPOLIMEROS ... 6
2.4 QUITOSANA ... 7
2.4.1 Histórico ... 7
2.4.2 Estrtura química: quitina e quitosana ... 7
3. METODOLOGIA ... 12
3.1 PROCESSO DE EXTRAÇÃO DA QUITOSANA ... 12
3.2 OBTENÇÃO DA QUITTINA ... 14 3.3 OBTENÇÃO DA QUITOSANA ... 20 3.4 METODOS DE OBTENÇÃO ... 22 3.5 CARACTERIZAÇÃO ... 23 4. RESULTADOS E DISCUSSÕES ... 24 4.1 Calculo do rendimento ... 24 4.2 MEV ... 25 4.3 Difração de raio X ... 32 4.4 FTIR ... 40 5. CONCLUSÕES ... 43
6. SUGESTOES PARA TRABALHOS FUTUROS ... 44
1. INTRODUÇÃO
Devido ao aumento na expectativa de vida, saúde em geral e bem estar da população, a ciência atualmente realiza inúmeras pesquisas com a finalidade de melhorar a qualidade de vida das pessoas gerando alternativas para o reparo e substituição de tecidos vivos vitimados por traumas ou patologias. Neste contexto, o uso de biomateriais, definidos como materiais farmacologicamente inertes, utilizados em implantes ou incorporados a sistemas biológicos a fim de suplementar ou substituir funções de tecidos ou órgãos (BHAT, 2005), aparece com grande destaque.
Surge então um novo campo da biotecnologia - a Engenharia de Tecidos – que consiste em um conjunto de conhecimentos e técnicas para a reconstrução de órgãos e tecidos. Apresenta-se como um campo de pesquisa multidisciplinar, envolvendo conhecimentos das áreas de biologia, ciências da saúde e de engenharias e ciência dos materiais.
A seleção do material é um dos primeiros passos para a reconstrução de um órgão, dependendo do tecido a ser regenerado. Propriedades como biocompatibilidade do material, resistência mecânica, tamanho e formato de poros são de grande relevância, além de sua interação com as células, de modo a permitir sua adesão, crescimento, migração e diferenciação, caso seja requerida (MACHADO et al., 2006; HUTMACHER, 2000).
No entanto, a dificuldade de selecionar o biomaterial ideal para montar este arcabouço justifica-se exatamente no desafio de agregar na mesma estrutura, um material que apresente um perfil de propriedades físico-quimicas e biológicas ideais (HSIEH; CHANG; LIN, 2007).
Assim, um dos grandes desafios na área de regeneração tecidual é a busca por biomateriais oriundos de matérias-primas de baixo custo, fácil acesso e que possuam características adequadas para a função destinada (DALLAN, 2005).
Diversos estudos têm apontado o uso de polímeros biorreabsorvíveis de origem natural como quitosana, alginato, gelatina, celulose e seus derivados (MENG et al., 2010; WITTAYA-AREEKUL e PRAHSARN, 2006; ZHAO et al., 2002), separadamente ou combinados, para aplicações em engenharia de tecidos. Assim, sistemas à base de polissacarídeos como a quitosana representam uma alternativa promissora para a produção de dispositivos médicos.
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Neste grupo, diversos estudos têm explorado o potencial da quitina e seus derivados, principalmente a quitosana que além de todas estas características, possuem propriedades cicatrizantes e grande disponibilidade comercial, o que os faz materiais ideais para a confecção de dispositivos médicos adequados para as mais variadas aplicabilidades (KUCHARSKA et al., 2008; REDDY et al., 2008).
A quitosana é o componente principal da carapaça dos crustáceos, sendo muito abundante na natureza. Sua fórmula estrutural consiste de um copolímero de N-acetil glicosamina (β-(1-4)2-acetamido-2-desoxi-D-glicose) e D-glicosamina (2-amino-2-desoxi-D-glicose). Este composto estimula a proliferação celular, além de ser bactericida, fungicida e hemostático, pode ser empregado na obtenção de filmes e membranas (combinados ou não com outras substâncias), além de formar géis em soluções ácidas. (HEIN et al., 2008).
A grande vantagem na utilização da quitosana é ser obtida de fonte natural, é renovável, biodegradável e normalmente sua matéria prima é desprezada na forma de lixo.
Assim, a adoção de uma política racional que gere resultados como inserção de novos produtos, redução de custos produtivos, qualificação de pessoal, preservação de meio ambiente, geração de venda, entre outros, é indiscutivelmente um conjunto de procedimentos que justifica atenção. Portanto, há de se ressaltar a importância deste trabalho dado à inovação que o mesmo oferece, visto que não existe no mercado tal produto com consequente valor agregado.
Além disso, há uma preocupação com o destino adequado para os resíduos de crustáceos da indústria pesqueira, para que as agressões ao meio ambiente sejam cada vez mais reduzidas. Pois, o resíduo proveniente do beneficiamento dos crustáceos é constituído por quitina, proteína, carbonato de cálcio e pode causar grande problema de ordem social por ser desagradável no cheiro, atrair insetos e pode acarretar danos a saúde humana.
No seguimento desse trabalho, está a hipótese norteadora de que a quitosana e um material biocompatível, tem potencial bactericida e antisséptico tornando-o apto para diversas aplicações medicas.
Baseando-se nos aspectos citados, esta pesquisa pretende extrair e caracterizar a quitosana proveniente do exoesqueleto da lagosta para aplicações médicas. Será realizado, em todas as fases de extração de quitosana, análise por difração de raio X para comprovar a eficácia no processo, seguido de sua caracterização.
1.1 Objetivo Geral
O presente trabalho objetiva extrair a quitosana a partir do exoesqueleto da lagosta - Palinurus elephas – e caracterizar o biomaterial.
1.2 Objetivos Específicos:
➔ Sintetizar a quitina extraída do exoesqueleto da lagosta;
➔ A partir da quitina sintetizada, obter o biopolímero de quitosana; ➔ Realizar uma análise crítica acerca dos processos relatados;
➔ Discorrer sobre as vantagens e desvantagens do processo visualizando seu objetivo final; ➔ Estabelecer o rendimento do polímero;
➔ Caracterizar o polímero através das técnicas de difração de raio-X, microcopia eletrônica de varredura e espectroscopia de infravermelho por transformada de Fourier.
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2. REVISÃO DE LITERATURA
2.1 ENGENHARIA DOS TECIDOS
A engenharia de tecidos é um campo multidisciplinar que busca o desenvolvimento de substitutos biológicos que melhoram, restauram ou mantêm a função de células, tecidos e órgãos (RAMBO, 2006). Tem o objetivo de produzir materiais duráveis, funcionais e compatíveis com os sistemas biológicos para serem utilizados com fins terapêuticos (GIRARDI, 2005).
Nos últimos anos a engenharia de tecidos tem apresentado grandes avanços, em especial na área da dermatologia. As primeiras aplicações clínicas de células humanas começaram por volta de 1980, com experimentos usando fibroblastos e queratinócitos para a regeneração em tecidos de pele (IKADA, 2006), e desde então, técnicas promissoras de produção de curativos dérmicos bioativos têm sido descritas.
Neste contexto, o desenvolvimento de matrizes poliméricas produzidas em laboratórios com materiais inertes destinadas ao uso como suportes de crescimento e desenvolvimento celular é de grande relevância.
2.2 BIOMATERIAIS
Biomaterial é todo material farmacologicamente inerte, utilizado para substituir, no todo ou em parte, sistemas biológicos. Estes devem possuir a capacidade de permanecer em contato com tecido vivo e recompor partes lesadas do organismo, ou ainda auxiliar na recuperação. Podem agir de modo contínuo ou intermitente, entrando em contato com fluídos corpóreos, mesmo que localizados fora do corpo. Podem ou não servir como matriz, veículo, suporte ou estimulador da formação de novo tecido (DALLAN, 2005; CUNHA, 2008).
Os biomateriais podem ser de origem natural destacando-se o colágeno purificado, as fibras proteicas, os polissacarídeos e os tecidos tratados; ou sintéticos como metais, cerâmicas, polímeros e compósitos (MARK & CALVERT, 1994). São classificados ainda como bioestáveis ou permanentes e bioabsorvíveis ou temporários. Os bioestáveis são aqueles
que substituem o tecido lesado por tempo indeterminado, como as próteses para articulações, válvulas cardíacas e lentes intraoculares. Para tanto se faz necessário que estes materiais possuam características físico-químicas compatíveis com tais funções. Por outro lado, algumas lesões necessitam apenas de preenchimento ou direcionamento para o processo de reparação tecidual. Os materiais bioabsorvíveis são alternativas para estas situações já que são degradados in vivo, atuando como dispositivos temporários (TÖRMÄLÄ et al., 1998).
Os biomateriais devem possuir características imprescindíveis de: biocompatibilidade, ou seja, devem atender ao requisito de funcionalidade para o qual foram produzidos, não estimulando ou provocando o mínimo de reações alérgicas ou inflamatórias; devem ser não tóxicos; esterilizáveis e capazes de reproduzir as propriedades dos tecidos que eles substituem (SZYCHER, 1992). A biocompatibilidade está relacionada à intensidade dos processos inflamatórios ou imunológicos desencadeados pelo organismo quando um material estranho entra em contato com fluidos biológicos.
A seleção de um biomaterial é baseada na combinação de suas propriedades mecânicas, físicas e biológicas (BENSON, 2002) e depende da utilização ao qual é destinada. Como essas propriedades são extremamente sensíveis a variações da estrutura do material em escala micro ou nanométrica, é fundamental que se tenha perfeito entendimento de como se correlaciona a microestrutura do material com as propriedades biológicas desejadas. Um exemplo são os biomateriais desenvolvidos para a área de regeneração de pele geralmente se apresentam na forma de filmes, espumas, géis ou membranas. Devem possuir características fundamentais como leveza, ausência de odor à aplicação e remoção, impermeabilidade a micro-organismos, permeabilidade ao oxigênio e ao vapor d’água, facilidade de processamento, biodegradabilidade e biocompatibilidade (CRAVEIRO & CRAVEIRO, 2000).
Atualmente, na área médica são empregados muitos tipos de biomateriais, tais como silicone e derivados, politetrafluoretileno, polietileno de alta densidade, vidro bioativo, acrílicos, adesivos entre outros, que podem ser utilizados em variados tipos de implantes.
Como se pode notar, a ciência dos biomateriais é uma área multidisciplinar. Seu objetivo geral não engloba apenas o desenvolvimento de compostos a serem utilizados como substitutos de tecidos lesados, mas também o entendimento das interações destes com o organismo receptor. Neste contexto, deve-se ressaltar que o conceito biocompatibilidade se resume na habilidade de um material em induzir no paciente uma resposta adequada a uma aplicação específica (WILLIAMS, 1987).
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2.3 BIOPOLÍMEROS
Polímeros naturais, ou biopolímeros, podem ser definidos como quaisquer polímeros produzidos por organismos vivos. Estes materiais apresentam uma grande diversidade de aplicações no campo da engenharia de tecidos, na medicina regenerativa e em dispositivos médicos. Exemplos de sistemas constituídos de biopolímeros são: implantes ortopédicos, válvulas cardíacas, marcapassos, bioeletrodos, biossensores, lentes de contato, sistemas de liberação controlada de medicamentos e curativos para pele (RATNER et al., 1996, JAGUR-GRODZINSKI, 2006).
A principal vantagem dos biopolímeros é a sua biocompatibilidade. Outra vantagem é a sua metabolização por enzimas. Problemas como respostas inflamatórias, frequentemente provocados por polímeros sintéticos, podem ser suprimidos quando do uso de tais materiais. Contudo, por sua composição ser muito mais complexa do que a dos polímeros sintéticos, a sua manipulação é frequentemente mais complicada (RATNER et al., 1996).
As três grandes classes de biopolímeros são: polissacarídeos, ácidos nucléicos e proteínas. Os polissacarídeos, em particular, possuem diversos papéis em organismos vivos e na natureza como um todo, sendo elementos-chave em processos biológicos. Dentro deste grupo, os amino-polissacarídeos como a quitosana são muito interessantes com respeito às suas funções biológicas e são, portanto, os mais estudados (IL’INA E VARLAMOV, 2005).
O uso potencial de um polímero como biomaterial depende de parâmetros importantes de trabalho como o grau de pureza do produto. Sabe-se que os polímeros, depois de sintetizados, podem apresentar algum tipo de impureza, tais como: resíduos de solventes, catalisadores de reação, estabilizadores, subprodutos da reação, monômeros residuais e oligômeros (MERKLI, 1996).
Pesquisadores de diversas áreas enfrentam o desafio de aprimorar e desenvolver esses biopolimeros visando aumento da expectativa e melhora da qualidade de vida e bem estar dos pacientes. Neste contexto, destaca-se a quitosana, o alginato, a celulose e o colágeno (VEIGA, 2009).
2.4 QUITOSANA
2.4.1 Histórico
Em 1811 Braconnot, ao trabalhar com fungos relatou uma nova substancia completamente distinta da encontrada nas madeiras (KNORR, 1991).
Odier em 1823 isolou uma substância insolúvel contida nas carapaças dos insetos. A quitina, em grego significa túnica, envelope ou cobertura. Embora tenha falhado em não detectar nitrogênio na composição, foi o primeiro a relatar a semelhança entre as substâncias presentes na armadura dos insetos e nos tecidos vegetais.
Posteriormente, Odier também observou a presença de quitina na carapaça de caranguejo e sugeriu que ela seria o material básico na formação do exoesqueleto de todos os insetos e possivelmente dos aracnídeos. Entretanto, só mais tarde, em 1843, Payen detectou a presença de nitrogênio na quitina (ROBERTS, 1992).
A quitosana foi descrita pela primeira vez em 1859 por Rouget, quando tratava quitina com uma solução em ebulição de hidróxido de potássio. Este nome foi proposto em 1894 por Hoppe-Seyler pelo fato desta substância possuir quantidade de nitrogênio igual à quitina original. (CHITIN AND CHITOSAN ASSOCIATION, 2008).
O estudo e aplicação da quitina e quitosana intensificaram-se em 1970, quando se observou o grande potencial de aplicação. (KNORR, 1991, HONG, 1996).
A quitosana só foi produzida industrialmente em 1971 no Japão. Em 1986, o Japão já possuía quinze indústrias produzindo quitina e quitosana em escala comercial (HIRANO, 1989).
O Japão e os EUA são os países que vêm se destacando como os maiores produtores, consumidores e pesquisadores destes polissacarídeos e derivados (NIFANT’EV, 1998, HIRANO, 1989, KOBELKE, 1990).
2.4.2 Estrutura química: quitina e quitosana
A celulose e a quitina são os materiais poliméricos mais importantes na natureza, devido a surpreendente abundância e fácil acesso (KURITA,1998). Esses materiais são semelhantes em sua natureza funcional (baixa solubilidade e baixa reatividade química) e na sua estrutura polimérica, porém a quitina difere da celulose pela substituição da hidroxila por um grupo acetamina no carbono de posição dois (KUMAR, 2000).
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A quitina é uma substância natural encontrada em áreas costeiras, pois tem como principais fontes as carapaças de crustáceos (notadamente o caranguejo, o camarão e a lagosta), sendo também encontrada em insetos, moluscos e na parede celular dos fungos (HEIN et al., 2008).
Nos exoesqueletos dos crustáceos, a quitina está associada com proteínas, materiais inorgânicos, pigmentos e lipídeos, apresentando entre 15-20% de quitina, 25-40% de proteínas e 40- 55% de carbonatos de cálcio.
Trata-se de um polissacarídeo de cadeia linear formado por unidades de N-acetil-2- dioxi-D-glicopiranose, que são interligadas por ligações glicosídicas β (1→4), de acordo com a Fig 1. É biodegradável, biocompatível aos tecidos e a bioatividade. Suas propriedades incluem a formação de polioxisais e filmes e quelação de íons metálicos, devido a altas porcentagens de nitrogênio (cerca de 6,89%) e características estruturais ópticas (KUMAR, 2000). É altamente hidrofóbico, insolúvel em água e nos solventes orgânicos. É solúvel em hexafluorisopropanol, hexafluoracetona, cloroálcoois adicionais a soluções aquosas de ácidos minerais e dimetilacetona contendo 5% de cloridrato de lítio (KUMAR, 2000).
Figura 1. Estrutura da quitina. Adaptação de GOMES, A.M.M., 2008.
Na natureza a quitina pode ser encontrada em três diferentes formas de arranjo estrutural de suas cadeias: alfa, beta e gama, sendo a ultima a mais difícil de ser encontrada. A Fig. 2 representa esquematicamente esses arranjos.
Figura 2. Estruturas polimóficas da quitina
A configuração da α-quitina é uma estrutura altamente organizada com fortes ligações de hidrogênio inter e intramoleculares de quitina que levam a ser rígida e insolúvel. Por outro lado, na β-quitina as interações intermoleculares são mais fracas, predominando as ligações de hidrogênio intramoleculares (GARDNER, 1975; MUZZARELLI, 1997).
Quitosana é um copolímero linear obtido a partir da desacetilação termoquímica alcalina da quitina. Resulta em ligações de N-acetil glicosamina (β-(1-4)2-acetamido-2-desoxi-D-glicose) e D-glicosamina (2-amino-2-(β-(1-4)2-acetamido-2-desoxi-D-glicose) (HEIN et al., 2008), Fig. 3. Quimicamente, é um biopolímero de alto peso molecular (PM), sendo uma poliamina e suas propriedades estão relacionadas aos grupos amino livres.
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O termo quitosana abraça uma série de polímeros, que variam em massa molar (em torno de 10.000 a 1 milhão de Daltons), dependendo da fonte e procedimentos de preparação, e em grau de desacetilação de 50 a 95% (NUNTHANID, 2001).
A quitosana é insolúvel em valores de pH neutro e alcalino, mas forma sais solúveis em água com ácidos inorgânicos e orgânicos fracos, incluindo ácido glutâmico, clorídrico, láctico e acético, resultando em soluções viscosas (DYER, et al. 2002). Em meio ácido, é um polieletrólito catiônico que tem seus grupos amino protonados (NH3+), conferindo à molécula cargas positivas. Quanto maior a quantidade destes grupos protonados na molécula, maior será a repulsão eletrostática entre as cadeias e também maior a solvatação em água. A quitosana é um biopolímero susceptível a mudanças estruturais, devido à grande quantidade de grupos reativos como as hidroxilas e, principalmente, pela presença de grupos aminos, que caracterizam a sua forte afinidade por moléculas polares (SANTOS, 2003). Como um policátion, a quitosana pode formar complexos eletrostáticos com espécies carregadas negativamente, incluindo proteínas, certos polímeros aniônicos, fármacos w outros anions de baixa massa molar. A quitosana exibe excelente propriedade de retenção de água, ação bactericida e uma dose letal, DL 50 encontrada na faixa de 16g x kg-1 de peso corporal, quando administrada oralmente em ratos, caracterizando uma baixa toxicidade. Essas propriedades são características importantes que podem influenciar no desempenho da quitosana em muitas das suas aplicações (CANELLA, 2001).
Devido à sua abundância como matéria-prima e características únicas, a quitina, a quitosana e seus derivados têm sido utilizados no desenvolvimento de muitos produtos e para as mais diversas áreas de aplicação, como medicina (curativos, ataduras, suturas, pele artificial, agente hemostático, membranas para órgãos artificiais, agente liberador de drogas, proteção gástrica, agente hipocolesterêmico e agente lipofílico) (LIU et al.,2004) nutrição (clarificante de vinhos, estabilizante de aromas, protetor de frutas e verduras, fibra dietética – alimento funcional), cosméticos, fotografia, tratamento de água (derramamento de petróleo, captura de metais pesados), agricultura (protetor de sementes, agente antimicrobiano para plantas, agente liberador de pesticidas e hebicidas) e etc (Fig. 4). Devido a sua maior versatilidade, a quitosana tem sido preferida em detrimento da quitina, na maior parte das aplicações.
Figura 4. Áreas de Aplicações da quitosana (KUMAR, 2000).
Dentre suas diversas características, destaca-se sua capacidade de ser absorvido pelo organismo. Por ser um material hemostático ajuda no processo de coagulação natural. A sua degradação produz oligômeros de N-acetil-β-D-glicosamina, que estimula a proliferação de fibroblastos e ajuda na deposição ordenada do colágeno, além de estimular o aumento da síntese de ácido hialurônico na região da ferida. Desta forma, a quitosana promove uma cicatrização mais rápida e previne a formação de cicatrizes, podendo ser usada em feridas abertas, reconstituição do tecido ósseo e cartilaginoso e preparo de pele artificial. (HEIN et al., 2008; RODRIGUES, 2008; YUDANOVA E RESHETOV, 2006; MALAFAYA et al., 2007).
Além dessas propriedades mencionadas anteriormente, a quitosana tem se destacado pela propriedade da bio/mucoadesividade, uma vez que seus grupos podem sofrer protonação em certos pHs fisiológicos e, assim, interagir eletrostaticamente com as cargas negativas na
12
mucosa ou superfícies celulares, caracterizando a sua propriedade de bioadesividade. Como exemplo, tem-se a facilidade de aderência em polímeros naturais como o cabelo e a pele, constituídos por proteínas e mucopolissacarídeos com cargas negativas. É bem conhecido que a força repulsiva existente entre as células vermelhas do sangue deve-se à rede de cargas negativas das membranas celulares. Esta alta carga negativa na superfície das células deve-se principalmente à presença de resíduos de ácido neuramínico na membrana celular. A formação do gel sobre as células vermelhas do sangue é decorrente da interação entre o polímero positivamente carregado (quitosana) e os receptores contendo resíduos do ácido neuramínico presentes na superfície da célula.
Dessa forma, a reutilização dessa substância química também é muito importante do ponto de vista ambiental e econômico, porque além de eliminar os resíduos da indústria pesqueira, o custo final de produção é reduzido em cerca de 60% (MATHUR e NARANG, 1990).
Atualmente, toda quitina produzida comercialmente é obtida a partir de carapaças de caranguejos e cascas de camarões, oriundos de resíduos da indústria de processamentos desses crustáceos enquanto alimentos, sendo sua produção anual comparável à de celulose (KUMAR, 2000; GEORGE E ABRAHAM, 2006; RINAUDO, 2008).
3. METODOLOGIA
3.1 PROCESSO DE EXTRAÇÃO DA QUITOSANA
14
3.2 OBTENÇÃO DA QUITINA
Para execução da pesquisa serão considerados as etapas e procedimentos abaixo especificados:
1. Foi escolhido para o desenvolvimento do trabalho o tipo e espécie de matéria prima. Foi selecionada a lagosta - Palinurus elephas - pois esta espécie predomina a costa
marítima brasileira;
2. Foi obtido o montante de matéria prima necessária para o desenvolvimento da pesquisa através de produtores dos resíduos de crustáceos da cidade de Natal/RN, especificamente o restaurante Camarões, que contribuiu com 70% do montante. O restante de matéria prima foi obtida através de doação do IBAMA (Instituto Brasileiro do Meio Ambiente), visto que a lagosta possui um período de defeso de seis meses, de janeiro à junho, ficando este órgão responsável pela fiscalização de toda costa brasileira durante esse período. A doação foi oriunda de apreensões;
3. Tratamento dos resíduos dos crustáceos necessário para síntese de quitina realiza-se através de processos químicos, isolando-a dos outros componentes do exoesqueleto. Seguem as etapas abaixo:
• Limpeza dos resíduos – lavagem em água corrente para remoção de sujidades; • Secagem – exposição ao sol, em temperatura ambiente, durante 24 horas para retirada de umidade necessária para moagem;
• Moagem – O montante de matéria prima foi moído em um moinho de facas, utilizando-se lamina de 30 mesh para obtenção de menor granulometria, 0,5 mm, necessária para favorecer o processo de reação química. O objetivo é aumentar a superfície de contato do material favorecendo assim a reação;
• Desmineralização – reduzir o teor de carbonato de calcio, observando a eliminação de carbonatos e fosfatos, por meio da imersão em ácido clorídrico:
(1) CaCO3 + 2 HCl → CO2↑ + CaCl2 + H2O
A desmineralização ocorre através do tratamento com vários ácidos, como HCl, HNO3, H2SO3, CH3COOH e HCOOH, sendo o HCl o ácido mais utilizado em diferentes concentrações.
De acordo com a equação 1, o que ocorre no processo de desmineralização é a quebra a molécula de carbonato de cálcio, resultando na liberação de gás carbônico.
Nessa fase de desmineralização, foi utilizado solução PA (padrão, que corresponde a 37%) de HCl, em concentrações de 7% e 10% v/v (volume/volume). Para calcular a concentração da solução foi necessário o seguinte calculo:
HCl = 37,2% → 12 N (d = 1,05)
Normalidade = 36,465g em 1000 ml → 1N 12 x 36,465 g de HCl = 37,2%
- Para reação de HCl 7%: 2N de HCl = 7,15%
17 ml HCl + 83 ml (água destilada) = 100 ml (solução de HCl 7,15%) - Para reação de HCl 10%:
3N de HCl = 10%
25 ml HCl + 75 ml (água destilada) = 100 ml (solução de HCl 10%)
Com uma relação de banho (R:B) de 1:5 e 1:10 (10 g de pó do exoesqueleto da lagosta foi adicionado 50 ml de solução de HCl e em 10 g do exoesqueleto da lagosta foi adicionado 100 ml de solução de HCl), ver Fig. 6. As amostras foram imersas em banho-maria, utilizando-se temperaturas de 50 °C e 75° C, durante 60 minutos (Fig 7).
16
Figura 7. Processo de desmineralização.
• Lavagem – Após o processo, as amostras foram lavadas com água destilada até neutralização do ph.
• Secagem – para retirada da umidade, colocada em estufa a 80 °C durante 1 hora.
• Dissecador – retirada de umidade durante 24 horas.
• Desproteinização – para reduzir o teor de nitrogênio proteico, por meio de imersão em hidróxido de sódio.
Para eliminar as proteínas, pode ser utilizado um grande número de solventes, tais como soluções aquosas de NaOH, Na2CO3, NaHCO3, KOH, K2CO3, Ca(OH)2, Na2SO3, NaHSO4, CaHSO3, Na3PO4 e Na2S, sendo o NaOH, o mais utilizado.
Portanto na desproteinização, foi utilizado solução PA (padrão, que corresponde a 99,9%) de NaOH, em concentrações de 7% e 10% p/v (peso/volume). Para calcular a concentração da solução foi necessário o seguinte calculo:
- Para solução de 7 %:
18
- Para solução de 10 %:
10 g de NaOH + 100 ml (água destilada) = 100 (solução de NaOH a 10%)
Com uma relação de banho (R:B) de 1:50 (3 g de pó desmineralizado foi adicionado 150 ml de solução de NaOH), ver Fig. 8. As amostras foram imersas em banho-maria, utilizando-se temperaturas de 50 °C e 75° C, durante 4 horas e 8 horas (Fig. 9).
Figura 9. Processo de desproteinização – Quitina.
• Lavagem – Após o processo, as amostras foram lavadas em água destilada até neutralização do ph.
• Secagem – para retirada da umidade, colocada em estufa a 80 °C durante uma hora.
20
Figura 10. Pó desproteinizado – Quitina.
3. 3 OBTENÇÃO DA QUITOSANA
A quitosana é o componente desacetilado da quitina. Portanto foi utilizado as amostras obtidas anteriormente para dar seguimento ao processo de extração.
• Desacetilação - os grupamentos acetamida (-NHCOCH3) da quitina são transformados em grupos amino (-NH2), por meio de imersão em hidróxido de sódio de alta concentração e altas temperaturas:
Portanto, na desacetilação foi utilizado solução PA (padrão, que corresponde a 99,9%) de NaOH, em concentrações de 40% e 50% p/v (peso/volume).
Com uma relação de banho (R:B) de 1:50 (1 g de quitina foi adicionado 50 ml de solução de NaOH) – Fig 11. As amostras foram em autoclave, a uma pressão de 1,3 bar, utilizando-se temperaturas de 100°C e 115° C, durante 1 hora e 1 hora e 30 minutos.
Figura 11. Representação das amostras no processo de desacetilação
• Lavagem – Após o processo, as amostras foram lavadas em água destilada até neutralização do ph, ver Fig 12.
22
Figura 12. Lavagem das amostras após desacetilação – Quitosana.
• Secagem – para retirada da umidade, colocada em estufa a 80 °C durante 1 hora.
• Dissecador – retirada de umidade durante 24 horas.
Após a síntese de cada fase foi realizado a pesagem do pó e ao final realizado o rendimento do produto final.
3.4 MÉTODOS DE OBTENÇÃO:
Toda a extração de quitosana foi realizada no laboratório de Engenharia Têxtil UFRN – LABTEX. As análises de DRX, MEV e FTIR foram realizadas no laboratório de Engenharia de Materiais, Física e Química da UFRN, respectivamente.
Para as análises morfológicas foi realizado a microscopia eletrônica de varredura (MEV) e difração de raio X (DRX). Seguido de esprectroscopia infravermelho por transformada de Fourier (FTIR).
3.5 CARACTERIZAÇÃO
- Calculo de rendimento da quitosana (Tabela 1, pag. 20)
Foi realizado o calculo de porcentagem a partir do peso inicial do exoesqueleto da lagosta em relação ao produto final.
- Análise morfológica por microscopia eletrônica de varredura (MEV)
As amostras de quitina e quitosana em pó foram analisadas por MEV, em um microscópio Philips XL 30 ESEM. Essa analise possui a finalidade de observar a estrutura e os fatores que influenciam suas modificações.
- Análise morfológica por difração de raio X
A difração de raio X foi realizada em Difratômetro Universal de raio – X modelo Shimadzu XRD-6000, com radiação Cu, potência de 30 kV e corrente de 30 mA. As amostras foram analisadas com varredura angular de 2Ɵ de 5° a 80°.
- Análise por espectroscopia de infravermelho por transformada de Fourier (FTIR)
Foi realizado espectroscopia de infravermelho para identificar os principais grupos funcionais de quitosana. Foi realizado em espectofotometro Perkin Elmer FT-IR SPECTRUM 1000 ASCII, com resolução de 4 cm-1.
24
4. RESULTADOS E DISCUSSÕES
4.1 Calculo do rendimento
Em resumo, conforme a tabela 1, após a retirada do cálcio o material, em média, tem uma perda de 70% de seu peso inicial, após a eliminação das proteínas têm-se 85% a menos em relação ao peso inicial e ao final, o rendimento da quitosana é de 10% de seu peso inicial.
Tabela 1. Representação do processamento do exoesqueleto da lagosta, obtenção da
quitosana e rendimento final das amostras. Exoesque-leto Condições experimen-tais Processo de desmine-ralização Amostra após remoção de cálcio Processo de desprotei-nização Amostra Quitina Processo de Desaceti-lação Quitosana 10g R:B - 1:5 T: 50°C HCl 7% t: 1h 3,70g R:B - 1:50 T: 75 °C NaOH 7% t: 4h 1,22g R:B - 1:50 T: 115 °C NaOH 40% t:1h – Autoclave 1,10g 10g R:B - 1:10 T: 50°C HCl 7% t: 1h 3,37g R:B - 1:50 T: 75 °C NaOH 10% t: 4h 1,11g R:B - 1:50 T: 115°C NaOH 50% t:1h - Autoclave 0,91g 10g R:B - 1:5 T: 75 °C HCl 7% t: 1h 3,58g R:B - 1:50 T: 50 °C NaOH 7% t: 4h 1,54g R:B - 1:50 T: 100 °C NaOH 40 % t:1h banho maria 0,76g 10g R:B - 1:10 T: 75 °C HCl 7% t: 1h 2,98g R:B - 1:50 T: 50 °C NaOH 10 % t: 4h 1,44g R:B - 1:50 T: 100 °C NaOH 40% t:2h banho maria 1,05g 10g R:B - 1:5 T: 50 °C HCl 10% t:1h 3,42g R:B - 1:50 T: 75 °C NaOH 10 % t: 8h 1,18g R:B - 1:50 T: 100 °C NaOH 40% t:4h banho maria 1,05g 10g R:B - 1:5 T: 75 °C HCl 10 % t:1h 2,51g R:B - 1:50 T: 75 °C NaOH 7 % t: 8h 1,25g R:B - 1:50 T: 100 °C NaOH 50% t:1h banho maria 0,96g 10g R:B - 1:10 T: 50 °C HCl 10 % t:1h 3,18g R:B - 1:50 T: 50 °C NaOH 7 % t: 8h 1,25g R:B - 1:50 T: 100 °C NaOH 50% t:2h banho maria 0,99g
10g R:B - 1:10 T: 75 °C HCl 10 % t:1h 3,91g R:B - 1:50 T: 50 °C NaOH10% t: 8h 1,29g R:B - 1:50 T: 100 °C NaOH 50% t:4h banho maria 1,05g
4.2 Análise Morfológica por Microscopia Eletrônica de Varredura (MEV)
As análises microscópicas da quitina e quitosana extraídas do exoesqueleto da lagosta estão em conformidade com a literatura abordada. As figuras 13, 14, 15, 16, 17 e 18 representam a estrutura de quitina e as figuras 19, 20, 21, 22, 23 e 24 representam a estrutura de quitosana.
Figura 13. Microscopia da quitina em 25X
Através do aumento de 25 vezes observa-se estruturas de partículas com ausência de padrão geométrico. Observa-se também que mesmo passando por um processo de seleção para obter partículas de 0,5 mm, comprova-se que esse tamanho não é padrão.
26
Figura 14. Microscopia da quitina 50X.
No aumento de 50 vezes foi observado superfícies particuladas finas.
Figura 15. Microscopia da quitina 100 X.
Figura16. Microscopia da quitina 200X.
Na Fig. 16 observa-se a camada mais superficial com maior aumento.
Figura 17. Microscopia da quitina 1000X.
28
Figura 18. Microscopia da quitina 2000X.
Na Fig. 18 pode-se observar as camadas fibrosas e rugosas.
Na microscopia da quitosana verifica-se partículas geometricamente irregulares e menores do que na quitina proveniente do processo de desacetilação, visto que neste processo o reagente utilizado encontra-se em altas concentrações e altas temperaturas.
Figura 20. Microscopia da quitosana 50X.
Na Fig. 20 observa-se estruturas particuladas finas.
Figura 21. . Microscopia da quitosana 100X.
30
Figura 22. . Microscopia da quitosana 200X.
A Fig. 22 apresenta estrutura fibrosa em camadas
Figura 23. . Microscopia da quitosana 1000X.
A figura com aumento de 100X mostra a presença de estrutura rugusa e maior precisão na visualização dos poros.
32
4.3 Difração de raios-X
Através da análise e estudo dos difratogramas de raio-X, é possível averiguar a cristalinidade da quitina e quitosana, visto que depende do grau de acetilação e do processo pelo qual o polissacarídeo foi obtido.
Na terminologia para quitina, o número de grupos acetoamido é determinado pelo grau de acetilação (GA). Por outro lado, quando o grau de desacetilação (GD) é elevado ou o grupo amino é predominante, o biopolímero é chamado de quitosana. Logo, a quitosana é constituída por um conjunto de cadeias poliméricas parcialmente desacetiladas. As aplicações e características da quitosana dependem fundamentalmente de grau de desacetilação e do tamanho das cadeias poliméricas. Está é um polímero parcialmente cristalino, e o grau de cristalinidade depende do grau de desacetilação.
Foi realizado analises por difração de raio-X, durante todas as etapas de síntese de quitosana. Na Fig. 25 está representado o gráfico do pó inicial do exoesqueleto da lagosta utilizada neste trabalho, sem nenhum tratamento. Neste momento observa-se que os picos em geral estão pouco definidos, estando apenas bem evidente o pico cristalino intenso de intensidade 318 cps, que corresponde a posição 2Ɵ = 29,88° relacionado ao cálcio, predominante no exoesqueleto da lagosta o qual confere bastante rigidez.
In
te
n
si
d
ad
e
(
c
p
s)
10 20 30 40 50 60 70 80 0 200 400 600 800 1000 1200 1400 1600 CaCoPosição 2
[teta]
Figura 25. Difratograma do exoesqueleto da lagosta.
As Figs. 26, 27 e 28 referem-se aos difratogramas da etapa de desmineralização. Os gráficos apresentados mostram que em todos os processos realizados o cálcio foi retirado com êxito, deixando o pó pronto para o próximo processo químico.
34 10 20 30 40 50 60 70 80 0 200 400 600 800 1000 1200 1400 1600 CaCO3 In te n si d ad e ( cp s) Posição 2 [teta]
Figura 26. Difratograma após desmineralização - amostra tratada com HCl 7%, R:B 1-5 e T
50 °C em 1h. 10 20 30 40 50 60 70 80 0 200 400 600 800 1000 1200 1400 1600 CaCO3 In te n si d ad e ( c p s)
Posição 2
[teta]
Figura 27. Difratograma após desmineralização – amostra tratada com HCl 10%, R:B 1-5 e T
10 20 30 40 50 60 70 80 0 200 400 600 800 1000 1200 1400 1600 CaCO3
In
te
n
si
d
ad
e (
cp
s)
Posição 2
[teta]
Figura 28. Difratogramas após desmineralização – amostra tratada com HCl
10%, R:B 1-10 e T: 75° em 1h.
As Figs. 29, 30 e 31 apresentam os difratogramas após a desproteinização. Observa-se nestas imagens que os picos característicos da quitina são bastante cristalinos e mais intensos em 292 e 1536 cps que correspondem respectivamente a 2Ɵ =10° e 2Ɵ = 19,32° (realizando uma média de todas as amostras). A partir dos gráficos observa-se que em todas as amostras foi realizado a retirada dos nitrogênios proteicos tonando os picos mais intensos e cristalinos.
36 10 20 30 40 50 60 70 80 0 200 400 600 800 1000 1200 1400 1600 1800 2000
In
te
n
si
d
ad
e (
cp
s)
Posição 2 [teta]Figura 29. Difratograma após desproteinização – QUITINA - Amostra tratada com
10 20 30 40 50 60 70 80 0 200 400 600 800 1000 1200 1400 1600 1800 2000
In
te
n
si
d
ad
e (
cp
s)
Posição 2
[teta]
Figura 30. Difratograma após desproteinização – QUITINA – amostra tratada com NaOH 10%, R:B 1-50, T: 75° e t: 4h. 10 20 30 40 50 60 70 80 0 200 400 600 800 1000 1200 1400 1600 1800 2000
In
te
n
si
d
ad
e (
cp
s)
Posição 2 [teta]38
Figura 31. Difratograma após desproteinização – QUITINA – amostra tratada com
NaOH 10%, R:B 1-50, T: 75° e t: 8h.
Partindo da análise dos gráficos, ao utilizar hidróxido de sódio a 7 ou 10 % o objetivo de retirar o nitrogênio proteico é obtido. O mesmo se aplica as outras variações como tempo, temperatura e concentração da amostra. O que irá variar de uma amostra para outra são os valores exatos da intensidade do maior pico característicos da quitina, esse valor cresce de acordo com o maior índice de concentração e temperatura. No entanto, visto que esta pesquisa é quali-quantitativa e analisando a equação 2, ainda que o valor do maior pico aumente representando o índice de cristalinidade, o valor da largura média das amostras não se alteram, estando entre 0,94 e 1,02 (ver Fig. 32).
Figura 32. Ilustração representando uma gaussiana da largura média do maior
pico de quitina.
Na Fig. 33 está o gráfico de quitosana, onde o pico mais intenso foi em 2Ɵ = 19,452 que corresponde a 1434 cps. Observam-se os picos característicos de quitosana e a partir deles pode-se determinar o índice de cristalinidade da estrutura polimérica. O índice de cristalinidade (ICR) pode ser determinado com o emprego da equação 2. (LI et al, 2010).
Sendo: IC e IA as intensidades dos sinais das regiões Cristalinas (2θ = 20°) e amorfas (2θ = 12°), respectivamente. A relação entre o grau de desacetilação e o índice de cristalinidade relativo é inversa, quanto maior índice de cristalinidade menor será o grau de desacetilação, já que é característica das quitinas possuírem elevado grau de cristalinidade. Na tabela 2, encontra-se o índice de cristalinidade e grau de desacetilação da amostra. O grau de desacetilação (GD) é um parâmetro que define a fração de unidades desacetiladas existentes nas cadeias poliméricas, o que define se o polímero é quitina ou quitosana. Quando o grau de desacetilação é > 60 % o polímero é definido como quitosana.
Os valores de GD foram obtidos de acordo com a equação 3, baseado na representação dos grupos funcionais obtidos por meio do ensaio de FTIR (A1655 e A3450).
(3)
Tabela 2. Índice de cristalinidade e grau de desacetilação da quitosana
Amostra IA IC % ICR %GD
Quitosana 108 1434 92,46 72,00 GD = 97,67 − [26,486 (A1640
40 10 20 30 40 50 60 70 80 0 500 1000 1500 2000 2500
In
te
n
si
d
ad
e
(
c
p
s)
Posição 2
[teta]
Figura 33. Difratograma da quitosana.
4.4 Espectro de Infravermelho por Transformada de Fourier
Partindo do espectro de FTIR apresentado na Fig. 34, os principais grupos funcionais e atribuições vibracionais do biopolímero quitosana encontram-se descritos na tabela 3. Foi realizada uma análise comparativa entre os espectros obtidos e a revisão de literatura abordada, para apresentar os grupos característicos do polímero e assim caracterizá-lo, observando seu processo de desacetilação.
0 500 1000 1500 2000 2500 3000 3500 4000 80 85 90 95 100 105
C= O (1640)
N-H (1562)
C-H (1375)
N-H (3250)
C-H (2875)
N-H (1625)
O-H (3450)
T
r
an
sm
itân
c
ia %
Cm
-1
Figura 34. Espectroscopia de infravermelho de quitosana
Na região de 3450 cm-1 e 3250 cm-1 encontra-se uma deformação axial de O-H e N-H proveniente do grupo NH2; em 2875 cm-1 observa-se o grupo C-O de grupos CH2 e CH3; em 1640 e 1625 cm-1 encontra-se uma deformação axial referente ao grupo C=O e NH respectivamente, proveniente da amida I; em 1562 cm-1 uma deformação angular proveniente de N-H da amida II, e em 1375 cm-1 uma deformação angular de C-H do grupo CH3.
42
Tabela 3. Bandas de absorção no FTIR da quitosana.
Número de onda em cm
-1Atribuição
3450 e 3250 Deformação axial de O-H e N-H do grupo NH2 2875 Deformação axial de C-H de grupos CH2 e CH3 1640 e 1625 Deformação axial de C=O e N-H (amida I)
1562 Deformação angular N-H do grupo NH2 (amida II) 1375 Deformação angular do C-H de CH3
5. CONCLUSÕES
1. No processo de desmineralização do exoesqueleto da lagosta, as concentrações de ácidos reproduziram um perfil bastante semelhante, e o objetivo da reação foi alcançado utilizando todas as variações de concentração, temperatura e tempo. Em síntese, foi importante usar a menor concentração de ácido para minimizar gastos de reagentes, menor temperatura e tempo para otimizar o processo.
2. O mesmo ocorre nos processos de desproteinização e desacetilação que as amostras permanecem com o perfil semelhante.
3. A análise de difratograma de Raios X mostram o grau de cristalinidade da quitina em relação à quitosana, onde o gráfico da quitina apresenta maiores picos e em maior número que o gráfico da quitosana. Podendo até relacioná-lo com o grau de desacetilação
4. A análise elementar foi importante, para verificar a percentagem de cada elemento na estrutura, conferindo quitina e quitosana, na proporção de seus grupos funcionais, relacionando o grau de desacetilação com o percentual de nitrogênio de cada polímero.
5. As identificações dos grupos funcionais através de espectroscopia de infravermelho, foram de grande importância, para identificar realmente os biopolímeros quitina e quitosana contribuindo para determinação do grau de desacetilação.
6. Dessa forma o processo de obtenção de quitosana a partir do exoesqueleto da lagosta, apresenta boas condições de reprodutibilidade e baixo custo financeiro, comparado com o valor de mercado.
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6. SUGESTÕES PARA TRABALHOS FUTUROS
Visto que a quitosana possui inúmeras aplicações e necessita ainda de variadas pesquisas, como sugestões para trabalhos futuros seguem:
- Realizar um trabalho comparativo entre a quitosana proveniente da lagosta, camarão e caranguejo;
- Extrair a quitosana proveniente de outras fontes;
- Continuar analises da quitosana extraída do exoesqueleto da lagosta voltada para seu potencial de séptico, bactericida e de regeneração tecidual;
- Transformar a quitosana em pó numa escala nanométrica e caracterizá-la; - Realizar testes in vivo clínicos e histológicos da quitosana para comprovar se potencial de aceleração de regeneração dos tecidos.
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