UNIVERSIDADE CEUMA
PRÓ-REITORIA DE PÓS-GRADUAÇÃO, PESQUISA E EXTENSÃO PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM BIOLOGIA PARASITÁRIA
SÃO LUÍS 2014
IVEN NEYLLA FARIAS VALE
ASPECTOS CELULARES E
MOLECULARES DA ADESÃO EM
ISOLADOS CLÍNICOS DE Candida spp
UNIVERSIDADE CEUMA
PRÓ-REITORIA DE PÓS-GRADUAÇÃO, PESQUISA E EXTENSÃO PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM BIOLOGIA PARASITÁRIA
IVEN NEYLLA FARIAS VALE
ASPECTOS CELULARES E MOLECULARES DA ADESÃO EM ISOLADOS CLÍNICOS DE Candida spp
SÃO LUÍS 2014
IVEN NEYLLA FARIAS VALE
ASPECTOS CELULARES E MOLECULARES DA ADESÃO EM ISOLADOS CLÍNICOS DE Candida spp
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Biologia Parasitária como parte dos requisitos para a obtenção do título de Mestre em Biologia Parasitária.
Orientador: Profa. Dra. Cristina de Andrade Monteiro
Co-orientador: Profa. Dra. Patrícia de Maria Silva Figueiredo
SÃO LUÍS 2014
Vale, Iven Neylla Farias
Aspectos celulares e moleculares da adesão em isolados clínicos de
Candida spp. / Iven Neylla Farias Vale. - São Luís: Universidade
CEUMA, 2014. 94 p.:il.
Dissertação (Mestrado) – Programa de Pós-Graduação em Biologia Parasitária. Universidade CEUMA, 2014.
1. Adesão. 2. ALS. 3. Candida. 4. Virulência. I. Monteiro, Cristina de Andrade (Orientador). II. Figueiredo, Patrícia de Maria Silva (Co-orientador). III. Título.
CDU: 616.934 V149a
IVEN NEYLLA FARIAS VALE
Aspectos celulares e moleculares da adesão em isolados clínicos de Candida spp
A Comissão julgadora da Defesa do Trabalho Final de Mestrado em Biologia Parasitária, em sessão pública realizada no dia / / , considerou a candidata
( ) APROVADA ( ) REPROVADA
1) Examinador ________________________________________
2) Examinador ________________________________________
3) Examinador ________________________________________
AGRADECIMENTOS
A Deus, em primeiro lugar, por ter permitido que eu chegasse até aqui, por ter me sustentado nos momentos mais difíceis; e quando muitas vezes pensei em desistir, o Senhor me deu força e vitória. Aos meus pais, Nedival e Ester, que sempre me incentivaram e acreditaram em mim, mesmo quando eu chegava triste por um experimento não ter dado certo.
Ao meu marido, André, pelo apoio incondicional, pelo companheirismo e compreensão em todos os momentos.
À minha querida orientadora, Cristina Andrade, pela paciência durante todos esses anos, por ter me incentivado e me ensinado tudo o que sei hoje. Por ser pra mim um modelo de profissional, pelo seu compromisso, sua ética e principalmente pela sua competência em tudo o que faz. Sempre serei grata a Deus pela sua vida.
A profa Patrícia Figueiredo pela dedicação e por ter me acompanhado desde a graduação com muito carinho sempre ajudando para o melhor desenvolvimento da pesquisa.
Ao prof. Silvio Monteiro pela análises estatísticas, pela paciência e pela atenção que sempre dedicou a mim.
Aos amigos que sempre torceram por mim, pelo meu sucesso em especial Millena Azevedo, Cássia Alves, Rafaella Souza e Daniella Silveira.
À minha querida turma IV, a turma das divas Fernanda, Francyelle, Márcia Machado, Kátia, Jéssica, Claudia, Carol e Lisiane, pelo companheirismo e pela amizade.
Aos queridos companheiros de laboratório em especial Márcia, Reinaldo, Laura, Anderson, Monique, Nadine, Enzo, Mariana sempre prontos a ajudar sempre que precisei.
Aos meus “pupilos” Vanessa, Fábio e Josivaldo pelo comprometimento que tiveram no decorrer dessa pesquisa e por me aguentar todo esse tempo.
A todos os professores do mestrado em biologia parasitária pela dedicação e pelo compromisso com o ensino e a pesquisa.
Aos professores do Instituto Federal do Maranhão por terem me dado a base que precisei para chegar até aqui.
Aos queridos amigos e líderes da Igreja Presbiteriana Renovada do Maiobão pelas orações e pelo apoio.
A FAPEMA pelo apoio financeiro durante dois anos e meio de mestrado. A todos que fazem parte dessa conquista, meu muito obrigada.
Até aqui nos ajudou o SENHOR. 1 Samuel 7.12
RESUMO
As diferentes espécies de Candida são capazes de expressar produtos gênicos distintos para adaptação e crescimento em uma variedade de condições fisiológicas extremas, proporcionando infecções. Muitos são os fatores responsáveis pela virulência como as lípases, as proteases, e as adesinas. A adesão é fator crítico inicial no processo de infecção sendo essencial tanto para a colonização e indução da doença mucosa subsequente. Este estudo foi realizado com quatro espécies de Candida (C. albicans, C. glabrata, C. parapsilosis e C. tropicalis) sendo avaliado: 1 – a capacidade hidrofóbica; 2- a aderência a materiais inertes (vidro, látex siliconado e aço inox) e a células (HEp-2); 3 – a influência de carboidratos (glicose, manose, rafinose, galactose, e lactose) no processo de aderência ao vidro; 4 – a presença de genes da família ALS e sua correlação com as propriedades adesivas em C. albicans. C. albicans apresentou maior hidrofobicidade entre as espécies testadas apresentando aglutinação desde as menores concentrações de sulfato de amônio. A aderência a lamínulas foi observada em 66,67% dos isolados de C. albicans, número inferior aos obtidos em C. parapsilosis (75%) e C. tropicalis (83,33%). C. parapsilosis apresentou melhor desempenho para aderência ao silicone com maior positividade (90%) e maior número de isolados classificados como aderentes muito fortes (15%). C. albicans e C. glabrata aderiram ao inox em 100% dos isolados testados enquanto que C. parapsilosis e C. tropicalis apresentaram positividade de 95 e 94,44% respectivamente. C. glabrata e C. albicans apresentaram maior capacidade de aderência às células HEp-2 (76,47 e 70,83% respectivamente) seguidas de C. tropicalis (66,67%). Manose inibiu a adesão em C. albicans, C. tropicalis e C. parapsilosis. Já rafinose intensificou o processo em C. tropicalis e mais intensamente em C. glabrata. Galactose também atuou incrementando adesão em C. glabrata e C. albicans. De um modo geral, o gene ALS6 foi o mais predominante (82,51%). Os genes ALS3 e ALS5 foram detectados em 31,82% dos isolados. Os demais genes foram detectados em frequência que não ultrapassou 20%. Foi verificada correlação positiva entre a presença de ALS1 e os padrões de aderência difuso e agregativo. ALS3 e ALS5 apresentaram correlação negativa com a aderência a lamínula. ALS1 ALS3 e ALS5 apresentaram correlação com a hidrofobicidade.
ABSTRACT
The different Candida species are capable of expressing various gene products for adaptation and growth in a variety of extreme physiological conditions, providing infections. Many are the factors responsible for the virulence as lipases, proteases, and adhesins. This study was performed with four Candida species (C. albicans, C. glabrata, C. parapsilosis and C. tropicalis) being evaluated: 1 – the hydrophobicity; 2 - adherence to inert materials (glass, stainless steel and silicone) and cells (HEp-2); 3 - The influence of carbohydrates (glicone, mannose, raffinose, galactose, and lactose) in glass adhesion process; 4 - the presence of the ALS gene family and its correlation with adhesive properties in C. albicans. C. albicans showed greater hydrophobicity between the species tested showing agglutination since lower concentrations of ammonium sulfate. The adhesion to glass coverslips were observed in 66.67 % of the isolates of C. albicans, the lower the number found in C. parapsilosis (75%) and C tropicalis (83.33%). C. parapsilosis showed better performance for adhesion to silicone with greater positivity (90%) and a higher number of isolates classified as very strong adherent (15%). C. albicans and C. glabrata adhered to stainless in 100% of tested isolates, while C. parapsilosis and C. tropicalis were positive in 95 and 94.44 % respectively. C. glabrata and C. albicans showed greater ability to adhere to HEp - 2 cells (76.47 and 70.83 % respectively) followed by C. tropicalis (66.67%). Mannose inhibited adhesion in C. albicans, C. tropicalis and C. parapsilosis. Have raffinose intensified the process in C. tropicalis and more intensely in C. glabrata. Galactose acted also increasing membership in C. glabrata and C. albicans. In general, the ALS6 gene was most prevalent (82.51%). ALS3 and ALS5 genes were detected in 31.82% of the isolates. The remaining genes were detected in frequency did not exceed 20%. Positive correlation between the presence of ALS1 and patterns of diffuse and aggregative adherence was checked. ALS3 and ALS5 were negatively correlated with the cover slip grip. ALS1 ALS3 and ALS5 correlated with hydrophobicity.
SUMÁRIO
1. INTRODUÇÃO ... 1
2. REFERENCIAL TEÓRICO ... 4
2.1 Patogênese de Candida ... 4
2.2 O processo de aderência em Candida ... 6
2.2.1 Parede Celular ... 6
2.2.2 Aderência ... 7
2.3 Adesão a células epiteliais ...11
2.4 Adesão a materiais inertes ...13
2.5 Influência de carboidratos no processo de aderência ...14
2.6 Aspectos moleculares da adesão ...15
2.6.1 A família gênica ALS ...18
3. OBJETIVOS ...21
3.1 Geral 21 3.2 Específicos ...21
4 METODOLOGIA ...22
4.1 Isolamento das Amostras ...22
4.2 Determinação da hidrofobicidade celular...22
4.3 Ensaio de adesão a material inerte ...23
4.3.1 Adesão à lamínula...23
4.3.2 Classificação da aderência ...23
4.3.3 Adesão ao silicone e inox ...24
4.4 Ensaio de adesão a células epiteliais ...25
4.4.1 Cultivo e preparo das monocamadas celulares ...25
4.4.2 Preparação do Inóculo e Teste de Adesão ...25
4.4.3 Classificação da aderência ...25
4.5 Influência de carboidratos no processo de aderência ...26
4.5.1 Preparação dos carboidratos ...26
4.5.2 Teste de aderência...26
4.6 Identificação molecular de genes da família ALS ...27
4.6.1 Extração de DNA ...27
4.6.2 Amplificação por PCR ...27
5 RESULTADOS e DISCUSSÃO ...29
5.1 Determinação da hidrofobicidade celular ...29
5.2 Ensaio de adesão a material inerte ...31
5.2.1 Aderência à lamínula ...31
5.2.2 Adesão ao silicone e inox ...38
5.3 Ensaio de adesão a células epiteliais...45
5.4 Influência de carboidratos no processo de adesão ...50
5.5 Identificação molecular de genes da família ALS ...53
6 CONCLUSÕES ...62
REFERÊNCIAS ...64
LISTA DE FIGURAS
Figura 1 - Secreção e ancoramento na superfície celular de adesinas fúngicas (VERSTREPEN; KLIS, 2006). ... 8 Figura 2 - Etapas do processo de invasão tecidual por Candida (GOW et al., 2012) ... 12 Figura 3 - Possível atuação dos genes da família SAP na patogênese de Candida (NAGLIK, J.
et al., 2004) ... 16 Figura 4 - Desenho esquemático da estrutura dos genes da família ALS (Fonte: Hoyer, 1998) ... 19 Figura 5 - Avaliação da hidrofobicidade de Candida em concentrações crescentes de sulfato
de amônio. Até 1,5 M: hidrofobicidade forte; entre 1,5 e 2,5M: moderada; acima de 2,5M: fraca ... 30 Figura 6–Frequência de isolados de Candida com capacidade de aderência a lamínula ... 31 Figura 7 - Frequência da intensidade de aderência à lamínula entre as diferentes espécies de
Candida... 32
Figura 8 - Frequência dos padrões de aderência a lamínulas observados nas diferentes espécies de Candida ... 34 Figura 9 - Distribuição dos padrões de aderência entre os isolados de Candida em relação ao
sítio de origem ... 36 Figura 10 - Padrões de aderência a lamínulas evidenciando arranjos celulares distintos
encontrados nas amostras de Candida. A) Difuso B) Agregativo C) Localizado D) Pseudo-hifa. Aumento: 1000x ... 37 Figura 11–Relação entre a intensidade de aderência e o padrão de aderência apresentado pelos
isolados de Candida ... 38 Figura 12–Frequência de diferentes espécies de Candida positivas e negativas para o teste de
adesão ao silicone. ... 39 Figura 13 – Frequência da intensidade de aderência ao silicone entre as diferentes espécies de
Candida. Classificação: Negativo: 0 UFCs; Fraco: entre 1 e 199 UFCs; Moderado: 200 a
Figura 14 -Frequência da intensidade de aderência ao silicone entre os diferentes sítios de origem analisados. Classificação: Negativo: 0 UFCs; Fraco: entre 1 e 199 UFCs; Moderado: 200 a 499 UFCs; Forte: 500 a 999 UFCs; Muito forte: mais que 1000 UFCs.. 41 Figura 15 - Frequência de diferentes espécies de Candida positivas e negativas para o teste de
adesão ao inox ... 42 Figura 16 - Frequência da intensidade de aderência ao inox entre as diferentes espécies de
Candida . Classificação: Negativo: 0 UFCs; Fraco: entre 1 e 199 UFCs; Moderado: 200 a
499 UFCs; Forte: 500 a 999 UFCs; Muito forte: mais que 1000 UFCs. ... 43 Figura 17 - Frequência da intensidade de aderência ao inox entre os diferentes sítios de
origem analisados. Classificação: Negativo: 0UFCs; Fraco: entre 1 e 199 UFCs; Moderado: 200 a 499 UFCs; Forte: 500 a 999 UFCs; Muito forte: mais que 1000 UFCs.. 44 Figura 18 - Frequência de diferentes espécies de Candida positivas e negativas para o teste de
adesão às células HEp-2 ... 46 Figura 19 - Padrões distintos de agregação observados em isolados de C. glabrata. Aumento:
1000x ao microscópio ótico. A) Agregativa; B) Localizada; C) Difusa ... 48 Figura 20 - Frequência de padrões de aderência distintos observados em isolados de Candida
a células HEp-2 ... 49 Figura 21 – Número de células aderidas na presença de carboidratos ... 50 Figura 22 - Influência dos carboidratos no processo de adesão ... 51 Figura 25 - Capacidade de aderência em C. parapsilosis na presença de carboidratos: A)
Controle; B) Aderência na presença de galactose; C) Aderência na presença de lactose. Aumento: 1000x ... 52 Figura 23 - Capacidade de aderência em C. albicans na presença de carboidratos: A) Controle
B) Aderência na presença de manose; C) Aderência na presença de galactose. Aumento: 1000x ... 52 Figura 24 - Capacidade de aderência em C. glabrata na presença de carboidratos: A)
Controle; B) Aderência na presença de galactose; C) Aderência na presença de rafinose. Aumento: 1000x ... 52
Figura 26 - Distribuição dos resultados de PCR para verificar a presença dos genes ALS em isolados de Candida albicans. ... 54 Figura 27 - Distribuição dos resultados de PCR para verificar a presença do gene ALS5
(tandem repeats) em isolados de Candida albicans. ... 56 Figura 28 - Reação de PCR amostras de C. albicans isoladas de urina. L – DNA ladder de 100
pb; 1 – controle negativo; 2 a 7 – produtos de PCR dos isolados de Candida abicans. .... 57 Figura 29 - Correlação entre a presença do gene ALS1 e os padrões de aderência exibidos por
Candida albicans... 58
Figura 30 - Correlação entre a presença dos genes ALS3 e ALS5 e a aderência à lamínula .... 59 Figura 31 - Correlação entre a presença do gene ALS1 e a hidrofobicidade em concentração de
0,5M em sulfato de amônio ... 60 Figura 32 - Correlação entre a presença do gene ALS3 e a hidrofobicidade em concentração de
0,5M em sulfato de amônio ... 60 Figura 33 - Correlação entre a presença do gene ALS5 e a hidrofobicidade em concentração de
LISTA DE TABELAS
Tabela 1 - Distribuição dos 79 isolados clínicos de Candida entre as diferentes espécies e sítios de origem ... 22 Tabela 2 - Primers para amplificação por PCR utilizados na pesquisa ... 28 Tabela 3 - Frequência de genes da família ALS em isolados clínicos de Candida ... 55
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
°C – graus Celsius ou graus centígrados
ALS – Agglutinin-Like Sequence
BHI – Brain Heart Infusion
CIA – Clorofórmio Álcool-Isoamílico
CLSI – Clinical and Laboratory Standards Institute CNCA – Candida não Candida albicans
COF – candidíase orofaríngea
CPH1 – Candida Pseudohyphal Regulator CVV – candidíase vulvovaginal
DMEM – Dulbecco's modified Eagles's medium DNA – Ácido desoxirribonucleico
dNTPs – Desoxirribonucleotídeo trifosfatado EDTA – ácido etileno diamono tetracético EFG1 – Enhanced Filamentous Growth EPA1 – Epithelial adhesin
GPI – Glycosyl Phosphatidyl Inositol HEp-2 – Human Epitelioma type 2
HEPES – ácido N-2-hidroxietilpiperazina-N’-2-etanossulfônico HWP – Hyphal Wall Protein
MEM – Meio Essencial Mínimo pb – pares de bases
PBS – Phosphate buffered saline PCR – Polimerase Chain Reaction PGA – Protein GPI Anchored
RHE – Epitélio humano reconstituído
SAP – Secreted Aspartic Proteinase
SDA – Saboraud Dextrose Agar SDS – Sodium dodecyl sulfate TE – Tris e EDTA
TL – Tampão de lise
TRIS – tampão TRIS-EDTA
UFCs – Unidades formadoras de colônias YNB – Yeast Nitrogen Base
1. INTRODUÇÃO
Nos últimos anos tem crescido o número de infecções fúngicas sistêmicas causadas por leveduras do gênero Candida consistindo um perigo potencial principalmente a saúde de pessoas imunocomprometidas como pacientes com AIDS ou doentes a espera de transplantes (COLOMBO et al., 2006; BERGAMASCO et al., 2013; COLOMBO et al., 2013)
As leveduras do gênero Candida existem como comensais no organismo, estando presentes na microbiota humana desde o nascimento sem causar infecções durante toda vida. Podem colonizar, principalmente, cavidade oral, vagina, aparelho respiratório, urinário, entre outras localizações (CARDOSO, 2004a; COSTA, 2009). No entanto, em certas condições, podem causar infecções superficiais em diferentes mucosas como candidíase orofaríngea (COF) ou candidíase vulvovaginal (CVV) (FIDEL, 1999; 2011).
A alteração destas leveduras comensais para agente infeccioso se dá, principalmente, em razão dos fatores de virulência do micro-organismo e da resposta imunológica do hospedeiro, o que coloca as espécies de Candida entre os principais fungos oportunistas (JAIN, 2010; SALIBA, 2012).
Além disso, o uso de dispositivos médicos como, por exemplo, cateteres e o aumento do número de pacientes que recebem terapia com antibióticos e drogas imunossupressores podem aumentar o risco de penetração de fungos através das barreiras mucosas (KLOTZ, S.A.; LIPKE, 2010). Estudos indicam que Candida
albicans é a principal causa de infecções sistêmicas com taxa de mortalidade de 40%
(WENZEL; GENNINGS, 2005; KAUFMAN et al., 2006).
C. albicans é o fungo mais comumente encontrado em laboratórios hospitalares e
constitui a quarta causa mais comum de hemoculturas positivas em pacientes hospitalizados na América do Norte (KLOTZ, 2010). Além disso, candidíase é a infecção oportunista mais comum em indivíduos infectados pelo HIV (KLOTZ, S. A. et al., 2007). Embora C. albicans seja a principal espécie isolada de pacientes com fungemia (CHAKRAVARTHI; WEI; NAGARAJA, 2010), relatos recentes indicam uma tendência para o aumento da prevalência de infecções causadas por espécies de
Candida não C. albicans (BASSETTI et al., 2006; COLOMBO et al., 2006;
HINRICHSEN et al., 2009; FALAGAS; ROUSSOS; VARDAKAS, 2010; DUTTA; PALAZZI, 2011). No Brasil as espécies mais prevalentes são C. albicans, tropicalis,
Candida parapsilosis, Candida glabrata, Candida krusei e Candida guillermondii
(HINRICHSEN et al., 2009).
De maneira semelhante a todas as doenças infecciosas a adesão de um micro-organismo ao tecido hospedeiro ou à superfície de um dispositivo médico deve ocorrer antes que a infecção se estabeleça. Assim como muitos micro-organismos, a capacidade de Candida albicans aderir a superfícies é, presumidamente, uma característica importante de sobrevivência e/ou patogenicidade (JAIN et al., 2010).
Muitos são os fatores responsáveis pela virulência dos fungos como as lipases, as proteases, e as adesinas. (GHANNOUM, 2000; NAGLIK, J. R.; CHALLACOMBE; HUBE, 2003; TAVANTI et al., 2003; FAVERO et al., 2008). Adesinas são proteínas de superfície celular importantes no processo de infecção, pois fazem a ligação da Candida à superfície da célula hospedeira a ser infectada.
C. albicans possui uma família de genes Agglutinin-like sequence (Als) que codifica
a principal classe de glicoproteínas de superfície celular relacionadas ao processo de adesão às superfícies das membranas mucosas e ao fenômeno de agregação celular (KLOTZ, 2010). Entretanto, as proteínas Als não foram identificadas em todas as espécies de Candida e, provavelmente, outros polipeptídeos diferentes possam exercer a função de aderência (NASCIMENTO, 2009; KLOTZ, S.A.; LIPKE, 2010).
Muitos estudos têm descrito a capacidade de aderência de C. albicans a vários tipos celulares, mas pouco se conhece sobre esta propriedade em outras espécies de Candida e o seu papel no reconhecimento da superfície celular do hospedeiro (LIMA-NETO et al., 2009). Alguns autoressugerem mecanismos distintos para o processo de adesão em outras espécies de Candida (KING; LEE; MORRIS, 1980; BENDEL; HOSTETTER, 1993; GILFILLAN et al., 1998; CORMACK; GHORI; FALKOW, 1999; LIMA-NETO et al., 2009; SILVA, S. et al., 2011). Há também sugestão de que a capacidade de adesão varie entre os isolados de diferentes espécies como o que foi verificado trabalho de Biasoli et al (2002) onde foram apontadas diferenças entre C. albicans, C. glabrata,
Estes fatos evidenciam que provavelmente haja diferenças inter e intra-específicas com relação à presença, estrutura molecular e a expressão de genes responsáveis por mecanismos de adesão em isolados de Candida clinicamente importantes.
A análise in vitro da propriedade de aderência das espécies de Candida pode contribuir para a compreensão do comportamento destes organismos em um processo de infecção específico.
2. REFERENCIAL TEÓRICO
2.1 Patogênese de Candida
Patogênese é a habilidade de um micro-organismo de causar infecções (KHAN et al., 2010). Os fatores de virulência são características inerentes a esses micro-organismos que facilitam a invasão e a colonização e são conhecidos como determinantes da patogenicidade. A habilidade de C. albicans ser a principal espécie em termos de colonização e patogenicidade no homem está relacionada a seus fatores e propriedades de virulência. Os principais fatores de virulência atribuídos às espécies de gênero
Candida são a habilidade de produzir enzimas hidrolíticas extracelulares: proteinases
(responsáveis pela hidrolização de ligações peptídicas promovendo adesão, invasão e dano tecidual) e fosfolipases (hidrolisam os fosfoglicerídeos de membrana) (MOHAN DAS; BALLAL, 2008), enzimas funcionam como facilitadoras da interação do fungo às células do hospedeiro (CAFARCHIA et al., 2008; AOKI et al., 2011); a expressão de fatores de adesão e a subsequente formação de biofilme; a capacidade de variação da morfologia celular; a habilidade de responder rapidamente às mudanças do meio e a penetração ao tecido afetado. Todas esses fatores são considerados relevantes na patogênese da candidíase (LIONAKIS; NETEA, 2013).
O processo de adesão, propriedade primária de virulência das leveduras, envolve fatores não biológicos, relacionados a forças de van der Walls, interações hidrofóbicas e eletrostáticas; e biológicos que se referem a mecanismos moleculares específicos como a expressão de adesinas, biomoléculas que promovem a aderência (SILVA, S. et al., 2011; STANISZEWSKA et al., 2012). A adesão pode ocorrer a diferentes superfícies como às células e aos polímeros inertes, e muitos fatores do hospedeiro podem alterar a expressão destas adesinas ou sua ligação às células hospedeiras influenciando na patogênese (AL-ZAHARAA et al., 2012). Alterações no hospedeiro são geralmente necessárias para que micro-organismos comensais tornem-se patógenos oportunistas e desencadeiem a infecção (YANG, 2003).
Subsequente ao processo de adesão celular ocorre a formação de biofilme, que está diretamente relacionada ao potencial de virulência de Candida. Esta propriedade consiste no surgimento de uma comunidade séssil caracterizada por células que formam
micro-colônias aderentes a um substrato, uma interface ou ainda a uma matriz exopolimérica de substâncias extracelulares permitindo, assim, uma proteção ambiental contra agentes externos favorecendo o desenvolvimento de infecções e uma resistência a agentes antimicrobianos (DONLAN; COSTERTON, 2002).
C. albicans é bem conhecida no meio clinico pela sua capacidade de aderir a tecido
humano danificado seja ele membrana de mucosas, o epitélio da bexiga, da válvula cardíaca ou dos vasos da retina. Além disso, a capacidade de invasão de tecidos e adesão a materiais artificiais tais como sondas, cateteres de látex, e vários tipos de materiais plásticos são responsáveis por causar infecções importantes (TAMURA et al., 2007).
Sabe-se que a adesão de C. albicans às superfícies artificiais e às mucosas é intensificado por vários fatores como produção de tubos germinativos, fosfolipases, proteases, outras atividades enzimáticas extracelular, carboidratos, pH e temperatura (GHANNOUM; ABU-ELTEEN, 1990; SITHEEQUE; SAMARANAYAKE, 2003)
Carboidratos da dieta como glicose e sacarose comumente consumidos, podem ser de importância na patogênese de C. albicans na cavidade oral, devido o efeito de tais açúcares na aderência da levedura in vitro (OLSEN, 1990; SANTANA et al., 2013).
Outros fatores químicos e físicos podem interferir no processo de aderência como presença de ácidos, pepstatina A, concanavalina A, heparina, glutaraldeído, peptídeos sintéticos (OLLERT et al., 1993), favorecendo-a ou impedindo que a mesma aconteça. Da mesma forma, a interação destas leveduras com outros micro-organismos pode proporcionar ou não o mecanismo de aderência ou de formação de biofilme (NOBBS et al., 2010), mas também são poucos os dados sobre estas interações.
Proteínas como as aspartil-proteases são enzimas proteolíticas que também possuem um papel essencial na adesão em C. albicans. Isso pode ser demonstrado através de estudos que revelam que isolados clínicos de Candida fortemente proteolíticos apresentaram uma alta capacidade de adesão, comparadas com outras de expressão de protease mais discreta. Isso porque essas proteases são capazes de degradar substratos como colágeno, queratina, albumina, hemoglobina, cadeias pesadas de imunoglobulina e proteínas de matriz extracelular (OLIVEIRA et al., 1998; PICHOVA et al., 2001). A
atividade da proteinase está relacionada com a expressão de uma família de genes da família SAP (secreted aspartic proteinase).
Apesar de haver estudos complexos destes fatores de virulência com relação à C.
albicans, os mesmos não são totalmente compreendidos em outras espécies de Candida.
Além disso, as variabilidades inter e intra-específicas existentes dentro do gênero
Candida também instigam um crescente e urgente avanço nas pesquisas relacionadas
aos fatores de virulência (YANG, 2003).
2.2 O processo de aderência em Candida
2.2.1 Parede Celular
A parede celular de C. albicans não apresenta apenas função de conferir rigidez e proteção a célula, mas também é o local inicial das interações hospedeiro-agente patogênico e é um alvo óbvio para o desenvolvimento de vacinas e antifúngicos. Aproximadamente 80 a 90% da parede celular de Candida é constituída por carboidratos havendo três constituintes que representam a maioria dos polissarcarídeos de parede celular:
• Polímeros de glicose com ramificações contendo ligações ß-1,6 e ß-1,3;
• Polímeros de N-acetil-D-glicosamina (GlcNac) ligados a moléculas de quitina por ligações ß-1,4;
• Polímeros de manose ligados covalentemente a manoproteínas.
A parede celular contém ainda 6 a 25% de proteínas e 1 a 7% de lipídeos. Os componentes estruturais são: os ß-glucanos e a quitina. Polímeros de manose (manoproteínas) representam 40% dos polissarcarídeos e são os principais constituintes da célula - grupo na qual pertence as adesinas (CARDOSO, 2004b).
A maioria das proteínas de parede é ligada covalentemente a β-1,6-glucanos por âncoras glicosil fosfatidilinositol (GPI). O genoma de C. albicans contém 115 prováveis proteínas GPI que podem ser ligadas à parede (RICHARD; PLAINE, 2007). A maior parte destas proteínas são expressas apenas sob condições específicas. Um estudo
recente sugere que não há mais do que aproximadamente 20-30 proteínas de parede expressas em qualquer dado momento (KLIS; BRUL; DE GROOT, 2010). Proteínas de parede GPI geralmente mostram uma estrutura modular, com um domínio conservado no N-terminal seguido por uma região altamente glicosilada, o domínio rico em serina e de treonina, que também podem incluir uma região de repetições (KLIS et al., 2009). Em particular, a glicosilação por manose em proteínas de parede é importante para limitar a porosidade da parede (DE GROOT; RAM; KLIS, 2005). Proteínas de parede apresentam uma variedade de funções que vão desde aderência (HOYER; PAYNE; HECHT, 1998; STAAB et al., 1999) e aquisição de ferro (ALMEIDA et al., 2008) até a invasão de tecidos (SCHALLER et al., 2005) e defesa contra a resposta imune (FROHNER et al., 2009). Recentemente, a resposta do proteoma da parede para alterações no pH do ambiente tem sido descrita (SOSINSKA et al., 2011).
2.2.2 Aderência
A adesão das células de Candida a vários substratos é um processo complexo influenciado por vários fatores. São várias as proteínas envolvidas, algumas funcionam como fatores de transcrição que interferem na taxa de expressão de adesinas e outras como mantenedoras da estrutura da parede celular. Entre os fatores de transcrição de
Candida estão Efg1 e Cph1 que atuam promovendo o crescimento pseudo-hifal em S. cerevisiae. Isolados nulos para efg1 e efg1/cph1 apresentam intensa redução das
propriedades adesivas, bem como o perfil transcricional de genes que codificam prováveis proteínas da parede celular gravemente alterado (DIETERICH et al., 2002; SOHN et al., 2003)
Outro grupo de proteínas com ação, principalmente indireta, no processo de adesão atua através de alterações da estrutura da parede celular. A ancora GPI ligada à parede celular, quando anulada, possui efeito negativo sobre a filamentação e também na aderência à células de mamíferos (ALBERTI-SEGUI et al., 2004).
Algumas proteínas de C. albicans são codificadas por uma família de genes ALS (Agglutinin-like Sequence). São glicoproteínas de superfície celular implicadas no processo de adesão às superfícies das membranas mucosas, as adesinas (KLOTZ, LIPKE, 2010). As adesinas são também responsáveis pelo fenômeno de agregação celular como revelam trabalhos anteriores (KING; LEE; MORRIS, 1980). A adesão
seguida de agregação celular tem sido documentada em vários estudos envolvendo uma miríade de alvos biológicos. Quando C. albicans encontra uma proteína ancorada, uma célula, ou tecido, o fungo adere e então agrega (KLOTZ, LIPKE, 2010).
Além de promoverem a agregação celular, as adesinas medeiam a adesão a epitélio, a formação de biofilme além de estarem ativamente envolvidas na patogênese de C.
albicans. As adesinas codificadas pelos genes da família ALS são proteínas de superfície
celular com características estruturais bem semelhantes entre os membros. A primeira proteína identificada foi denominada Als1p e é caracterizada por três domínios. A região N-terminal contém um provável peptídeo sinal e é relativamente conservada entre proteínas da família Als. É uma região caracterizada pela pouca glicosilação (ZHAO, 2003 e HOYER, 2001). A porção central das proteínas consiste de um número variável de repetições em série (aproximadamente 36 aminoácidos de comprimento) e seguida pela região C-terminal rica em aminoácidos serina e treonina que contém uma sequência de âncora de glicosil fosfatidilinositol (ZHAO,2003 E HOYER, 2001) (Figura 1).
Figura 1 - Secreção e ancoramento na superfície celular de adesinas fúngicas (VERSTREPEN; KLIS, 2006).
Experimentos de expressão heteróloga dos genes ALS de C. albicans em S.
cerevisiae proporcionaram um fenótipo de aderência a este organismo, confirmando que
Parede Celular
Meio Extracelular
proteínas Als estão envolvidas diretamente na adesão de C. albicans às superfícies celulares (NOBBS; VICKERMAN; JENKINSON, 2010).
As proteínas Als possuem algumas funções diferenciadas. A expressão Als5p em S.
cerevisiae confere aderência a vários substratos, incluindo células endoteliais e gelatina,
enquanto que a expressão de Als6p resulta apenas na adesão a gelatina (SHEPPARD, 2004). Apesar desta diferença acentuada entre a função de Als5p e de Als6p estas proteínas possuem identidade superior a 80% com relação aos aminoácidos. As repetições in tandem e porções C-terminal destas proteínas são virtualmente idênticas, e a maioria das diferenças de sequência estão concentradas nas porções N-terminais das duas proteínas. Estes dados sugerem que a variabilidade da sequência N-terminal confere especificidade ao substrato (SHEPPARD, 2004).
As proteínas Als não foram identificadas em todas as espécies de Candida e provavelmente nestas outros polipeptídeos diferentes possam exercer a função de aderência (NASCIMENTO, 2009; KLOTZ, S.A.; LIPKE, 2010; SILVA, S. et al., 2011). Assim estudos ainda são necessários para revelar as diferenças fenotípicas e moleculares da propriedade de aderência entre as espécies de Candida.
Outra importante adesina é encontrada nos tubos germinativos de C. albicans, mas não em formas leveduriformes ou em pseudo-hifas. Hwp1 é uma manoproteína semelhante às proteínas Als e é fortemente expressa também durante a formação de biofilme. Hwp1 desempenha um papel importante na aderência às células epiteliais (STAAB et al., 1999), onde serve como um substrato para a enzima transglutaminase epitelial e pode ser estavelmente ligado à superfície das células epiteliais.
Provavelmente a aderência entre as espécies de Candida não obedeça ao mesmo mecanismo gênico. Isso pode ser evidenciado no trabalho de Bendel (1993) onde foi investigado o papel de análogos de integrina na adesão epitelial de C. albicans e C.
tropicalis. A integrina1 (Int1) é uma proteína de superfície de C. albicans que apresenta
alta similaridade com as integrinas de vertebrados. A expressão do gene INT1 em
Saccharomyces cerevisae foi suficiente para torná-lo aderente a células epiteliais
humanas apesar de normalmente essa espécie não apresentar tal característica. Além disso, a mutação em INT1 em C. albicans suprime o desenvolvimento das hifas, a
adesão a células epiteliais e a virulência das amostras em camundongos (GALE et al., 1998).
Experimentos investigando o papel de análogos de integrina na adesão epitelial de
C. albicans e C. tropicalis por citometria de fluxo com o anticorpo monoclonal (mAb)
OKM1 revelou que a fluorescência de superfície foi maior para C. albicans e apresentou uma redução significativa em C. tropicalis (BENDEL; HOSTETTER, 1993). No entanto, a adesão à célula epitelial humana na linhagem HeLa não diferiu para estas duas espécies de Candida . A disparidade entre a expressão da integrina análoga e a adesão epitelial sugerem mecanismos distintos para este processo em C.
albicans versus C. tropicalis.
Com relação a C. glabrata, trabalhos recentes identificaram 23 adesinas de parede celular que, provavelmente, estão envolvidas na adesão ao epitélio humano e na formação de biofilme (DE GROOT et al., 2008). O principal grupo de adesinas de C.
glabrata, é codificada por genes da família EPA (epithelial adhesin), também
identificada em C. albicans. A capacidade de C. glabrata aderir a diferentes biomateriais e a epitélio pode ser um reflexo da expressão da adesina epitelial (Epa) sobre a superfície das células, que é induzida pela presença de ácido nicotínico (DOMERGUE, 2005). Além disso, apesar do grande número de genes EPA, demonstrou-se que a deleção do EPA1 sozinho reduz a adesão in vitro sugerindo que a aderência à células epiteliais humanas é mediada em grande parte por uma adesina única, Epa1p, codificada pelo gene EPA1, uma lecitina dependente de Ca2+ (LI, FANG et al., 2007; IELASI; DECANNIERE; WILLAERT, 2012).
Epa1p é membro de uma grande classe de proteína da parede celular ancorada à glicosil fosfatidilinositol (GPI) (GPI-CWPs) encontradas em diversas espécies de fungos (BRUL et al., 1997; KAPTEYN; VAN DEN ENDE; KLIS, 1999; BRUNEAU et al., 2001).
Estudos relacionados a genômica comparativa entre as espécies de Candida revelaram que C. parapsilosis revelaram que esta espécie poderia apresentar proteínas Als embora nem todos os membros encontrados em C. albicans sejam encontrados em
outras espécies de Candida (BUTLER et al., 2009) Analisando a expressão gênica durante a formação de biofilme em condições de hipóxia por 24 e 50h, outro experimento identificou cinco membros da família ALS em C. parapsilosis por qRT-PCR (ROSSIGNOL et al., 2009).
Estudos recentes comparam a atuação de alguns genes relacionados à adesão entre
C. albicans e C. parapsilosis (DING et al., 2011). O produto do gene BCR1 (biofilm and wall cell regulator) é um fator de transcrição conservado requerido na formação
de biofilme tanto em C. albicans quanto em C. parapsilosis. Alguns dos principais alvos de BCR1 em C. albicans incluem genes que codificam adesinas e proteínas de parede celular (ALS1, ALS3, HWP1 e genes relacionados) sugerindo que BCR1 está envolvido na fase inicial da adesão e desenvolvimento de biofilme.
Descrevendo uma análise do papel da BCR1 em C. parapsilosis, Ding et al (2011) mostraram que C. parapsilosis gera biofilmes in vivo em modelo de cateter em ratos, e que BCR1 é necessário para este processo, além disso demonstraram existir pouca sobreposição entre os alvos de BCR1 nas duas espécies.
2.3 Adesão a células epiteliais
A adesão de Candida às células epiteliais é fator crítico inicial no processo de infecção sendo essencial tanto para a colonização e indução da doença mucosa subsequente. Além disso, colonização de superfícies mucosas é um fator de risco conhecido para candidíase disseminada (MARR et al., 2000; TAKESUE et al., 2004) porque a adesão é essencial para a Candida persistir na superfície mucosa. Desta forma, não é surpreendente que este organismo expresse múltiplas estruturas distintas de superfície que medeiam a adesão às células epiteliais. (CALDERONE et al., 2000; SUNDSTROM, 2002; YANG, 2003; WHITEWAY; OBERHOLZER, 2004).
C. albicans provoca frequentemente infecções superficiais através da invasão e
destruição de células epiteliais, mas também pode causar infecções sistêmicas por penetrar através das barreiras epiteliais e pode invadir células epiteliais. A invasão de tecidos por C. albicans passa por várias etapas: adesão ao epitélio; penetração epitelial e invasão pelas hifas; difusão vascular, o qual envolve a penetração de hifas nos vasos sanguíneos e o depósito das células de levedura para a corrente sanguínea, e, finalmente
colonização, endotelial e penetração durante doença disseminada (Figura 2) (WACHTLER et al., 2012).
Figura 2 - Etapas do processo de invasão tecidual por Candida (GOW et al., 2012)
Células epiteliais da mucosa não só fornecem uma barreira física, mas também podem reconhecer fungos e responder através da produção de citocinas (WEINDL et al., 2007; LI, L.; DONGARI-BAGTZOGLOU, 2009). C. albicans interage estreitamente com estas células, tanto como um comensal como durante as fases ativas de invasão. Superfícies mucosas em indivíduos saudáveis são frequentemente colonizados por C.
albicans. Um número relativamente pequeno de células de levedura presentes não induz
danos em células epiteliais e, assim, não desencadeia uma resposta de citocinas em células epiteliais das mucosas ou em macrófagos. A doença invasiva ocorre quando C.
albicans atravessa a superfícies do tecido. Um mecanismo pelo qual células de
leveduras podem atravessar a superfície epitelial é endocitose, em que o fungo é internalizado pelas células epiteliais e pode ocorrer através de dois mecanismos
Adesão e colonização Penetração das hifas e invasão Disseminação vascular Colonização do endotélio e penetração Hifa Célula de levedura
distintos: endocitose induzida, que é análoga ao que ocorre em bactérias enteropatogênicas intracelulares facultativas, e penetração ativa, semelhantes a fungos fitopatogênicos (MORENO-RUIZ et al., 2009; DALLE et al., 2010; MARTIN et al., 2011; WACHTLER et al., 2012). Trabalhos recentes demonstraram que a endocitose induzida contribui consideravelmente para os momentos iniciais da invasão, enquanto que a penetração ativa representa a via dominante de invasão epitelial (WACHTLER et al., 2012).
Embora tanto a levedura como as hifas sejam capazes de induzir a endocitose, acredita-se que hifas de C. albicans sejam mais eficazes para estimular o processo. Este ponto de vista é suportado pela observação de que mutantes que não apresentam a capacidade de formar hifas são muito menos eficazes na indução de endocitose em comparação com células do tipo selvagem (PARK et al., 2005). Isso sugere que hifas podem apresentar moléculas em sua parede celular que ligam-se a receptores de células epiteliais conduzindo à indução da endocitose. Uma dessas moléculas pode ser Als3, uma proteína de superfície celular que se liga a E-caderina e N-caderina e induz endocitose.
2.4 Adesão a materiais inertes
Espécies de Candida podem aderir a uma grande variedade de superfícies diferentes no corpo humano, o que facilita a colonização em diversos órgãos ou tecidos e até mesmo superfícies abióticas que, eventualmente, pode ser utilizada com finalidade terapêutica tais como metais, silicone, plásticos, entre outras. Tais locais podem fornecer ambientes muito diferentes para crescimento e colonização de Candida e esta tem desenvolvido mecanismos específicos de adaptação às respectivas condições. Consequência disso é o fato de Candida ser capaz de crescer em vários tipos de superfícies, levando a formação de biofilme em cateteres, por exemplo, o que representa um grande problema especialmente em unidades de terapia intensiva (KUMAMOTO, 2002; DOUGLAS, L. J., 2003).
Espécies como C. parapsilosis e C. albicans têm sido constantemente identificadas como causadoras de candidemia. A elevada frequência, principalmente de C.
superfícies plásticas tais como o cateter (DAGDEVIREN; CERIKCIOGLU; KARAVUS, 2005).
Um estudo recente, avaliando a adesão de espécies de Candida não-Candida
albicans (CNCA) isoladas de urina, evidenciou que todas as estirpes de CNCA foram
aderentes a silicone, embora tenham sido observadas diferenças de acordo com as espécies e as cepas estudadas. (SILVA, S. et al., 2010). Outro estudo de aderência, dessa vez com C. parapsilosis (KUHN et al., 2004), neste mesmo material, mostrou que essa propriedade também se constituiu como um fator comum entre os isolados testados. Em outro estudo onde foi comparada a capacidade de adesão entre C.
parapsilosis e C. albicans, também em cateter de silicone e foi observado que a
capacidade de aderência foi a mesma para ambas as espécies (KOJIC; DAROUICHE, 2003).
2.5 Influência de carboidratos no processo de aderência
Devido a importância da propriedade de aderência na patogênese de Candida, substâncias que possam interferir nesse processo devem ser cuidadosamente estudadas no intuito de fornecer alvos terapêuticos alternativos novos e menos onerosos. Carboidratos comumente consumidos na dieta como glicose e sacarose, podem ser de importância na patogênese de C. albicans na cavidade oral, devido o efeito de tais açúcares na aderência da levedura in vitro (OLSEN, 1990). C. albicans cresce em meio definido com altas concentrações (500 mM) de carboidratos da dieta exibindo aderência aumentada a superfícies acrílicas (SAMARANAYAKE, L. P.; MCCOURTIE; MACFARLANE, 1980; SAMARANAYAKE, L. P.; MACFARLANE, 1982).
Estudos anteriores já haviam demonstrado que a aderência de C. albicans a superfícies de acrílico e às células epiteliais foi intensificada após crescimento das leveduras em meio contendo altas concentrações de vários açúcares como fonte de carbono (DOUGLAS, J.; HOUSTON; MCCOURTIE, 1981). Samaranayake, MacFarlane (1982) mostraram que leveduras incubadas com sacarose e glicose apresentaram melhor aderência a acrílicos que os controles crescidos em meios sem açúcar. Estudo recente demonstrou que os hidratos de carbono na dieta podem modular
o desenvolvimento de biofilmes de C. albicans na superfície de dentadura (SANTANA et al., 2013).
A aderência de Candida às superfícies epiteliais parece ser similarmente promovida, mas poucas investigações após crescimento em diversas fontes de carbono têm sido feitas (ABU-ELTEEN, 2005). Os efeitos de vários tipos de carboidratos tais como frutose, lactose, maltose e xilitol no mecanismo de aderência, são também pobremente entendidos, e não existem resultados com outras fontes de carbono. Além disso, a maioria dos relatos referem-se a estudos com C. albicans, desse modo há pouca informação em relação à adesão em espécies de CNCA tais como C. tropicalis, C.
glabrata e C. parapsilosis.
2.6 Aspectos moleculares da adesão
Existem vários genes que medeiam a aderência de Candida a células hospedeiras. Esses genes codificam proteínas genericamente chamadas de adesinas por sua atuação no processo adesão. Algumas dessas proteínas são conhecidas como invasinas, pois atuam no início do processo como as proteínas Sap (aspartil proteases ácidas) e as proteínas Als (sequências semelhantes a aglutininas). Essas proteínas são codificadas pelos genes da família SAP e ALS, respectivamente (HOYER et al, 1998, NAGLIK, 2003).
Naglik et al. (2004) demonstraram a participação de genes da família SAP na infecção de mucosas (SAP1, SAP2 e SAP3) e em infecções sistêmicas (SAP4, SAP5 e
SAP6). Em formas leveduriformes de C. albicans, a expressão dos genes SAP1 a SAP3 é
mais intensa que nas formas filamentosas onde a expressão dos genes SAP4 a SAP6 é mais acentuada (Figura 3). Estudos identificaram genes SAP em outras espécies de
Candida incluindo C. dubliniensis, C. tropicalis, C. parapsilosis e C. guilhermondii
(MONOD et al., 1994; GILFILLAN et al., 1998).
Estudos demonstram que a atuação de proteínas Sap pode facilitar no processo de aderência uma vez que essas enzimas têm a capacidade de degradar proteínas da membrana celular da célula hospedeira permitindo a adesão e invasão da célula fúngica (BORG-VON ZEPELIN et al., 1999).
Figura 3 - Possível atuação dos genes da família SAP na patogênese de Candida (NAGLIK, J. et al., 2004)
As aspartil proteases (Sap) de C. albicans são codificadas por 10 genes. A família de genes SAP favorece a atuação de um sistema proteolítico indispensável tanto no comensalismo quanto no desenvolvimento de infecções, pois permitem a aquisição de nutrientes pela proteólise de substratos do hospedeiro (HUBE; NAGLIK, 2001; ZAUGG et al., 2001).
Todos os 10 genes da família SAP de C. albicans codificam pro-enzimas contendo cerca de 60 aminoácidos a mais do que a enzima madura que são processadas durante o transporte através da via secretora. As enzimas maduras contêm motivos de sequência típica para todas as aspartil proteases, incluindo dois resíduos de aspartato conservados em local ativo e de resíduos de cisteína conservados envolvidos na manutenção da estrutura tri-dimensional (MONOD et al., 1994; PICHOVA et al., 2001; STANISZEWSKA et al., 2012).
C. albicans também possui uma grande família de genes ALS (Agglutinin-like sequences) (HOYER et al., 2001) composta por nove genes (HOYER et al., 1995;
HOYER; PAYNE; HECHT, 1998; GAUR; KLOTZ; HENDERSON, 1999; HOYER; HECHT, 2001) responsáveis por codificar proteínas Als como as Als1p (FU et al.,
SAP
SAP1 – Invasão da pele SAP 1, 2 e 3 - Invasão/dano tecidual SAP 4, 5 e 6 – Infecção sistêmica SAP 2 - Interação sistema imune SAP 4, 5 e 6 – Dimorfismo hifal específico SAP 5, 6 e 7 – Biofilme SAP 1 e 3 – Aderência a epitélio bucal1998), Als3p (GAUR; KLOTZ, 1997) e Als5p (HOYER; PAYNE; HECHT, 1998), adesinas envolvidas em vários outros processos além da adesão celular.
Muitas adesinas como Eap1 e Als3 foram identificadas e caracterizadas por sua expressão em S. cerevisiae (GAUR; KLOTZ, 1997; LI, F.; PALECEK, 2003). No intuito de entender mais a respeito das novas estratégias de interação patógeno-hospedeiro, foram identificadas proteínas adicionais com possíveis funções adesivas. Sohn et al (2006) identificaram diversos candidatos pelo perfil transcricional de células de C. albicans. Foram utilizados substratos abióticos como poliestireno além de células epiteliais. A expressão de genes, PGA7, PGA23, PRA1 e AUF8 foi induzida em todos os casos durante a adesão a diferentes substratos, mas não foram expressos sob idênticas condições em cultura em suspensão.
De maneira similar ao que ocorre com os membros da família SAP (proteases ácidas de aspartato), os genes ALS são expressos diferencialmente sob uma variedade de condições em C. albicans; (HOYER et al., 1995; HOYER et al., 1998; HOYER; PAYNE; HECHT, 1998).
Se essas famílias gênicas desempenham uma função importante na patogênese de C.
albicans, é possível que elas também contribuam para a patogenicidade de espécies de
CNCA clinicamente relevantes (HOYER et al., 2001).
Análises por Southern blot com sondas específicas para detecção de ALS tem sugerido a presença de famílias gênicas ALS em C. dubliniensis e C. tropicalis, sendo que três genes ALS já foram isolados para cada espécie (HOYER et al., 2001). Estes resultados preliminares também sugeriram que há número similar de genes ALS em C.
albicans e C. dubliniensis.
Estudos a respeito de genes de aderência em espécies de CNCA ainda são poucos, entretanto, a pesquisa em bioinformática por famílias de genes patógeno-específicos de espécies de Candida revelou uma série de genes que codificam proteínas da parede celular em C. parapsilosis. Este estudo incluiu cinco genes ALS e seis genes foram previstos para proteína ancorada glicosil fosfatidilinositol 30 (Pga30).
No que diz respeito às proteínas da parede celular de C. tropicalis, pelo menos três genes que codificam proteínas Als foram identificados utilizando primers degenerados
(Hoyer, 2001). Entretanto, ao avaliar a presença de ALS3 em C. albicans, C. tropicalis e C. glabrata esse gene só foi encontrado em C. albicans (NASCIMENTO, 2009). Outro estudo também verificou que a amplificação de genes relacionados à adesão como ALS2 e ALS3 foi observada em todos os isolados de C. albicans e em nenhum de
C. tropicalis (COSTA, 2009). A nosso conhecimento, nenhum outro trabalho foi
realizado nesta área.
A integrina1 (Int1) é uma proteína de superfície de C. albicans que apresenta alta similaridade com as integrinas de vertebrados. A expressão do gene INT1 em
Saccharomyces cerevisae foi suficiente para torná-lo aderente a células epiteliais
humanas apesar de normalmente essa espécie não apresentar tal característica. Além disso, a mutação em INT1 em C. albicans suprime o desenvolvimento das hifas, a adesão a células epiteliais e a virulência das amostras em camundongos (GALE et al., 1998).
O gene INT1 de C. albicans foi originalmente clonado devido a sua similaridade com integrinas de leucócitos de vertebrados, adesinas que se ligam a proteínas da matriz extracelular e induzem mudanças morfológicas em resposta a sinais extracelulares (KLOTZ, S. A.; PENDRAK; HEIN, 2001).
Outra importante adesina de C. albicans, a Hwp1, é encontrada na superfície dos tubos germinativos e participa da regulação de ligações a células epiteliais (CHAFFIN et al., 1998). Por ser um substrado para transglutaminases, está intimamente relacionada com a patogênese em candidíase sistêmica.
Isolados que não apresentam o gene HWP1 não podem aderir de forma eficiente em células epiteliais bucais e tem capacidade reduzida em causar candidíase sistêmica em ratos (STAAB; SUNDSTROM, 1998; PADOVAN et al., 2009).
2.6.1 A família gênica ALS
A família de genes ALS (sequências semelhantes à aglutinina) codifica oito glicoproteínas de superfície celular que exibem função de adesão a células hospedeiras (GAUR; KLOTZ, 1997; FU et al., 1998; HOYER et al., 2001; ZHAO et al., 2004). A
organização básica desses genes (Figura 4) é semelhante entre os membros da família consistindo em três domínios gerais.
Um domínio relativamente conservado existe na região 5’ com cerca de 1300 pb e 50-90% de identidade entre os membros (HOYER; HECHT, 2001), codificando uma região da proteína que compreende 320 a 330 aminoácidos iniciais que é exibida na superfície da célula pelo restante da proteína madura, a qual, devido à sua pesada glicosilação, assume uma conformação alongada (JENTOFT, 1990; KAPTEYN et al., 2000; HOYER et al., 2001). Acredita-se que para alguns genes ALS, a variabilidade de sequência existente dentro do domínio 5’ esteja relacionada ao principal domínio adesivo da proteína Als (HOYER; HECHT, 2000; ZHAO et al., 2003).
Figura 4 - Desenho esquemático da estrutura dos genes da família ALS (Fonte: Hoyer, 1998)
O domínio central é composto por sequências repetidas in tandem de 108 pb variáveis em tamanho e sequência. Dentro de um gene ALS o tamanho da região varia consideravelmente entre os alelos devido a diferença de números de cópias da sequência de 108 pb presente. O domínio 3’ é relativamente variável em tamanho e sequência (HOYER et al., 2001; ZHAO et al., 2007) e juntamente com a região de tandem repeats codifica uma sequência de aminoácidos (aproximadamente 100) rica em serina e treonina que é altamente glicosilada na proteína madura (ZHANG et al., 2003; ZHAO et al., 2003).
Embora as unidades dos tandem repeats em cada gene ALS seja de 108 pb, a sequência básica das unidades repetidas é variável e pode ser usada para classificar os genes ALS em três subfamílias consistindo em: i) ALS1 a ALS4; ii) ALS5 a ALS7; e iii)
ALS9 (HOYER et al., 2008). Deleção de genes individuais de ALS e ensaios fenotípicos
em linhagens mutantes de C. albicans demonstraram que ALS1, ALS2, ALS3, ALS4 e
ALS9 podem contribuir para adesão de C. albicans (FU et al., 2002; ZHAO et al., 2003; Domínio 5’ Domínio de tandem repeats Domínio 3’
ZHAO et al., 2005; ZHAO et al., 2007). A super expressão de genes ALS em S.
cerevisiae sugeriu um papel adesivo também para ALS5 e ALS6 (GAUR; KLOTZ,
1997; SHEPPARD et al., 2004) mas ainda há muito a ser esclarecido sobre a presença e o papel desses genes nas demais espécies do gênero Candida .
No locus ALS3, C. albicans tende a manter os alelos heterozigotos com relação ao número de cópias da sequência de repetição in tandem presentes no domínio central (OH et al., 2005). Testes fenotípicos em C. albicans mostraram que o alelo ALS3 com 12 cópias repetidas in tandem apresentaram maior contribuição na adesão às superfícies endotelial e epitelial, enquanto que o alelo ALS3 com nove repetições apresentaram uma contribuição significativa, mas muito pequena no processo adesivo (OH et al., 2005).
A recombinação homóloga entre as sequências de repetições in tandem presentes em genes ALS poderia explicar as diferentes histórias de genes co-localizados em um organismo predominantemente clonal, como C. albicans.
3. OBJETIVOS
3.1 Geral
Analisar os aspectos celulares e moleculares da propriedade de aderência in vitro de espécies de Candida a superfícies abióticas e bióticas.
3.2 Específicos
Verificar o nível de hidrofobicidade celular de espécies de Candida;
Verificar a capacidade de aderência de Candida a materiais inertes (lamínulas de vidro, látex siliconado e inox);
Analisar a capacidade de aderência in vitro de Candida às células Hep-2;
Comparar a capacidade de aderência às diferentes superfícies entre as espécies analisadas;
Correlacionar a capacidade de aderência das espécies com hidrofobicidade celular;
Verificar a influência de diferentes carboidratos no processo de aderência de
Candida
Verificar a presença de genes ALS nos isolados de Candida albicans;
Associar a propriedade de aderência dos isolados de C. albicans com a presença dos genes da família ALS.
4 METODOLOGIA
4.1 Isolamento das Amostras
No presente estudo foram utilizadas 79 amostras clínicas provenientes de diversos sítios (sangue, ponta de cateter, secreção traqueal, secreção vaginal e urina) obtidas de um laboratório particular da cidade de São Luís – MA, gentilmente cedidas e depositadas na micoteca do Laboratório de Micologia do Núcleo de Doenças Endêmicas e Parasitárias do UNICEUMA (Tabela 1).
Tabela 1 - Distribuição dos 79 isolados clínicos de Candida entre as diferentes espécies e sítios de origem Espécies Sítios anatômicos de origem da amostra
Urina Sangue Secreção Vaginal Secreção Traqueal Ponta de Cateter Não definido Total C. albicans 11 - 2 11 - 0 24 C. parapsilosis 5 10 - - 4 1 20 C. tropicalis 8 3 - 5 - 2 18 C. glabrata 14 - - 3 - - 17 TOTAL 38 13 2 19 4 3 79
Todas as leveduras foram previamente identificadas pelo sistema automatizado VITEK (bioMérieux).
As culturas estoque foram mantidas a -20ºC em caldo BHI (Brain Heart Infusion – Acumedia Manufactures). Após recuperação, as linhagens foram mantidas em meio SDA com Cloranfenicol, estocadas a 4ºC durante o período experimental sendo renovadas de 10 em 10 dias para preservação de suas propriedades.
4.2 Determinação da hidrofobicidade celular
As amostras de Candida foram crescidas em meio SDA a 37°C por 24h. As culturas foram suspensas em solução PBS (Tampão fosfato salina) (PBS, 0,01 M, pH 7,4) e testadas para evidenciar isolados autoaglutinadores. Em caso de resultado negativo neste teste, os isolados foram então suspensos com concentrações crescentes de sulfato
de amônio, de 0,5M, 1,0M, 1,5M, 2,0M, 2,5M e 3,0M. A formação de grumos em até dois minutos após a suspensão indica resultado positivo (SCHMIDT et al., 1998). A formação de grumos em concentrações até 1,5 M de sulfato de amônio indica hidrofobicidade forte, a partir de 1,5 até 2,5M, moderada e acima de 2,5M fraca (LOCATELLI et al., 2004).
4.3 Ensaio de adesão a material inerte
4.3.1 Adesão à lamínula
Para a análise da aderência, lamínulas de vidro redondas estéreis (Glasscyto) foram colocadas em placas de microtitulação de 24 poços (TPP Zellkultur Testplatte 24F). Um poço foi utilizado como controle recebendo apenas meio de cultura para garantir a integridade do meio. Os demais poços receberam 40µL de inóculo (106 UFC/mL) + 960 µL de BHI suplementado com 6% de glicose. As placas de microtitulação foram incubadas a 37°C durante 8h. Posteriormente, o meio de incubação foi removido e as microplacas lavadas com água ultrapura para remover as células não aderidas. As lamínulas foram coradas com 1% (v/v) de violeta cristal por cinco minutos, posteriormente lavadas com água ultrapura estéril para remover o excesso de corante, e colocadas sobre lâminas para visualização em microscopia óptica (NIKON Eclipse E100). O experimento foi realizado em triplicata.
4.3.2 Classificação da aderência
A classificação da capacidade de aderência à lamínula foi estabelecida baseado no trabalho de Emira et al (2011) de acordo com a quantidade de células aderidas nas lamínulas por campo, em um microscópio óptico, com aumento de 1000 vezes (BIASOLI; TOSELLO; MAGARO, 2002). Foram contadas as leveduras aderidas em cada lamínula, em um máximo de 70 campos, escolhidos aleatoriamente e em sentido unidirecional. Considerou-se negativo quando não foi observada qualquer célula de levedura em 70 campos; fraco (+), quando havia entre 1 e 10 leveduras aderidas por campo em 50 campos analisados; moderada (++) quando havia mais de 10 leveduras aderidas por campo em 30 campos observados; e, forte quando foram contabilizadas 25 ou mais leveduras aderidas por campo em um total de 20 campos analisados. As
análises foram realizadas por dois observadores para melhor certificação dos resultados. Não houve diferenças discrepantes dos resultados dos dois observadores.
Os padrões de arranjo celular de Candida às lamínulas de vidro são assim classificadas: padrão difuso quando as células de levedura aderem a toda a superfície da lamínula de vidro, sem formar grupos de células; adesão localizada que envolve grupos de leveduras que aderem a regiões localizadas da lamínula; agregativa que é caracterizada por grumos de leveduras que se arranjam como “tijolos empilhados” ou “cachos de uva” que se ligam à superfície da lâmina de vidro. A formação de filamentos ou pseudo-hifas ao longo da superfície da lamínula caracterizou o padrão filamentoso ou pseudo-hifal (MENEZES et al., 2013).
4.3.3 Adesão ao silicone e inox
Este protocolo foi utilizado com algumas adaptações para os dois materiais citados. Foram utilizados fragmentos de látex siliconizado (cateter urinário, Solidor®) medindo 0,5 mm de diâmetro e fragmentos de agulha medindo 1 cm. Os fragmentos de silicone, inox foram lavados e esterilizados em tubos contendo 5 mL de meio BHI.
Amostras de Candida crescidas em SDA com Cloranfenicol (Acumedia) por 24h foram ressuspendidas em solução salina a 0,85% e padronizadas para aproximadamente 106 UFC/mL de acordo com a turbidez do tubo 0,5 da escala de McFarland. Após a padronização, 0,1 mL do inóculo fúngico foi adicionado ao meio contendo o fragmento estudado por 8h a 37ºC.
Após este período, os fragmentos foram lavados com solução salina estéril e cuidadosamente colocados em tubos contendo 5 mL com a mesma solução e, em seguida, agitados em vórtex por 30s. Foram adicionadas alíquotas de 0,1mL desta solução a placas contendo SDA e os inóculos espalhados com auxílio de alça de Drigalski. Após 24h de incubação, foi determinado o número de unidades formadoras de colônia (UFCs) por 0,1 mL de Candida recuperada de cada fragmento avaliado.
No presente estudo foi proposta uma classificação da aderência a esses materiais. Foram classificadas como negativas as amostras que não apresentram UFCs ao final do processo. Foram classificadas como aderentes fracas as amostras que apresentaram
