TÍTULO: EXPRESSÃO DE MACRÓFAGOS INTRATUMORAIS EM NEOPLASIAS MAMÁRIAS CANINAS
TÍTULO:
CATEGORIA: CONCLUÍDO
CATEGORIA:
ÁREA: CIÊNCIAS BIOLÓGICAS E SAÚDE
ÁREA:
SUBÁREA: Medicina Veterinária
SUBÁREA:
INSTITUIÇÃO(ÕES): CENTRO UNIVERSITÁRIO CATÓLICO SALESIANO AUXILIUM - UNISALESIANO
INSTITUIÇÃO(ÕES):
AUTOR(ES): GUILHERME SANTOS ANDRADE
AUTOR(ES):
ORIENTADOR(ES): ANALY RAMOS MENDES FERRARI, HEITOR FLAVIO FERRARI
1. RESUMO
O câncer de mama é uma das principais causas de morte de mulheres e, embora a melhora na detecção e no tratamento precoce tenha reduzido a mortalidade dessa neoplasia, nem todos os pacientes foram beneficiados com os avanços devido à variabilidade nos tipos tumorais existentes. Assim como em humanos, devido ao fato de as neoplasias mamárias caninas apresentarem variabilidade em tipos celulares e alta suscetibilidade a mutações, originam-se diversos tipos tumorais. Graças à maior longevidade, quando comparados aos animais de laboratório, e também pelo fato de a carcinogênese e progressão tumoral serem acelerados, o uso de cadelas como modelos experimentais para o estudo de neoplasias mamárias é amplamente difundido. A complexa ecologia celular das neoplasias estabelece o seu potencial de malignidade. Sabe-se que a regressão ou o crescimento de tumores são promovidos por macrófagos associados a tumores (TAMs), uma das principais células que compõe o ecossistema tumoral. Desta forma, o presente projeto de pesquisa tem por objetivo o melhor esclarecimento da complexidade do tumor mamário em cadelas, permitindo assim que novas terapêuticas sejam instauradas, melhorando a qualidade de vida dos animais acometidos e contribuir ao desenvolvimento da medicina no que concerne às neoplasias mamárias. Os resultados deste estudo sugerem que tumores malignos apresentam alta contagem de TAMs, a qual está diretamente relacionada à proliferação tumoral marcante, metástase linfática e também ao fator prognóstico. Apesar de escassa literatura acerca do assunto em cães, em humanos os estudos sobre TAMs são bastante avançados e promissores. É, portanto, de grande importância que novos estudos sejam empregados na medicina veterinária a fim de melhorar a qualidade de vida e bem-estar dos animais domésticos, além de melhor caracterizar a complexa biologia tumoral.
2. INTRODUÇÃO
O câncer de mama é uma das principais causas de morte de mulheres e, embora a melhora na detecção e no tratamento precoce tenha reduzido a mortalidade dessa neoplasia, nem todos os pacientes foram beneficiados com os avanços devido à variabilidade nos tipos tumorais existentes. Assim como em humanos, devido ao fato de as neoplasias mamárias caninas apresentarem variabilidade em tipos celulares e alta suscetibilidade a mutações, originam-se diversos tipos tumorais. Devido à anatomia similar da glândula mamária, há possibilidades de associação
entre o desenvolvimento tumoral e melhores perspectivas terapêuticas entre ambas espécies. A complexa ecologia celular das neoplasias estabelece o seu potencial de malignidade. Sabe-se que a regressão ou o crescimento de tumores são promovidos por macrófagos associados a tumores (TAMs), uma das principais células que compõe o ecossistema tumoral. Os macrófagos são mediadores inflamatórios e importantes reguladores do processo de desenvolvimento. Como um fagócito chave, os macrófagos evoluíram como parte da imunidade inata para engolfar e processar restos celulares e de patógenos. Além disso, produzem fatores que afetam o seu microambiente e conectam a resposta imune inata à resposta adaptativa. Os macrófagos residentes agem como sensores ao dano tecidual, atuando assim na manutenção da homeostasia tecidual. Desta forma, o presente projeto de pesquisa tem por objetivo o melhor esclarecimento da complexidade do tumor mamário em cadelas, permitindo assim que novas terapêuticas sejam instauradas, melhorando a qualidade de vida dos animais acometidos e contribuir ao desenvolvimento da medicina no que concerne às neoplasias mamárias.
3. OBJETIVOS
Classificar o padrão histológico da neoplasia e correlaciona-lo com a presença de macrófagos;
Compreender o papel dos macrófagos no desenvolvimento tumoral;
Correlacionar a presença dos macrófagos com o grau de malignidade da neoplasia;
Acrescentar informações ao acervo digital para melhorar cada vez mais os métodos de tratamento das neoplasias mamárias em cadelas e humanos.
4. METODOLOGIA
Este projeto foi aprovado pelo Comitê de Ética e Pesquisa no Uso de Animais do Centro Universitário Católico Salesiano Auxilium (CEUA – UniSALESIANO) de Araçatuba (protocolo número 43/2017) no dia 28 de Setembro de 2017 e inclui amostras de 15 cadelas, em sua maioria idosas (>7 anos), diagnosticadas com neoplasia mamária pelo método de citologia por punção biopsia aspirativa (PBA).
5. DESENVOLVIMENTO Obtenção e processamento
Após a excisão cirúrgica por mastectomia radical e fixação em formalina, os materiais foram encaminhados para inclusão em parafina e, posteriormente, corte com micrótomo para confecção das lâminas de histopatológico (coloração de hematoxilina e eosina) e imuno-histoquímica (anticorpo monoclonal para macrófagos – MAC387). Histopatologia
A classificação histológica adotada internacionalmente é estabelecida pela Organização Mundial da Saúde (OMS), que descreve e subdivide os carcinomas não infiltrativos, carcinomas complexos, carcinomas simples (tubulopapilífero, sólido, anaplásico), sarcomas e tumores benignos. No Brasil, Cassali et al. (2013) utilizam uma classificação estabelecida por Misdorp et a. (1991), que foi utilizada para a classificação neste projeto.
A graduação histopatológica permite a avaliação da arquitetura tecidual e variações morfológicas no núcleo, os quais estão correlacionados com a agressividade tumoral (ELSTON; ELLIS, 1991). Atualmente utiliza-se o sistema graduação de Nottingham modificado por Elston e Ellis (1998), que substituiu métodos subjetivos de avaliação de malignidade pela aparência geral do tumor. Conforme esse sistema a graduação se baseia na quantificação de formações tubulares, pleomorfismo nuclear e contagem mitótica (Tabela I), gerando resultado que tem importante valor prognóstico (ELSTON; ELLIS, 1998).
Tabela I – Sistema do Nottingham modificado por Elston & Ellis (1991), adaptado de ELSTON; ELLIS, 1998. Critérios avaliados Aspectos Escore Formações tubulares
> 75% do tumor é composto por túbulos 1 Entre 10 e 75% de formações tubulares 2 Os túbulos ocupam 10% ou menos do tumor 3 Pleomorfismo
nuclear
Núcleo pequeno e regular 1
Aumento moderado e variação nuclear 2 Pleomorfismo evidente, com grande variação do tamanho e forma
do núcleo
Contagem mitótica (40x)
0 a 8 mitoses por campo 1
9 a 16 mitoses por campo 2
> 17 mitoses por campo 3
Fonte: adaptado de ELSTON; ELLIS, 1998.
Avaliação da presença de macrófagos
Foi realizada a técnica de imuno-histoquímica para a avaliação da presença de macrófagos nas amostras de neoplasias mamárias caninas, previamente fixadas em formalina e embebidos em parafina. Foi utilizado o anticorpo MAC387 para avaliar o infiltrado de macrófagos do tipo M1 e M2. A quantidade de macrófagos será estimada em conformidade com os critérios estabelecidos por (CASSALI et al. 2018).
Serão escolhidos, em cada amostra, 5 pontos com maior concentração de infiltração leucocitária (hot spots) que serão observados em menor aumento e aumento de 40x, seguida da contagem e soma dos resultados conforme CASSALI et al. 2018.
Pesquisa de metástase em linfonodo satélite
Foi realizada pelos mesmos procedimentos supracitados, inclusos exames histopatológico e imuno-histoquímica.
Análise dos dados
Os dados foram processados no Microsoft® Office Excel e apresentados na forma de tabelas e gráficos.
6. RESULTADOS Aspectos clínicos
A idade média dos 15 cães incluídos no projeto é de 9 anos. Os tumores foram classificados (Tabela II) como carcinoma tubulopapilífero (n = 1/15; 6,6%), carcinoma papilífero (n = 5; 33,3%), carcinoma sólido (n = 1; 6,6%), carcinoma tubular (n = 5; 33,3%) e carcinoma complexo (n = 3; 20%). Destes, 7 (46,6%) eram de grau I, 7 (46,6%) de grau II e um carcinoma sólido (altamente maligno, 6,6%).
Tabela II: classificação e graduação histopatológica.
Identificação Classificação Total de
amostras
Graduação PC* 69 Carcinoma tubulopapilífero n = 1/15 (6,6%) II
PC 07, 50, 70, 89 e 108 Carcinoma papilífero n = 5/15 (33,3%) I e II PC 213 (15) Carcinoma sólido n = 1/15 (6,6%) - PC 32, 240, 108, 39, 213 (17) Carcinoma tubular n = 5/15 (33,3%) I e II PC 87, 104, 115 Carcinoma complexo n =3/15 (20%) I e II
Fonte: Arquivo pessoal. PC: peça cirúrgica. Contagem de macrófagos
Os TAMs positivos para o anticorpo MAC387 foram observados em todas as neoplasias em níveis discretos, moderados e intensos. Apresentaram-se como células isoladas (Figura I) ou formando grupos em espaços intratumorais (Figura II). A PC 240 (Carcinoma tubular), em particular, apresentou arranjo periférico de macrófagos, com poucos macrófagos intratumorais. Neoplasias de maior graduação apresentaram maior contagem de macrófagos (Gráfico I). Observou-se também que neutrófilos foram marcados pelo anticorpo e, portanto, não foram inclusos na contagem. A variação da contagem em CMA (40x) foi de 41 (8 macrófagos por CMA) em um carcinoma tubular até 151 (30 macrófagos por CMA) em um carcinoma sólido (Tabela II).
Figura I – (A) Carcinoma tubular de grau I (Aumento de 10x, coloração de Hematoxilina e Eosina); (B) Carcinoma tubular de grau I (Aumento de 40x, coloração de Hematoxilina e Eosina); (C) histoquímica com anticorpo anti-macrófago/MAC387 em mama (Aumento de 10x); (D)
Imuno-histoquímica com anticorpo anti-macrófago/MAC387 em linfonodo satélite, evidenciando macrófagos isolados (setas escuras) (Aumento de 10x).
Fonte: arquivo pessoal.
Figura II – (A) Carcinoma sólido (Aumento de 10x, coloração de Hematoxilina e Eosina); (B) Carcinoma sólido (Aumento de 40x, coloração de Hematoxilina e Eosina); (C) Imuno-histoquímica com anticorpo macrófago/MAC387 em mama (Aumento de 10x); (D) Imuno-histoquímica com anticorpo anti-macrófago/MAC387 em mama (Aumento de 40x). Nota-se intensa marcação de macrófagos que formam grupos (seta escura).
Fonte: Arquivo pessoal.
Gráfico I: Correlação entre a graduação e a média da contagem de macrófagos. Observa-se que quanto maior o grau de malignidade, maior a contagem de macrófagos.
Tabela III: contagem de macrófagos em campo de maior aumento.
Amostras Contagem total Média (macrófagos por CMA*) Graduação PC 07 81 16 I PC 32 112 22,4 II PC 39 41 8 I PC 50 68 13,5 II PC 87 77 15,4 II PC 89 61 12 II PC 104 76 15 I PC 108 (15) 42 8,5 II PC 115 47 9,5 I PC 213 (15) 151 30 III PC 69 51 10 II PC 70 97 19,5 I PC 108 (17) 119 23,8 II PC 240 37 7,5 I PC 213 (17) 35 7 I
Desvio padrão = 34,2. Erro padrão = 0,0088326.
Fonte: Arquivo pessoal. CMA: campo de maior aumento (40x). 7. CONSIDERAÇÕES FINAIS
Este estudo avaliou o papel dos TAMs nas neoplasias mamárias caninas e a sua associação com aspectos histopatológicos, pois em humanos existe a associação entre a presença destas células, o desenvolvimento tumoral e a metástase (CASSALI et al. 2018; GWAK et al. 2015). A contagem de macrófagos difere entre as neoplasias benignas, malignas e entre os subtipos (CASSALI et al. 2018). Observou-se que tumores de maior graduação, como o carcinoma sólido, apresentaram maior contagem de TAMs (RAPOSO et al. 2012; CASSALI et al. 2018). O carcinoma sólido é um neoplasma mamário frequente em cães de caráter maligno e microscopicamente caracterizado pela proliferação de células epiteliais em um arranjo sólido, com a formação de cordões ou agrupamentos celulares (CASSALI et al. 2014).
A imunorreatividade dos macrófagos foi detectada pela observação de marcação nuclear e citoplasmática de coloração marrom-escuro. Observou-se também reação positiva em neutrófilos, porém estes não foram inclusos na contagem (RAPOSO et al. 2012). Agrupamentos (clusters) de macrófagos foram observados ao redor dos ductos, no seu lúmen e na periferia de algumas amostras. Além disso, nas neoplasias mamárias de maior grau, observou-se áreas com intensa infiltração leucocitária entre as células neoplásicas ou estroma fibrovascular, apresentando
normalmente padrão difuso. Apesar disso, áreas com infiltração densa também foram visualizadas (RAPOSO et al. 2012).
Os TAMs apresentam diferentes funções em dependência de sua localização no microambiente tumoral (CASSALI et al., 2018). Nos estágios iniciais da carcinogênese, macrófagos são encontrados na membrana basal durante a sua destruição tumoral maligna e em tecidos invasivos de neoplasias avançadas (CONDEELIS; POLLARD, 2006). Essas características sugerem que as células neoplásicas utilizam da capacidade remodeladora dos macrófagos, permitindo assim que os tumores migrem através do estroma tecidual (POLLARD, 2004).
Os resultados deste estudo sugerem que tumores com maior grau de malignidade apresentam alta contagem de TAMs, a qual está diretamente relacionada à proliferação tumoral marcante, metástase linfática e também ao fator prognóstico. Apesar de escassa literatura acerca do assunto nos cães, em humanos os estudos sobre TAMs são avançados e promissores. É, portanto, de grande importância que novos estudos sejam empregados na medicina veterinária a fim de melhorar a qualidade de vida e bem-estar dos animais domésticos, além de melhor caracterizar a complexa biologia tumoral.
8. FONTES CONSULTADAS
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