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RICARDO ABEL DEL CASTILLO TORRES
Purificação de partículas de bixina por precipitação com CO
2supercrítico como antissolvente a partir de solução de ativos
obtida da extração de sementes semi desengorduradas de
urucum (Bixa orellana L.) assistida por ultrassom
CAMPINAS - SP 2015
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FACULDADE DE ENGENHARIA DE ALIMENTOS
RICARDO ABEL DEL CASTILLO TORRES
“Purificação de partículas de bixina por precipitação com CO
2supercrítico como antissolvente a partir de solução de ativos
obtida da extração de sementes semi desengorduradas de
urucum (Bixa orellana L.) assistida por ultrassom”
Dissertação apresentada à Faculdade de Engenharia de Alimentos da Universidade Estadual de Campinas como parte dos requisitos exigidos para a obtenção do título de Mestre em Engenharia de Alimentos.
Orientadora: Dr. Maria Angela de Almeida Meireles Coorientador: Dr. Diego Tresinari dos Santos
ESTE EXEMPLAR CORRESPONDE À VERSÃO FINAL DA DISSERTAÇÃO DEFENDIDA PELO ALUNO RICARDO ABEL DEL CASTILLO TORRES E ORIENTADO PELA PROF.a DRa. MARIA ANGELA DE ALMEIDA MEIRELES. Assinatura da Orientadora
____________________________
CAMPINAS - SP 2015
Claudia Aparecida Romano - CRB 8/5816
Del Castillo Torres, Ricardo Abel,
D377p DelPurificação de partículas de bixina por precipitação com CO2 supercrítico como antissolvente a partir de solução de ativos obtida da extração de sementes semi desengorduradas de urucum (Bixa orellana L.) assistida por ultrassom / Ricardo Abel Del Castillo Torres. – Campinas, SP : [s.n.], 2015.
DelOrientador: Maria Angela de Almeida Meireles Petenate. DelCoorientador: Diego Tresinari dos Santos.
DelDissertação (mestrado) – Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia de Alimentos.
Del1. Bixina. 2. Dióxido de carbono supercrítico. 3. Ultrassom. I. Petenate, Maria Angela de Almeida Meireles. II. Santos, Diego Tresinari dos. III. Universidade Estadual de Campinas. Faculdade de Engenharia de Alimentos. IV. Título.
Informações para Biblioteca Digital
Título em outro idioma: Bixin particles purification by precipitation with supercritical CO2 as anti-solvent from active solution obtained from the extraction of semi-defatted seeds of annatto
(Bixa orellana L.) assisted by ultrasound
Palavras-chave em inglês: Bixin
Supercritical carbon dioxide Ultrasound
Área de concentração: Engenharia de Alimentos Titulação: Mestre em Engenharia de Alimentos Banca examinadora:
Diego Tresinari dos Santos Irede Angela Lucini Dalmolin Vanessa Martins da Silva Data de defesa: 06-03-2015
Programa de Pós-Graduação: Engenharia de Alimentos
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______________________________________ Dr. Diego Tresinari dos Santos
DEA/FEA/UNICAMP Coorientador - Presidente
_______________________________________ Prof.a Dr.a Irede Angela Lucini Dalmolin
Instituto Federal Catarinense Titular
_________________________________________ Dr.a Vanessa Martins Da Silva
DEA/FEA/UNICAMP Titular
__________________________________________ Prof. Dr. Julian Martínez
DEA/FEA/UNICAMP Suplente
__________________________________________ Dr.a Priscilla Carvalho Veggi
Politécnica - USP Suplente
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Este trabalho apresenta um estudo da aplicação do CO2 supercrítico como antissolvente em contato com a solução de ativos (SA), solução extraída de sementes de urucum (Bixa orellana L.) semi desengorduradas a fim de se obter partículas ricas em bixina. Para isso, duas etapas foram desenvolvidas. Na primeira e tapa foi aperfeiçoada a técnica de obtenção da SA a partir da extração dos compostos das sementes com etanol, combinando dois equipamentos: Ultra turrax (UTurrax), que produz suspensão operando por recirculação do líquido, e o Ultrassom (USom), que produz cavitação acústica no líquido. Esta é a primeira vez que o UTurrax foi usado para obter compostos ativos das sementes semi desengorduradas de urucum. A mistura etanol e ativos formou a suspensão, denominada de SA. O objetivo nesta etapa foi obter uma SA rica em bixina e pobre em óleo. Com esse intuito foram feitas extrações variando-se as condições de uso ou não de USom e a razão massa de solvente por massa de matéria-prima (S/F). A composição química dos extratos foi analisada em relação ao teor de bixina e fenólicos por método espectrofotométrico, enquanto que o teor de lipídios foi determinado nas sementes pelo método de extração Soxhlet. O uso de USom (800 W) e S/F de 1,6 g CO2/g urucum apresentou menor teor de óleo na SA, isto é, o maior teor de óleo pe rmaneceu nas sementes (0,49 ± 0,08 g/100 g sementes, b.u.). Houve também menor rendimento de extração de óleo (X0): 2,6 ± 0,4 g/100 g sementes (b.u.), uma vez que a extração foi mais seletiva, resultando em rendimento de extração de bixina e fenólicos de 0 ,19 ± 0,06 g/100 g sementes (b.u.) e 0,8 ± 0,1 g/100 g se mentes (b.u.), respectivamente. Na segunda etapa, a SA foi alimentada na unidade de precipitação Antissolvente
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utilizado um planejamento experimental fatorial completo com 3 variáveis (pressão, vazão de CO2 e vazão de SA) em 2 níveis (10 – 12 MPa, 500 – 800 g/h e 0,5 – 1 mL/min, respectivamente) sem repetição, totalizando 8 ensaios experimentais. O rendimento de precipitação foi influenciado negativamente pela pressão, sendo maior (80,5 %) a 10 MPa, 500 g/h e 0,5 mL/min. Da análise de distribuição das massas das partículas na coluna de precipitação, concluiu-se que para todos os ensaios maior massa foi depositada na base da coluna (aproximadamente 40 g/100 g extrato). A maior concentração de bixina foi determinada na parede da coluna (51 ± 15 g/100 g extrato), com massa de extrato igual a 8,73 g/100 g sementes para 12 MPa, 500 g/h e 1 mL/min. A concentração de fenólicos nas partículas coletadas não foi influenciada pelas variáveis de estudo. A eficiência de precipitação de bixina nesta condição foi de 88,4 %. Porém, acredita-se que a eficiência de precipitação de bixina pode ter sido ainda maior, pois houve setores da coluna nos quais foi difícil a coleta das partículas. Por último, através do processo de precipitação na unidade SAS, foi possível a obtenção de partículas com concentração de bixina 59 vezes maior do que a concentração inicial de bixina na SA alimentada.
Palavras-chave: Bixina, Dióxido de carbono supercrítico, Ultra turrax, Antissolvente supercrítico, Ultrassom.
ix
The following thesis consist of applying supercritical CO2 as an antisolvent in contact with the active solution (SA) extracted from semi-defatted annatto seeds (Bixa
orellana L.) to obtain particles rich in bixin. The thesis was developed in two stages. In
the first stage we apprimorate the technique for obtaining the SA by extracting the compounds from the seeds with ethanol. This was accomplished by combining two equipments. One of the equipment consisted of producing suspension operated by recirculation of a liquid (Ultra-turrax) and the other equipment consisted of producing acoustic cavitations (Ultrasound) inside the liquid. This was the first time Ultra-turrax was used to obtain SA from the semi-defatted annatto seeds. The mixture formed by the ethanol used here as a solvent and the actives formed suspension which is nominated as SA. The objective of this stage was to obtain an SA with high content of bixin and with minimum content of oil. The extractions were done by varying some conditions: presence or not of ultrasound and two ratio of S/F (mass of solvent/mass of raw material). The chemical composition of extracts was analyzed in terms of percentage of bixin and phenolics using the spectrophotometry method, while the percentage of oils from the seeds was determine by the Soxhlet extraction method. The use of ultrasound (800 W) and S/F of 1.6 was chosen as the optimal extraction condition, since it presented a low percentage of oil in the SA, that is, the greater the percentage of oil present in the seeds (0.49 ± 0.08 %, wb ) the lower the efficiency of extraction (X0): 2.6 ± 0.4 % (wb) Extraction was more selective, resulting in bixin and phenolics extraction in a solution of extract of 0.19 ± 0.06 % ( wb) and 0.75 ± 0.10 % (wb), respectively. In the second stage, the SA was inserted into the precipitation
unit-x
factorial design with 3 variables was used (pressur e, flow of CO2 and flow of SA) in 2 levels (10 – 12 MPa, 500 – 800 g/h and 0.5 – 1 mL/min, respectively) without repetition, totalizing 8 experiments. The efficiency of precipitation was negatively influenced by pressure, being greater (80.5 %) at 10 MPa, 500 g/h and 0.5 mL/min. We concluded that high amount of mass was deposited in the column’s base (approximately 40 %) by analysing the distribution of the mass of particles in the interior of the precipitation column. Great concentration of bixin was settled in the column’s walls (51 ± 15 %), where the mass of the extract was of 8.73 % for 12 MPa, 500 g/h and 1 mL/min. The concentration of phenolics in the particles collected was not influenced by the variables of study. The precipitation efficien cy of bixin in this condition was 88.4 %. However, its believe that the efficiency of bixin precipitation it could had been greater, because there were areas of the column that it was impossible to collect precipitated particles. Lastly, through the precipitation process in the SAS-unit of LASEFI, we obtained particles with concentration of bixin 59 times greater than the initial concentration of bixin in SA inserted in the SAS-unit.
Keywords: Bixin, Supercritical carbon dioxide, Ultra-turrax, Supercritical antisolvent, Ultrasound.
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ABSTRACT... ix
AGRADECIMENTOS ... xvi
LISTA DE FIGURAS ... xviii
LISTA DE TABELAS ... xxi
ABREVIATURAS E SIGLAS ... xxii
1. INTRODUÇÃO ... 1
2. OBJETIVOS... 4
2.1 Objetivo geral ... 4
2.2 Objetivos espec íficos ... 4
3. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA ... 5
3.1 Urucunzeiro ... 5
3.2 Carotenoides ... 7
3.3 Fenólicos ... 9
3.4 Algumas tecnologias de extração convencionais aplicadas na obtenção de carotenoides ... 10
3.5 Algumas tecnologias com fluidos pressurizados ... 11
3.5.1 Extração com fluidos supercríticos (SFE) ... 11
3.5.2 Extração com líquidos pressurizados (PLE) ... 12
3.5.3 Precipitação com Antissolvente supercrítico (SAS) ... 13
3.6 Utilização do ultrassom no processo de extração... 15
3.7 Utilização do ultra turrax no processo de extração ... 17
4. MATERIAL E MÉTODOS ... 18
4.1 Estruturação da primeira etapa do trabalho de dissertação ... 18
4.1.1 Sementes semi desengorduradas de urucum (Bixa orellana L.) ... 19
xii
4.1.2.1 Determinação de lipídios ... 20
4.1.2.2 Determinação de Fenólicos totais ... 20
4.1.2.3 Determinação do conteúdo de bixina (%) ... 22
4.1.3 Testes preliminares na obtenção da SA ... 23
4.1.4 Obtenção da SA ... 24
4.1.4.1 Equipamentos utilizados na obtenção da SA... 24
4.2 Estruturação da Segunda Etapa do trabalho de dissertação ... 31
4.2.1 Fracionamento com antissolvente supercrítico ... 32
4.2.1.1 Modificação 1: Preenchimento do espaço vazio na tampa da coluna de precipitação ... 33
4.2.1.2 Modificação 2: Redução do comprimento do tubo capilar na tampa superior da coluna de precipitação... 35
4.2.2 Coleta dos precipitados ... 36
4.2.3 Processo de fracionamento com antissolvente supercrítico ... 37
4.2.4 Planejamento experimental ... 39
4.2.5 Caracterização das partículas concentradas obtidas... 40
4.2.5.1 Rendimento de precipitação ... 40
4.2.5.2 Composição química ... 40
4.2.5.3 Morfologia... 40
5. RESULTADOS E DISCUSSÃO ... 42
5.1 Resultados e discussão da Primeira Etapa... 42
5.1.1 Caracterização química ... 42
5.1.2 Rendimento de extração de fenólicos e bixina na SA... 46
5.1.2.1 Determinação de fenólicos totais ... 46
5.1.2.2 Determinação de bixina... 48
5.1.3 Rendimento de extração na obtenção da SA ... 49
5.2 Resultados e discussão da Segunda Etapa... 51
5.2.1 Preenchimento do lugar vazio na tampa da coluna de precipitação ... 51
5.2.2 Redução do comprimento do tubo capilar na tampa superior da coluna de precipitação... 52
xiii
5.2.5 Distribuição da massa das partículas no sistema SAS ... 56
5.2.6 Concentração de fenólicos nas massas das partículas precipitadas segundo cada setor do sistema ... 57
5.2.7 Distribuição da bixina segundo a vazão de CO2 e os setores da coluna 59 5.2.8 Microscopia eletrônica de varredura ... 60
6. CONCLUSÕES... 63
7. SUGESTÕES PARA TRABALHOS FUTUROS ... 65
8. Referências ... 68
9. ANEXOS ... 78
9.1 Galeria de fotos ... 78
9.1.1 Extração preliminar na obtenção de SA... 78
9.1.2 Processamento de obtenção da SA ... 78
9.1.3 Curiosidade após a determinação dos lipídeos totais pelo método Soxhlet... 79
9.1.4 Unidade de precipitação SAS ... 80
9.1.4.1 Coluna de precipitação e filtro de linha ... 80
9.1.4.2 Componentes internos da coluna de precipitação... 81
9.1.4.3 Configuração interna da tampa inferior ... 82
9.1.5 Experimentos desenvolvidos na unidade de precipitação SAS ... 82
9.1.6 Observação visual do tamanho das partículas ... 87
9.1.7 Partículas coletadas ... 88
9.1.8 Observação visual do tamanho das gotas de SA... 89
9.2 Atividades acadêmicas ... 90
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A Dios, A mi mamá Juanita, por ser ejemplo de perseverancia y coraje. A mi esposa y mis hijos: Cecilia, Bruce Stefano, Christopher Giovanni y Briana Sophia, por el eterno amor y la felicidad que representan en mi vida. A mis hermanos: Homero, Winston, Charito y Rosita por el cariño y el apoyo sin límites.
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AGRADECIMENTOS
À Deus, por tudo!
À Professora Maria Angela, pela oportunidade, credibilidade, orientação, paciência e recursos que possibilitaram a realização deste trabalho.
Ao meu amigo e coorientador Diego pelas orientações.
À UNICAMP, por toda a sua estrutura.
Aos professores da FEA/UNICAMP, pelos diversos ensinamentos, dentro e fora das salas de aula.
Ao CNPq, pela bolsa de mestrado.
Aos secretários da pós-graduação Cosme e Marcos, e do DEA Reinaldo e Frederico pelo auxilio com os trâmites burocráticos.
Aos amigos e colegas do LASEFI, Sylvia, Angela, Felipe, Giovani, Moysés, Pedro, Bebel, Eric, Ádina, Renata, Julio, Fiorella e Juliana pelo ânimo, disponibilidade, conselhos acadêmicos e os bons momentos de trabalho no laboratório.
Aos membros da banca, pela contribuição para a finalização deste trabalho.
Aos membros do exame de qualificação Marleny e Gislaine que contribuíram com as orientações para a iniciação do presente trabalho.
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A meu amigo Fernando pelos primeiros passos caminhados pela UNICAMP para a iniciação do meu mestrado, ao professor Carlos Grosso do DEPAN/FEA pela oportunidade e pelos primeiros ensinamentos na UNICAMP.
Aos amigos e colegas da pós-graduação do DEA/FEA/UNICAMP, Rúbner, Daniel, Manuel, Renata, Juliane, Ana, Andresa e José pelos momentos de estudo e descontração, foi muito bom conhecer vocês.
Aos membros do Departamento de Engenharia de Alimentos da Faculdade de Indústrias de Alimentos da Universidade Nacional da Amazônia Peruana pela aprovação da minha permissão para a realização do mestrado.
Aos meus amigos Antonio Pasquel e Ricardo García por assinar as minhas cartas de recomendação, requisitos para a efetivação da minha matrícula no mestrado.
Ao Ed e Rosita Koretzky pela contribuição do texto na língua inglesa do presente trabalho.
A minha sogra Marthita pelo suporte e por me representar frente às diversas secretarias no Peru, que certamente tornou mais amigável a minha estadia no Brasil.
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Figura 1: Urucum fruto do Urucunzeiro (RÉ-JORGE, 2009) ... 5 Figura 2: Estrutura dos pigmentos do urucum e do β-caroteno (RICHFIELD, 2007; EDGAR181, 2009a; b)... 8 Figura 3. Principal estrutura molecular de fenóis nas sementes de urucum (NOTWITH, 2013)... 10 Figura 4: Primeira etapa do trabalho de dissertação. ... 18 Figura 5: Equipamento Ultra turrax (IKA, 2014) ... 26 Figura 6: (a) Unidade de produção de ultrassom, (b) transdutor ultrassônico, (c) sonificador (UNIQUE, 2014). ... 28 Figura 7: Segunda etapa do trabalho de dissertação ... 32 Figura 8: Diagrama esquemático da unidade de precipitação SAS (GOMES, 2013) ... 33 Figura 9: Modificação do espaço vazio na tampa da coluna de precipitação com adição de bucha de teflon. ... 34 Figura 10: Redução do comprimento do tubo capilar pelo qual percorre a SA e o CO2. ... 36 Figura 11: Diagramas esquemáticos do injetor tipo T. ... 38 Figura 12: Teor de óleo nas sementes (g óleo/100 g semente em base úmida) após extração para a obtenção da SA ... 43
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de ativos ... 44 Figura 14: Processo de precipitação a partir da SA nos estudos preliminares de concentração e formação de partículas. ... 45 Figura 15: Rendimento de extração de fenólicos totais (mg GAE/100mg semente em base úmida) a partir de sementes semi desengorduradas de urucum. ... 47 Figura 16: Rendimento de extração de bixina (mg/100mg semente em base úmida) a partir de sementes semi desengorduradas de urucum. ... 48 Figura 17: Rendimento de extração (g extrato/100 g semente em base úmida) .... 50 Figura 18: Rendimento de precipitação de Bixina (mg Bixina/100 mg de ativos alimentados na unidade SAS) com três comprimentos de tubo capilar. ... 52 Figura 19: Efeito da Pressão, Vazão de CO2 e vazão de SA no rendimento de precipitação. ... 54 Figura 20: Distribuição das massas das partículas (g/100 g ativos) no sistema SAS usando o menor comprimento do tubo capilar 6,6 cm ... 56 Figura 21: Distribuição da massa das partículas no sistema de precipitação SAS a 10 MPa ... 57 Figura 22: Concentração de fenólicos nas partículas (mg GAE/100mg partículas) e a distribuição do total de fenólicos precipitados durante o processo, por setores do sistema SAS... 58 Figura 23: Efeito da interação da vazão de CO2 com os setores da coluna... 60
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Figura 25: Alíquotas de SA ... 78
Figura 26: UTurrax assistido por USom ... 79
Figura 27: Aspecto dos lipídeos após extração o método Soxhlet ... 79
Figura 28: Unidade de precipitação SAS ... 80
Figura 29: Coluna de precipitação e filtro de linha ... 81
Figura 30: Componentes internos da coluna de precipitação ... 81
Figura 31: Configuração interna da tampa inferior ... 82
Figura 32: Experimentos desenvolvidos na unidade de precipitação SAS ... 86
Figura 33: Observação visual do tamanho das partículas ... 87
Figura 34: Distribuição das partículas segundo os locais de coleta ... 88
xxi
Tabela 1: Condições de processamento na obtenção da SA ... 31
Tabela 2: Composição de lipídeos (valor [%] ± amplitude) nas sementes semi desengorduradas de urucum (b.u.) após o processo de obtenção da SA ... 42
Tabela 3: Análises de Variância (ANOVA) para Teor de óleo. ... 45
Tabela 4: ANOVA para Fenóis totais (mg GAE/mg semente) ... 47
Tabela 5: ANOVA para Bixina (mg Bixina/mg semente) ... 49
Tabela 6: ANOVA de rendimento de extração. ... 50
Tabela 7: Planejamento experimental com os rendimentos de precipitação ... 53
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LASEFI = (LAboratório de tecnologia Supercrítica: Extração, Fracionamento e
Identificação de extratos vegetais.
SA = Solução de ativos. USom = Ultrassom. UTurrax = Ultra turrax.
SFE = Supercritical Fluid Extraction (extração com fluido supercrítico) PLE = Pressure Liquid Extraction (extração com líquido pressurizado) SFEE = Supercritical Fluid Extraction of Emultions (extração com fluido supercrítico de emulsões)
SAS = Supercritical fluid Anti-Solvent (antissolvente supercrítico) PEG = Polietileno glicol.
DCM = Diclorometano.
S/F = Solvent/Feed (razão entre massa de solvente e massa de matéria-prima de alimentação [g/g])
UV = Ultraviolet (raio ultravioleta) t.s. = tampa superior.
p.c. = parede da coluna. b.c. = base da coluna. f.b. = filtro base.
GL= graus de liberdade. SQ = soma dos quadrados.
xxiii wb = wet basis (base úmido)
1 1. INTRODUÇÃO
Este estudo foi realizado no LASEFI (LAboratório de Tecnologia Supercrítica:
Extração, Fracionamento e Identificação de extratos vegetais), como o intuito de
purificar partículas de bixina por precipitação com CO2 supercrítico como antissolvente a partir de uma solução de ativos (SA) obtida da extração de sementes semi desengorduradas de urucum (Bixa orellana L.) assistida por ultrassom (USom).
Um dos atributos mais importantes na comercialização de alimentos é o impacto visual causado pela cor (LEAL et al., 2012). Diversas substâncias com atributos para conferir ou intensificar a cor são adicionadas aos alimentos, como os carotenoides β-caroteno, licopeno, luteína e zeaxantina (TOCCHINI et al., 2001; MARTÍN et al., 2007) que conferem uma extensa gama de cores, diversos tons de vermelho, laranja e amarelo (STAHL et al., 2003). Segundo SANTOS et al. (2013a), TAPIERO et al. (2004) e SHAHID et al. (2013), há um crescente interesse em usar pigmentos naturais por apresentarem uma ampla faixa de atividades biológicas, incluindo atividade antioxidante, anti-inflamatória, anticâncer, entre outras.
As sementes do urucum acumulam vários derivados de carotenoides (incluindo bixina e norbixina), terpenóides, tocotrienóis, hidrocarbonetos aromáticos, e flavonóides (RODRIGUES et al., 2007).
Assim, para a obtenção destes compostos a partir das sementes do urucum, algumas técnicas de extração convencionais já foram estudadas como, por
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exemplo, extração em óleo, em soluções aquosas alcalinas, solventes orgânicos (VAN SCHEPPINGEN et al., 2012) e extração mecânica (BARROZO et al., 2013).
Contudo, aplicações mais recentes, cujos processos são chamados de tecnologias limpas de extração ou separação também foram estudadas, por exemplo: Extração com fluidos supercríticos (SFE) por ALBUQUERQUE et al. (2012), Extração com líquidos pressurizados (PLE) por RODRIGUES et al. (2013), Extração com fluido supercrítico de emulsões (SFEE) e Precipitação com Antissolvente supercrítico (SAS), por MATTEA et al. (2009b); SANTOS et al. (2013b); SANTOS (2013a) e SANTOS et al. (2010).
Dentre as aplicações, o estudo feito por SANTOS (2013b) tem certa proximidade com o presente estudo. A unidade de precipitação SAS empregada no presente trabalho é uma modificação da unidade usada por SANTOS (2013b). Os autores usaram o β-caroteno puro e extrato rico em bixina obtido das sementes de urucum com CO2 supercrítico para precipitá-los a partir de soluções contendo polietileno glicol (PEG) como material encapsulante em diclorometano (DCM). Tanto para o β-caroteno quanto para o extrato rico em bixina, CO2 supercrítico foi utilizado como antissolvente para formar partículas encapsuladas ou não.
O presente estudo abrange duas etapas: a primeira etapa consistiu em aperfeiçoar a técnica de obtenção da SA a partir da extração dos compostos das sementes semi desengorduradas de urucum com etanol como solvente, combinando dois equipamentos: um equipamento de produção de suspensão operado por recirculação do líquido e outro equipamento de produção de cavitação acústica (ultrassom = USom) no líquido. Neste estudo, o equipamento
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de produção de suspensão, conhecido como Ultra turrax (UTurrax), foi empregado pela primeira vez para a extração dos compostos ativos das sementes semi desengorduradas de urucum que, em contato com o etanol, formam a suspensão que é nomeada nesta pesquisa como SA. O estudo das variáveis uso ou não de USom e a razão de massa de solvente para massa de alimentação (S/F) levaram a aperfeiçoar o processo de obtenção da SA.
Na segunda etapa, o processo purificação e formação de partículas aconteceu no interior da coluna da unidade SAS, através da precipitação dos ativos, assim que o CO2 supercrítico dissolveu o etanol da SA. A importância da precipitação está na formação de partículas em tamanhos diversos, podendo estar na escala nanométrica. Além da purificação e formação de partículas, foi realizada a identificação e quantificação das partículas segundo a configuração das zonas ao interior da coluna nas quais as partículas foram mais ricas em bixina e/ou mais ricas em fenóis. Este método, além de ser biosseguro, permite estabelecer condições operacionais que tornam o processo altamente seletivo para incrementar a eficiência na obtenção das partículas enriquecidas em bixina e fenólicos.
4 2. OBJETIVOS
2.1 Objetivo geral
Purificar partículas de bixina por precipitação com CO2 supercrítico como antissolvente a partir de solução de ativos obtida da extração assistida por ultrassom de sementes semi desengorduradas de urucum.
2.2 Objetivos específicos
o Determinar o efeito do ultrassom e da razão S/F na obtenção de solução de ativos ricos em bixina das sementes semi desengorduradas de urucum; o Determinar o efeito da pressão, vazão de CO2 e vazão de solução de ativos
na concentração de bixina e fenóis utilizando CO2 supercrítico como antissolvente através do método SAS;
o Determinar a distribuição das partículas no interior da coluna de precipitação;
o Modificar a unidade de precipitação SAS com o intuito de aumentar a eficiência do processo de precipitação;
o Caracterizar quimicamente as sementes semi desengorduradas, a solução de ativos, as partículas precipitadas e a solução residual da saída de cada processo;
o Analisar a morfologia das partículas purificadas por MEV (Microscopia Eletrônica de Varredura).
5 3. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
3.1 Urucunzeiro
O urucunzeiro (Bixa orellana L.) é uma planta da família das bixáceas, originária da América do Sul. As espécies são provavelmente nativas do Acre, no noroeste do Brasil. Na verdade, o gênero provavelmente se originou nas encostas dos Andes ocidentais entre os rios Huallaga-Ucayali e Madre de Dios no Peru e o rio Madeira no Brasil, já que a maioria das espécies estão presentes nesses locais. O urucunzeiro também é cultivado em outros países tropicais (LEAL, 2012).
Urucum (Figura 1) é o fruto do urucunzeiro, em cujo interior se encontram as sementes que contêm bixina e a norbixina, de grande interesse comercial, as quais têm estruturas químicas semelhantes ao β-caroteno (SHAHID, 2013).
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Estudos sobre as épocas de colheita do urucum feitos por KATO et al. (1992) reportam que a maior porcentagem de bixina obtida das sementes foi alcançada entre 30 e 51 dias após a abertura da primeira flor.
Por outro lado, a EMBRAPA (2011) no boletim Prosa Rural do mês de março de 2011, estabelece que a diversidade de cultivos é uma garantia de renda na agricultura familiar. Por isto, foi adotada em diferentes áreas do nordeste brasileiro. O modelo de exploração integrada de diferentes culturas foi implementado após a constatação da existência de mercado consumidor para diversos produtos, dentro dos quais as propriedades lucram com a venda do urucum como matéria-prima para a indústria de corantes. Na região norte do Brasil o cultivo de urucum vem sendo há 20 anos a principal atividade econômica das comunidades locais (EMBRAPA, 2014). Esse é o caso do povo Yawanawá localizado no estado do Acre, estado que faz fronteira com o Peru, onde uma empresa americana de cosméticos orgânicos compra a produção de semente de urucum de várias aldeias Yawanawá.
Na região sudeste, o estado de São Paulo é o maior produtor de urucum (ESALQ/USP, 2010). O município de Monte Castelo tem a maior produção de urucum do estado de São Paulo. Para o ano 2014, devido à falta de chuva, segundo a Coordenadoria de Assistência Integral, a estimativa era de colher 480 toneladas, quase 40 % a menos que em 2013, quando foram colhidas 680 toneladas. O preço da venda do quilograma do urucum beneficiado para o ano 2014 foi de R$ 5, cerca de 16 % a menos do que em 2013 (RURAL, 2014). Em 2007, por exemplo, o produtor recebia de R$ 0,80 a R$ 1,00 por ponto percentual de bixina, mas o quilograma de
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bixina cristalizada (90 %), conhecida também como corantes especiais, atingia R$ 300,00. As demais formas de comercialização do corante natural de urucum recebem preço menor, porém bem superior ao pago pelo colorífico (PRODETEC, 2013).
Segundo o IBGE (2010), o registro da produção urucum foi de 13.309 t/ano. Já em 2013, o Brasil produziu em média 12.400 t/ano de grãos de urucum, mas apenas 20 % destinam-se à indústria de corantes naturais, fato que estaria vinculado aos altos custos de sua produção, bem superior ao custo de produção de corantes sintéticos (PRODETEC, 2013). Porém, recentes estudos têm demonstrado que técnicas de extração por tecnologia à alta pressão podem produzir compostos de interesse altamente competitivos em relação aos custos de produção (ALBUQUERQUE, 2012).
No que diz respeito às perspectivas de aplicação industrial para os anos futuros o ITAL (2014) indica o urucum como um dos exemplos de: ingredientes naturais com funções flavorizantes, corantes naturais desenvolvidos pelas indústrias de ingredientes, vegetal para a obtenção de extratos naturais, como um dos principais ingredientes na culinária no norte e sul do Brasil e como parte da tendência de consumo de produtos com macroingredientes funcionais ou de valor nutritivo elevado.
3.2 Carotenoides
Pigmentos conhecidos como carotenoides possuem a função de proteger as plantas contra os processos foto-oxidativos. Eles são eficientes antioxidantes na
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eliminação molecular de oxigênio singlete e radicais peroxil. Em animais e no organismo humano, eles fazem parte do sistema de defesa antioxidante. Eles também interagem sinergeticamente com outros antioxidantes e a eficácia é maior quando se têm misturas de carotenoides ao invés dos compostos individuais. Estruturalmente, os carotenoides apresentam absorção máxima próximo de 450 nm. Estudos em humanos evidenciam que os carotenoides protegem a pele contra os danos foto-oxidativos (STAHL, 2003).
Aspectos notáveis dos carotenoides, como função antioxidante, auxílio na prevenção de doenças cardiovasculares e outros aspectos positivos para combater outras doenças como o câncer são citados por SANTOS (2013a) e TAPIERO (2004).
A bixina é um corante lipossolúvel e representa cerca de 90 % dos corantes existentes nas sementes do urucum, e é uma alternativa para colorir alimentos gordurosos. A norbixina é derivada do norbixato de sódio, que é solúvel em água e é usado para colorir produtos não-oleosos; após acidificada, torna-se também um corante lipossolúvel (KATO, 1992) (Figura 2).
Figura 2: Estrutura dos pigmentos do urucum e do β-caroteno (RICHFIELD, 2007; EDGAR181, 2009a; b).
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Segundo SHUHAMA et al. (2003), os níveis de concentração de bixina de 12 até 23 mg/g são dependentes dos fatores ligados ao meio ambiente tais como iluminação, temperatura, pluviosidade, solo e cultivo. Na pesquisa feita por CHISTÉ et al. (2011a), foi determinado 14 ± 2 mg/g de bixina nas sementes de urucum.
Além do alto interesse na indústria de alimentos (ITAL, 2014), os corantes das sementes de urucum têm despertando crescente interesse também para a sua aplicação na indústria farmacêutica (KIOKIAS et al., 2003; DOS SANTOS et al., 2010), de cosméticos (ALVES et al., 2006) e têxtil (DAS SAHA et al., 2012).
3.3 Fenólicos
Os compostos bioativos no organismo humano ajudam a controlar as doenças crônicas não transmissíveis, interferindo em alvos fisiológicos específicos, modulando a defesa antioxidante, defesa frente a processos inflamatórios e mutagênicos, os mesmos que estão relacionados a várias doenças pelo que a ingestão destes compostos é essencial para a manutenção da saúde. Nos vegetais estes compostos bioativos estão representados pelos carotenoides, fitoesteróis, terpenos e os compostos fenólicos. Estes últimos estão associados à redução no risco de doenças cardiovasculares, câncer e outras doenças crônicas devido à ação antioxidante, sequestrando os radicais livres e metais pró-oxidantes (DE OLIVEIRA et al., 2011).
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Segundo a sua estrutura molecular, os fenóis possuem o grupo hidroxila (-OH) ligado ao anel benzênico (Figura 3). No que diz respeito às sementes de urucum (Bixa orellana L.) através de ensaios espectrofotométricos feitos por CHISTÉ (2011a), foi constatado a presença de fenóis em 1,7 ± 0,1 mg GAE/g, em termos de fenóis totais. Semelhantes quantidades foram determinadas por CHISTÉ et al. (2011b).
3.4 Algumas tecnologias de extração convencionais aplicadas na obtenção de carotenoides
A extração dos produtos naturais derivados de plantas provavelmente existe há muito tempo, desde o primeiro momento que o homem aprendeu a criar o fogo. Ao longo dos séculos foram realizadas as extrações sólido-líquido, através das fermentações das folhas de plantas, frutos e raízes. Nesse processo, o homem foi
Figura 3. Principal estrutura molecular de fenóis nas sementes de urucum (NOTWITH, 2013).
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isolando uma serie de extratos com atividade farmacológica. Muitos desses compostos são utilizados com fins medicinais.
Já na atualidade, estas técnicas de extração convencionais ainda continuam vigentes e, em geral, são utilizadas como referência para fazer comparações com técnicas que empregam equipamentos sofisticados ou solventes não tóxicos.
3.5 Algumas tecnologias com fluidos pressurizados
Esta seção apresenta um ligeiro panorama da aplicação de algumas tecnologias com fluidos pressurizados na obtenção de alguns principais compostos e grande parte dela esta orientada aos compostos abordados no presente trabalho de dissertação.
Embora a extração de carotenoides tenha sido realizada inicialmente com fluidos supercríticos por alguns autores, como a solubilidade da maior parte dos carotenoides em CO2 supercrítico é muito baixa sob pressões moderadas, pressões elevadas (maior que 40 MPa) são necessárias para a obtenção de rendimentos aceitáveis (MATTEA et al., 2009a).
3.5.1 Extração com fluidos supercríticos (SFE)
A extração com CO2 supercrítico para desengordurar sementes de urucum foi estudada por ALBUQUERQUE (2012), com o intuito de obter um extrato rico em tocotrienóis e sementes desengorduradas ricas em bixina. Estabeleceram as condições do processo de 313 e 333 K, e 20, 31 e 40 MPa. Não achando diferença significativa entre as quantidades de extrato obtidas nestas condições de
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processo. O maior rendimento foi de 22 mg de extrato/g de sementes secas obtido a 333 K e 40 MPa. Para estas condições de processo o custo de manufatura (COM) do extrato é menor. Pensando em um aproveitamento posterior da bixina residual nas sementes previamente extraídas com CO2 supercrítico, porém condições 313 K e 20 MPa foram selecionadas, uma vez que foi produzido óleo de urucum com o menor teor em bixina. Após a utilização dos mesmos parâmetros de extração RODRIGUES et al. (2014) determinaram que o conteúdo de bixina nas sementes de urucum desengorduradas foi de 2,5 ± 0,2 (% m/m).
3.5.2 Extração com líquidos pressurizados (PLE)
Um liquido em particular pode ser pressurizado e aquecido à pressão e temperatura em baixo do seu ponto critico e depois utilizado na extração de vários compostos, baseado no aumento do potencial de solubilidade dos compostos a extrair e na aceleração da cinética de dessorção destes compostos a partir da matriz vegetal. O processo de extração liquida a pressões maiores que a pressão ambiente e moderadas a altas temperatura é conhecido como “extração liquida pressurizada” (PLE) (RODRIGUES, 2014). Baseados nos resultados de estudos preliminares na extração de bixina a partir de sementes desengorduradas, RODRIGUES (2014) escolheram o etanol como solvente, determinando máximo e mínimo rendimento global de 7,22 % e 2,67 %, respectivamente para as condições de S/F = 8, T = 60 °C e P = 10 MPa; sendo que para as mesmas condições foram encontradas valores máximos e mínimos para o rendimento em termos de bixina iguais a 9,07 % (m/m) e 1,75 % (m/m), respectivamente.
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Valor semelhante (1,9 % m/m) foi determinado por RODRIGUES (2013) quando comparados os extratos obtidos por PLE nas condições de 2 MPa e 333 K, sendo que este cálculo corresponde ao rendimento de bixina em relação à quantidade total de bixina encontrada na semente desengordurada. Etanol e acetato de etila apresentaram-se como os melhores solventes para a obtenção de extratos ricos em bixina, porém etanol se apresenta como uma alternativa mais aceitável para a extração de bixina por ser reconhecido como um solvente geralmente seguro (GRAS), sendo amplamente aceito sem restrições na obtenção de extratos vegetais em todo o mundo.
3.5.3 Precipitação com Antissolvente supercrítico (SAS)
As tecnologias de precipitação com fluidos supercríticos estão sendo aplicadas na formação de partículas, devido às suas distintas vantagens, tais como a produção de micro ou nanopartículas com uma distribuição de tamanho de partículas estreita e redução do solvente residual no produto até concentrações muito baixas (menor que 50 ppm) (SUO et al., 2005).
Durante o processo de precipitação com antissolvente supercrítico (SAS) uma solução contendo o composto e o antissolvente (CO2 em condições supercríticas) são alimentados separadamente e continuamente na câmara de precipitação. Este processo é baseado no uso de dois fluidos, solvente orgânico e antissolvente, que são completamente miscíveis. O soluto de interesse, que será micronizado, deverá ser solúvel no solvente orgânico e insolúvel no CO2 supercrítico.
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De acordo com REVERCHON (1999) a aplicação do antissolvente supercrítico abarca diversos setores de produção, tais como: explosivos, supercondutores, catalisadores polímeros, compostos inorgânicos, produtos farmacêuticos e matérias corantes. Assim para a micronização do licopeno MIGUEL et al. (2006), mostra que acontece uma redução no tamanho das partículas desde 80 até 20 μm quando vazão de CO2 é reduzida de 4,3 até 3,0 Kg/h e a vazão da solução do diclorometano-licopeno mantendo fixas as condições de pressão (15 MPa), temperatura (35 °C) e a concentração da solução diclorometano-licopeno (500 ppm). No que diz respeito à micronização de carotenoides, SANTOS (2013b) utilizaram o CO2 supercrítico como fluido antissolvente permitindo a recristalização do β-caroteno em tamanho menor. As vazões de CO2 e solução de β-caroteno (8 mg/mL) foram de 1,5 kg/h e 1 mL/min, respectivamente, e a pressão e temperatura de precipitação foram de 0,8 MPa e 313 K, respectivamente. Micrografias eletrônicas de varredura foram realizadas para as amostras do β-caroteno antes e depois da micronização, observando que, adicionalmente às mudanças relacionadas ao tamanho das partículas, também podem ser observadas mudanças relacionadas a sua morfologia após o processo SAS. O β-caroteno não processado apresentou uma forma semelhante a flocos, enquanto que o precipitado apresentou uma forma semelhante a folhas.
Mais recentemente foi observado também, em experimentos desenvolvidos no LASEFI, que se ao invés de um composto puro, uma mistura de compostos for adicionada, além da formação de partículas através do contato do CO2 em condições supercríticas pode ocorrer ter o fracionamento deles, podendo se
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observar a purificação de um composto ou classe em detrimento da remoção dos outros compostos (SANTOS et al., 2012). Também conhecido como fracionamento com antissolvente supercrítico (CATCHPOLE et al., 2004) ou extração com antissolvente supercrítico (MARQUÉS et al., 2013), este processo vem sendo empregado com sucesso para a precipitação seletiva de compostos extraídos de materiais vegetais. Como diferentes compostos estão também presentes nas sementes de urucum, assim como nos seus extratos, parece promissor o fracionamento destes compostos empregando técnicas ambientalmente corretas como a SAS, visando à obtenção de extratos mais puros em relação aos compostos de maior valor agregado (bixina, por exemplo).
Em suma, no que diz respeito à precipitação SAS, atualmente a literatura científica não registra a identificação das concentrações dos compostos segundo o lugar onde ficou precipitado ao interior da coluna de precipitação. Consequentemente o presente trabalho é o primeiro com esta identificação.
3.6 Utilização do ultrassom no processo de extração
De acordo com ESCLAPEZ et al. (2011) a aplicação do USom no processo de extração aporta os seguintes benefícios: incrementa a quantidade dos compostos no produto extraído consequentemente tem menor gasto de energia e utiliza temperatura moderada. Por outro lado, as possíveis variáveis a considerar dentro de um determinado estudo podem ser: a frequência, a temperatura de extração, as características do reator e a interação entre a matéria-prima e o solvente. Nesse sentido, algumas dessas considerações foram aplicadas por
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RODRIGUES (2014) para o cálculo da extração das sementes desengorduradas de urucum em termos de rendimento global e de bixina. Para isso a célula de extração foi introduzida dentro de um banho ultrassônico operado a uma frequência de 40 kHz e potência 135 W, variando as condições de uso ou não de USom, S/F, temperatura e tipo de solvente. Estes autores, determinaram que o rendimento global de extra (X0 (%)) teve valores maior e menor de 13,06 (uso de USom, S/F = 8, T = 60 °C e etanol) e 0,30 (uso de USom, S/F = 8, T = 40 °C e água), respectivamente. Para o rendimento em termos de bixina (BY (%)) de 22,89 e 0,22; respectivamente. Semelhantes considerações foram adotadas por GONZALEZ-CENTENO et al. (2014) para a extração aquosa assistida por ultrassom no estudo da uva da variedade pomace, avaliando o efeito da frequência acústica (40, 80 e 120 kHz), a densidade do poder ultrassônico (50, 100 e 150 W/L) e o tempo de extração (5, 15 e 25 min) nos fenólicos totais, flavonoides totais e capacidade antioxidante, sendo todas elas significativas (p<0,05). Foram gerados modelos matemáticos que explica o comportamento do sistema predizendo a produção de extração de fenólicos como os compostos de flavonol e capacidade antioxidante dos extratos da uva pomace, com isso a condição ótima para os fatores de resposta foram 40 kHz, 150 W/L e 25 min, conseguindo predizer 32,31 mg GAE/100 g de peso fresco para os fenólicos totais, 2,04 mg quercetin/100 g de peso fresco para flavonoides totais e 53,47 e 43,66 mg Trolox/100 g de peso fresco, para o valor calculado e o ensaio, respectivamente.
O Ultrassom é um fenômeno físico cujo possível efeito no liquido é criar, aumentar e implodir cavidades de vapor e gases, conhecido como cavitação,
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promovendo efeitos de ativação em reações químicas. Segundo o requerimento, ela pode estar nas indústrias de biotecnologia, cerâmica, química e farmacêutica a sonificação é utilizada na produção de emulsões, catalisação de reações, extração de componentes e redução do tamanho de partículas (UNIQUE, 2014).
3.7 Utilização do ultra turrax no processo de extração
Foi reportado por DEVAPPA et al. (2010) que o rendimento de extração de ésteres de forbol utilizando o UTrrax foi maior na medida que o solvente empregado era maior. Assim, para as variáveis de velocidade do UTurrax de 13,000 até 20,500 rpm e proporções de metanol:óleo de 1:1; 1,5:1 e 2:1 (v/m) com quase o 95 % de extração.
18 4. MATERIAL E MÉTODOS
As pesquisas de processos de obtenção da SA a partir das sementes semi desengorduradas de urucum, e de formação de partículas por precipitação SAS a partir da SA foram desenvolvidas no LASEFI. Assim, como partes da pesquisa foram desenvolvidas duas etapas.
4.1 Estruturação da primeira etapa do trabalho de dissertação
Como introdução ao desenvolvimento da primeira etapa do trabalho apresenta-se a ilustração das atividades segundo a Figura 4.
Sementes semi desengorduradas de urucum Espectrofotômetro: Absorbância a 487nm (bixina) 760 nm (fenólicos) Ultra turrax 900 Watts 26000 rpm 2000 mL/min Etanol P.A. (Min 99,5 GL)
SA
Rendimentoglobal de extração Conteúdo de fenólicos totais Variáveis de resposta
Conteúdo de bixina Primeira Etapa
Remoção da fração lipídica das sementes in natura por
SFE a: T = 40 °C, P = 20 MPa, Vazão CO2 = 200 g/min
S/F = 11. Após SFE: óleo 1,24 %,
bixina 3,02 % Bixina - FAO/WHO (2006) - Lei de Lambert-Beer Espectrofotômetro (absorbância a 760nm) Ultrassom 800 Watts 19 kHz T = 60 °C; t = 40 min; S/F (1,6; 3,9 e 7,8)
Conteúdo de óleo nas sementes após
extração Testes preliminares na obtenção da
solução de ativos (SA)
Fenólicos Método
Folin-Ciocalteau
Sementes após obtenção de
SA Método Folin-Fenólicos
Ciocalteau
Determinação de lipídios totais Soxhlet, éter de petróleo por 6 horas
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4.1.1 Sementes semi desengorduradas de urucum (Bixa orellana L.)
4.1.1.1 Origem
No presente estudo foram utilizadas sementes semi desengorduradas de urucum, da variedade Piave Vermelha (safra 2013) da Estação dos Grãos Ltda. São Paulo. O processo para semi desengordurar as sementes foi realizado na unidade piloto de SFE (Thar Technologies, SFE-2 x 5LF-2FMC, Pittsburgh, EUA) no LASEFI. A extração com CO2 puro teve as seguintes condições: T = 40 °C, P = 20 MPa, Vazão de CO2 = 200 g/min e S/F = 11. O valor de S/F foi 68,6 % menor que aquilo utilizado por ALBUQUERQUE (2012), e com isso as sementes tiveram a condição final de semi desengorduradas.
4.1.1.2 Armazenamento das sementes de urucum
Assim que o processo de SFE foi concluído, as sementes semi desengorduradas foram acondicionadas em sacos de polietileno de cor preta e armazenadas em freezer doméstico (Metalfrio, DA420, São Paulo, SP) em temperatura de -10 °C, até realização das análises e obtenção da SA.
4.1.2 Caracterização química
Foi determinada a composição centesimal parcial das sementes semi desengorduradas de urucum, no Laboratório de Alta Pressão em Engenharia de Alimentos – LAPEA/DEA/UNICAMP: lipídios (AOCS, 2009). No LASEFI/DEA/UNICAMP foi determinado o conteúdo de bixina e fenólicos totais.
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4.1.2.1 Determinação de lipídios
Os lipídios totais das sementes semi desengorduradas após a obtenção da SA foram determinados utilizando balança analítica (Sartorius analytic A200S, ± 0,0001 g, Sartorius GMBH Gottingen, Alemanha) a partir da massa de 5 g. Também foi utilizado éter de petróleo PA (Chemco, lote 29402, Sinergia, Campinas, SP) como solvente sob refluxo em aparelho de Soxhlet por 6 horas.
Os balões volumétricos de 250 mL contendo o óleo e o solvente foram colocados em rota evaporador (Heildoph Instruments, modelo Laborota 4001, Viertrieb, Alemanha) a vácuo até a evaporação total do solvente. A seguir o solvente é removido do rota evaporador e os balões foram colocadas em estufa (Tencal, modelo TE-395-1, Piracicaba, SP) a 105 °C durante duas horas.
Logo os balões foram resfriados à temperatura ambiente em dissecador. Após resfriados, foram determinadas novamente as massas. Este processo de aquecimento e resfriamento foi repetido até que as massas dos balões ficassem constantes. Esta determinação foi feita em duplicata.
4.1.2.2 Determinação de Fenólicos totais
Para determinar a quantidade de fenóis totais nas sementes semi desengorduradas de urucum e na SA utilizou-se o método do reagente Folin-Ciocalteu com as adequações para extratos vegetais (NAVARRO, 2010).
Uma solução estoque foi preparada em balão volumétrico de 100 mL dissolvendo 0,5 g de ácido gálico (Sigma-Aldrich, lote 023K01171, EUA) em 10 mL de etanol e depois completou-se o volume com água destilada, sendo que esta
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solução tem validade máxima de 2 dias se conservada a menos de 5 ºC. Em seguida, foram preparadas as soluções de calibração (necessárias para a construção da curva padrão) em balões volumétricos de 10 mL, diluindo com água destilada as frações da solução estoque para conseguir concentrações de ácido gálico iguais a 0,05 mg/mL, 0,10 mg/mL, 0,15 mg/mL, 0,25 mg/mL e 0,50 mg/mL, respectivamente.
As soluções de amostra foram preparadas dissolvendo 20 mg das sementes semi desengorduradas e 10 mg dos extratos da SA em 1 mL de etanol e, em seguida, diluindo a mistura com água destilada até o volume final de 10 mL. Também foi feita uma diluição 1:10 v/v do reagente Folin-Ciocalteau (Dinâmica, lote 67543, Sinergia, Campinas - SP) em água destilada. O carbonato de sódio anidro (Dinâmica, lote 67653, Sinergia, Campinas, SP) foi diluído com água destilada até uma concentração final de 75 mg/mL. Para a solução branco foi utilizada água destilada.
Previamente ao início das reações, novas diluições (1:10 v/v) das soluções de calibração e de amostra foram feitas. As reações foram conduzidas misturando 2 mL destas novas diluições (calibração, amostra ou branco) com 10 mL da solução do reagente Folin-Ciocalteu. Transcorrido 1 min e antes de 8 min adicionaram-se 8 mL da solução de carbonato de sódio. Deixou-se em banho térmico (Marconi modelo MA 127/BO, Piracicaba, SP) a 50 ºC por 5 min e imediatamente depois a absorbância foi lida em espectrofotômetro UV-vis (Hitachi, modelo U-3010, Tóquio, Japão) usando comprimento de onda de 760 nm.
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O conteúdo de fenóis totais das amostras foi calculado em equivalentes de ácido gálico (GAE) em mg de ácido gálico por mg de amostra utilizando a equação da reta (resultante da regressão linear da curva padrão) para transformar os valores de absorbância das amostras em miligramas de ácido gálico equivalentes . Para esta determinação foram feitas leituras das absorbâncias com três repetições.
4.1.2.3 Determinação do conteúdo de bixina (%)
O conteúdo de bixina da SA medida a partir da determinação do teor de sólidos foi determinado de acordo com a FAO/WHO (2006), pelo Comitê de Especialistas em Alimentação e Aditivos.
Pesou-se aproximadamente 0,0010 g de extrato, obtido a partir da SA após a determinação do teor de sólidos em balança analítica (Sartorius GMBH, modelo A200S, ± 0,0001, Gottingen, Alemanha) e diluiu-se com acetona para originar concentrações adequadas de bixina para análise.
O procedimento foi o seguinte: a amostra foi diluída com acetona em balão volumétrico de 10 mL (V1). Uma alíquota de 1 mL (va) foi pipetada em balão volumétrico de 5 mL (V2). Mais uma alíquota de 1 mL (vb) foi pipetada em balão volumétrico de 5 mL (V3) e completado com acetona PA ACS (Êxodo cientíca, lote A10014RA, Hortolândia, SP).
Em seguida esta diluição foi inserida em cubeta de quartzo para leitura de absorbância, lida em três repetições, no comprimento de onda de 487 nm, em espectrofotômetro (HACH,DR/4000 U, Lovelend, EUA). O teor de bixina foi
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calculado de acordo com a lei de Lambert-Beer (Equação 1), utilizando o coeficiente de estimação igual a 𝐸1𝑐𝑚 1% = 3.090 (ALBUQUERQUE, 2012).
𝐵𝑖𝑥𝑖𝑛 % = 𝐴×10
𝐸1 𝑐𝑚1 %
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× 𝑉1×𝑉2×𝑉3
𝑚𝐸𝑋𝑇[𝜇𝑔]×𝑣𝑎×𝑣𝑏 (1)
Onde V1, V2 e V3 são os volumes de dissolução, va e vb são os volumes das alíquotas, e mEXT é a massa de extrato seco (μg) (RODRIGUES, 2013). Para a solução branco foi utilizada acetona.
4.1.3 Testes preliminares na obtenção da SA
Foram realizados testes preliminares na obtenção de SA mantendo constante o S/F = 7,8 com as variáveis velocidade rotacional 26000 min-1, 20000 min-1 e 10000 min-1, e com coleta de alíquotas de 1 mL a cada 5 e 10 min, com o intuito de determinar as cinéticas de extração. Porém, para 26000 min-1 a variação da temperatura de 35 °C aos 5 min de extração até 75 °C antes dos 20 min impossibilitou considerar válido o experimento preliminar.
Para 20000 min-1 também foram observadas mudanças na temperatura de 28 °C aos 5 min até 36 °C aos 20 min. Para 10000 min-1; também foram observadas as mudanças na temperatura de 27 °C aos 5 min até 36 °C aos 20 min. Com esses testes preliminares se procedeu a vedar o sistema e monitorar a temperatura através de um banho de refrigeração ultratermostatizado (Marconi, modelo MA184, Campinas, SP).
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Com isso foi possível ter um melhor controle da temperatura, estabelecendo 60 °C como condição do processamento na obtenção da SA. Mais um processo preliminar foi realizado a S/F 7,8; velocidade rotacional 26000 min-1, 60 min de extração e com tomada de alíquota a cada 5 min até completar os primeiros 40 min e mais 2 alíquotas, uma por vez a cada 10 min.
Entretanto, para cada alíquota coletada o volume da SA dentro da ponteira da pipeta não tinha o mesmo volume (observação visual), a observação foi que nessa condição de extração por recirculação se gera alta turbulência. Além disso, acredita-se que à temperatura de 60 °C o volume ocupado pelo etanol seja maior que nas condições de temperatura ambiente.
Por último, e já com informação suficiente gerada nas ações preliminares, foi decidido pela a obtenção da SA por processo em batelada, com vazão de 2000 mL/min e velocidade rotacional 26000 min-1 (por gerar maior turbulência, então acredita-se que resulta em maior rendimento de extração), tempo de extração 40 min (por ter-se observado rápida saturação do solvente) e o uso ou não de USom (com o intuito de aumentar o rendimento de extração).
4.1.4 Obtenção da SA
4.1.4.1 Equipamentos utilizados na obtenção da SA
Os principais equipamentos na obtenção da SA foram: um equipamento de produção de suspensão operado por recirculação do líquido (Ultra turrax, Dijkstra Vereenigde, IKA® mag LAB®, NJ Lelystad, Holanda) e outro equipamento de
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produção de cavitação acústica (Ultrassom, Unique Group, Desruptor, Indaiatuba, SP) no líquido.
Cabe destacar que, no presente estudo, o UTurrax foi usado pela primeira vez para extração dos compostos ativos das sementes semi desengorduradas de urucum, que em mistura com o etanol, formam a SA.
4.1.4.1.1 Ultra turrax
Este equipamento (Figura 5) está constituído de uma unidade de controle com sete módulos de operação (no presente estudo foi utilizado o módulo com os maiores valores de processamento vazão 2000 mL/min e velocidade rotacional de 26000 min-1), duas opções de mistura contínua, as quais são por recirculação mais a velocidade do rotor ou só pela velocidade do rotor (neste estudo foi utilizada a primeira opção).
Na Figura 5, a letra (a) esquematiza o equipamento UTurrax na configuração integral, a letra (b) representa o aparelho de dispersão, a letra (c) é o módulo Micro-Plant com a sua configuração interior na letra (d). A letra (e) representa o estator e rotor e na letra (f) é desenhado o perfil de velocidade em sentido axial e radial pela qual escoa a SA.
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Figura 5: Equipamento Ultra turrax (IKA, 2014)
Segundo IKA (2014), devido à alta velocidade de rotação do rotor, a solução processada (Figura 5, (f)) é conduzida axialmente à cabeça do dispersor, e em seguida é levado radialmente através das fendas do sistema do rotor/estator. As altas acelerações que atuam sobre o material geram cisalhamento e empuxo
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extremamente fortes. Além disso, é produzida alta turbulência entre o rotor e o estator que fornece ótima mistura da suspensão.
4.1.4.1.2 Ultrassom
O equipamento de ultrassom (Figura 6) está constituído de uma unidade de controle através da qual é possível ajustar as condições: potência ultra-sônica até 99% de 800 Watts, seleção de ponta (micro e macro ponta, no presente trabalho foi utilizada a macro ponta de titânio), seleção do tempo programável, transdutor ultra-sônico e sonificador.
Segundo UNIQUE (2014), a cavitação/implosão de micro bolhas no sonificador causa o rompimento das células ou a homogeneização de líquidos não compatíveis (óleo e água). Ao transformar energia elétrica em energia mecânica (através do transdutor) obtêm-se ciclos de tensão e compressão dentro do líquido, causando a formação de bolhas microscópicas trocando pressões locais na ordem de milhares de atmosferas.
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Figura 6: (a) Unidade de produção de ultrassom, (b) transdutor ultrassônico, (c) sonificador (UNIQUE, 2014).
4.1.4.1.3 Processo de obtenção da SA
A obtenção da SA foi realizada com o equipamento ilustrado na Figura 5. Quando aplicado USom, a macro ponta da Figura 6, era submergida 3 cm dentro do solvente no interior do vaso do UTurrax.
Inicialmente, pesou-se as sementes semi desengorduradas de urucum em balança analítica (Sartorius GMBH, modelo A200S, ± 0,0001 g, Gottingen, Alemanha) no interior de cestas de 7 cm diâmetro x 10 cm de comprimento, fabricados em Poliéster 150 fios por cm2 (Silk Screen Brasil, Campinas, SP).
A massa do etanol PA (Synth, lote 180675, Diadema, SP) também foi pesada para obter razões de S/F de 7,8; 3,9 e 1,6.
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O banho de refrigeração ultratermostatizado (Marconi, modelo MA184, Campinas,SP) foi ligado a 60 °C, enquanto o balão volumétrico com etanol foi submerso no interior do banho até atingir a temperatura de trabalho.
Após isso, foram distribuídas as células com sementes no interior do vaso do UTurrax. Então, o balão foi retirado do banho e assim que todo o conteúdo do etanol do balão foi vertido, ligou-se o UTurrax assistido ou não com USom.
Assim que foram atingidos os 40 min de processamento, tanto o UTurrax como o USom foram desligados, enquanto o banho de refrigeração ultratermostatizado foi programado a -10 °C para ajudar na redução da temperatura do processo.
Assim que a temperatura no interior do vaso encontrava-se entre 30 e 40 °C, a SA era coletada através da válvula ilustrada na Figura 5 (a), determinando o volume da SA. Após isso, colocaram-se as cestas com sementes dentro de um dessecador até atingir peso constante para depois determinar o teor de óleo.
4.1.4.1.4 Determinação do teor de sólidos
Para a determinação do teor de sólidos, tomou-se 40 mL da SA, distribuídos em provetas graduadas de 10 mL de massa conhecida. O conteúdo de cada proveta foi vertido em uma placa de Petri (também de massa conhecida) por vez. Colocou-se as placas de Petri dentro de um dessecador até atingir peso constante. Em seguida, o teor de sólidos resulta da razão da massa de sólidos
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contida na placa de Petri dividido pelo volume de SA que foi vertido no interior da placa.
4.1.4.1.5 Determinação do rendimento de extração
Para determinar a massa de extrato, multiplicou-se o volume da SA obtido no processo de extração (seção 4.1.4.1.3) pelo teor de sólidos (seção 4.1.4.1.4). Conhecido este valor e a massa das sementes semi desengorduradas que foram utilizadas no inicio do processo de obtenção da SA, foi determinado o rendimento de extração através da Equação 2, também utilizada por RODRIGUES (2013).
𝑋0 =
𝑚𝑒𝑥𝑡𝑟𝑎𝑡𝑜
𝑚𝑎𝑚𝑜𝑠𝑡𝑟𝑎× 100 (2)
Onde:
X0 = rendimento global de extração mextrato = massa da SA
mamostra = massa das sementes semi desengorduradas
4.1.4.1.6 Validação do processo de obtenção da SA
Para validar o processamento da obtenção da SA, foi planejada a execução de 6 extrações com replicata distribuídas segundo a Tabela 1.
Os fatores estudados foram: S/F (massa de etanol/massa de sementes semi desengorduradas) assistida ou não por ultrassom. As variáveis respostas foram: o rendimento global X0 (%), teor de óleo nas sementes após a obtenção da SA, rendimento de extração de bixina (%) e fenólicos totais (%).
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Tabela 1: Condições de processamento na obtenção da SA S/F Ultrassom Ultra turrax Ultrassom
1,6 Sem 900 Watts 26000 rpm 2000 mL/min Temperatura 60 °C Tempo = 40 min 800 Watts 19 kHz Temperatura 60 °C Tempo = 40 min 1,6 Com 3,9 Sem 3,9 Com 7,8 Sem 7,8 Com
4.2 Estruturação da Segunda Etapa do trabalho de dissertação
Da mesma forma que foi implementada a primeira etapa do presente trabalho, nesta seção é descrita a estruturação das atividades desenvolvidas na segunda etapa do trabalho de dissertação, conforme observado na Figura 7.
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SA
Fração: lipídica, fenólicos, bixina e outros compostos
SAS
Purificação e formação departículas Condição do processo para 8
experimentos com SA de S/F 1,6: P = 10 e 12 MPa; Vazão SA = 0,5 e 1 mL/min; Vazão do CO2 = 500 e 800 g/h Injeção de CO2 Análise estatistica Rendimento de precipitação Distribuição de tamanho das partículas
Morfologia Conteúdo de bixina
Variáveis de resposta
Conteúdo de fenólicos totais
Segunda Etapa
Testes preliminares com SA de S/F 3,9 e 1,6: P = 10 MPa; Vazão SA = 0,5 mL/ min; Vazão do CO2 = 500 g/h Espectrofotômetro: Absorbância a 487nm (bixina) 760 nm (fenólicos) Bixina - FAO/WHO (2006) - Lei de Lambert-Beer Fenólicos Método Folin-Ciocalteau
Figura 7: Segunda etapa do trabalho de dissertação
4.2.1 Fracionamento com antissolvente supercrítico
Um diagrama esquemático do equipamento empregado para executar os experimentos de precipitação SAS é mostrado na Figura 8. Esta unidade de formação de partículas via SAS esta composta por: 1 Cilindro de CO2; 2 Filtro de CO2; 3 Válvulas de bloqueio; 4 Manômetros; 5 Banho termostático; 6 Bomba de CO2; 7 Banho de aquecimento; 8 Reservatório da SA; 9 Bomba HPLC; 10 Termopar; 11 Coluna de precipitação; 12 Controladores de temperatura; 13 Filtro; 14 Filtro de linha; 15 Válvulas micrométrica com um sistema de aquecimento;16 Frasco de vidro; 17 Rotâmetro com flutuador de vidro e 18 Totalizador de vazão. Esta unidade foi uma modificação elaborada por GOMES et al. (2013), a partir do
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trabalho desenvolvido por SANTOS (2011), a mesma que foi utilizada no desenvolvimento do processo de precipitação e formação de partículas da SA obtida da extração de sementes semi desengorduradas de urucum, com algumas pequenas modificações na unidade que permitiram alcançar os objetivos propostos no presente trabalho.
1 2 3 4 4 5 6 3 3 11 8 15 15 16 17 18 9 10 13 14 12 7
Figura 8: Diagrama esquemático da unidade de precipitação SAS (GOMES, 2013)
4.2.1.1 Modificação 1: Preenchimento do espaço vazio na tampa da coluna de precipitação
A primeira modificação foi realizada na tampa superior da coluna de precipitação (Figura 9), onde foi introduzida uma bucha de teflon para preencher o espaço vazio entre o conector e a tampa (o desenho dentro da linha tracejada é uma projeção da parte interna da tampa, na qual a bucha de teflon foi introduzida).
