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UNIVERSIDADE FEDERAL FLUMINENSE 2004
ROSA MARIA RIBEIRO VIEIRA
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Dissertação apresentada ao Curso de Pós-Graduação em Patologia Experimental da Universidade Federal Fluminense, como requisito parcial para obtenção do grau de mestre.
ORIENTADOR: PROFª. DRA. HELOISA WERNECK DE MACEDO
Niterói, RJ - Brasil 2004
UNIVERSIDADE FEDERAL FLUMINENSE - UFF
PRÓ-REITORIA DE PESQUISA E PÓS-GRADUAÇÃO - PROPP
Este trabalho foi realizado no Departamento de Patologia da Faculdade de Medicina - UFF e no Instituto de Biofísica Carlos Chagas Filho – UFRJ por Rosa Maria Ribeiro Vieira, sob a orientação da Profª Dra. Heloisa Werneck de Macedo.
VIEIRA, Rosa Maria Ribeiro
Amebíase e outras parasitoses intestinais no município de São João do Piauí, PI - Brasil. Niterói, UFF, 2004.
88 f.
Tese - Mestrado
1. Prevalência de enteroparasitoses; 2. Amebíase 3. São João do Piauí
ROSA MARIA RIBEIRO VIEIRA
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Dissertação apresentada ao Curso de Pós-Graduação em Patologia Experimental da Universidade Federal Fluminense, como requisito parcial para obtenção do grau de mestre.
ORIENTADOR: PROFª. DRA. HELOISA WERNECK DE MACEDO
APROVADA EM
BANCA EXAMINADORA
PROF. DRA.
MARIA DA GLÓRIA MARTINS TEIXEIRAPROF. DRA. SILVIA S. B. DE MONDINO
PROF. DRA. REGINA HELENA SARAMAGO PERALTA
Niterói, RJ - Brasil 2004
A meus pais, José Maria e Rosa por terem realizado em mim a frustração de não terem podido estudar.
A meu esposo Nelson e a meus filhos Brunno, Patrícia e Rafael. A Deus Pai, força e referência maior de amor e compreensão.
A
GRADECIMENTOS
E
SPECIAIS
À Professora, Heloisa Werneck de Macedo, minha orientadora, pela presença constante, pela compreensão nos momentos difíceis, por seu espírito científico e, sobretudo, pela amizade dedicada a seus orientandos. Muitos foram os momentos em que os problemas da vida me fizeram pensar em desistir, porém sua força, confiança e ajuda, fizeram com que eu seguisse em frente.
À Professora, Lúcia de Fátima de Meneses Feitosa, pela inestimável colaboração nesse trabalho, pelos ensinamentos, pelas conversas sobre a vida e por todo o carinho a mim dedicado durante o nosso convívio.
A todos os indivíduos do município de São João do Piauí que, anonimamente, tornaram possível a realização desse trabalho.
Amigo – junto de mim silencioso, presente e eloqüente.
A
GRADECIMENTOS
Aos Professores, José Mauro Peralta e Regina Helena Saramago Peralta, pela disponibilidade e ajuda sempre que solicitados.
Ao Thiago Cordeiro pela simpatia e disponibilidade em ajudar.
Às minhas amigas do Laboratório de Imunologia da UFF, Vera Lúcia, Dayse, Maria Marta, Elza, Leonídia, Tania e Ivone, pela força e companheirismo, durante toda essa jornada.
A Maria Odete e Aline minhas companheiras de mestrado.
A Thereza e Alessandra secretárias da Pós-Graduação em Patologia.
Aos Professores e Coordenadores do Curso de Pós-Graduação em Patologia. À Professora, Solange Artimus de Oliveira, que gentilmente cedeu o microscópio de Fluorescência do laboratório de Pesquisa do DIP-HUAP.
A Valéria e Vera Lúcia pela ajuda na execução da técnica de Imunofluorescência. Às Professoras, Eliene e Andréa, pela força e por me substituírem nas aulas.
S
UMÁRIO
DEDICATÓRIA 4 AGRADECIMENTOS ESPECIAIS 5 AGRADECIMENTOS 7 SUMÁRIO 8 LISTA DE FIGURAS 10 LISTA DE TABELAS 11 ABREVIATURAS 12 RESUMO 14 ABSTRACT 15 1 INTRODUÇÃO 16 1.1 AS ENTEROPARASITOSES NO BRASIL... 161.2 O COMPLEXO ENTAMOEBA HISTOLYTICA/ENTAMOEBA DISPAR... 20
1.2.1 O AGENTE... 20
1.2.2 HISTÓRICO... 22
1.2.3 O CICLO EVOLUTIVO... 27
1.2.4 A DISTRIBUIÇÃO GEOGRÁFICA... 29
1.2.5 PATOGÊNESE E MANIFESTAÇÕES CLÍNICAS... 30
1.2.6 O DIAGNÓSTICO LABORATORIAL... 37
1.3 SÃO JOÃO DO PIAUÍ... 43
2 OBJETIVOS 46 3 MATERIAL E MÉTODOS 46 3.1 ÁREA ESTUDADA E AMOSTRAGEM... 46
3.2 QUESTIONÁRIO... 47
3.3 EXAME PARASITOLÓGICO DE FEZES... 47
3.3.1 HOFFMAN, PONS & JANER, 1934... 47
3.3.2 PESQUISA DE COPROANTÍGENOS (E. HISTOLYTICA)... 48
3.3.3 PESQUISA DE ANTICORPOS ANTI-E. HISTOLYTICA/E.DISPAR NO SORO POR IMUNOFLUORESCÊNCIA INDIRETA (IFI)... 49
3.3.4 ANÁLISE ESTATÍSTICA... 51
4 RESULTADOS 52 4.1 PREVALÊNCIA GLOBAL E ESPECÍFICA DAS PARASITOSES INTESTINAIS... 52
4.2 PREVALÊNCIA DE INFECÇÃO ÚNICA E ASSOCIADA... 53
4.3 DISTRIBUIÇÃO DAS PARASITOSES INTESTINAIS POR SEXO... 55
4.4 DISTRIBUIÇÃO DAS PARASITOSES INTESTINAIS POR FAIXA ETÁRIA... 55
4.5 DETECÇÃO DE COPROANTÍGENOS... 56
4.6 DETECÇÃO DE ANTICORPOS NO SORO... 57
4.7 ASSOCIAÇÃO ENTRE PRESENÇA DE E. HISTOLYTICA / E. DISPAR E MANIFESTAÇÕES CLÍNICAS NA POPULAÇÃO ESTUDADA... 59
4.8 ASSOCIAÇÃO ENTRE COMPLEXO E. HISTOLYTICA / E. DISPAR PARASITOSE INTESTINAL E CONDIÇÕES SANITÁRIAS DA POPULAÇÃO ESTUDADA... 60
5 DISCUSSÃO 61 5.1 PREVALÊNCIA GLOBAL E ESPECÍFICA DAS PARASITOSES INTESTINAIS... 61
5.2 DISTRIBUIÇÃO POR SEXO E FAIXA ETÁRIA... 64
5.3 MÉTODOS DIAGNÓSTICO DA AMEBÍASE... 64
5.4 ASSOCIAÇÃO ENTRE PARASITOSES INTESTINAIS E CONDIÇÕES SANITÁRIAS NA POPULAÇÃO ESTUDADA... 69
6 CONCLUSÕES 71
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IGURAS
Figura 1 - Trofozoítas de E. histolytica
(www.dpd.cdc.gov/dpdx/HTML/ImageLibrary/Amebiasis_il.htm
em 19/01/04)... 21
Figura 2 - Cistos de E. histolytica (www.dpd.cdc.gov/dpdx/HTML/ImageLibrary/Amebiasis_il.htm em 19/01/04)... 21
Figura 3 - Ciclo evolutivo da E. histolytica (Haque et al., 2003)... 28
Figura 4 - Sudeste do Piauí (www.citybrazil.com.br/pi/ em 19/01/04)... 44
Figura 5 - São João do Piauí... 44
Figura 6 - Prevalência específica de parasitoses intestinais na comunidade... 53
Figura 7 - Distribuição da infecção por Giardia lamblia por faixa etária... 56
Figura 8 - Distribuição da infecção por Hymenolepis nana por faixa etária... 56
Figura 9 - Método de Imunofluorescência indireta (negativa em cima à esquerda; positiva em cima à direita, em baixo à esquerda e à direita)... 58
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ISTA DE
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ABELAS
Tabela I - Prevalência das parasitoses intestinais na população... 52
Tabela II - Associações parasitárias mais freqüentes... 54
Tabela III - Distribuição das parasitoses intestinais por sexo... 55
Tabela IV - Manifestações clínicas das pessoas positivas para o Complexo
E. histolytica/E. dispar... 59
Tabela V - Origem do abastecimento de água para consumo, das pessoas positivas para o Complexo E. histolytica/E. díspar... 60
Tabela VI - Origem da água consumida pelas pessoas positivas para o
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BREVIATURAS
AL Aglutinação em látex A. lumbricoides Ascaris lumbricoides
CE Ceará
CD “Cluster of differentiation”
C3, C3a, Componentes do Sistema Complemento C3b, C5b-9 Componentes do Sistema Complemento
CIE Contraimunoeletroforese
DIP Doenças Infecciosas e Parasitárias DNA Ácido desoxirribonucleico
E. coli Entamoeba coli E. dispar Entamoeba dispar E. hartmani Entamoeba hartmani E. histolytica Entamoeba histolytica E. moskovskii Entamoeba moskovskii
EIA Ensaio imuno enzimático
ELISA “Enzyme-linked immunosorbent assay” EPF Exame parasitológico de fezes
FIOCRUZ Fundação Instituto Oswaldo Cruz G. lamblia Giardia lamblia
H. nana Hymenolepis nana
HPJ Hoffmann, Pons e Janer
HAI Hemaglutinação indireta
HUAP Hospital Universitário Antônio Pedro
ID Imunodifusão radial
IFI Reação de imunofluorescência indireta
IgM Imunoglobulina M
IgG Imunoglobulina G
IgA Imuniglobulina A
M Molar
MIF Conservante feito com Mercúrio + Iodo + Formol
Neg Negativo
OMS Organização Mundial de Saúde
Perc Percentual
PBS “Phosphate-buffered saline” PCR “Polymerase chain reaction”
PI Piauí
RNA Ácido Ribonucleico RPM Rotação por minuto SNC Sistema Nervoso Central T. trichiura Trichuris. trichiura
UFF Universidade Federal Fluminense UFRJ Universidade Federal do Rio de Janeiro
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ESUMO
Este trabalho é resultado de uma pesquisa para determinar a prevalência das enteroparasitoses e sobretudo da amebíase em indivíduos residentes em áreas urbana e rural do Município de São João do Piauí, onde as condições de higiene e de saneamento básico são precárias, sem água tratada para a maioria dos moradores. Na primeira etapa, foram recolhidas 791 amostras de fezes e constatou-se que 58% dos indivíduos apresentavam um ou mais parasito intestinal, incluindo alguns de interesse médico; na segunda etapa, realizou-se a diferenciação das amebas do Complexo Entamoeba histolytica / Entamoeba dispar em 33 amostras de fezes frescas das 172 amostras positivas, que revelou a prevalência de 39% para a forma patogênica e invasiva – Entamoeba histolytica. A análise de amostras de soro pela técnica de Imunofluorescência indireta para avaliar a possibilidade de ocorrência de casos de amebíase extra-intestinal, revelou que apenas 5% dos soros testados apresentavam títulos de anticorpo anti-Entamoeba histolytica, sugerindo que a colonização por Entamoeba histolytica não necessariamente induz a produção de resposta imune humoral e que a ocorrência de quadros invasivos – o abscesso hepático – não é comum na região.
A
BSTRACT
This work is the result of research to determine the prevalence of enteroparasitosis, particularly amoebiasis, in individual who reside in the rural and urban areas of São João do Piauí municipality where basic sanitary and hygienic conditions are precarious, the water having no types of treatment for the majority of people. In the first step, 791 stools samples were collected and it was confirmed that 58% of the individuals presented one or more intestinal parasites, including some of medical interest; in the second step, a differentiation was made between the amoebas of the Entamoeba histolytica / Entamoeba dispar complex in 33 fresh stool of 172 positive samples which revealed a prevalence of 39% of the pathogenic and invasive form of Entamoeba histolytica. The analysis of serum samples by Indirect Immunofluorescence techinique to evaluate the probability of occurrence of extra-intestinal amoebiasis reveled only 5% of the tested sera suggesting that antibody titles of Entamoeba histolytica do not necessarily colonize the humoral immune response and that invasive events – such as hepatic abscess – are not common in this region.
1
1.1 AS ENTEROPARASITOSES NO BRASIL
As parasitoses intestinais causadas por helmintos e por protozoários afetam no mínimo dois bilhões de pessoas no mundo. Muitos dos indivíduos parasitados apresentam múltiplos parasitos, e a re-infecção é um problema comum (Rossignol, 1998). Representam ainda, nos dias de hoje, um flagelo sobretudo para as populações mais carentes dos países em desenvolvimento incluindo o Brasil, constituindo um grave problema de saúde pública, pelas altas taxas de prevalência e pela estreita correlação com o grau de desnutrição das populações (Grillo et al., 2000). Acometem, principalmente, crianças em idade escolar, podendo comprometer seu desenvolvimento físico e intelectual, pois além de exercerem seus efeitos patogênicos diretos, podem influenciar o estado nutricional, o crescimento e a função cognitiva dos escolares (Santos et al., 1993; Rocha et al.,1994; Ludwuig, et al.,1999 ; Oliveira et. al., 2001; Prado et al.,2001; Ogliari, et al.,2002 ; Saturnino, et al.,2003).
A alta freqüência de episódios de diarréia devido a infecções intestinais é um dos principais fatores que contribuem para a morbidade e mortalidade em crianças, nos países tropicais, o que também contribui para o retardo no desenvolvimento na infância.
Por todos esses fatores, as enteroparasitoses continuam sendo causa importante de morbidade e mortalidade no mundo (De Carli et al.,1997).
O Brasil, devido à sua situação geográfica, às condições climáticas e aos graves problemas sanitários enfrentados por grande parte da população, apresenta índices de parasitoses elevados. A prevalência das enteroparasitoses varia de acordo com a região e com a população estudada (Saturnino et al.,2003). Muitos são os fatores interferentes: a presença de indivíduos susceptíveis, as migrações humanas, as condições ambientais favoráveis de temperatura e umidade (Gatti et al.,1999) e os aglomerados de pessoas que vivem em condições mínimas de qualidade de vida.
Como fatores agravantes, há a falta de saneamento básico, a carência de infra-estrutura, de programas de prevenção e de tratamento para os milhões de pessoas que vivem, muitas vezes em condições sub-humanas. Indivíduos morando nas ruas, nas proximidades de lixões, de valas e sobre esgoto, eliminam seus dejetos nas redondezas de suas habitações, contaminando o solo e as fontes de água utilizadas para suas necessidades mais básicas (De Carli et al.,1997; Becker et. al., 2002). Em resumo, a fome e a miséria absolutas em que vivem muitos dos nossos cidadãos, só propiciam o aumento das taxas de parasitismo, uma vez que as principais vias de transmissão são a fecal-oral e o contato direto com o solo. A prevalência de infecções por parasitos intestinais, é
portanto, considerada um dos principais parâmetros de avaliação do status da saúde pública de uma região, ou mesmo de um país (Gonçalves et al.,1990; Costa-Macedo et al.,1998), as crianças, principalmente as menores de cinco anos refletem bem esta situação, pela maior vulnerabilidade e menor capacidade de deslocamento.
Na transmissão de infecção por geohelmintos, por exemplo, é fundamental que o solo esteja contaminado com material fecal e, portanto, está relacionada com as condições de higiene e de vida das populações urbanas e rurais (De Carli et al.,1997). A infecção pelos helmintos Ascaris lumbricoides (A. lumbricoides, Trichuris trichiura (T. trichiura) e ancilostomídeos está associada à desnutrição protéico-calórica e com o comprometimento no desenvolvimento físico e intelectual das crianças (Pedrazzani et al.,1998 ;Stephenson et al.,1989). Desnutrição em crianças e A. lumbricoides coexistem em muitas partes do mundo (Gupta et al.,1990) e anemia por carência de ferro está associada com a presença de ancilostomídeos (Ferreira et al., 1998).
Muitos estudos indicam uma alta prevalência de parasitoses intestinais nas populações ameríndias (Santos et. al., 1995), onde fatores de ordem ambiental e sócio-cultural como destino inadequado dos dejetos, a qualidade da água sem tratamento, o hábito de andar descalço e estar em contato direto com o solo favorecem a transmissão dos parasitos. O contato com a sociedade nacional é muito variável, existem grupos totalmente isolados e outros em contato permanente. Esse contato acaba determinando um risco às doenças endêmicas locais, incluindo as enteroparasitoses e as que são induzidas pela sociedade contactante (Miranda et. al., 1999).
É necessário conhecer as características, o perfil epidemiológico das diferentes tribos, as questões relacionadas ao modo de vida e as práticas histórico-culturais das populações indígenas para que seja possível traçar um programa de prevenção e tratamento das enteroparasitoses (Fontbonne et. al., 2001).
Inúmeros estudos sobre prevalência de enteroparasitoses têm sido desenvolvidos em creches e escolas, onde a ocorrência de muitos casos demonstra a facilidade com que as crianças se infectam (Becker et al., 2002; Ogliari et al., 2002; Marinho et al., 2002; Ferreira et al., 2003; Saturnino et al., 2003).
Outros estudos mostram também prevalências elevadas de parasitoses intestinais em diferentes regiões do Brasil, tanto em área urbana quanto rural, diferindo, no entanto, em relação à prevalência específica dos parasitos, por região (Ludwig et al., 1999; Tavares-Dias et al., 1999; Oliveira et al., 2001; Alves et al., 2003; Moraes et al., 2003).
No estado do Piauí, por ser grande parte da população de baixa renda, têm-se relatado altas prevalências de parasitoses intestinais, destacando-se a amebíadestacando-se como uma das mais freqüentes (Ramos et al., 2000; Alves et al., 2003; Oliveira et al., 2003).
1.2 O
COMPLEXO ENTAMOEBA HISTOLYTICA/E
NTAMOEBA DISPAR1.2.1 O
AGENTEEntamoeba histolytica (E. histolytica) pertence ao filo Sarcomastigota, classe Sarcodina, ordem Amoebida e gênero Entamoeba. A principal característica da classe Sarcodina é a locomoção e incorporação de alimentos através da emissão de pseudópodes. Cistos e trofozoítas são suas formas evolutivas (Levini et al., 1980; Ravdin, 1995).
O trofozoíta é um endoparasito obrigatório e nesta forma se locomove, alimenta, multiplica e excreta. Varia em tamanho entre 10 e 60 µm de diâmetro, contém um único núcleo com cariossoma central e, freqüentemente, apresenta hemácias, às vezes, leucócitos ou bactérias fagocitados em seu citoplasma. É rico em glicogênio e, ao contrário do cisto que é inerte, apresenta intensa mobilidade. É pleomórfico e obtém energia para sua locomoção através da conversão anaeróbica de glicose e piruvato a etanol. Possui ribossomas com arranjos em forma de hélice, que se agregam formando barras alongadas com bordos arredondados, constituindo os corpos cromatóides. Não possui mitocôndria clássica, retículo endoplasmático rugoso ou complexo de Golgii. (Stanley Jr.,2003)
Possui núcleo vesicular e esférico, medindo entre 4 e 7 µm de diâmetro, contendo uma membrana acromática delicada, revestida por uma camada de pequenos grânulos de cromatina, de tamanho uniforme, em contato uns com os outros ou muito próximos. O cariossoma é central, de pequeno
tamanho, de forma esférica, circundado por uma estrutura acromática como uma cápsula (Stanley Jr, 2003) (Figura 1).
Figura 1 - Trofozoítas de E. histolytica
(www.dpd.cdc.gov/dpdx/HTML/ImageLibrary/Amebiasis_il.htm em 19/01/04)
O cisto infeccioso é a forma de resistência do parasito e a que garante a transmissão da espécie. Tem forma esférica medindo entre 10 e 16 µm de diâmetro, possui de um a quatro núcleos (quatro no cisto maduro). No cisto imaturo, o glicogênio se encontra num vacúolo distinto, tornando-se mais difuso na medida em que o cisto amadurece. Os corpos cromatóides estão presentes no cisto imaturo e desaparecem quando o cisto amadurece. O núcleo tem morfologia semelhante ao do trofozoíta (Diamond & Clark, 1993) (Figura 2).
Figura 2 - Cistos de E. histolytica
1.2.2 H
ISTÓRICODas espécies de amebas que parasitam o intestino humano, a Entamoeba histolytica é,sem dúvida, a mais patogênica com marcante habilidade para lisar tecidos do hospedeiro (Petri, Jr.,2002). Segundo a Organização Mundial de Saúde, a amebíase é definida pela presença da E. histolytica no intestino humano, causando ou não sintomas (WHO, 1997). O homem é seu único hospedeiro (Stanley, Jr.,2003).
A colite e os abscessos hepáticos causados por amebas já eram conhecidos, na antiguidade, e Hipócrates já havia reconhecido quadros clínicos que se correlacionavam perfeitamente com a doença invasiva causada por Entamoeba histolytica (Stanley Jr., 2003). Atribui-se a James Annestey o reconhecimento pioneiro da relação entre disenteria e abscesso hepático . Em 1855, Lambl postulou que amebas nas fezes seriam responsáveis por quadros de diarréia (Petri,Jr., 1996) .
Coube porém ao médico Fedor Aleksandrovich Lösch, em 1875, a descrição da presença de trofozoítas móveis de uma ameba encontrada nas fezes disentéricas e nos tecidos intestinais de um fazendeiro russo falecido após um quadro prolongado de disenteria a que ele denominou de “Amoeba coli” (Petri,Jr.,1996 ; Salles et al.,1998). Fedor Lösch, no entanto, não atribuiu à ameba a causa primária do quadro disentérico pois acreditou que as bactérias eram verdadeiramente a causa primária, e as amebas contribuíam apenas com o agravamento do quadro inflamatório estabelecido (González-Ruiz et al.,1994 ; Jackson, 1998). Ao inocular material fecal do referido paciente em cães, por via
oral, ele conseguiu reproduzir, experimentalmente, a disenteria e demonstrava assim a via de transmissão fecal-oral (Ravdin, 1995).
Vários outros pesquisadores confirmaram as observações do médico russo, porém, sempre associando amebas às bactérias ( Ravdin, 1995).
Councelman e Lafleur, em 1891, descreveram a presença de “Amoeba coli” em pus de abscesso hepático, bacteriologicamente estéril, demonstrando assim o poder patogênico da ameba na ausência de bactérias. Eles chamaram essa ameba de “Amoeba dysenteriae” (Jackson, 1998).
Schaudinn, em 1903, reconheceu a forma cística do parasito e o nome genérico Entamoeba foi então estabelecido. Para a ameba não patogênica, aquela que colonizava o intestino dos indivíduos assintomáticos, ele reservou o nome de Entamoeba coli e para a ameba que produzia disenteria e, portanto patogênica, Schaudin introduziu o nome Entamoeba histolytica denominação bastante apropriada e que até hoje vigora (Jackson,1998).
Walker and Sellards em 1913, documentaram que a forma cística era a forma infectante do parasito e para isso utilizaram voluntários humanos em suas pesquisas. O ciclo biológico foi descrito em 1925 por Dobell (Petri, Jr.,1996), e o primeiro cultivo em meios artificiais foi conseguido por Boeck e colaboradores também no ano de 1925 (Salles et al.,19980).
Em 1925, o parasitologista francês Emile Brumpt, notando a maior incidência da amebíase invasiva em áreas de clima tropical e temperado, propôs que o gênero Entamoeba incluía duas espécies morfologicamente idênticas. Uma delas não patogênica, a qual ele denominou de Entamoeba dispar comumente
encontrada em zonas temperadas, onde se observava alta prevalência de portadores assintomáticos e baixa prevalência da doença. A outra espécie, que ele postulou como sendo patogênica e responsável pela amebíase invasiva, foi denominada Entamoeba dysenteriae e era mais prevalente em zonas tropicais, onde a incidência da doença invasiva era maior (Jackson,1998).
A hipótese de Brumpt não foi bem aceita, na época e pelas cinco décadas que se seguiram, porque ele não conseguiu distinguir morfologicamente as duas espécies de ameba e, também, porque evidências obtidas em trabalhos experimentais em animais e em humanos mostravam que amebas abrigadas por portadores assintomáticos poderiam produzir doença (Diamond & Clarck,1993).
É importante também ressaltar o trabalho de Diamond e de colaboradores, que em 1968, conseguiram cultivar axenicamente a Entamoeba histolytica isto é, o cultivo da ameba livre de associação à qualquer outro microorganismo, o que significou um grande avanço pois permitiu o estudo da biologia celular e da bioquímica do parasito (Diamond, 1968).
Reeves e Bischoff através de um estudo eletroforético qualitativo, avaliando cinco enzimas amebianas, conseguiram demonstrar diferenças nos padrões enzimáticos entre variadas cepas, utilizando para isso amebas de vida livre , amebas de répteis e E. histolytica . Este estudo significou a primeira evidência bioquímica consistente, da diferenciação de cepas deste importante grupo de organismos (Reeves & Bischoff, 1968).
Na década de 70, Sargeaunt e colaboradores expandindo e refinando o trabalho de Reeves e Bischoff conseguiram demonstrar diferenças nos padrões enzimáticos das amostras obtidas de pacientes assintomáticos e de pacientes com manifestações clínicas da amebíase, designados zimodemos não patogênico e patogênico respectivamente. Desta forma provaram que Emile Brumpt tinha razão ao afirmar que existência de duas espécies distintas de amebas possuindo microscopicamente a mesma morfologia (Sargeaunt et al., 1978 ; Sargeaunt & Williams, 1979 ; Jackson, 1998).
Egbert Tannich e colaboradores na Alemanha, provaram por análise do DNA que isolados patogênicos de Entamoeba histolytica eram geneticamente distintos dos isolados não patogênicos e portanto representavam formas geneticamente diferentes (Tannich et al.,1989).
O debate sobre a existência de duas espécies de amebas morfologicamente idênticas foi resolvido em um encontro satélite realizado em janeiro de 1997, na cidade do México , o XIII Seminar on Amebiasis , que com a aceitação da comunidade científica presente concluiu que os estudos bioquímicos, imunológicos e genéticos apontavam na direção da existência de duas espécies. A Entamoeba histolytica foi então re-classificada como duas espécies de protozoários parasitas do intestino humano: Entamoeba histolytica propriamente dita, patogênica e invasiva, e Entamoeba dispar não patogênica e não invasiva (Espinosa-Cantellano, et al., 1998).
A distinção entre as duas espécies irá, gradualmente mudar nosso conceito sobre a epidemiologia, o controle e o tratamento da amebíase. Até recentemente, dois dos mais enigmáticos aspectos da biologia da Entamoeba
histolytica foram sua inexplicada variabilidade de potencial patogênico e a restrição da amebíase invasiva a determinadas áreas geográficas apesar da distribuição mundial do parasito. O principal debate era centralizado na existência ou não de duas espécies de Entamoeba histolytica. A técnica baseada na análise de bandas padrão, após eletroforese em gel, das enzimas hexoquinase e fosfoglicomutase, revelou que a amebíase invasiva é produzida por cepas que têm padrão isoenzimático característico (zimodemos) distinto daquele obtido em amebas abrigadas por muitos dos portadores assintomáticos (Sargeaunt et al., 1978). Além disso, anticorpos monoclonais reconhecem especificamente as amebas patogênicas (Gonin & Trudel, 2003).
Entretanto, resultados mostrando a conversão de zimodemos não patogênicos em patogênicos, durante o processo de axenização, reacendeu a discussão da existência ou não de duas espécies, uma não patogênica para o intestino humano e sob condições desconhecidas transformando-se na outra patogênicos para o hospedeiro.( Mirelman et al.,1986)
Mais recentemente, a aplicação da biologia molecular tem fornecido evidências que confirmam variações distintas entre os genomas das duas espécies ( Diamond & Clark, 1993; González-Ruiz et al., 1994; Petri, Jr., 1996; Jackson, 1998; Salles et al., 1998; Stanley Jr., 2003).
1.2.3 O
CICLO EVOLUTIVOE. histolytica tem um ciclo biológico simples, existindo sob a forma de cistos infectantes e de trofozoítos amebóides. (Stanley, 2003).
A infecção tem início quando o homem ingere a forma cística madura da E. histolytica que contém quatro núcleos, através de água, alimentos ou mãos contaminadas por fezes, ou ainda por contato direto pessoa a pessoa. A forma cística ingerida passa pelo estômago resistindo à acidez do órgão, chega ao intestino, onde na porção terminal do intestino delgado ou no início do intestino grosso (região íleo-cecal), sofre desencistamento. Esse processo ocorre por lise de suas paredes na presença dos sucos digestivos alcalinos e neutros, em temperatura de 37ºC e anaerobiose. Cada cisto tetranucleado dá origem, por divisão nuclear seguida de divisão do citoplasma, a oito trofozoítas metacísticos. Estes trofozoítas amebóides são, então, arrastados por toda a extensão do intestino grosso até o cólon. Aí se estabelecem aderindo à camada de mucina que recobre o epitélio intestinal e ingerem bactérias e partículas nutritivas do meio, reproduzindo por divisão binária e encistando, completando assim seu ciclo biológico, quando os cistos são eliminados nas fezes para infectar novos indivíduos (Espinozza-Cantellano & Palomo, 2000; Que & Reed, 2000; Eichinger, 2001; Haque et. al., 2003) (Figura 3).
1.2.4 A
DISTRIBUIÇÃO GEOGRÁFICAA amebíase é uma doença mundialmente disseminada, mas com maior freqüência em grupos sócio-econômicos menos favorecidos, indivíduos institucionalizados, homossexuais masculinos, imigrantes de áreas endêmicas e viajantes para regiões de alta endemicidade. Em países desenvolvidos, é mais comum em imigrantes e viajantes provenientes do terceiro mundo seguido por homossexuais masculinos e imunossuprimidos (Gatti et. al., 1995; Petri Jr. & Singh, 1999; Shamsuzzaman et al., 2000a; Stanley, 2003). As áreas de incidência mais elevada são aquelas onde o saneamento é inadequado e grande número de pessoas vivem aglomeradas. Incluem muitos países, em desenvolvimento, nos trópicos, principalmente, México, Índia, nações das Américas Central e do Sul, Ásia tropical e África (Huston, et al.,1999; Hughes, 2000).
Na sua forma invasiva, atinge cerca de 50 milhões de pessoas em todo o planeta ocasionando entre 40 a 100 mil mortes anuais (Walsh, 1986).
Nos estudos epidemiológicos realizados em diferentes partes do mundo, a soroprevalência encontrada, em comunidades de países em desenvolvimento, varia de 5 a 50% (Sánchez-Guillén et al., 2002).
Por ser o Brasil um país muito grande, ainda não se tem uma estimativa da prevalência da amebíase no território nacional. A presença do Complexo E.histolytica / E.dispar tem sido relatada em vários estados como Rondônia (Giraldi et al., 2001; Orlandi et al., 2001), Amazonas (Nozaki et al., 1990; Miranda et al., 1999); Pará (Miranda et al., 1998); São Paulo (Ferreira et al., 1994; Ludwig et al., 1999); Minas Gerais (Rocha et al., 1994; Rezende et al.,
1997; Rocha et al., 2000); Piauí (Oliveira et al., 2001; Alves et al., 2003); Ceará (Braga et al., 2001a; Braga et al., 2001b) e Rio de Janeiro (Macedo, 1996). Nos estudos de prevalência tem sido utilizados diferentes métodos diagnósticos como exame parasitológico de fezes (EPF) (Oliveira et al., 2001; Alves et al., 2003), pesquisa de antígenos nas fezes (Braga et al., 2001a; Braga et al., 2001b) e pesquisa de anticorpos no soro (Braga et al., 1996).
1.2.5 P
ATOGÊNESE E MANIFESTAÇÕES CLÍNICASApesar da infecção por E. histolytica ter caráter cosmopolita, não se observa uma relação estreita entre prevalência e patogenicidade. É assintomática em cerca de 90% dos casos, mas, no entanto, é a segunda causa de morte por protozoários no mundo, superada apenas pela malária (WHO, 1997; Petri, Jr. & Singh, 1999; Que & Reed, 2000; Moncada et al.,2003).
O espectro clínico da amebíase envolve quadros extremos que variam desde quadro assintomático até colite amebiana fulminante, ou ainda necrose hepática que pode determinar a morte do hospedeiro. Ainda ocorrem os quadros intermediários que são os mais comuns (Rey, 2001).
O habitat natural da E. histolytica é o intestino grosso humano. O ambiente da luz intestinal é propício para a convivência pacífica da ameba com seu hospedeiro, onde ela pode se alimentar e se encistar para dar continuidade ao seu ciclo biológico.
A infecção na maioria das vezes é autolimitada e assintomática (Haque et al., 2003), e os trofozoítas colonizam o intestino grosso por aderência a
glicoproteínas presentes na mucina do cólon (Petri, Jr., 1999) que é uma barreira de defesa à invasão de patógenos.
A E. histolytica é um patógeno potente (Stanley, 2003) e uma das mais importantes células citotóxicas conhecidas (Mc Coy et al., 1994). Exibem também uma extraordinária capacidade citolítica (Leippe, 1997). É capaz de lisar “in vitro” uma grande variedade de células em cultura, como Polimorfonucleares Neutrófilos, Macrófagos e Linfócitos T (Petri, Jr., 1996; Stauffer & Ravdin, 2003).
Existem três fases distintas e separadas na patogênese da amebíase intestinal: colonização; ruptura e/ou dissolução da camada de muco que recobre a mucosa intestinal para ganhar acesso ao epitélio; ligação a células epiteliais do cólon do hospedeiro e citólise das mesmas (Moncada et al., 2003).
Por razões desconhecidas, em determinadas condições, a E. histolytica abandona a sua condição de comensal, degrada a camada de muco que reveste o cólon e ganha acesso ao epitélio intestinal. Lesa e causa erosão na submucosa, formando úlceras características em forma de “botão de camisa” (Que & Reed, 2000) e, em casos mais raros, lesa também a camada muscular. Através dessa camada entra na circulação portal, atinge o fígado, e através da circulação geral se dissemina para outros órgãos moles como o pulmão, o cérebro, o pericárdio, etc. (Eichinger, 2001).
Para que E. histolytica exerça seu potencial patogênico sobre as células do hospedeiro, é necessário que se estabeleça um contato direto entre moléculas de adesão da superfície da ameba e receptores específicos nas células do hospedeiro. Estas moléculas são respectivamente uma lectina de 260 KDa e
Glicoconjugados (Glicoproteínas e Glicolipídeos) contendo resíduos expostos de Galactose e N-Acetil-D-Galactosamina. A patogenia da amebíase é portanto contato-dependente (Haque, 2003; Stauffer & Ravdin, 2003).
A lectina é uma molécula central no processo de colonização, encistamento e invasão da E. histolytica (Petri Jr., 2002; Ravdin et al., 2003). Experimentos mostraram que células de mamíferos que não expressam resíduos de Galactose ou N-Acetil Galactosamina são resistentes à morte por E. histolytica (Stanley, 2003) e que a inibição de lectina torna a ameba incapaz de aderir e de lisar as células do hospedeiro. (Ravdin et al., 1980; Li et al., 1988; Dodson et al., 1999; Ravdin, 2003). Esta lectina é uma molécula glicoprotéica heterodímera de 260 KDa que reconhece resíduos de Galactose e N-Acetil-D-Galactosamina. É um importante fator de virulência da ameba, mediando aderência ao epitélio intestinal e citólise dependente de contato. A molécula consiste de uma sub-unidade pesada de 170 KDa e uma leve de 31 ou 35 KDa ligadas por pontes de dissulfeto (Yau et al., 2001). Adicionalmente, uma subunidade intermediária da lectina de 150 KDa também contribui para a aderência (Tachibana et al., 2003).
A patogênese da amebíase requer aderência ao epitélio intestinal, efeitos citolíticos e proteolíticos da ameba sobre os tecidos e resistência do parasito aos mecanismos de defesa do hospedeiro (Hughes & Petri, Jr., 2000).
Estudos mostram que a morte celular, na amebíase invasiva, ocorre inicialmente por necrose lítica mediada pelos amebaporos, pequenos peptídeos localizados nos grânulos citoplasmáticos, secretados pela ameba após contato, e que são capazes de se inserir na membrana das células e de formar poros nessas membranas, numa ação semelhante a dos Linfócitos T citotóxicos. Os grânulos
citoplasmáticos também contém lisozimas, fosfolipases, cisteino-proteinases e proteínas que ligam Cálcio (Leippe, 1997; Yan & Stanley, Jr., 2001).
No entanto, um outro mecanismo de morte celular ocorre principalmente no abscesso hepático amebiano. É a apoptose ou morte celular programada, um sistema seqüencial de morte das células, executada por degradação de vários componentes celulares. E.histolytica ativa a apoptose por ativação da Caspase 3, um componente crítico na fase efetora da via apoptótica (Yan & Stanley, Jr., 2001).
As cisteínoproteases secretadas pela ameba dentro do microambiente são também fatores importantes de virulência na doença causada por E. histolytica, pois degradam a matriz extra-celular, separando as células facilitando a invasão (Moncada et al., 2003). Degradam Imunoglobulina A (IgA) (Kelsall et al., 1993) e Imunoglobulina G (IgG) (Haque et al., 2003; Que & Reed, 2003), componentes da resposta imune humoral. As cisteínoproteases também estão envolvidas no recrutamento de células inflamatórias para o local da invasão (Moncada et al., 2003). Ativam complemento por via alternativa, por clivagem direta da cadeia alfa de C3 (Reed et al., 1989), mas degradam C3a e C3a, anafilatoxinas geradas pela ativação da cascata do complemento (Que & Reed, 2003).
E. histolytica é resistente à lise pelo Complexo de ataque à membrana, formado pelos componentes terminais da cascata do complemento C5b – 9. Essa resistência é mediada pela lectina da ameba, que compartilha similaridade estrutural e antigênica com o CD59, um inibidor de C5b-9 em células sangüíneas humanas (Braga et al., 1992). A lectina é portanto uma proteína
multifuncional, cuja atividade é crucial para a citotoxicidade da ameba (McCoy et. al., 1994).
Resumidamente, os fatores ligados ao parasito, ao hospedeiro e à microbiota, que concorrem para que a ameba assuma ou não um perfil invasivo, são o perfil genético e imunoenzimático do parasito, os fatores do hospedeiro (idade, estado nutricional, competência do seu sistema imunológico), os mecanismos que o parasito utiliza para escapar das defesas do hospedeiro e a modulação que a microbiota pode exercer sobre a virulência do parasito (Salles et al., 1998).
A decisão por invadir é uma ameaça à vida do hospedeiro, mas é uma atitude suicida da ameba, pois não há evidências de que ela volte a se encistar após invadir, e se isso ocorresse, como estes cistos continuariam sendo eliminados para dar continuidade ao ciclo? Certamente, ao invadir, ela ou morre pelo tratamento específico do hospedeiro, ou morre com ele ao determinar quadros fatais (Stauffer & Ravdin, 2003).
As principais manifestações clínicas da amebíase são a colite amebiana disentérica, a colite amebiana não disentérica e o abscesso hepático amebiano. Esses quadros são caracterizados por lesões inflamatórias e ulcerativas do cólon e por abscessos (Stanley Jr., 2003). Felizmente, a maior parte dos portadores de E. histolytica não desenvolvem quadros invasivos mesmo os de área endêmica (Blessmann, et al., 2003).
Tipicamente os pacientes com colite amebiana se apresentam com história de dor abdominal em cólica por várias semanas, perda de peso, diarréia
aquosa e sanguinolenta, tenesmo, febre e manifestações dispépticas. O início é insidioso, os sinais e sintomas são variáveis, tornando difícil o diagnóstico. Febre e fezes sanguinolentas estão ausentes em muitos dos casos (Haque et al., 2003).
Os diagnóstico diferencial de uma doença diarréica com sangue oculto ou aparente nas fezes, deve incluir infecção bacteriana por Shigella spp, Salmonella spp, Campylobacter spp, Escherichia coli enteroinvasora e enterohemorrágica, e ainda causas não infecciosas como a doença inflamatória intestinal, a colite isquêmica, as malformações artério-venosas e a diverticulite (Stanley, 2003).
A colite amebiana pode ser disentérica e não disentérica. A colite disentérica tem um período de incubação que varia de dias a meses. O quadro clínico se apresenta de forma aguda e os principais sintomas são: diarréia com fezes líquidas, muco-sanguinolentas e dependendo da gravidade, muco-pio-sanguinolentas, com vinte ou mais evacuações diárias. Dor epigástrica, plenitude, pirose e flatulência também podem estar presentes. (Salles et. al., 1998; Haque et. al., 2003).
A colite não disentérica é a forma observada com maior freqüência. Tem início insidioso, com crises de diarréia com menor número de evacuações que a forma anterior, fezes moles ou pastosas acompanhadas de dor em cólica, podendo ou não conter muco ou sangue, flatulência e desconforto abdominal. As crises se intercalam com períodos de diarréia e de constipação intestinal, dor e sensação de plenitude.
Alguns indivíduos podem ainda desenvolver um quadro fulminante de colite, com diarréia sanguinolenta profusa, febre, dor abdominal disseminada, sinais de irritação peritoneal e leucocitose. O índice de perfuração intestinal, nesses casos, é muito alto. Gestantes, pacientes imunossuprimidos por uso de corticóides e indivíduos imunocomprometidos, são pacientes que se encontram numa faixa de risco aumentada para a colite fulminante. Uma outra complicação da colite amebiana é o megacólon tóxico (Adams & Mac Leod, 1977; Petri and Singh, 1999; Stanley Jr., 2003; Haque et. al., 2003).
O abscesso hepático amebiano é das manifestações clínicas extra-intestinais a mais comum. Provavelmente, a ameba atinge o fígado por disseminação pela via hematogênica e/ou linfática. Alguns indivíduos apresentam, simultaneamente, o quadro de colite mas não é comum o indivíduo com abscesso hepático apresentar sintomatologia intestinal concomitante. O mais comum é o indivíduo relatar durante a anamnese, episódios de diarréia recentes (Stanley Jr, 2003). A doença hepática amebiana deve ser suspeitada em indivíduos com história de exposição ao parasito, como moradia e viagens para áreas endêmicas, ou imigrantes provenientes de áreas endêmicas e que apresentem febre, dor no hipocôndrio direito e perda de peso (Haque, 2000).
O abscesso hepático é dez vezes mais comum em homens adultos jovens, entre 20 e 40 anos, do que em mulheres, e é pouco comum em crianças, apresentando distribuição homogênea por sexo. Não se sabe por que o abscesso hepático afeta mais homens do que mulheres, uma das possíveis explicações é o uso abusivo do álcool (Hughes et al., 2000).
Na maioria dos casos, o abscesso é único e localizado no lobo direito do fígado, enquanto os piogênicos são múltiplos. (Hughes et al., 2000)
Na forma aguda, o abscesso hepático se apresenta com febre e dor abdominal localizada no hipocôndrio direito e hepatomegalia. Na forma sub-aguda, a perda de peso é um dado importante, enquanto que a febre e a dor são menos freqüentes.
Deve ser feito o diagnóstico diferencial com abscessos piogênicos, cisto hidático e hepatoma. (Petri & Singh, 1999). Abscesso pulmonar, cerebral, pericárdico e amebíase cutânea são manifestações extra-hepáticas menos comuns (Haque, 2003).
1.2.6 O
DIAGNÓSTICO LABORATORIALApós o reconhecimento do complexo formado pela E. histolytica patogênica e invasiva e pela E. dispar comensal do intestino humano, a OMS recomendou que a E.histolytica deve ser identificada por testes específicos e que os pacientes por ela infectados, sejam eles sintomáticos ou assintomáticos, devem ser tratados (WHO, 1997).
O diagnóstico laboratorial da amebíase compreende uma variedade de testes que, individualmente ou em conjunto, objetivam identificar corretamente a E. histolytica. Os testes disponíveis utilizam materiais biológicos e metodologias diferentes onde cistos, trofozoítos, antígenos da superfície da ameba, antígenos recombinantes, anticorpos produzidos contra antígenos amebianos e as características bioquímicas e genéticas das cepas são pesquisados.
No Brasil e nos demais países em desenvolvimento, a amebíase é mais comumente diagnosticada através do EPF baseado na identificação microscópica, utilizando critérios morfológicos de cistos e trofozoítos de amebas em amostras de fezes (Haque et. al., 2003), técnica que certamente diagnosticou e ainda é capaz de diagnosticar muitos casos de colite amebiana, quando utilizados por profissionais qualificados e treinados (Stanley, Jr., 2003).
Diferentes métodos podem ser utilizados no EPF. O método direto não requer concentração, pode ser útil para a identificação do trofozoíta vivo presente em fezes diarréicas, e a observação de eritrócitos fagocitados, no seu interior, permite a distinção entre E. histolytica e E. dispar. Esse material deve ser posteriormente corado, para melhor visualização das estruturas. Dois métodos de coloração são recomendados: hematoxilina férrica e tricrômica (De Carli, 2001). Para a identificação da forma cística, geralmente, presente em fezes moldadas, métodos de concentração devem ser utilizados como: sedimentação espontânea (Hoffman et al.,1934) ou por centrifugação e flutuação com sulfato de Zinco (Faust et al., 1938).
A cultura da E. histolytica seguida da análise eletroforética do perfil de algumas isoenzimas introduzida por Sargeaunt e Williams, em 1978, foi o primeiro método laboratorial capaz de diferenciar com precisão E. histolytica de E. dispar (Huston et. al., 1999) e é considerada “padrão ouro” para o diagnóstico diferencial da amebíase (Abd-Alla et al., 1993; Gonin & Trudel, 2003). A metodologia apresenta limitações que podem se traduzir em falsos resultados negativos. Além disso, não é um método prático e muito menos rápido para o diagnóstico, já que requer entre uma e várias semanas para se completar e
necessita de aparelhagem apropriada. Isso limita sua utilização, em países em desenvolvimento, onde os recursos são escassos e ocorre a maioria dos casos de amebíase invasiva (Haque et. al., 1997; Huston et al.,1999). A cultura é mais sensível que o exame parasitológico de fezes, a análise de isoenzimas diferencia as duas espécies do complexo (González-Ruiz et al., 1994). Porém, falsos resultados negativos são observados em amostras positivas pela microscopia. Duas possíveis explicações são a demora no processamento das amostras, pois os trofozoítas não resistem por muito tempo no meio externo e o uso de terapêutica anti-amebiana anterior à coleta da amostra (Haque et. al., 1998).
Outros testes utilizados no diagnóstico da amebíase se baseiam em reações imunológicas onde são pesquisados antígenos da E. histolytica e anticorpos produzidos pelo organismo contra estes antígenos. Enquanto a pesquisa do antígeno é útil para determinar a prevalência da infecção, os testes sorológicos fornecem experiência cumulativa da infecção por E. histolytica na população. A pesquisa do antígeno é baseada nas diferenças antigênicas entre as lectinas da E.histolytica e da E.dispar e é realizada por um ensaio imunoenzimático que utiliza anticorpos monoclonais para epítopos antigênicos da E. histolytica (Haque et al.,1997). O antígeno em questão é a lectina de adesão específica de galactose e N-acetil-galactosamina. É um método sensível, específico, capaz de diferenciar a forma invasiva da forma não invasiva (Haque et. al., 1999), padronizado para detectar antígenos em amostras de fezes (coproantígenos). Foi também utilizado com sucesso, na pesquisa de antígeno circulante, no soro de indivíduos com diagnóstico confirmado de abscesso
hepático amebiano, antes do início do tratamento, onde os autores detectaram antígeno em 22 (96%) de 23 casos de abscesso hepático (Haque et. al., 2000).
Anticorpos séricos desempenham um papel importante no diagnóstico da forma hepática da amebíase, quando a maioria dos pacientes não apresenta antígeno nas fezes (Petri, Jr & Singh, 1999). São marcadores de infecção corrente ou passada (Haque et. al., 1999) e também distinguem infecção por E. histolytica, pois a presença da E. dispar, no organismo, não induz resposta imune. Diversos testes utilizando metodologias diferentes ajudam no diagnóstico sorológico da amebíase. São eles: a hemaglutinação ativa indireta (HAI), os ensaios imunoenzimáticos (EIA), a imunofluorescência indireta (IFI), a aglutinação em látex (AL), a imunodifusão em gel (ID), a contraimunoeletroforese (CIE), etc. sendo EIA, IFI e HAI os mais utilizados. Todos detectam anticorpos específicos contra antígenos amebianos e são marcadores de doença invasiva. A principal desvantagem destes testes é que eles podem permanecer positivos por anos, após a infecção (Hughes & Petri, Jr., 2000). As diferenças entre sensibilidade e especificidade dos diferentes métodos dependem dos antígenos, dos conjugados e dos procedimentos por diferentes laboratórios, levando a uma grande diversidade de resultados (Carvalho et al.,1994). O HAI, teste rápido de baixo custo e de fácil execução, tem alta sensibilidade e especificidade, preenchendo assim os requerimentos para investigação epidemiológica (Hira et. al.,2001) e tem sido o mais utilizado na rotina diagnóstica da amebíase (Roche & Benito,1999). Os testes imunoenzimáticos têm sensibilidade e especificidade comparadas a HAI sendo os métodos de escolha em muitos laboratórios. A ID é específica, porém, menos sensível que a HAI e o EIA e requer mais tempo para
se completar. Atualmente existem kits comerciais para detecção de anticorpos para a E. histolytica pelas metodolgias HAI, EIA e ID. Os métodos sorológicos tem sido limitados pela utilização de preparados antigênicos brutos não bem definidos. O maior problema dos testes que pesquisam anticorpos séricos utilizando antígenos totais da E. histolytica é que nas áreas de alta endemicidade, os indivíduos podem permanecer positivos por anos, após a infecção, o que não ocorre quando o antígeno é a lectina de adesão da ameba. Um trabalho conduzido, na África do Sul, com este antígeno mostra que os anticorpos anti-lectina parecem ter vida curta e sugerem que este é o teste sorológico mais específico para a amebíase invasiva aguda (Haque et al,2000).
A detecção de anticorpos da classe Imunoglobulina M (IgM) pode constituir uma estratégia importante para um diagnóstico precoce da amebíase. A regressão dos anticorpos IgM anti-lectina no soro acontece por volta do terceiro mês, em cerca de 50% dos casos (anticorpo de fase aguda que não permanece detectável por muito tempo no soro), e o seu reaparecimento ou aumento tardio dos títulos, representa um importante fator prognóstico (agudização ou re-infecção) (Abd-Alla et al., 1998). Esses mesmos autores, dois anos depois, apontaram a pesquisa de antígeno (lectina) e de anticorpos IgG e IgA na saliva, como uma outra alternativa diagnóstica.
Vários métodos baseados na reação em cadeia da polimerase (PCR) que amplificam e detectam o DNA da E. histolytica em amostras de fezes têm sido desenvolvidos, com semelhante sensibilidade e especificidade à da cultura, seguida pela análise isoenzimática (Huston et al.,1999). A PCR é, porém, muito mais sensível do que a pesquisa do antígeno nas fezes, quando amplifica
genes do ácido ribonucleico (RNA) ribossômico e quando a fonte do DNA e de antígeno são trofozoítas em cultura (Haque et al.,1998; Huston et al,1999). Quando comparado com a detecção do parasito nas fezes, método mais utilizado na rotina diária, ambas as técnicas parecem ter a mesma sensibilidade (Haque et al., 1998). Avanços nas técnicas de PCR fazem deste método uma outra possibilidade diagnóstica, principalmente, quando se necessita fazer a genotipagem das cepas (Stanley, Jr., 2003). A PCR multiplex, por exemplo, é uma metodologia capaz de amplificar simultaneamente dois fragmentos de DNA espécie específicos utilizando dois pares de iniciadores “primers”. A amplificação genética por PCR de genes nos quais existe polimorfismo entre duas espécies permite a diferenciação do patógeno do não patógeno (Pillai & Kain, 2000). A grande dificuldade reside na purificação de quantidades suficientes de DNA genômico de boa qualidade. A fonte é invariavelmente fezes, onde contaminantes e inibidores de amplificação persistem. Soma-se a isso o fato de que significante porção do DNA genômico da Entamoeba se encontra encapsulado, na forma cística, o que não é de fácil purificação (Pillai et al., 2001). A PCR tem como desvantagem o fato de ser cara, trabalhosa, demorada, e não disponível para uso em países em desenvolvimento onde a amebíase é prevalente e representa um grave problema de saúde coletiva (Haque et al.,1998).
Pelo amplo espectro clínico da amebíase, envolvendo desde portadores assintomáticos, até quadros graves e fatais de doença intestinal, extra-intestinal e pelas características do parasito e do hospedeiro, todos os testes disponíveis (desde a microscopia até a genética, passando pelos bioquímicos e imunológicos) têm sua importância e suas limitações e nenhum deles,
isoladamente, é capaz de fechar um diagnóstico de amebíase nas suas diferentes formas de expressão clínica. Talvez, os que mais se aproximem da meta de serem marcadores únicos sejam a detecção de trofozoítas hematófagos nas fezes e a detecção de antígeno sérico por ELISA e/ou por PCR, para os quadros de colite e de amebíase extra-intestinal respectivamente.
1.3 S
ÃOJ
OÃO DOP
IAUÍO Município de São João do Piauí está localizado ao Norte do Parque Nacional da Serra da Capivara, na Região Sudeste do Estado do Piauí (Figuras 3 e 4), importante pólo turístico do Estado, por conter vários sítios arqueológicos. Possui uma área territorial de 1488 km², de clima tropical semi-árido quente. A população é estimada em 18.000 habitantes, distribuídos entre área urbana (14.000) e área rural (4.000). A taxa de emigração é alta no Município, explicada pela busca de trabalho e de um melhor sistema de educação. O sistema econômico é constituído por atividades agrícola, pecuária e avicultura, e, em menor escala, por apicultura e indústria de confecção (www.citybrazil.com.br/pi/sjoaopiaui/).
As condições sócio-econômicas da área rural são baixas: faltam saneamento básico e reservatórios de água adequados. O abastecimento de água é feito através de poços comunitários e de açudes. Poucas famílias utilizam água filtrada. A maioria das casas não possui fossas ou latrinas e as fezes são depositadas nos terrenos próximos às residências. A falta de hábitos de higiene e de saneamento básico aumenta muito o risco associado a várias parasitoses entre as quais, a amebíase, principal objetivo do nosso estudo, onde água e
alimentos contaminados por fezes, são a principal via de transmissão da parasitose.
Figura 4 - Sudeste do Piauí (www.citybrazil.com.br/pi/ em 19/01/04)
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¾ Determinar a prevalência das parasitoses intestinais, nos residentes do município de São João do Piauí, sudeste do Piauí.
¾ Investigar, pela pesquisa do coproantígeno, a existência de casos de Entamoeba histolytica na população em estudo.
¾ Correlacionar a ocorrência de amebíase às manifestações clínicas da doença. ¾ Investigar, pela pesquisa de anticorpos, através da técnica de Imunofluorescência indireta, a possível ocorrência de amebíase extra-intestinal, na população estudada.
¾ Correlacionar dados de prevalência das enteroparasitoses às condições sanitárias da população estudada.
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3.1 Á
REA ESTUDADA E AMOSTRAGEMO inquérito coproparasitológico foi realizado, em janeiro de 2002, em um total de 791 indivíduos com idades entre 2 meses e 82 anos, residentes nas áreas rural e urbana do município de São João do Piauí.
Após serem esclarecidos os objetivos do projeto, foi obtido o consentimento informado dos adultos participantes e dos responsáveis por famílias que tinham crianças e deficientes.
Cada participante recebeu um frasco contendo formol a 10% para coleta de fezes e as amostras foram recebidas, no laboratório municipal, onde foram submetidas ao método de sedimentação espontânea de Hoffman, Pons & Janer – HPJ (Hoffman et al., 1943).
Após o exame parasitológico de fezes, os 172 indivíduos que apresentavam o complexo E. histolytica / E. dispar nas fezes, foram convocados para uma nova coleta de fezes frescas e coleta de sangue, com o objetivo de
realizar a pesquisa de coprontígeno e de anticorpos anti-E. histolytica. Foi coletado um total de 100 amostras de sangue, mas apenas 33 indivíduos entregaram o material fecal solicitado para a pesquisa de coproantígeno.
3.2 Q
UESTIONÁRIOFoi aplicado pelos profissionais de saúde participantes do projeto, um questionário para coletar dados como idade, sexo, condições de moradia, fontes de abastecimento de água, sinais e sintomas freqüentes em indivíduos com enteroparasitose (Modelo em anexo). Um total de 165 pessoas respondeu o questionário, sendo que somente 41 dos 172 indivíduos que apresentaram EPF positivo para E. histolytica / E. dispar e 3 dos 13 positivos na pesquisa do coproantígeno.
3.3 E
XAME PARASITOLÓGICO DE FEZES3.3.1
H
OFFMAN, P
ONS& J
ANER, 1934
As fezes contidas no frasco coletor contendo Formol 10% foram inicialmente homogeneizadas. De cada material fecal, foi preparada uma suspensão aquosa (1:10). A suspensão foi então filtrada para cálice de sedimentação, usando-se gaze dobrada e adicionada com água até que o nível do líquido ficasse a aproximadamente dois centímetros da borda do cálice. Após sedimentação por duas horas, foi feita a leitura de duas lâminas do sedimento colocado entre lâmina e lamínula.
3.3.2 P
ESQUISA DE COPROANTÍGENOS(E.
HISTOLYTICA)
Foram analisadas pelo teste imunoenzimático para detecção rápida da Adesina (lectina) da E. histolytica, de acordo com o fabricante, 33 amostras de fezes frescas conservadas em freezer a -20ºC até o momento de sua utilização (Entamoeba histolytica II – Tech. Lab. Inc., Blacksburg, Virgínia, USA).
Os testes foram realizados em microplacas cujas cavidades são revestidas com anticorpos policlonais que se ligam à adesina do Complexo E. histolytica /E. dispar. A cada uma das cavidades utilizadas foi adicionada uma gota do conjugado (anticorpo monoclonal ligado à peroxidase específica para a adesina da E.histolytica) e em seguida foram adicionados 200µl dos controles positivo e negativo nas cavidades correspondentes e 200µl das amostras de fezes diluídas nas cavidades teste (de 0,5 a 0,20g de fezes em 400µl do diluente de amostra). A placa foi coberta por adesivo próprio e incubada em temperatura ambiente por 2 horas, ao final deste tempo, lavada com a solução de lavagem utilizando-se pipeta multicanal, repetindo-se a etapa por 4 vezes, ou até que a placa tenha ficado absolutamente livre de qualquer partícula fecal. Os resíduos líquidos foram removidos batendo-se a placa sobre folha de papel toalha seca, até a eliminação total do líquido. Foram adicionadas 2 gotas do substrato da enzima (Tetrametilbezidina e Peróxido de Hidrogênio) a todas as cavidades, testes e controles, e a placa foi novamente incubada, durante 20 minutos, à temperatura ambiente, fazendo-se uma leve agitação no início da incubação e, após 5 minutos, para misturar o conteúdo dentro das cavidades. Finalizando a reação, foi adicionada uma gota de solução de bloqueio (ácido sulfúrico, 1M) a cada cavidade. A leitura da reação foi feita em leitor de microplacas Elisa (Stat Fax
