Institutos Nacionais de Ciência e Tecnologia
Edital Nº 15/2008
MCT/CNPq/FNDCT/CAPES/FAPEMIG/FAPERJ/FAPESP
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Instituição Sede: Fundação Hemocentro e Faculdade de
Medicina de Ribeirão Preto
Laboratórios ou Grupos de Pesquisas Associados
•Laboratório de Hematologia da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto da USP.
•Laboratório de Morfofisiologia Molecular e do Desenvolvimento da Faculdade de Zootecnia e Engenharia de Alimentos de Pirassunga, USP
•Centro de Transplantes de Medula Óssea do Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto da USP
•Departamento de Cirurgia, setor de Anatomia dos Animais Domésticos e Silvestres da Faculdade de Medicina Veterinária da USP
•Instituto de Ciências Biomédicas da UFRJ
•Laboratórios de Terapia Celular do Hemocentro de Hemocentro de Ribeirão Preto – HCFMRP-USP
•Laboratório de Biologia Celular do Hemocentro de Ribeirão Preto – HCFMRP-USP •Laboratório de Biologia Molecular do Hemocentro de Ribeirão Preto – HCFMRP-USP •Laboratório de Transferência Gênica do Hemocentro de Ribeirão Preto – HCFMRP-USP •Laboratório de Criobiologia I e II do Hemocentro de Ribeirão Preto – HCFMRP-USP •Laboratório de Biotecnologia do Hemocentro de Ribeirão Preto – HCFMRP-USP •Laboratório de HLA do Hemocentro de Ribeirão Preto – HCFMRP-USP
•Laboratório de Anemias Hereditárias do Hemocentro de Ribeirão Preto – HCFMRP-USP •Laboratório de Genética Molecular do Hemocentro de Ribeirão Preto – HCFMRP-USP •Laboratório de Citometria de Fluxo do Hemocentro de Ribeirão Preto – HCFMRP-USP •Centro Químico de Proteínas do Hemocentro de Ribeirão Preto – HCFMRP-USP •Centro de Primatologia do Instituto Evandro Chagas de Belém, Pará.
•Departamento de Genética e Biologia Evolutiva do Instituto de Biociências – USP •Laboratório de Genética da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto – USP •Departamento de Biologia Celular, Molecular e Bioagentes Patogênicos – USP •Departamento de Clínica Médica, Divisão de Imunologia Clínica - FMRP-USP
Pesquisadores Principais
• Dimas Tadeu Covas – Fundação Hemocentro de Ribeirão Preto
• Eduardo Magalhães Rego – Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto/USP • Flavio Vieira Meirelles - Faculdade de Zootecnia e Engenharia de Alimentos • Júlio Cesar Voltarelli - Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto/USP
• João Palermo Neto – Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia/USP
• Klena Sarges Marruaz da Silva –Centro de Primatas do Institudo Evandro Chagas –Belém -PA • Lewis Joel Greene - Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto/USP
• Lygia da Veiga Pereira - Instituto de Biociências/USP
• Maria Angélica Miglino - Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia/USP
• Roberto Passetto Falcão - Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto/USP • Stevens Kastrup Rehen - Instituto de Ciências Biomédicas da UFRJ • Wilson Araújo da Silva Jr - Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto/USP
SUMÁRIO
Instituto Nacional de Ciência e Tecnologia em Células-Tronco e Terapia
Celular INCTC... 4
A) Descrição do Programa do Instituto ... 4
O tema: Terapia Celular... 5
Justificativa ... 13
B) Objetivos e Metas ... 18
C) Detalhamento do Programa de Pesquisa ... 19
Estudos com Células-tronco Pluripotenciais ... 44
Células Pluripotenciais Induzidas ... 52
Células tronco Somáticas ... 58
Ensaios Clínicos ... 87
INDICADORES ... 98
D) Detalhamento do Programa de Formação de Pessoal Qualificado ... 99
E) Detalhamento das Ações de Transferência de Conhecimento para a Sociedade ... 106
F) Detalhamento das Ações para transferência de conhecimento para o Setor Empresarial ou para a formação de Políticas Públicas ... 113
G) Descrição Detalhada do Grupo Proponente ... 121
H) Especificação das Atividades a Serem Desempenhadas pelos Membros da Equipe ... 132
I) Mecanismos que Serão Utilizados para Promover a Interação entre os Grupos de Pesquisa ... 133
J) Formas de Interação com Grupos no Exterior ... 135
K) Definição das Tarefas Específicas de Cada Entidade Participante ... 136
L) Análise Comparativa entre a Situação Atual e a Pretendida ... 137
M) Orçamento Justificado ... 138
N) Potencial de Geração de Patentes ... 153
O) Relação dos Projetos Financiados nos últimos 5 anos ... 155
P) Anuência Formal das Instituições Envolvidas ... 159
Q) Contrapartida Institucional ... 186
Infra-estrutura ... 188
R) Cronograma ... 200
S) Indicação do Comitê Gestor ... 202
T) Estrutura Organizacional e Funcional do Instituto ... 203
Instituto Nacional de Ciência e Tecnologia em Terapia Celular A) Descrição do Programa do Instituto
A presente proposta de criação de um Instituto Nacional de Ciência e Tecnologia em Terapia Celular (INCTC) constitui a continuidade e a ampliação das atividades do Centro de Terapia Celular (CTC-CEPID-FAPESP), um dos Centros de Excelência em Pesquisa, Inovação e Difusão criados pela FAPESP em 2001 com o objetivo de ser um novo paradigma para a organização da pesquisa no Estado de São Paulo. O CTC-CEPID, da mesma forma que deverá atuar o futuro INCTC, desenvolve atividades nos três setores que constituem o escopo do projeto: pesquisa científica na fronteira do conhecimento, difusão do conhecimento para a sociedade e inovação tecnológica em estreita colaboração com o setor produtivo.
A melhor maneira de indicarmos o que seremos capazes de fazer é demonstrando o que fizemos e o que estamos fazendo no momento. O CTC-FAPESP conta com oito pesquisadores principais (PI) que até 2000 apresentavam boa produção acadêmica porém com pouca interação entre si. O impacto da criação do CTC pode ser avaliado na figura 1. A produção acadêmica relacionada ao tema Terapia Celular dos oito PIS aumentou consideravelmente ano a ano atingindo, em 2007, cerca de 70 artigos. As citações dos artigos destes PIs também cresceu significativamente a partir de 2000 e ultrapassou 600 citações em 2007. O índice h do grupo é, no momento, 42 o que demonstra a qualidade da produção científica. As colaborações entre os PIS, medida pelas publicações conjuntas de artigos, também aumentou demonstrando que o CTC, à medida que estabeleceu uma temática única, promoveu a convergência e a integração das linhas de pesquisa dos seus PIs. Além disso, também estimulou os pesquisadores a participarem ativamente dos processos de difusão do conhecimento científico. Prova disso foi a edição, em 2006, do livro “Células-Tronco – A Nova Fronteira da Medicina” que se tornou referência para a área no país e foi ganhador do Prêmio Jabuti em 2007.
A criação do Instituto Nacional de Ciência e Tecnologia em Terapia Celular (INCTC) permitirá a consolidação e a ampliação da experiência do CTC, possibilitando a mobilização e a agregação dos melhores grupos de pesquisa com células-tronco e terapia celular do país que passarão a atuar em rede, amplificando
as competências específicas e permitindo que ocorra um avanço capaz de colocar o país em posição destacada no cenário internacional.
Figura 1. Evolução no número de trabalhos e de citações dos oito PIs do CTC.
O tema: Terapia Celular
A terapia celular, por definição mínima, compreende a utilização de células com objetivos terapêuticos. Estas células podem ser usadas das mais diferentes maneiras: injetadas endovenosamente para exercerem ações sistêmicas ou atingirem órgãos e tecidos protegidos, como a medula óssea ou o SNC; usadas localmente ou injetadas diretamente no tecido ou órgão comprometido com o objetivo de promover algum efeito benéfico regenerativo ou protetor.
As células usadas para fins da terapia celular também variam amplamente com relação ao seu estado de maturação e diferenciação. Podem ser utilizadas células maduras do sangue periférico como eritrócitos, leucócitos e plaquetas como acontece, por exemplo, nas transfusões sanguíneas, ou ainda linfócitos ou células dendríticas sensibilizados in vitro nas chamadas vacinas celulares; também podem ser utilizadas células-tronco ou células progenitoras com o objetivo de promover o reparo ou mesmo a total substituição de um tecido ou órgão lesado. Neste último caso temos o exemplo, consolidado por mais de 40 anos de experiência, dos transplantes de células-tronco hematopoéticas derivadas da medula óssea, do sangue periférico ou do sangue do cordão umbilical e que são capazes de reconstituir todo o sistema hematopoético.
Outros exemplos de terapias celulares bem sucedidas com células-tronco, tanto embrionárias como somáticas em modelos animais e no homem, têm surgido nos últimos anos e a procura de novas terapias celulares efetivas tem ocupado, de forma relevante e explosiva, a literatura científica.
O Instituto Nacional de Terapia Celular (INTC) pretende desenvolver um extenso programa de pesquisas básicas e clínicas para entender, isolar, cultivar e usar terapeuticamente, tanto em modelos animais como em humanos, as células-tronco derivadas de diversas fontes: células-células-tronco embrionárias, células-células-tronco somáticas e células-tronco pluripotenciais induzidas (IPS). Para a melhor compreensão dos mecanismos envolvidos na manutenção ou no ressurgimento da pluripotência, também serão estudadas células-tronco neoplásicas derivadas de tecidos diversos, especialmente as da medula óssea que originam as leucemias e os linfomas.
De forma geral, o escopo do projeto científico pode ser visto na figura 2. O conjunto de células-tronco que serão estudadas pode ser dividido nas chamadas células-tronco pluripotenciais e nas células-tronco somáticas. Entre as primeiras incluem-se as células-tronco embrionárias e as células-tronco pluripotenciais induzidas (IPS). No segundo grupo serão estudadas células-tronco hematopoéticas (CTH), células-tronco mesenquimais (MSC), células progenitoras endoteliais (CPE) e células-tronco neoplásicas (CSC). Adicionalmente, serão estudadas células-tronco pouco caracterizadas atualmente, como as células epiteliais da placenta e as células-tronco de partes distintas do saco vitelínico.
Estas células serão isoladas, caracterizadas morfológica e funcionalmente e cultivadas para se tornarem objetos de estudos que terão foco no entendimento de propriedades funcionais e na identificação de mecanismos moleculares, genéticos e epigenéticos envolvidos na indução e no controle da diferenciação celular. Um grande conjunto de ferramentas metodológicas, dominadas pelos grupos participantes, serão empregadas nestes estudos, incluindo: metodologias genômicas, proteômicas, citogenéticas, genéticas, epigenéticas, imunológicas, embriológicas, de biologia e cultivo celular e de biologia sistêmica. Estas células também serão cultivadas em larga escala para serem usadas em estudos pré-clínicos e pré-clínicos envolvendo tanto animais como humanos. Especificamente para os estudos em animais estamos propondo a criação de um Centro de Estudos
Pré-clínicos e de um Banco de Células-tronco com o objetivo de permitir estudos em animais de vários portes (roedores e histricomorfos, coelhos, ovinos, suínos, caninos, eqüinos, bovinos e macacos). Este Centro será formado pela participação da Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia de São Paulo- USP, Faculdade de Zootecnia e Engenharia de Alimentos de Pirassununga –USP, pelo Centro Nacional de Primatas do Instituto Evandro Chagas de Belém-PA e pelo laboratório de Estudos com Modelos Animais do CTC. A infra-estrutura e a competência científica e tecnológica já existentes nestas Instituições permitirão a formação de uma rede de estudos pré-clínicos sem precedente no país. Especialmente os estudos com primatas (macacos do velho e novo mundo) acrescentarão um diferencial importante nos estudos pré-clínicos com células-tronco feitos no país.Em humanos, três estudos clínicos de fase I e II serão conduzidos especificamente usando células-tronco mesenquimais: em diabetes tipo I, no tratamento da doença do enxerto contra o hospedeiro aguda pós-transplante de medula óssea (DECHA).
Para executar este ambicioso plano de trabalho foram reunidos especialistas e instituições com comprovada experiência científica em várias áreas: biologia celular e molecular, genética, embriologia, imunologia, hematologia, biologia de sistemas, química de proteínas, veterinária e bioinformática. A participação destes cientistas e de seus respectivos grupos será feita de forma integrada e complementar, sendo os projetos científicos propostos o resultado de uma abordagem multidisciplinar voltada para o esclarecimento de aspectos científicos específicos, mas ao mesmo tempo integradores de questões maiores e relevantes. Espera-se que esta abordagem científica multifacetada e multidisciplinar de um tema específico permita rápido progresso na área de terapia celular, consolidando e ampliando a participação do Brasil na comunidade internacional de primeira linha no que concerne a este tema. As atividades de pesquisa são descritas com detalhes no item C.
Figura 2. Escopo do projeto
Paralelamente ao programa científico, pretende-se o desenvolvimento de intensa atividade de transferência de conhecimentos científicos para a sociedade envolvendo o público em geral, mas também e principalmente os professores do ensino fundamental e médio e os seus alunos. O INTC pretende ampliar as atividades de transferência que já são feitas pelo Centro de Terapia Celular (CTC-CEPID-FAPESP), estendendo estas atividades para os locais dos laboratórios associados (São Paulo, Pirassununga, Rio de Janeiro e Belém) e propondo novas atividades com maior abrangência.
Células‐tronco Pluripotenciais Células‐tronco Somáticas
Genômica
CPE CTH Câncer Embrionárias Induzidas (IPS) Células Epiteliais
da Placenta Células‐Tronco doSaco Vitelínico
Propriedades Funcionais e Mecanismos
Proteômica Citogenética Genética B. Celular Epigenética B.Sistêmica Imunologia Embriologia Engenharia deCultivo
Indução e Controle da Diferenciação
Produçãode célulasparauso
Estabelecimento de Linhagens b á Estabelecimentode Linhagens neoplásicas Mecanismos da Transformação neoplásica
ModelosAnimais Humanos Camundongos Histricomorfos Coelhos Ovinos Suínos Caninos Equinos Bovinos Macacos Diabete DECHA (1) DECHA (2) MSC
As atividades de disseminação do conhecimento sempre foram relevantes no programa do CTC. Em 2000, como parte desse programa foi montada na instituição-sede do CTC (Hemocentro de Ribeirão Preto – HCFMRP-USP) um espaço de 50 m2 denominado Casa da Ciência (Rua Tenente Catão Roxo, 2501) onde foram alojados 8 profissionais dedicados integralmente à divulgação e ao ensino de ciências. Essa equipe é liderada pela Profa. Dra. Marisa Barbieri, professora aposentada da Universidade de São Paulo e que possuí larga experiência no ensino e na formação de professores de ciências e biologia para o ensino fundamental e médio. A montagem deste espaço físico recebeu apoio, além da Fundação Hemocentro de Ribeirão Preto e da FAPESP, da Fundação Vitae e da própria Universidade de São Paulo por meio de bolsas-trabalho vinculados ao programa COSEAS.
Dentre as atividades de destaque desenvolvidas podemos listar: os Cursos de Especialização denominados “As Células, o genoma e você, professor”, oferecidos em conjunto pela USP e pela Secretaria de Estado da Educação de São Paulo a mais de 200 professores das escolas de ensino fundamental e médio tanto da rede pública como privada; os cursos de extensão universitária presenciais e à distancia com duração de 30 horas; os projetos de iniciação científica júnior apoiados com bolsas pela FAPESP; os cursos de iniciação científica para alunos da rede pública denominados “Caça Talentos” e “Adote um Cientista”, sendo o primeiro um projeto de convivência semanal entre os pesquisadores do Centro e alunos e professores e o segundo o desenvolvimento de projetos de pesquisa simples, liderados por pós-graduandos da Universidade de São Paulo que se encarregam, cada um deles, de um pequeno grupo de alunos; produção de material educacional para divulgação científica como o “Jornal das Ciências” que se encontra na sua 18a.
edição e é produzido pelos alunos e distribuído para as escolas da região; produção de jogos educacionais, de peças teatrais como “A agonia de uma Célula”; confecção de cartilhas como “Uma conversa sobre HIV e AIDS” que foi patrocinada pelo Ministério da Saúde e distribuída para Escolas de todo o pais e a redação de artigos científicos sobre o projeto educacional do CTC e que foram publicados no Brasil e no exterior.
Em 2004, a Casa da Ciência teve suas atividades ampliadas tendo sido montado, com o apoio da Universidade de São Paulo que cedeu uma residência no Campus Universitário de Ribeirão Preto, o MULEC -Museu e Laboratório de Ensino
produzidos nas atividades desenvolvidas na Casa da Ciência. Este novo espaçorecebe a visitação de alunos e do público em geral. Outras atividades desenvolvidas compreenderam participações na Semana Nacional de Ciências e Tecnologia (2004, 2005, 2006, 2007), em congressos científicos (SBPC), em programas da mídia eletrônica (rádio e TV) e na mídia impressa. Todas estas atividades de divulgação da ciência promovidas e apoiadas pelo CTC estão descritas com detalhes no portal da Casa da Ciência (http://www.hemocentro.fmrp.usp.br/projeto/casaciencia) e farão parte do programa educacional do INCTC. O histórico resumido das atividades de transferência de conhecimento do CTC é apresentado na figura 3.
Outras atividades educacionais e de formação de recursos humanos compreendem os cursos de verão oferecidos anualmente e os cursos de formação profissional. O CTC oferece anualmente, no mês de janeiro, um curso de verão destinado a alunos matriculados em cursos de graduação da área biológica de todo o Brasil. Até o momento já foram oferecidos 8 edições com a participação de mais de 280 alunos. A temática destes cursos têm sido a genômica, a proteômica e as células-tronco. O curso, com duração de duas semanas, inclui aulas teóricas e fundamentalmente práticas laboratoriais na temática proposta. O CTC oferece também cursos de atualização profissional para médicos e não médicos na área de hemoterapia, enfermagem, assistência social e gestão de serviços de saúde.
O CTC está ligado à Universidade de São Paulo por intermédio da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto e de outras unidades situadas do Campus de Ribeirão Preto e os seus professores e pesquisadores participam ativamente dos cursos de graduação em medicina, farmácia, química e informática biomédica. Participam também regularmente dos cursos de pós-graduação destas unidades.
2001 2002 2003 2004 2005 2006 2007 2008
“As células, o genoma e você, professor” “Caça-Talentos”
“Site” “Jornal das Ciências”
“Pré-congresso”
Iniciação Científica Júnior”
“Curso On-Line (COL) ” “MuLEC”
“Semana Nacional de Ciência e Tecnologia” “Adote um Cientista” “Roda da
Ciência” “Terças da
Ciência”
“Mural I e II” “Sextas da
Ciência” “Mural III” “Folhetins”
“PIPOC” “PIPAS”
“Portal para professores” “Espaço Ciência para
todos” “Painel do Sangue” “Congresso de Pediatria” “Sangue Seguro” “Parceiros na divulgação de Ciências”
“Agonia de uma célula”- Brasília “Mostra Células-Tronco” “Sara e as relíquias do sangue” “Pré iniciação científica USP” “Ciência com jovens – fazendo o
futuro”
“Sala Retrô” “Eventos e Atividades”
Instituições de Apoio e Financiamento:FAPESP; CNPq; Fundação Vitae; Pró-Reitoria de Cultura e
Extensão – USP
Figura 3 . Histórico das atividades de transferência
Na presente proposta o objetivo é ampliar esta experiência do CTC, estendendo o alcance das iniciativas descritas para os laboratórios e unidades que se associam agora na proposta do INCTC. Propomos também o aumento em escala destas iniciativas por meio do oferecimento dos cursos de especialização através da internet. O público alvo serão os alunos e os professores de ciências e biologia do ensino fundamental e médio. No primeiro ano do INCTC está previsto o oferecimento de um curso de especialização com duração de 360 horas para a formação de 900 professores de ciências e biologia. Como parte integrante das atividades do curso, cada professor terá que matricular uma classe de no mínimo 40 alunos regulares do ensino público o que totalizará 36.000 alunos participantes do curso no período de 10 meses. As atividades com os professores serão
predominantemente à distância usando a plataforma TIDIA. Vinte por cento das atividades serão presenciais e serão realizadas nos pólos de educação a distância situados em unidades das Universidades Estaduais Paulistas. O curso de especialização será autorizado pela USP e desenvolvido dentro do Programa Universidade Virtual do Estado de São Paulo (UNIVESP). A documentação para oficialização deste curso junto às instituições citadas encontra-se em tramitação com anuência preliminar do Secretário de Ensino Superior do Estado de São Paulo e do Pró-reitor de Cultura e Extensão da Universidade de São Paulo. A partir do segundo ano do projeto, o curso poderá ser estendido para todo o Brasil.
Pretendemos ainda montar um Curso de Pós-graduação Inter-Unidades (FMRP-USP, FMV-USP, FZ-USP, ICB-USP e UFRJ) com temática na terapia celular e um curso de mestrado profissionalizante para a formação especializada de técnicos para atuação nesta área.
Complementarmente a estas atividades estamos apresentando um ambicioso plano de divulgação da ciência e de formação de divulgadores científicos por meio de cursos de pós-graduação strictu e latu senso. A divulgação dos produtos científicos gerados no INCTC, identificada como relavante pelos seus participantes, será feita de diversas formas suplementares à produção de artigos científicos. O objetivo maior será atingir amplos segmentos sociais para promover o interesse em ciência e despertar para a necessidade da educação científica permanente. Estas novas ações previstas para o INCTC estão descritas com maiores detalhes no item E.
Por fim, as atividades de inovação formam, em conjunto com o programa de pesquisa e de transferência, a tripla-hélice que caracteriza este projeto e deveria ser, de modo ideal, as características marcantes das Universidades e do Centros de Pesquisa do século XXI (Etzkowitz, 1996). Neste tópico também se pretende ampliar a experiência do CTC-CEPID que de forma bem sucedida implantou uma incubadora de empresas no seio da entidade sede (CRH-HCFMRP-USP). Esta incubadora denominada INBIOS – Incubadora de Empresas de Biotecnologia em Saúde foi constituída em 2002 com os objetivos de apoiar empreendedores para a criação ou continuidade de novos negócios de biotecnologia ou a criação de pequenas empresas de biotecnologia da cadeia de suprimento de médias e grandes empresas, ou ainda braços de P&D de médias e grandes empresas que tenham
interesse de desenvolver um produto ou linhas de produto ou serviços na incubadora. As áreas preferenciais de ação da INBIOS foram definidas como: biotecnologia, biomedicina, equipamentos e materiais médico-odontológicos, instrumentação, tecnologia da informação, meio-ambiente, química e técnicas nucleares. Em 2006, a INBIOS, por meio de convênio, passou a integrar a SUPERA – Incubadora de Empresas de Base Tecnológica de Ribeirão Preto com a denominação SUPERA-HEMOCENTRO (http://www.fipase.org.br/default.asp).
No momento, a SUPERA apóia 09 empresas residentes, 03 empresas pré-residentes, 01 empresa associada e 20 projetos na modalidade Hotel de Projetos. A SUPERA-HEMOCENTRO está instalada em espaço de 128 m2 e oferece abrigo a cinco
empresas: Rad Tech Sistemas Médicos Ltda, Capelli Fabris Desenvolvimento e Pesquisa Ltda, Lychnoflora Pesquisa e Desenvolvimento de Produtos Naturais Ltda, CG Brasil Consultoria e Informática Ltda e Innolution Sistemas de Informática Ltda. O projeto do INCTC incorporará esta experiência de extensão para o setor produtivo. Adicionalmente, serão desenvolvidas novas ações visando o desenvolvimento tecnológico e a sua transferência para o setor produtivo como descrito com detalhes no item F.
Justificativa
Em 2005, o Reino Unido promoveu um painel de especialistas com o objetivo de realizar o diagnóstico e o planejamento de atividades relacionadas às células-tronco e à terapia celular por 10 anos (2006-2015) . No documento final, UK Stem Cell Initiative – Report and Recomendations – foram apresentadas ações de curto, médio e longo prazo para colocar o RU na liderança mundial neste setor que foi considerado estratégico devido ao seu potencial inovador na cura e tratamento de doenças. No capítulo 5 do referido documento foi apresentado um fluxograma que descreve os passos críticos que governariam o desenvolvimento de produtos e processos com células-tronco e terapias celulares. Na figura 4 reproduzimos esse fluxograma. Por essa concepção, o desenvolvimento de novas terapias celulares começa por um esforço em pesquisa básica para isolar, caracterizar e compreender os mecanismos biológicos envolvidos na manutenção do estado indiferenciado das células-tronco. O segundo passo nesse fluxograma compreende o estabelecimento
de linhagens de C-T bem caracterizadas e homogêneas, depositadas em banco de células-tronco criado específicamente para esse fim e encarregado da guarda, ampliação e distribuição destas linhagens para os diversos laboratórios. No RU esta sugestão levou à criação do Banco Nacional de Células-tronco (UK Stem Cell Bank). O terceiro passo consiste na produção de células-tronco bem caracterizadas em larga escala para serem usadas nos estudos pré-clínicos e clínicos. No RU, diversas iniciativas neste sentido, patrocinadas pelo governo e pela iniciativa privada, estão em andamento. Nesta etapa, a geração de patentes de produtos e processos é altamente provável o que explica o grande interesse da iniciativa privada nesta área no mundo todo. Na quarta etapa do fluxograma situam-se os estudos clínicos que demandam estruturas físicas e profissionais especializados nesta área. Na etapa final acontece o registro e a liberação do produto para uso gera.
No Brasil, podemos afirmar com segurança, que a maioria dos estudos e iniciativas encontram-se na primeira fase do fluxograma descrito. A presente proposta avança neste sentido. Estamos propondo um conjunto de atividades que se distribuem pelas quatro fases descritas: pesquisa básica, estabelecimento de um banco de células-tronco, desenvolvimento de sistemas de cultivo em larga escala em condições GMP e testes pré-clínicos e clínicos. Este esforço coordenado colocará o país na fronteira do conhecimento em terapia celular.
THERAPIES PRODUCED FROM STEM CELL LINES
Basic Stem Cell
Research Stem Cell
Bank Stem Cell Therapy Production Unit Clinical Trials Stem Cell Licensed Product Manufacture
Cell Biology Research grade cell banking
and characterisation
Production process development
Specialist Bed and
Facilities Stem Cell Therapy Imunology
Animal Modeling Safety and Efficacy Commercial or
Plubic Sponsor Clinical grade
cell banking and characterisation
Plot scale capacity to supply stem cell
clinical trials Epigenetics
Coordination Therapy Surveilance
Bioengineering 1,3,5,6,7,8,9,10, 11,12,13,14,15, 16,17,18,19,20, 21.24 e 25 * 4,6,7,26, e 27* 2 e 23* 28, 29 e 30*
Figura 4. Fluxograma das fases do desenvolvimento de terapias celulares. (Adaptado de UK Stem Cell Initiative, 2005).* número dos subprojetos descritos nesta proposta.
Na última linha da figura 4, indicamos a relação das etapas indicadas com os subprojetos propostos.
O grande diferencial deste projeto é que ele amplia o escopo dos estudos com células-tronco e terapias celulares que ocorrem no país. Embora existam vários estudos clínicos de fase I e II em andamento salientamos que esses estudos estão sendo feitos, na sua maioria, com células mononucleares da medula óssea minimamente manipuladas. Estes estudos foram planejados no auge da divulgação de experimentos preliminares em modelos animais que sugeriam que as células da medula óssea fossem altamente plásticas e atuavam na reconstituição de órgãos como o cérebro e o coração. Muitos grupos de pesquisa, sem nenhuma experiência prévia no estudo de células-tronco, embarcaram nestes projetos simplesmente estimulados pela facilidade de obtenção das células. Entretanto, esta fase se esgotou rapidamente e ficou demonstrado que os avanços clínicos revolucionários esperados com o uso da fração mononuclear da MO não se confirmaram, o que remeteu esse tipo de estudo para o fim da fila das prioridades em terapia celular.
Marketing Approval Cell Therapy
Production Stem Cell Clinical Research Research &
A terapia celular, como definimos anteriormente, tem imenso potencial terapêutico podendo mesmo revolucionar a forma de tratamento de inúmeras doenças crônico-degenerativas. Entretanto, para que este potencial se realize faz-se necessário um conjunto de atividades científicas e regulatórias que, no momento, ainda não se encontra totalmente consolidada no país.
O projeto do INCTC propõe um modelo de atuação coordenada, à semelhança dos modelos que foram adotados pelos países que se tornaram líderes nesse setor, especialmente o Reino Unido. Como mostrado na figura 4, a nossa proposta é constituída por um conjunto de subprojetos que visam atender as exigências técnicas e científicas para que terapias celulares efetivas sejam disponibilizadas para amplos setores da população num universo temporal que varia de 8 a 15 anos.
Neste contexto, um primeiro conjunto de subprojetos destina-se ao estudo das propriedades básicas das células-tronco (biologia celular, imunologia, epigenética, genômica, citogenômica, proteômica, bioengenharia, etc.). Neste grupo também se inclui o desenvolvimento de modelos animais e aqui ressaltamos a utilização, pela primeira vez no país, de primatas não humanos para o desenvolvimento de modelos experimentais destinados a testar terapias celulares. Outra iniciativa inédita é a montagem de um Centro de Estudos Pré-clínicos para atender a demanda que será gerada pelo projeto. Esta iniciativa deverá também beneficiar outros estudos não só de terapia celular já que o Brasil é carente de centros com esta especiaficação.
Um segundo conjunto de subprojetos, que se desenvolverá concomitante ao primeiro, destina-se à derivação de linhagens homogêneas de células-tronco, tanto pluripotenciais como somáticas. O objetivo é a obtenção de linhagens celulares de CT bem caracterizadas e que possam ser amplificadas em sistemas de cultivo sem perderem as suas propriedades primordiais com a finalidade de serem disponibilizadas para os diversos laboratórios de pesquisa e para os estudos pré-clínicos e pré-clínicos. Para alcançarmos este objetivo pretendemos estabelecer dois bancos de células-tronco: um para células-tronco animais que será coordenado pelos grupos da Profa. Maria Angélica Miglino da FMVSP-USP e pela Dra. Klena Sarges Marruaz da Silva do Centro Nacional de Primatas de Belém-PA; o segundo banco, para células-tronco humanas já existe no CTC-Hemocentro e deverá ser
ampliado na sua capacidade de processamento para atender a todas as necessidades encetadas pelo projeto. A premissa maior desta fase do projeto é que os efeitos terapêuticos eventuais que serão obtidos nos modelos animais e nos estudos clínicos, para serem reprodutíveis e confiáveis, precisam ser diretamente correlacionados com populações celulares específicas e passíveis de amplificação em cultura para que os progressos nesta área sejam cientificamente consistentes.
Devemos também enfatizar que a preocupação com a qualidade e caracterização das linhagens de células-tronco que serão testadas se acompanha também com a qualidade dos testes pré-clínicos. Para garantir que esta fase fundamental para o desenvolvimento das terapias celulares futuras seja executada com todo o rigor científico e metodolólgico necessário, estamos propondo a constituição de um Centro de Estudos Pré-Clínicos que será fisicamente descentralizado envolvendo a Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia de São Paulo – USP, a Faculdade de Zootecnia de Pirassununga – USP, o Laboratório de Estudos Animais do CTC-Hemocentro e o Centro Nacional de Primatas do Instituto Evandro Chagas de Belém- PA. Especialmente neste último centro serão executados estudos pré-clínicos com primatas não humanos o que significa uma evolução sem precedentes no Brasil e em boa parte do mundo.
Um terceiro grupo de subprojetos se destina a implementar sistemas de produção de células-tronco larga escala para que as terapias células se tornem disponíveis para grande número de pacientes. A capacidade limitada de cultivo das células-tronco é, hoje, o maior obstáculo para que terapias celulares efetivas sejam disponibilizadas. À guisa de exemplo, no estudo clínico de fase I que estamos conduzindo usando células estromais mesenquimais para o tratamento da doença do enxerto contra o hospedeiro aguda (DECHA) pós-transplante de medula óssea, o tratamento de um único paciente com 70 Kg de peso corporal exige o cultivo de células em 30 frascos de cultura de 1L por 20 a 30 dias para a obtenção final de cerca de 7 x 107 células. Impossível imaginar que este tipo de tratamento possa ser estendido a todos que dele necessitem sem um sistema mais eficiente de cultivo celular. A alternativa é produção de células em biorreatores e nesta proposta este objetivo será perseguido tanto para a amplificação de células-tronco embrionárias como para células-tronco mesenquimais.
O quarto grupo de subprojetos compreende os estudos clínicos. Destacam-se aqui os estudos que envolvem a utilização de células-tronco mesenquimais para o tratamento de pacientes com diabetes tipo I e o destinado ao tratamento da doença do enxerto contra o hospedeiro pós-transplante de medula óssea (DECHA). O nosso grupo foi o primeiro e é, no momento, o único que está usando células mesenquimais cultivadas em condições GMP para terapia celular.
No conjunto de propostas, este projeto de INCTC promove um grande avanço nos estudos envolvendo células-tronco e terapia celular no país.
B) Objetivos e Metas
Organizar pesquisadores brasileiros com larga experiência no estudo de células tronco, e atuantes em Instituições de diferentes partes do país, em um Instituto Nacional de Ciencia, Técnologia e Inovação (INCTI). A criação deste INCTI permitirá a troca de informações, reagentes, métodos, recursos humanos e logística, bem como disponibilizará o grande parque de equipamentos existente, de tal sorte a gerar produção acadêmica, tecnológica e na formação de recursos humanos na área de biotecnologia, saúde e ciências agrárias com impacto nacional e internacional.
A meta do Instituto é o desenvolvimento de ciência básica abordadando questões fundamentais como as características das células tronco de diferentes origens e espécies, e os mecanismos genéticos, epigenéticos e celulares regulando sua manutenção e diferenciação. Além disto, serão desenvolvidos protocolos técnicos, um banco de células e tecidos, ferramentas de bioinformática, linhagens celulares e modelos usando animais geneticamente manipulados que serão empregados em subprojetos envolvendo vários pesquisadores atuando de forma coordenada na análise das diferentes facetas dos problemas. Na área aplicada, serão desenvolvidas estratégias de tratamento usando células tronco para diabetes mellitus, esclerose múltipla e para a doença do enxerto versus hospedeiro.
O Instituto também tem como meta a formação de recursos humanos na área de biotecnologia aplicável à area da saúde e às ciências agrárias. Além de criar
oportunidades para professores do ensino médio de adquirir formação científica e despertar o interesse de alunos na área de ciências. Em paralelo, a população geral será informada do progresso do projeto e os resultados serão divulgados junto às empresas de tecnologia, algumas das quais serão beneficiárias da incubadora de empresas SUPERA ligada a FUNDHERP.
Para possibilitar o acompanhamento e a avaliação do centro proponente, listamos abaixo (item C), os objetivos específicos estipulados em cada um dos sub-projetos. Da mesma forma, estas informações (e ou outras complementares), os cronogramas de execução estão listados em outra seção do projeto e podem ser consultados no website www.hemocentro.fmrp.usp.br/projeto/inct .
C) Detalhamento do Programa de Pesquisa
O programa de pesquisas do INCTC se compõe de 30 subprojetos que são apresentados a seguir, juntamente com os objetivos e metas de cada um. Na segunda parte deste item (C2) estes subprojetos são resumidamente descritos como parte de uma organização racional maior do programa indicando, preliminarmente, o caráter integrador da proposta. Esta racionalidade foi indicada anteriormente na figura 4. No item H deste projeto (Especificação das Atividades a serem desempenhadas pelos membros da Equipe) é apresentada uma tabela que mostra a participação integrada dos diversos grupos de pesquisa envolvidos (representado pelo nome do coordenador) nestes subprojetos.
C1. Subprojetos, Objetivos e Metas
Sub-projeto 1: “Avaliação da estabilidade epigenética de linhagens de células-tronco embrionárias estabelecidas em diferentes condições”
http://www.hemocentro.fmrp.usp.br/projeto/inct/pdf/SUB01.pdf
1. Estabelecimento de linhagens de CTEh a partir da massa celular interna de blastocistos;
2. Avaliação de diferentes condições de estabelecimento das linhagens (na presença ou ausência de fibroblastos murino; com soro fetal bovino ou serum replacement; em meio definido) em seu estado epigenético;
3. Caracterização da plasticidade das linhagens de hES;
4. Analise do estado de atividade do cromossomo X nas células de trofoblasto retiradas dos embriões;
5. Avaliação do efeito de instabilidade cromossômica na capacidade de diferenciação das CTEh
Sub-projeto 2: “Propagação de células-tronco embrionárias humanas em biorreatores visando o aumento de escala para transplantes em doenças degenerativas”
http://www.hemocentro.fmrp.usp.br/projeto/inct/pdf/SUB02.pdf
Coordenador: Stevens Kastrup Rehen
1. Avaliar comparativamente o crescimento e pluripotencialidade de células-tronco embrionárias humanas em sistemas agitados, tanto na forma de corpos embrióides, quanto utilizando microcarregadores como suporte.
2. Caracterizar a estabilidade cromossômica e capacidade de diferenciação de células-tronco embrionárias humanas mantidas em sistemas agitados por longos períodos.
3. Ampliar a escala de produção de células-tronco embrionárias humanas, através da utilização de biorreatores, para fins de transplante em animais de experimentação e eventualmente em humanos.
4. Estabelecer um protocolo de expansão de células-tronco embrionárias humanas economicamente viável e aplicável à obtenção de grandes quantidades de células.
Sub-projeto 3: “Bases moleculares da diferenciação hematopoética a partir de CTE”
http://www.hemocentro.fmrp.usp.br/projeto/inct/pdf/SUB03.pdf
Coordenadores: Marco Antonio Zago eDimas Tadeu Covas
1. Padronização do protocolo in-vitro de diferenciação de CTH a partir de linhagens de CTEh;
2. Seleção imunomagnética das CTH CD34+ derivadas de CTE e de SCU e extração de RNA
3. Padronização do protocolo in-vitro de diferenciação de linfócitos T a partir de CTH CD34+ derivadas de CTE ou de SCU;
4. Avaliação dos processos de diferenciação por citometria de fluxo; 5. Obtenção do perfil transcricional de mRNAs utilizando microarrays; 6. Obtenção do perfil transcricional de microRNAs utilizando microarrays;
7. Análise dos dados utilizando métodos bioinformáticos e bases de dados específicas e identificação de potenciais mecanismos regulatórios.
8. Validação das diferenças por PCR em tempo real (tanto de mRNA como microRNA).
Sub-projeto 4: “Cultura de células tronco adultas e embrionárias de animais e humanos para uso em terapias celulares”
http://www.hemocentro.fmrp.usp.br/projeto/inct/pdf/SUB04.pdf
Coordenador: Maria de Fátima Lima de Assis
1. Cultivar células tronco adultas e embrionárias com o mínimo de interferência química para a conservação da integridade genômica, mantendo as culturas criopreservadas nas primeiras passagens evitando a ocorrência de poliploidia “in vitro”;
3. Estimular a célula tronco adulta a desenvolver funções específicas de células tronco embrionárias (desdiferenciação celular).
4. Levantamento bibliográfico para a escolha do protocolo a ser adotado no cultivo celular;
5. Triagem, coleta e identificação do material a ser trabalhado; 6. Cultivo, expansão e criopreservação de células tronco adultas; 7. Identificação cariotípica das células tronco adultas cultivadas; 8. Diferenciação das células tronco adultas em tecidos específicos; 9. Cultivo, expansão e criopreservação das células tronco embrionárias; 10. Identificação cariotípica das células tronco embrionárias cultivadas;
11. Início da diferenciação das células tronco embrionárias cultivadas, em tecidos específicos;
12. Desdiferenciação de células tronco adultas tornando-as potencialmente embrionárias.
13. Redação e publicação dos produtos obtidos.
Sub-projeto 5: “Modificação gênica de células-tronco” http://www.hemocentro.fmrp.usp.br/projeto/inct/pdf/SUB05.pdf Coordenador: Dimas Tadeu Covas
1. Construir vetores lentivirais contendo fatores de transcrição supostamente envolvidos na manutenção da pluripotencialidade seguido do elemento IRES e GFP;
2. Induzir ao aumento da expressão dos fatores de transcrição Oct3/4, Sox2 e Nanog pela transdução dos vetores virais em células mesenquimais e endoteliais
3. Observar as alterações ocasionadas no perfil de expressão gênica de genes pela metodologia de RT-PCR, com o intuito de elucidar o mecanismo de
atuação da expressão destes fatores de transcrição e descrever novos alvos terapêuticos
4. Selecionar clones de células mesenquimais transformadas com os vetores lentivirais e observar a viabilidade e a capacidade de diferenciação em diferentes linhagens celulares.
Sub-projeto 6: “Estabelecimento de linhagens de células tronco pluripotentes induzidas (iPS) de modelos animais de grande porte”
http://www.hemocentro.fmrp.usp.br/projeto/inct/pdf/SUB06.pdf
Coordenador: Lygia da Veiga Pereira
1. Desenvolvimento de vetores de indução de pluripotencia em celulas de primatas não humanos e caes;
2. Estabelecimento de linhagens de iPS a partir de fibroblastos desses modelos animais;
3. Diferenciacao neural das iPS e ensaio pré-clinico nos modelos animais com lesão de medula espinhal.
Sub-projeto 7: “Estabelecimento de linhagens de células tronco pluripotentes induzidas (iPS) a partir de fibroblastos de pacientes com doenças genéticas mendelianas e multifatoriais (com componente genético)”
http://www.hemocentro.fmrp.usp.br/projeto/inct/pdf/SUB07.pdf
Coordenador: Lygia da Veiga Pereira
1. Sistematização da metodologia de geração de iPS humanas a partir de fibroblastos derivados de pele, e a partir de células derivadas de sangue e medula ossea;
2. Estabelecimento de linhagens de iPS a partir de pacientes com doenças genéticas de interesse do grupo para estudos dos mecanismos moleculares das mesmas;
3. Estabelecer iPS a partir da linhagem de fibroblastos humanos GM1662, 46 XX, heterozigota para uma mutação no gene HPRT, visando o uso desta linhagem no estudo de modificações epigenéticas associadas à inativação do cromossomo X em humanos.
4. Desenvolver vetores adenovirais bi-cistrônicos visando (i) aumentar a eficiência da produção de iPS; e (ii) gerar iPS não-geneticamente-modificadas através da eliminação dos vetores pós-indução.
Sub-projeto 8: “Células pluripotentes autólogas geradas a partir de células somáticas diferenciadas”
http://www.hemocentro.fmrp.usp.br/projeto/inct/pdf/SUB08.pdf
Coordenador: Flavio Vieira Meirelles
1. Indiferenciação de células diferenciadas através das metodologias: 2. Inserção gênica de fatores conhecidos (iPS)
3. Transferência nuclear utilizando fibroblastos como célula doadora de núcleo 4. Transferência nuclear utilizando iPS como célula doadora de núcleo
5. Derivação de células pluripotentes a partir das metodologias descritas acima, bem como a partir de células embrionárias produzidas in vivo.
6. Análise e comparação morfológica, da expressão gênica e epigenética das células indiferenciadas obtidas a partir das metodologias descritas anteriormente.
7. Determinar a metodologia que apresente padrão de transcriptoma, epigenoma e proteoma mais semelhante às células indiferenciadas do grupo controle e aplicá-la no modelo interespecífico.
8. Execução de provas funcionais de indiferenciação das células produzidas pelo modelo interespecífico: citoplasto bovino e célula de macaco como doadora de núcleo.
Sub-projeto 9: “Modelo animal para estudo da herança mitocondrial intra e inter-espécie”
http://www.hemocentro.fmrp.usp.br/projeto/inct/pdf/SUB09.pdf
Coordenador: Flavio Vieira Meirelles
1. Produzir blastocistos bovinos (Bos taurus) que contenham mtDNA de origem somática intra (B. indicus) ou inter-específica (Homo sapiens) em heteroplasmia com mtDNA de origem embrionária (herdado do oócito).
2. Desenvolver um método para aumentar a porcentagem herdada nos blastocistos de mtDNA somático (B. indicus ou H. sapiens).
Sub-projeto 10: “Conhecimento básico sobre a biologia da MSC através de sua comparação com pericitos”
http://www.hemocentro.fmrp.usp.br/projeto/inct/pdf/SUB10.pdf
Coordenador: Dimas Tadeu Covas
1. Comparar pericitos frescos, pericitos cultivados em condições de MSC, e MSCs entre si quanto a seu comportamento quando submetidos a condições de diferenciação descritas para MSC e a diferentes condições de cultivo in vitro;
2. Comparar pericitos frescos, pericitos cultivados em condições de MSC, e MSCs quanto à sua capacidade de contribuição para diferentes tecidos quando injetados em blastocistos;
3. Estudar o perfil de marcadores de superfície exibido por pericitos frescos, em comparação direta com o de pericitos cultivados em condições de MSC e o de MSCs cultivadas;
4. Estudar o perfil de citocinas com potencial imunomodulatório de pericitos frescos em comparação com o de pericitos cultivados em condições de MSC e o de MSCs cultivadas;
e investigar o papel de pericitos durante o processo de reparo/regeneração tecidual.
Sub-projeto 11: “Avaliação do potencial angiogênico e elucidação das interações moleculares de células-tronco mesenquimais e células endoteliais em sistemas de co-cultivo in vitro e in vivo”
http://www.hemocentro.fmrp.usp.br/projeto/inct/pdf/SUB11.pdf
Coordenador: Dimas Tadeu Covas
1. Isolar e caracterizar de populações celulares da medula óssea, veia do cordão e capilares cerebrais humanas no que diz respeito ao nível de expressão dos marcadores CD271, CD140B, 3G5, NG2, Stro-1 e CD146 para selecionar o marcador mais apropriado para realizar a clonagem celular; 2. Clonagem celular por “sorting” de populações celulares da medula óssea,
veia do cordão e capilares cerebrais utilizando um dos marcadores previamente caracterizados;
3. Caracterização morfológica e imunofenotípica de populações celulares isoladas por “sorting”;
4. Isolar e caracterizar células-tronco mesenquimais do saco vitelínico canino (cSV-CTM);
5. Potencial de diferenciação das populações celulares humanas isoladas por “sorting” e das CTM caninas em adipócito, osteócito e condrócito
6. Modificação Gênica de células-tronco humanas isoladas por “sorting” e das CTM caninas com luciferase/DsRed e seleção das células positivas para DsRed por citometria de fluxo; e o marcador previamente selecionado;
7. Caracterização Morfológica, Fenotípica de células-tronco isoladas por “sorting” e positivas para luciferase/DsRed+;
8. Isolamento e cultivo de células endoteliais humanas e caninas positivas para CD31 obtidas da veia do cordão humano (HUVEC) e do saco vitelínico canino (cSV-CE), após a seleção por citometria de fluxo; /CD31+ pós sorting;
9. Geração ex-vivo de células endoteliais humanas a partir de células progenitoras endoteliais AC133+ isoladas da medula óssea e sangue do cordão umbilical;
10. Caracterização morfológica e fenotípica de células endoteliais/CD31+;
11. Co-cultivo com contato e sem contato de populações celulares humanas isoladas por “sorting” e CTM caninas com células endoteliais;
12. Análise morfológica, imunofenotípica e de expressão gênica das populações celulares antes e após o co-cultivo com células endoteliais;
13. Avaliação do potencial angiogênico “in vivo” de populações celulares isoladas por “sorting”, antes e após o co-cultivo com células endoteliais em modelos de implantes de matrigel em camundongos NOD/SCID utilizando métodos não invasivos (Sistema IVIS);
14. Caracterização dos capilares dos implantes por microscopia confocal;
15. Avaliação do potencial angiogênico “in vivo” das células endoteliais após a indução da isquemia de membros inferiores, em camundongos NODSCID por microscopia confocal.
Sub-projeto 12: “Comparação da expressão de proteínas de células tronco mesenquimais humanas obtidas da medula óssea e da veia do cordão umbilical” http://www.hemocentro.fmrp.usp.br/projeto/inct/pdf/SUB12.pdf
Coordenador: Lewis Joel Greene
1. Obtenção de células tronco mesenquimais humanas a partir da medula óssea e da veia do cordão umbilical e expansão dessas células in vitro.
2. Caracterização imunofenotípica e diferenciação das CTMs em osteócitos e adipócitos.
3. Extração e quantificação das proteínas citoplasmáticas solúveis das CTMs. 4. Eletroforese bidimensional e comparação das proteínas presentes nos
extratos de CTMs com marcadores fluorescentes do DIGE. 5. Análise quantitativa dos géis 2D pelo software DeCyder.
6. Identificação das proteínas nos “spots” de interesse por espectrometria de massas (MALDI-TOF-TOF) obtidos do gel preparativo após digestão com tripsina e busca em bancos de dados.
7. Análise das proteínas com diferenças quantitativas e qualitativas através dos bancos de dados com o Gene Ontology.
8. Comparar os resultados obtidos por Proteoma aos já publicados por SAGE.
Sub-projeto 13: “Diferenças na expressão gênica e de marcadores imunofenotípicos em células epiteliais amnióticas obtidas na presença e na ausência de componentes de origem animal”
http://www.hemocentro.fmrp.usp.br/projeto/inct/pdf/SUB13.pdf
Coordenador: Wilson Araújo da Silva Jr
1. obter populações de células epiteliais amnióticas por dois métodos diferentes de isolamento e cultivo;
2. avaliar por citometria de fluxo a expressão de marcadores típicos de células-tronco embrionárias nas duas populações celulares;
3. comparar por citometria de fluxo a expressão de marcadores de superfície relacionados com a imunogenicidade e efeito imunomodulador atribuído a estas populações celulares;
4. comparar o perfil de expressão gênica das duas populações celulares por microarrays;
5. comparar o potencial de diferenciação destas células em linhagens derivadas das três camadas germinativas: endoderme (diferenciação hepática),
mesoderme (diferenciação cardiomiogênica) e ectoderme (diferenciação neurogênica)
Sub-projeto 14: “Isolamento e caracterização funcional de células-tronco pluripotentes - side population”
http://www.hemocentro.fmrp.usp.br/projeto/inct/pdf/SUB14.pdf
Coordenador: Dimas Tadeu Covas
1. Isolamento de células-tronco “side population” da medula óssea, veia do cordão e capilares cerebrais (dia 0);
2. Isolamento de células “side population” a partir de culturas de células-tronco mesenquimais isoladas da medula óssea, veia do cordão e capilares cerebrais utilizando o protocolo clássico de aderência ao plástico;
3. Avaliar a freqüência de células-tronco “side population” na medula óssea, veia do cordão e capilares cerebrais no dia 0;
4. Avaliar a freqüência de células “side population” nas culturas de células-tronco mesenquimais isoladas pelo protocolo clássico de aderência ao plástico;
5. Cultivar células-tronco “side-population”, isoladas no dia 0, e a partir de culturas de células-tronco mesenquimais em três meios de cultivo: a) meio MSC; b) meio HSC e c) meio hES;
6. Caracterização morfológica e imunofenotípica das células-tronco “side population” antes e após o cultivo nos diferentes meios de diferenciação; 7. Potencial de diferenciação em adipócito, osteócito e condrócito de
células-tronco “side population” isoladas da medula óssea, veia do cordão e capilares cerebrais;
8. Caracterização do perfil de expressão gênica funcional (RT-PCR e Microarray) das células-tronco “side population” antes e após o cultivo nos diferentes meios de diferenciação;
9. Desenvolvimento de modelos animais para estudo do potencial vasculogênico das células-tronco “side population” e células diferenciadas: a) modelo de transplante de medula e b) modelo de implante de células em matrigel
Sub-projeto 15: “Avaliação Funcional de microRNAs na diferenciação de células mesenquimais estromais multipotentes humanas”
http://www.hemocentro.fmrp.usp.br/projeto/inct/pdf/SUB15.pdf
Coordenador: Dimas Tadeu Covas
1. Isolamento e expansão de células tronco mesenquimais a partir de medula óssea;
2. Diferenciação em osteoblastos;
3. Quantificação do nível de expressão de miRNAs maduros em diferentes tempos da diferenciação em osteoblastos;
4. Identificação dos potenciais genes alvos para os miRNAs eleitos utilizando algoritmos como miRanda e RNAhybrid;
5. Análise funcional de miRNAs diferencialmente expressos.
Sub-projeto 16: “Análise da Expressão Gênica durante a diferenciação osteogênica in vitro em amostras de pacientes portadores de Osteogênese Imperfeita”
http://www.hemocentro.fmrp.usp.br/projeto/inct/pdf/SUB16.pdf
Coordenador: Wilson Araújo da Silva Jr
1. Analisar o perfil de expressão gênica pela técnica de microarray em células-tronco mesenquimais em pelo menos quatro tempos de diferenciação osteogênica. Essa análise será aplicada individualmente em duas amostras processadas de pacientes portadores de Osteogênese Imperfeita e de indivíduos controles (não portadores da doença).
2. Selecionar genes com padrão de expressão distinta da amostra controle para validação por PCR quantitativo em tempo real;
3. Realizar experimentos funcionais para avaliar se processos biológicos como proliferação celular, migração, apoptose, viabilidade e morte celular, estão afetados durante a osteogênese de pacientes com Osteogênese Imperfeita; 4. Identificar as vias gênicas que podem ser afetadas na Osteogênese
Imperfeita após análise conjunta dos experimentos citados nos itens anteriores.
Sub-projeto 17: “Análise gênica, protéica e funcional de células-tronco mesenquimais de pacientes com doenças auto-imunes”
http://www.hemocentro.fmrp.usp.br/projeto/inct/pdf/17.pdf
Coordenador: Julio Cesar Voltarelli
1. Isolar, expandir e caracterizar as CTMs (unidades formadoras de colônia fibroblastóides, imunofenotipagem, capacidade proliferativa, tempo de duplicação celular) isoladas da medula óssea de pacientes com DM-1 e EM; 2. Avaliar a capacidade imunossupressora das CTMs em ensaios de co-cultivo
com linfócitos T;
3. Avaliar o efeito da imunossupressão em altas doses sobre as CTMs;
4. Analisar a expressão gênica em larga escala das CTMs pela técnica de cDNA microarrays;
5. Analisar a expressão protéica em larga escala das CTMs pela técnica de gel de eletroforese bidimensional;
6. Validar os resultados de expressão gênica obtidas por cDNA microarrays pelo método de RT-PCR em Tempo Real;
7. Estudar alguns genes/proteínas relevantes, cuja expressão revelar-se alterada nos estudos de expressão gênica e protéica em larga escala, por meio de estudos funcionais com RNA de interferência.
Sub-projeto 18: “Determinação dos níveis de algumas proteínas relacionadas ao processo apoptótico e controle do ciclo celular de células precursoras hematopoéticas normais e células precursoras”
http://www.hemocentro.fmrp.usp.br/projeto/inct/pdf/SUB18.pdf
Coordenador: Lewis Joel Greene
1. Isolamento, separação, caracterização e tratamento das células precursoras normais, células-tronco leucêmicas e blastos leucêmicos;
2. Padronização de géis;
3. Análise dos spots por densiometria;
4. Imunodetecção das proteínas envolvidas no processo apoptótico utilizando anticorpos monoclonais ou policlonais específicos;
5. Identificação das proteínas reconhecidas por Western blotting por espectrometria de massas MALDI-TOF e ESI-MS/MS;
6. Análise dos resultados por uso de bioinformática
Sub-projeto 19: “O papel da disquerina na diferenciação das células hematopoéticas”
http://www.hemocentro.fmrp.usp.br/projeto/inct/pdf/SUB19.pdf
Coordenador: Eduardo Magalhães Rego
1. Avaliar o papel da disquerina nas células tronco hematopoéticas comparando CTH de camundongos mutantes para Dkc1 ou selvagens, quanto a sua capacidade de repovoar receptores C57/BL6 letalmente irradiados;
2. Avaliar o papel da disquerina na diferenciação do precursor linfóide mais imaturo por ensaios de repopulação competitivos utilizando camundongos rag-/-, os quais não apresentam células T e B maduras no sangue periférico;
3. Quantificar a expressão do gene Dkc1 por PCR em Tempo Real.em precursores isolados por FAC Sorting da MO de camundongos Dkc1m e selvagens;
4. Analisar apoptose e crescimento celular dos progenitors linfóides Dkcm comparadas as células correlatas dos animais selvagens
Sub-projeto 20: “Modelo de Leucemia Aguda em Chlorocebus aethiops (Cercopithecus aethiops) Usando Células Tronco Hematopoéticas Transduzidas com Vetor Retroviral Contendo o Gene Híbrido CALM-AF10”
http://www.hemocentro.fmrp.usp.br/projeto/inct/pdf/SUB20.pdf
Coordenador: Eduardo Magalhães Rego
1. Estabelecer modelo de leucemia aguda em Chlorocebus aethiops Usando Células Tronco Hematopoéticas Transduzidas com Vetor Retroviral Contendo o Gene Híbrido CALM-AF10
2. Estabelecer protocolo de coleta e cultura de células tronco hematopoéticas de medula óssea
3. Estudar as características hematológicas, citogenéticas e moleculares 4. Determinar protocolo de imunossupressão e transplante de medula óssea 5. Estabelecer o modelo de expressão de genes por vetor retroviral em células
tronco hematopoéticas da medula óssea de Chlorocebus aethiops
6. Estudar as alterações hematológicas, citogenéticas e moleculares decorrentes da expressao retroviral o gene CALM-AF-10 em células da medula óssea de Chlorocebus aethiops após transplante autólogo.
Sub-projeto 21: “Avaliação do potencial terapêutico de células-tronco mesenquimais na regeneração de úlceras de pele ocasionadas por queimadura térmica extensa em modelo animal”
http://www.hemocentro.fmrp.usp.br/projeto/inct/pdf/SUB21.pdf
Coordenador: Júlio César Voltarelli
1. Comparar o potencial terapêutico e regenerativo de CTMs xenogênicas e alogênicas;
2. Comparar o potencial terapêutico e regenerativo de CTMs administradas por via tópica e/ou via sistêmica;
3. Comparar o potencial terapêutico e regenerativo de CTMs xenogênicas selvagens (Gal-1+/+) ou destituídos do gene da galectina 1 (Gal-1-/-);
4. Avaliar a gravidade da queimadura e o processo de regeneração tecidual por análises histopatológicas das biópsias das úlceras;
5. Analisar a expressão gênica e a expressão in situ de fatores angiogênicos, fatores de crescimento, metaloproteinases, quimiocinas e citocinas em biópsias das úlceras;
6. Analisar a expressão protéica diferencial por abordagem proteômica das biópsias das úlceras.
Sub-projeto 22: “Uso de celulas-tronco mesenquimais modificadas geneticamente para expressão do fator IX em modelos murinos portadores de Hemofilia B”
http://www.hemocentro.fmrp.usp.br/projeto/inct/pdf/SUB22.pdf
Coordenador: Dimas Tadeu Covas
1. Isolamento e expansão de células-tronco mesenquimais hepáticas murinas; 2. Cultivo, expansão e caracterização da linhagem de célula-tronco
3. Modificação gênica de pericitos murinos (mCTM/FIX) e linhagem LX-2 humano (hLX-2/FIX) com o fator IX recombinante utilizando o sistema retroviral;
4. Clonagem celular das linhagens celulares mCTM/FIX e hLX-2/FIX para a obtenção de um clone com elevados níveis da proteína recombinante;
5. Caracterização das linhagens recombinantes mCTM/FIX e hLX-2/FIX quanto o nível de expressão do mRNA relativo ao FIX por RT-PCR em tempo real e nível de proteína presente no citoplasma por ELISA;
6. Avaliação da atividade biológica do fator IX recombinante presente no sobrenadante destes clones celulares pelo teste in vitro de coagulação sangüínea APTT (tempo de tromboplastina parcial ativada);
7. Infusão dos clones recombinantes mCTM/FIX e hLX-2/FIX em camundongos hemofílicos portadores de hemofilia B;
8. Avaliação da cinética in vivo do fator IX recombinante em diferentes tempos após a infusão;
9. Avaliação da enxertia da linhagem recombinante no tecido murino;
10. Avaliação da manutenção do período de expressão da proteína recombinante.
Sub-projeto 23: “Desenvolvimento de um bioprocesso para expansão de Células-Tronco Mesenquimais em microcarregadores”
http://www.hemocentro.fmrp.usp.br/projeto/inct/pdf/SUB23.pdf
Coordenador: Dimas Tadeu Covas
1. Isolamento, cultivo e expansão em cultura estática de células-tronco mesenquimais da medula óssea e da parede da veia umbilical como procedimento de referência (controle);
3. Comparar as CTM cultivadas em microcarregador em biorreator “spinner” e cultura estática utilizando cinco parâmetros: a) morfologia; b) perfil imunofenotípico; c) perfil citogenético; d) potencial de diferenciação em adipócitos, osteócitos e condrócitos e e) perfil de expressão gênica;
4. Comparar a eficiência do cultivo de CTM em biorreator “spinner” e cultura estática quanto: a) potencial de expansão (número de duplicações da população inicial); b) velocidade de expansão (tempo de duplicação); c) viabilidade celular e d) atividade metabólica (consumo de glicose, produção de lactato, produção de amônia, entre outros);
Sub-projeto 24: “Proteômica funcional: estudos do papel da nucleofosmina na gliomagênese”
http://www.hemocentro.fmrp.usp.br/projeto/inct/pdf/SUB24.pdf
Coordenador: Lewis Joel Greene
1. Extensão dos estudos de obtenção de mapas bidimensionais de proteínas por eletroforese bidimensional das amostras de novos pacientes.
2. Identificação de proteínas por espectrometria de massas por MALDI-TOF-TOF 3. Introdução da estratégia proteômica de Shotgun peptide sequencing
complementando os dados obtidos por gel bidimensional.
4. Ensaios de proliferação, migração e apoptose sob estímulos por EGF em linhagens celulares T98G e U87MG.
5. Obtenção de mapas bidimensionais de extratos protéicos das linhagens celulares T98G e U87MG sob estímulo de EGF.
6. Identificação de proteínas diferencialmente expressas entre células estimuladas por EGF e não-estimuladas.
7. Silenciamento ou modulação da expressão do gene de nucleofosmina por RNA de interferência (RNAi) em linhagens celulares T98G e U87MG com ou sem estímulo por EGF e estudo funcional (ensaios de proliferação, migração e apoptose)
