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O estudo dos genes WT1 e WT2 e da apoptose em
pacientes com tumor de Wilms
Campinas, 2014
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O tumor de Wilms é uma neoplasia embrionária, originada de células do blastema metanéfrico, sendo histologicamente caracterizado como tumor trifásico, pois as células blastematosas, estromais e epiteliais estão presentes em proporções variáveis, com grande diversidade de arranjo celular e graus de diferenciação com ou sem anaplasia. Este tumor está associado a síndromes genéticas e a malformações do trato geniturinário. O objetivo desta tese foi avaliar as alterações nos genes WT1 e WT2 e a relação do índice apoptótico com o estadiamento tumoral. Para investigação das alterações nos genes WT1 e WT2, foi utilizado o método FISH, a presença das proteínas WT1, p53 e MMP-2 foi investigada por imunoistoquímica e para detectar células em apoptose, foi utilizado o método TUNEL. Os resultados evidenciaram cópias extras dos genes WT1 e WT2, com citogenética molecular nuc ish (WT1x3),(WT2x3) [100%], sugerindo que a evidencia da cópia-extra do gene WT2 pode ser explicada por trissomia ou por isodissomia uniparental, porém a presença da cópia-extra do WT1, até o momento, não foi relatada em qualquer caso clínico na literatura, sendo necessários mais estudos que a justifiquem. Por imunohistoquímica, o tumor apresentou reação positiva para WT1 (80%), p53 (96,4%), assim como no estroma e ao redor do tumor, para MMP-2 (97%). Possivelmente essa alta expressão de WT1 pode estar refletindo a perda da regulação desse gene no desenvolvimento normal celular. A detecção da p53 neste estudo pode indicar a mutação do gene TP53, sugerindo que os tumores de Wilms poderiam progredir para anaplasia, após adquirem mutação do TP53, porém não como um evento isolado. Outros eventos seriam necessários para esta progressão, como a perda do alelo normal do TP53. A alta expressão da MMP-2 no estroma e ao redor do tumor não implica em sua atividade proteolítica, já que essa proteína pode estar em sua forma latente como também ativa e a técnica imunohistoquímica utilizada neste trabalho não diferencia essas formas. Não se identificou diferença significativa do índice apoptótico segundo estadio tumoral (p=0,937), mas os tumores em estadio III apresentaram índice seis vezes menor o daqueles em estadio II, em ausência de neoadjuvância, proporção que aumentou para 29 vezes, na presença de quimioterapia neoadjuvante, parecendo indicar que a neoadjuvância pode interferir sobre os mecanismos envolvidos na apoptose.
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Wilms' tumor is an embryonic neoplasm arising from cells of the metanephric blastema, and histologically characterized as three-phase tumor, because blastematous, stromal and epithelial cells are present in varying proportions, with great diversity of cell arrangement and degrees of differentiation, with or without anaplasia. This tumor is associated with genetic syndromes and malformations of the genitourinary tract. The aim of this thesis was to evaluate changes in WT1 and WT2 genes and the relationship of apoptotic index to tumor staging. For investigation of changes in WT1 and WT2 genes, the FISH method was used, the presence of the WT1 p53 and MMP-2 proteins was investigated by immunohistochemistry and to detect cells in apoptosis, the TUNEL method was used. The results showed extra copies of WT1 and WT2 genes with molecular cytogenetic nuc ish (WT1x3), (WT2x3) [100%], suggesting that the evidence of extra-copy of WT2 gene can be explained by trisomy or uniparental isodisomy, but the presence of extra-copy of WT1, so far, has not been reported in any clinical case in the literature, being necessary more studies to justify it. By immunohistochemistry, the tumor showed a positive reaction for WT1 (80%), p53 (96.4%), as well as for MMP-2 (97%), in the stroma and surrounding the tumor. Possibly this high expression of WT1 may reflect the loss of regulation of this gene in the normal cell development. The detection of p53 in this study may indicate the mutation of the TP53 gene, suggesting that the Wilms' tumors may progress to anaplasia, after acquiring mutation of TP53, but not as an isolated event. Other events are needed for this progression, as loss of the normal allele of TP53. The high expression of MMP-2, in the stroma and surrounding the tumor, does not imply its proteolytic activity, since this protein may be at its latent form as well as active and the immunohistochemical technique used in this study does not differentiate these forms. There was no significant difference in the apoptotic index according to tumor stage (p = 0.937), but stage III tumors showed a six times smaller index than those in the stage II, in the absence of neoadjuvant therapy, rising to 29 times in the presence of chemotherapy neoadjuvant, seeming to indicate that neoadjuvant therapy may interfere with the mechanisms involved in apoptosis.
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SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO 29
1.1 EMBRIOLOGIA RENAL 30
1.2 O TUMOR DE WILMS 34
1.2.1 Histiogênese do tumor de Wilms 35 1.2.2 Características clínicas 36
1.2.3 Diagnóstico 39
1.2.4 Classificação histológica tumoral 42 1.2.5 Relação entre estadiamento do tumor de Wilms e esquema terapêutico 47
1.3 BIOLOGIA MOLECULAR NO TUMOR DE WILMS 50
1.3.1 Genes relacionados ao tumor de Wilms 51
1.3.2 Marcadores moleculares 56
1.3.3 Crescimento e morte celular no tumor de Wilms 58
2 JUSTIFICATIVA 63 3 OBJETIVOS 65 3.1 OBJETIVO GERAL 65 3.2 OBJETIVOS ESPECIFICOS 65 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 66 4 MANUSCRITO 1 81 5 MANUSCRITO 2 94 6 CONCLUSÃO 110
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DEDICATÓRIA
Aos meus filhos, Dudu e Gemaninha. Razão da minha vida.
A Roberto, pelo seu amor e por estar sempre ao meu lado, sem me deixar desistir.
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“Aprender
é a única coisa de que a mente nunca se cansa, nunca tem medo e
nunca se arrepende.”
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“Cada um que passa em nossa vida, passa sozinho, pois cada pessoa é única e nenhuma substitui a outra. Cada um que passa em nossa vida passa sozinho, mas quando parte, nunca vai só nem nos deixa a sós. Leva um pouco de nós, deixa um pouco de si mesmo. Há os que levam muito, mas há os que não levam nada”.
Saint-Exupéry
A Deus, por mais essa oportunidade.
Aos meus filhos, por entenderem, compartilharem e apoiarem essa nova etapa da minha vida, Sem vocês, com certeza, não teria conseguido viver esses momentos. Roberto, por todo o amor, carinho, apoio, cumplicidade e incentivo, sem os quais a vida não seria tão boa.
Aos meus pais, Aloisio e Ivone, grandes incentivadores e admiradores da minha carreira, presença constante na minha vida, sempre me ensinaram a trabalhar e lutar pelos meus ideais.
Aos meus irmãos, Alexandre, Valéria, Verônica, Aloisio e Ana Tereza, por todo apoio, incentivo, respeito e carinho. Tenho muito orgulho de tê-los como irmãos. Alexandre e Verônica, Tiago, Renan e Victor, o carinho e o apoio de vocês com Dudu e Germaninha foram fundamentais.
A Ana Luiza e Victor, pelas diversas “manobras” com Dudu e Germaninha.
A Profª. Drª. Laurecir, por ter me aceitado como aluna, pelo aprendizado, pelas oportunidades, pelo incentivo, pela paciência, por todo o apoio e dedicação e,
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principalmente, por ter enfrentado comigo todos os desafios. Laure, obrigada pelo carinho.
A Profa Dra Tereza Cartaxo, co-orientadora desta tese, suas sugestões foram fundamentais para a realização desse trabalho.
A Adriana e a Nara, por estarem sempre dispostas a ajudar desde o início desse projeto.
Ao Prof. Dr. Edson Pimentel, pelo apoio e carinho.
A Profa. Drª. Heidi, por disponibilizar seu laboratório para a realização do TUNEL. Aos profissionais do Laboratório do CEHONPE por oportunizarem nossos experimentos.
A Claiton, pelo apoio na busca dos blocos de parafina.
Ao Serviço de Patologia do Hospital Oswaldo Cruz, por disponibilizar o material da pesquisa.
A Lílian, pelo acolhimento e carinho desde o primeiro dia que chegamos à UNICAMP, sempre muito prestativa, cuidadosa e bastante competente no trabalho burocrático de que necessitávamos.
A Andréa e Karine, pelo apoio, carinho, parceria e amizade. A Eduardo, pelas aulas de Biologia e Bioquímica.
Filipe valeu a contribuição, jamais esquecerei inclusive da “Rota do Folato”.
As minhas amigas, Viviane e Neves, que sempre foram muito parceiras nessa jornada. Foi muito bom nosso convívio!
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guloseimas e boas conversas.
A Inalda, Bosco e Glória, pela colaboração no manuseio dos prontuários dos pacientes.
A Emílio, pelo apoio em todas as nossas idas e permanências em Campinas. A Deuzany, pelo apoio e amizade desde a graduação.
A Verinha, por ter apoiado e incentivado essa batalha.
A Faculdade de Enfermagem Nossa Senhora das Graças – UPE, pelo apoio nesses quatro anos.
Ao Programa de Pós-Graduação em Biologia Celular e Estrutural da UNICAMP pelo acolhimento no período do doutorado.
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Segundo Manuscrito
Tabela 1 – Classificação histológica dos tipos de tumor de Wilms segundo grau de risco – Hospital Universitário Oswaldo Cruz – 2000-2010 ... 100 Tabela 2 – Distribuição de frequência dos tipos tumorais de Wilms, segundo grau de risco e estadiamento – Hospital Universitário Oswaldo Cruz – 2000-2010 ... 101 Tabela 3 – Medidas-resumo do número de células e do índice apoptótico segundo quimioterapia neoadjuvante– Hospital Universitário Oswaldo Cruz – 2000-2010 102 Tabela 4 – Índices apoptóticos segundo estadio do tumor de Wilms e
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Quadro 1- Síndromes genéticas e características clínicas associadas ao TW ... 38 Quadro 2 – Relação de exames complementares que devem integrar a
investigação diagnóstica de tumor de Wilms... 41 Quadro 3 - Classificação histológica dos tumores renais da infância segundo a Sociedade Internacional de Oncologia Pediátrica ... 42 Quadro 4 – Protocolos de tratamento estratificado, baseados na extensão e nos fatores prognósticos propostos pelo NWTSG e SIOP ... 48 Quadro 5 – Critérios de estadiamento do tumor de Wilms, segundo SIOP e
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PRIMEIRO MANUSCRITO
Figura 1. Diagnóstico histológico e imunohistoquímico de tumor de Wilms ... 91 Figura 2. Hibridização in situ do tecido tumoral incluído em parafina do paciente com TW, a partir da técnica de FISH ... 92 Figura 3. Micrografia da técnica do TUNEL ... 93
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LISTA DE ABREVIATURAS
BAX Proteína X associada à BCL-2 (do inglês, BCL2 associated X protein) BCL-2 Proteína 2 de células B de linfoma (do inglês, B-cell lymphoma protein 2) CDKN1C Inibidor de quinase dependente de ciclina tipo 1C (do inglês, cyclin-dependent
kinase inhibitor 1C)
CEHONPE Centro de Onco-hematologia Pediátrica
DAX1 Sexo reverso dosagem-sensitiva, região crítica do gene de hipoplasia adrenal (do inglês dosage-sensitive sex reversal, adrenal hypoplasia congenita, critical region)
DNA Ácido desoxirribonucleico (do inglês, deoxyribonucleic acid)
EGR1 Resposta 1 do crescimento precoce (do inglês, early growth response 1) EGR2 Resposta 2 do crescimento precoce (do inglês, early growth response 2) EMT Transição epitélio-mesenquimal (do inglês, epithelial-mesenchymal transition). GCBTTW Grupo Cooperativo Brasileiro para Tratamento do Tumor de Wilms
H19 Gene H19
HUOC Hospital Universitário Oswaldo Cruz
IGF-2 Fator de crescimento insulina-símile Tipo 2 (do inglês, insulin-like growth factor 2)
INCA Instituto Nacional de Câncer José Alencar Gomes da Silva KTS Lisina, Tirosina, Serina
LOH Perda de heterozigosidade (do inglês, lost of heterozigosity)
MET Transição mesênquimo-epitelial (do inglês, mesenchyme-epithelial transition) MMP Metaloproteinase
MMP2 Metaloproteinas 2 (gelatinase A)
NWTSG Grupo Nacional de Estudo de Tumor de Wilms (do inglês, National Wilms Tumor Study Group)
p53 Proteína citoplasmática 53 (do inglês, tumor protein 53) PAX2 Gene da proteína de caixa pareada 2 (do inglês, paired box-2)
PAX6 Gene responsável pela aniridia
PDGF-R Receptor do fator I de crescimento derivado de plaqueta RN Restos nefrogênicos
RNIL Restos nefrogênicos intralobares RNPL Restos nefrogênicos perilobares SBW Síndrome de Beckwith-Weidmann
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SDD Síndrome de Denys-Drash SGB Simpson-Golabi-Behmel
SIOP Sociedade Internacional de Oncologia Pediaátrica (do francês, Societé Internationale d’Oncologie Pediátrique)
SYNDECAN 1 Receptor do fator de crescimento de fibroblastos proteoglicanas de sulfato de heparin (do ingles, Heparan Sulfate Proteoglycan Fibroblast Growth Factor Receptor)
TP53 Gene Supressor Tumoral TP53
TW Tumor de Wilms
UKCCSG Grupo de Estudo do Câncer da Criança do Reino Unido (do inglês, United Kingdom Children’s Cancer Study Group)
UPE Universidade de Pernambuco
VEGFR1 Receptor do fator de crescimento endotelial vascular (do inglês, vascular endothelial growth receptor)
WARG Síndrome de associação de TW, aniridia, malformações geniturinárias e retardo mental
WNT Vírus de tumor mamário em rato tipo não alado (do inglês, wingless-type mouse mammary tumor virus)
WNT4 Membro 4 do sítio de integração do vírus de tumor mamário em rato tipo não alado (do inglês, wingless-type mouse mammary tumor virus integration site, member 4)
WT1 Proteína-1 do tumor de Wilms (do inglês, Wilms tumor protein-1)
WT1 Gene-1supressor do tumor de Wilms (do inglês, Wilms’ tumor supressor gene-1)
WT2 Gene-2 supressor do tumor de Wilms (do inglês, Wilms’ tumor supressor gene-2)
1 INTRODUÇÃO
O câncer pediátrico representa de 0,5% a 3% de todos os tumores na maioria das populações (PARKIN et al., 1988; BUCKLEY, 2011), sendo a primeira causa de morte por doença, desde um ano de idade até o final da adolescência (BRASIL, 2014).
No Brasil, de acordo com os dados de Registro de Câncer de Base Populacional, a incidência de câncer pediátrico se aproxima a 3% (BRASIL, 2013). Para o período de 2012 a 2013, as estimativas de incidência realizadas pelo Instituto Nacional de Câncer José Alencar Gomes da Silva (INCA) apontaram a ocorrência de 11.530 casos novos de câncer em crianças e adolescentes no país (BRASIL, 2013).
Dentre os cânceres pediátricos, os tumores renais representam de 5% a 10% (D’ANGIO, 2003), sendo o tumor de Wilms (TW), também conhecido como nefroblastoma, o tumor embrionário maligno mais comum em crianças (RIVERA; HABER, 2005; GLEASON et al., 2014).
Os tumores sólidos embrionários são neoplasias que se originam a partir de células primordiais do mesoderma que sofrem mutações espontâneas. Todavia neles não há obrigatoriedade de alterações secundárias, como ocorre na maioria das neoplasias em adulto (DEHNER, 1998). São exemplos de tumores sólidos embrionários TW, retinoblastoma, hepatoblastoma, neuroblastoma, tumor neuroectodérmico primitivo e rabdomiossarcoma, os quais, além de se
diferenciarem dos tumores de adultos por suas características
anatomopatológicas, local de acometimento e comportamento clinico, também o fazem pela grande variedade histológica (KOESTERS et al., 2003).
Dentre esses tumores embrionários, o TW é o que evidencia melhor correlação morfológica com as fases do desenvolvimento embrionário. O TW é originado de células primordiais que sofreram mutações espontâneas, resultando
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em um tumor de morfologia trifásica, por possuir como componentes o blastema, o epitélio e o estroma, os quais se assemelham às fases do desenvolvimento do tecido de origem (MASCHIETTO et al., 2008).
De acordo com Kim et al. (2009), vários biomarcadores, como as proteínas p53, WT1, BCL-2, BAX, VEGFR1 e MMP-2, têm sido considerados importantes na patogênese do TW como também parecem estar envolvidos na proliferação e na apoptose das células neoplásicas, bem como influenciar o comportamento biológico desse tumor.
Embora a sobrevivência de pacientes com câncer infantil venha melhorando continuamente nas últimas décadas, a cura nos países em desenvolvimento é menor do que em países desenvolvidos, principalmente devido a fatores socioeconômicos, bem como ao diagnóstico tardio, o que contribui para pior prognóstico devido à doença avançada (HARMON et al., 2011; LJUNGMAN et al., 2011; LUKASA et al., 2012). Assim, a identificação das características de apresentação desse tumor embrionário torna-se importante, pois possibilita a avaliação de fatores que podem interferir na sobrevivência das crianças.
Abordar a embriogênese renal possibilita compreender a patogênese do TW, suas características clínicas, as dificuldades para seu diagnóstico, do que deriva um prognóstico ainda sombrio, apesar dos avanços que se tem feito especialmente no que se refere à biologia molecular desse tumor.
1.1 EMBRIOLOGIA RENAL
O desenvolvimento dos sistemas urinário e genital está intimamente relacionado e ocorre a partir do mesoderma intermediário. Dos cordões nefrogênicos são formados o sistema urinário e a saliência gonadal origina o sistema genital (QUEIROZ; SILVA, 2004).
Os rins se desenvolvem em três estágios, sequenciais, nos quais se identifica que a ontogênese repete a filogênese (TANK et al., 2012). O mesênquima intermediário, disposto longitudinalmente no tronco fetal, subjacente aos somitos e adjacente ao mesoderma esplancnopleural (medialmente) e ao mesoderma mesodérmico (lateralmente), tal como ocorre nos vertebrados inferiores, desenvolve divertículos epiteliais, segmentados, seriais, denominados nefrótomos. Cada nefrótomo é formado por uma cavidade (nefrocele) que se comunica com o celoma por meio de um tubo denominado nefróstoma, cuja parede dorsal evagina como um cordão nefrogênico formado por túbulos (MICU et
al., 2013).
A partir desses primórdios, têm origem os pró-nefros, que se constituem em aglomerados celulares nas partes mais craniais do cordão nefrogênico, cujas extremidades centrais são conectadas ao epitélio celômico sob a forma de conjuntos celulares de conformação linear, que provavelmente representam o tubo peritoneal elementar. Os pró-nefros, que se constituem em rins não funcionantes, surgem no início da quarta semana gestacional, mas degeneram no início da quinta semana de vida uterina (SCHNECK; BELLINGER, 2007; TANANGO, 2007).
As extremidades dorsais dos túbulos craniais se dobram caudalmente e se fundem para formar o ducto excretor primário longitudinal. Na medida em que o processo embrionário prossegue, o ducto excretor primário alonga e sua porção caudal se destaca do cordão nefrogênico, para permanecer imediatamente abaixo da ectoderme. Nesse nível, ele cresce caudalmente, independente do mesênquima nefrogênico, curva-se ventralmente para se abrir na cloaca. Os túbulos formados mais tardiamente, portanto mais caudais, também se abrem nesse ducto e proliferam a partir dele. Na parede ventral da nefrocele ou no teto do celoma adjacente ao tubo peritoneal, são formados arranjos capilares específicos (glomérulos), margeando o epitélio celômico, os quais, contudo, não são funcionantes (MICU et al., 2013).
O segundo estágio de desenvolvimento renal humano consiste na formação dos mesonefros, os quais servem como órgãos excretores para o embrião. Sua
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formação se dá pela conexão dos túbulos ao ducto excretor primário, agora denominado ducto mesonéfrico. Caudalmente inicia-se a formação de cúpulas constituídas por mesênquima intermediário, que darão origem aos nefrons, mas estes ainda não são metaméricos, pois, não estão organizados em uma série de segmentos (QUEIROZ; SILVA, 2004).
Dentro de cada mesonefro, cada túbulo mesonéfrico é uma condensação de células mesenquimais que se epiteliza para formar vesículas. As vesículas crescem, assumem a forma de um S, e uma de suas extremidades se abre no ducto mesonéfrico, enquanto a outra dilata e invagina, de tal forma que a camada mais externa forma a cápsula glomerular, ou cápsula de Bowmann, e a mais interna diferencia-se em podócitos mesonéfricos, que se ligam a capilares invaginados, provenientes de ramos laterais da aorta, para formar os glomérulos (SCHNECK; BELLINGER, 2007; MICU et al., 2013).
Ao final da sexta semana gestacional, cada mesonefro é um órgão fusiforme, alongado, que se projeta na cavidade celômica, bilateralmente ao mesentério dorsal, em nível do septo transverso do terceiro segmento lombar. A projeção completa desse conjunto é denominada ponte mesonéfrica, mesonefro ou corpo de Wolff, resultante de interações epitélio-mesenquimais. A diferença entre o mesonefro e o metanefro (que constitui o rim) é a ausência da alça de Henle, porque no mesonefro os túbulos contorneados proximal e distal já estão formados (SCHNECK; BELLINGER, 2007; MICU et al., 2013).
É importante ressaltar que o ducto mesonéfrico se alonga caudalmente na parte lateral da ponte néfrica e na extremidade caudal da ponte, projeta-se na cavidade celômica, na substância de uma dobra mesonéfrica. Na medida em que os ductos mesonéfricos se aproximam do sinus urogenital, as dobras se fundem entre a bexiga (ventralmente) e o reto (dorsalmente). No embrião do sexo masculino, o ducto mesonéfrico forma os ductos epididimal, eferente e ejaculatório (MICU et al., 2013).
Na porção distal do ducto mesonéfrico, é formado um botão uretérico, originado da transformação de células mesenquimais em células epiteliais, o qual
assume a forma de platô, em cujas extremidades superiores aglomeram-se células mesenquimais. A epitelização dessas células pode originar as vesículas mesonéfricas e, posteriormente, a cápsula de Bowman, o glomérulo e os túbulos contorneados distal e proximal, como também ramificar para formar os túbulos coletores, os cálices e a pélvis renal dos metanefros (QUEIROZ; SILVA, 2004; SCHNECK; BELLINGER, 2007; TANAGO, 2007; MICU et al., 2013).
Os metanefros compartilham com os mesonefros exclusivamente as evaginações do ducto mesonéfrico cuja dicotomização produz o padrão de ductos coletores. Assim, os metanefros são formados a partir de três conjuntos celulares: uma evaginação do ducto mesonéfrico para formar o botão uretérico; uma condensação local do mesênquima para formar o blastema metanéfrico e a migração do mesênquima angiogênico no blastema metanéfrico, para dar origem aos glomérulos e aos vasa recta (MICU et al., 2013).
Durante todo o processo embriológico renal, são observadas
transformações de células mesenquimais em células epiteliais, importantes para a compreensão da patogênese do TW. As interações epiteliais mesenquimais entre o sistema de ductos e o mesênquima circundante ocorrem tanto no sistema mesonéfrico como no metanéfrico. A diferença está em, nos mesonefros, ocorrer uma progressão craniocaudal, com degeneração dos nefros craniais antes que os caudais estejam formados, enquanto que, nos rins metanéfricos, uma parte do mesênquima se mantém como células-tronco, que continuam a se dividir para alongar os túbulos e os ductos coletores, sob a ação da angiotensina II, responsável pela maturação renal e pela formação ureteral (MICU et al., 2013).
A manutenção de células mesenquimais como células-tronco explica o porquê mutações ou interrupções no processo de diferenciação celular podem acarretar na malformação do rim, resultando inclusive em TW (LI et al., 2002).
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1.2 O TUMOR DE WILMS
Em 1793, John Hunter e, em 1814, Hancer fizeram relatos de patologia que foi reconhecida como nefroblastoma, em 1899 (BECKWITH et al., 1996). O cirurgião alemão Carl Max Wilms realizou larga revisão de outros casos na literatura, descrevendo sete casos de sua experiência, tecendo considerações sobre a histogênese dos nefroblastomas e associando ao desenvolvimento do rim. Com isso, o tumor leva até hoje seu epônimo, tumor de Wilms, ligando o cirurgião à história dessa neoplasia (COPPES-ZANTINGA; COPPES, 1999, D’ANGIO, 2003).
O TW é a neoplasia maligna renal mais comum na população pediátrica, afetando uma em 10.000 crianças e respondendo por 6% a 7% dos tumores malignos da infância. Ocorre mais comumente em menores de 5 anos de idade. Cerca de 75% dos casos ocorre em crianças com média de idade igual a 3,5 anos. A incidência após os 10 anos de idade é baixa e a distribuição é maior no sexo masculino (HUI et al., 2012).
A distribuição do TW apresenta diferenças por etnia. É ligeiramente mais frequente em populações de origem negra, com uma incidência maior que dez casos por milhão para negros norte-americanos e nigerianos, enquanto que, em populações de origem asiática, tem menor incidência igualando-se a cerca de três casos por milhão (DUCORE et al., 2004; HUNG et al., 2004). Frequentemente crianças negras com TW apresentam mais anomalias congênitas que as brancas, contudo, na presença de tumor bilateral, não há diferença significativa (BRESLON
et al., 1996).
O Brasil é apontado como um dos países com maior incidência mundial de TW, tendo como referência as cidades de São Paulo e de Goiânia, onde o número de casos anuais é de cerca de sete casos por milhão de crianças (DE CAMARGO
Mesmo que a maioria dos TW seja unilateral e esporádico, 5% a 10% são bilaterais e aproximadamente 2% estão associados à história familiar desse tumor, tendo indicativo de ser de origem germinativa. No entanto o surgimento do tumor, nesses casos ocorre mais precocemente, havendo relatos de acometimento de crianças do sexo masculino aos 29,6 meses de idade (GRUNDY et al., 2002).
As variações na incidência mundial do TW apontam para um maior envolvimento de fatores genéticos na gênese desse tumor (PRITCHARD-JONES; HAWKINS, 1997; FUKUZAWA et al., 2004).
1.2.1 Histiogênese do tumor de Wilms
A histiogênese do TW ainda é controversa, mas há concordância que a origem é a partir do blastema indiferenciado metanefrogênico, que pode sofrer diferenciação bifásica, tanto como célula epitelial ou célula mesenquimal. Sendo assim pode influenciar para que ocorram malformações de tecidos mesenquimais como conjuntivo fibroso, cartilagem, ossos, músculo estriado e liso, e também interferir sobre a formação de túbulos coletores renais (CANALE; MUECKE, 2008).
As células epiteliais e as mesenquimais diferem em diversos aspectos funcionais e fenotípicos, podendo auxiliar na compreensão do TW. Células epiteliais formam camadas, pois apresentam junções aderentes, desmossomos e
gap junctions. Adicionalmente apresentam polarização apical-basolateral
responsável pela distribuição localizada de moléculas de adesão, assim como podem se mover em uma camada celular, sem, contudo se destacar dela. Células mesenquimais, por sua vez, não formam tecidos organizados em camadas, não apresentam organização apical-basolateral ou polarização da superfície celular, mas podem se diferenciar em diversos tecidos, na dependência da sinalização molecular, tal como ocorre na embriogênese renal (THIERY; SLEEMAN, 2006).
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Todavia células epiteliais podem ser transformadas em células mesenquimais também sob a influência de moléculas sintetizadas a partir de genes modificados, num mecanismo ainda não totalmente elucidado, ao invés da hipótese de que a histiogênese do TW derive de alterações gênicas, que orquestram transições epitélio-mesenquimais, originando elementos renais diferenciados e indiferenciados renais (THIERY; SLEEMAN, 2006; CANALE; MUECKE, 2008).
Além das similaridades histológicas entre o TW e a histologia renal, a evidência mais forte são os estudos genéticos que têm demonstrado mutação no gene WT1 em 10% a 15% dos pacientes com o tumor. Essa evidência tem base na função do gene WT1 exercer papel importante na nefrogênese (LOVVRON et
al., 2007).
1.2.2 Características clínicas
Clinicamente, o TW é assintomático na maior parte dos casos, embora possam estar presente vômito, febre e palidez de mucosas (indicativa de anemia). Por esse motivo, em 75% a 80% dos pacientes o tumor é percebido acidentalmente pelos pais, parentes ou pelo pediatra, em uma avaliação de rotina, como um edema ou uma massa abdominal, que aparece no flanco e se desenvolve para a região anterior, depois medial e caudalmente. O limite superior não pode ser delineado e a margem inferior pode ser palpada até o nível da crista ilíaca. Quando localizada à direita, pode oferecer dificuldade para ser diferenciada do fígado e, nesses casos, o critério diferencial é que o tumor não se movimenta durante a respiração. Uma vez que células neoplásicas podem se deslocar e pode ser desencadeada hemorragia a palpação abdominal não deve ser excessiva. (LI
manifestação hemorrágica após trauma abdominal, a qual se acompanha de dor aguda, podendo simular abdômen agudo (CAJAIBA, REYES-MÚGICA, 2007).
A característica dessa massa abdominal é importante porque nos estágios iniciais, o diagnóstico pode ser dificultado mesmo por ultrassonografia e tomografia computadorizada, sendo necessário lançar mão de outros exames complementares como dosagem de eritropoietina urinária, renina plasmática, pielografia intravenosa, mielograma, dentre outros (CANALE; MUECKE, 2008; MARTINEZ et al., 2010).
A hematúria também é um sinal presente em 3,5% a 20% dos casos, podendo ser macroscópica ou se manifestar como coloração urinária avermelhada, mas seu valor diagnóstico é controverso (SAH et al., 2010). Alguns estudiosos consideram-na um indicativo de mau prognóstico, enquanto outros entendem que a taxa de sobrevida independe de sua presença (GRUNDY et al., 2002; CANALE; MUECKE, 2008).
Até 50% das crianças com TW apresentam hipertensão arterial em alguma fase da evolução da doença, podendo ser causada pela isquemia renal, decorrente da pressão do tumor diretamente sobre a artéria renal, ou ainda decorrer do aumento de secreção de renina pelo tumor (GRUNDY et al., 2002; PRITCHARD-JONES et al., 2002; DOME et al., 2006; CANALE; MUECKE, 2008). Embora a hipertensão não seja causa isolada de morte nesses pacientes, ela deve ser rigorosamente monitorizada antecedendo a terapêutica cirúrgica (CANALE; MUECKE, 2008).
Podem ser observadas anidria, hemi-hipertrofia, hérnia umbilical e anormalidades geniturinárias, como criptorquidia, edema escrotal, varicocele e hipospádia (GRUNDY et al., 2002; PRITCHARD-JONES et al., 2002; DOME et al., 2006).
Outro dado relevante na caracterização clínica do TW é sua associação com uma grande variedade de síndromes, anormalidades genéticas e diferentes malformações clínicas. Essas síndromes decorrem da ação de genes que estão associados diretamente a tumorigênese ou podem ainda estar atuando em vias
38
bioquímicas das quais pode participar o gene WT1. A associação com síndromes genéticas ocorre em cerca de 2% dos TW. Estes casos (Quadro 1), podem ser divididos em dois grupos principais, as síndromes com e sem aumento do crescimento (SCOTT et al., 2006; CAJAIBA; REYES-MÚGICA, 2007; SAH et al., 2010).
Quadro 1- Síndromes genéticas e características clínicas associadas ao TW
SÍNDROMES CARACTERÍSTICAS
Por supercrescimento
Síndrome de Beckwith-Wiedemam Hemi-hipertrofia, macroglossia, onfalocele, vísceromegalia e predisposição para TW.
Síndrome de Simpson-Golabi-Behmel Macrocefalia, hipertelorismo ocular, macrostomia, macroglossia, anormalidades palatais, retardo mental.
Síndrome de Perlman
Gigantismo fetal, displasia renal, TW, hipertrofia de células das ilhotas, múltiplas anomalias congênitas e retardo mental.
Sem supercrescimento
Síndrome de WARG TW, aniridia, anomalias genitais e retardo mental. Síndrome de Denys-Drash Esclerose mesangial difusa com falência renal
precoce, disgenesia gonodal XY e TW. Síndrome de Frasier Disgenesia gonadal e nefropatia
Li I-Fraumeni
Predisposição ao câncer - 50% de chance de
desenvolver tumores antes da terceira década de vida e 90% desenvolvem câncer antes dos 70 anos de idade.
Fonte: SCOTT et al. (2006)
As síndromes de supercrescimento como Beckwith-Wiedemam, de Simpson-Golabi-Behmel, de Perlman, podem predispor ao TW. A síndrome de Beckwith-Wiedemam, com presença de anomalias genéticas ou epigenéticas no braço curto do cromossomo 11 (11p15.5) é a síndrome de hipercrescimento mais frequente associada ao TW (DUMOUCEL et al., 2014).
Todavia, nas outras síndromes que não apresentam supercrescimento, como a síndrome de WARG, ocorre importante deleção do cromossomo 11 (11p13), região onde está localizado o gene WT1, associado à predisposição de maior risco para TW (DUMOUCEL et al., 2014). A síndrome de Denys-Drash, a
síndrome de Frasier ou tumor bilateral apresentam mutações no gene WT1 que decorre do risco de desenvolver TW variável entre 20% e 90% (PELLETIER et al., 1991).
Anomalias isoladas, como aniridia esporádica, hemi-hipertrofia e malformações geniturinárias, podem também ser acompanhadas de TW, sem, contudo, caracterizar uma síndrome. As anomalias geniturinárias estão presentes em 4,5% a 7,5% dos pacientes com TW unilateral, e em 13,4% dos casos de tumor bilateral (GRUNDY et al., 2002).
Além dessas anomalias que podem acompanhar o TW, em estadios avançados, o sinal clínico pode ser comprometimento de outros órgãos que não o rim, por metástase pulmonar, hepática, retroperitoneal, mediastinal, pleural, diafragmática, adrenal ou óssea, que são as mais frequentes (CANALE; MUECKE, 2008).
Outras complicações que podem se apresentar ao diagnóstico incluem ruptura tumoral, envolvimento de veia cava e átrio cardíaco, hepatomegalia, ascite e insuficiência cardíaca. Pode também haver associação com síndromes paraneoplásicas, tais como policitemia, doença de von Willebrand, deficiência de fator VII (MARTINEZ et al., 2010).
1.2.3 Diagnóstico
O diagnóstico do TW é firmado em períodos diferentes conforme as características de atenção à saúde do país em que reside a criança. Assim há relatos de ocorrer em média entre os 43 e 48 meses de vida, acometendo ambos os sexos na mesma proporção (BRESLOW et al., 2006). No entanto pesquisa realizada na cidade de Lagos, Nigéria, no período de janeiro de 2008 a dezembro de 2012, envolvendo 44 casos, relata predomínio de diagnóstico em crianças de um a cinco anos de idade, com predomínio no sexo masculino, numa proporção
40
de 4:1 feminino (SOYEMI et al., 2013). Estes dados diferem dos resultados de experiência por 10 anos em hospital de Kanti, no Nepal, na qual entre março de 1998 a fevereiro de 2008, dentre os 60 casos diagnosticados, a média de idade ao diagnóstico igualou-se à 36 meses, com razão de sexo masculino:feminino de 3:1 (SAH et al., 2010).
Uma vez identificado qualquer sintoma ou sinal sugestivo de TW, a investigação diagnóstica e a avaliação da extensão da doença devem ter início com a maior brevidade para dar melhores condições prognósticas, já que 92% dos casos alcançam taxa de sobrevivência em cinco anos a partir de terapia adequada (MARTINEZ et al., 2010).
Na anamnese, deve ter atenção para investigar história familiar de casos de câncer, defeitos genitais e tumores benignos. O exame físico deve incluir avaliação de pressão arterial, peso, estatura, tamanho de fígado e baço, presença de linfonodos, dor óssea, edema e anormalidades congênitas, além da presença de massa abdominal (CANALE; MUECKE, 2008).
Quanto aos exames complementares, devem ser realizados exames de imagem, dosagens laboratoriais e biópsia (WIENER et al., 1998; OTHERSEN et
al., 1998; GRUNDY et al., 2002). Na ultrassonografia abdominal, evidencia-se a
presença de uma massa, sólida ou cística, sua relação com estruturas vizinhas, presença de linfonodos regionais, invasão vascular (veias renal e cava inferior), invasão hepática por metástases e ainda o rim contralateral para descartar possibilidade de tumor bilateral (WIENER et al., 1998; OTHERSEN et al., 1998; GRUNDY et al., 2002).
A tomografia computadorizada de abdome fornece dados mais detalhados referentes ao TW Wilms às estruturas vizinhas, permitindo melhor planejamento cirúrgico. Já a imagem por ressonância magnética não é um exame de rotina, devido ao alto custo, porém é importante para diferenciar TW de RN (WEIRICH et
al., 2004; MARTINEZ et al., 2010).
A radiografia simples de tórax deve ser realizada em todos os casos pois a presença de nódulos renais à tomografia computadorizada em ausência de
alterações pulmonares radiológicas é indicativo de maior risco de recorrência tumoral. O objetivo da radiografia de tórax é identificar metástases pulmonares, presente em 10% a 15% dos casos, o que contribui para o estadiamento da doença (RITCHEY et al., 1995; LI et al., 2002; WEIRICH et al., 2004; MARTINEZ;
et al., 2010).
No Quadro 2, estão resumidos os exames complementares que devem compor o diagnóstico de TW, contribuindo para menor risco de subdiagnóstico ou retardo de diagnóstico nos casos recentes (CANALE; MUECKE, 2008).
Quadro 2 – Relação de exames complementares que devem integrar a investigação diagnóstica de tumor de Wilms
INVESTIGAÇÃO EXAME COMPLEMENTAR
Hematológica Eritrograma, leucograma e trombocitograma, com contagem de reticulócitos Mielograma (principalmente nos casos de policitemia)
Bioquímicos
Provas de função hepática (aspartato aminotrasnferase, alanina
aminotransferase, desidrogenase lática, fosfatase alcalina, proteínas totais e frações)
Provas de função renal (ureia, creatinina, depuração da creatinina) Eletrólitos séricos
Ácido úrico
Urinária Urinálise completa Contagem de Addis
Outras Dosagem de eritropoietina sérica Dosagem de renina
Fonte: Adaptado de Canale e Muecke (2008, p. 69)
Quando os tumores são bilaterais ou sincrônicos, o risco de insuficiência renal é importante e todos os esforços devem ser feitos para manutenção da função renal. Sua frequência varia de 4% a 6%, mas, nos casos de TW familiar, em torno de 2% estão associados ao aumento da frequência de tumores bilaterais e a idade de acometimento é menor no momento do diagnóstico (BRESLOW et
42
1.2.4 Classificação histológica tumoral
O TW, dentre as características que interferem sobre o prognóstico em longo prazo e a taxa de sobrevida, difere de outros cânceres. Inclui o cuidado de não realizar procedimentos que favoreçam o deslocamento de células (MARTINEZ
et al., 2010). Por esse motivo, a Societé Internationale d’Oncologie Pediatrique (SIOP) considera que a classificação histológica tumoral e o estadiamento devem
ser realizados após o tratamento cirúrgico, independente de ser antecedida por quimioterapia, denominada quimioterapia neoadjuvante (VUJANIĆ et al., 2002).
O Quadro 3 apresenta os tipos tumorais classificados segundo a SIOP, revisada em 200, na qual se observa a obrigatoriedade de considerar a presença ou não de quimioterapia neoadjuvante, já que essa terapêutica oncológica promove alterações celulares e teciduais. A SIOP admite tumores de baixo risco, risco intermediário e alto risco para recorrência (VUJANIĆ et al., 2002).
Quadro 3 - Classificação histológica dos tumores renais da infância segundo a Sociedade Internacional de Oncologia Pediátrica
1. Casos pré-tratados
I. Tumores de baixo risco Nefroblastoma mesoblástico
Nefroblastoma cístico parcialmente diferenciado Nefroblastoma completamente necrótico
II. Tumores de risco intermediário Nefroblastoma tipo epitelial Nefroblastoma tipo estromal Nefroblastoma tipo misto Nefroblastoma tipo regressivo Nefroblastoma com anaplasia focal III. Tumores de alto risco Nefroblastoma tipo blastematoso
Nefroblastoma com anaplasia difusa Sarcoma de células claras
Tumor rabdoíde do rim 2. Casos operados sem quimioterapia prévia
I. Tumores de baixo risco Nefroblastoma mesoblástico
Nefroblastoma cístico parcialmente diferenciado II. Tumores de risco intermediário Nefroblastoma não anaplásico e suas variantes
Nefroblastoma com anaplasia focal III. Tumores de alto risco Nefroblastoma com anaplasia difusa
Sarcoma de células claras Tumor rabdóide do rim Fonte: VUJANIĆ et al. (2002).
O TW é caracterizado por sua diversidade histológica, estando descrito como um tumor embrionário trifásico. O tumor pode apresentar um, dois, ou três componentes histológicos, podendo ser células blastematosas, estromais e epiteliais, em proporções variáveis com grande diversidade de arranjo celular e graus de diferenciação, com ou sem anaplasia (MAITI et al., 2000; KUSAFUKA, 2002; KUMAR et al., 2004).
O TW apresenta as características dos tipos tumorais de acordo com os tipos celulares:
Componente epitelial
O componente epitelial de diferenciação, presente na maioria dos casos de TW, se apresenta em forma de túbulos lineados por células colunares, com núcleos hipercromáticos, túbulos e estruturas glomerulares que indicam os vários estágios da nefrogênese normal, podendo apresentar também epitélio mucinoso e escamoso, estruturas neurais e células neuroendócrinas (FUKUZAWA et al., 2004).
Os TW com predomínio do componente epitelial são menos agressivos. No entanto, quando submetidos à quimioterapia neoadjuvante, não se obtém redução de volume maior que 40%, do que decorre sua classificação como maus respondentes (WEIRICH et al., 2001). Mesmo assim, geralmente apresentam bom prognóstico (METZGER; DOME, 2005; VERSHUUR et al., 2010), possivelmente porque em torno de 80% desses tumores são diagnosticados e tratados em estadio I e apenas 5,7% de estádio III ou IV (VERSHUUR et al., 2010).
Componente estromal
O TW com predomínio do componente estromal apresenta células fusiformes indiferenciadas e áreas mixoides, podendo apresentar também alguns derivados mesodérmicos, como músculo liso, músculo estriado, tecido adiposo,
44
cartilagem ou osso (LEMERLE et al., 1976; BECKWITH, 1983; FUKUZAWA et al., 2004; RIVERA; HABER, 2005).
Tumores com predomínio do componente estromal predispõem ao desenvolvimento de mutações do gene supressor WT1 (Wilms’ Tumor Suppressor
Gene) (KALAPURAKAL et al., 2004; WEIRICH et al., 2001). A presença do
estroma na histologia pode mimetizar sarcoma de células claras, nefroma mesoblástico congênito ou sarcoma sinovial (KALAPURAKAL et al., 2004), podendo ser encontrado focalmente no meio do componente blastematoso. Esses tumores frequentemente são bilaterais e encontrados em crianças menores de 3 anos de idade (SABA et al.,1998).
TW com predomínio estromal são mal respondentes à quimioterapia neoadjuvante, já que 86,1% deles não reduzem o volume tumoral mais que 40% (WEIRICH et al., 2001). Mesmo assim, pesquisa realizada em 2010, envolvendo 1389 casos, dos quais 10% eram estromais, demonstrou taxa livre de doença em cinco anos em 94,3% dos pacientes (VERSCHUUR et al., 2010).
Componente blastematoso
Os TW do tipo histológico blastematoso apresentam células pequenas, variando de ovais a redondas, com núcleos irregulares e pequenos, citoplasma escasso, várias figuras mitóticas e corpos apoptóticos. Apresentam padrão de crescimento difuso, no formato de serpentina, nodular ou basalóide (FUKUZAWA
et al., 2004; RIVERA; HABER, 2005).
O predomínio do componente blastematoso no TW se caracteriza por ser altamente invasivo, do que decorre mais de 75% desses tumores serem classificados em estadio III ou IV (RIVERA; HABER, 2005). Todavia o blastema apresenta boa resposta à quimioterapia neoadjuvante, o que possibilita melhores condições cirúrgicas (WEIRICH et al., 2001).
O TW com predomínio blastematoso tem pior prognóstico e respondem por maior taxa de recidiva em cinco anos, quando comparados aos tumores com
predomínio estromal ou epitelial (KALAPURAKAL et al., 2004).
Anaplasia
A anaplasia é caracterizada pela presença de polimorfismo dos componentes histológicos, aumento do tamanho nuclear (pelo menos três vezes maiores que os núcleos das células adjacentes) e hipercromasia nuclear (GRUNDY et al., 2002).
Entre 5% a 10% dos TW apresentam anaplasia, alteração histológica considerada um marcador de resistência à quimioterapia e associação a disseminação regional, óbitos e recidivas. Todavia a associação entre anaplasia e agressividade tumoral ou disseminação tumoral ainda é controversa (WEIRICH et
al., 2004).
A baixa frequência da anaplasia em TW pode estar associada à idade do paciente, sendo rara em pacientes aos 2 anos de idade, atingindo frequência de 13% nos maiores de 5 anos de idade, além do predomínio no sexo feminino e nos afro-americanos (BECKWITH; PALMER, 1978; DOME et al., 2006).
A anaplasia é classificada como focal, quando restrita a uma região do tumor, podendo ser completamente ressecada, não havendo extensão vascular ou sítios metastáticos. É considerada difusa na presença de multifocalidade, existência de sítios extrarrenais, e acentuada atipia identificada em biópsia aleatória. Essa classificação tem importância clínica porque a multifocalidade se associa a pior prognóstico, maior resistência à quimioterapia neoadjuvante e, consequentemente, maior dificuldade no procedimento cirúrgico (MARTINEZ et
al., 2010).
Restos nefrogênicos
Restos nefrogênicos (RN) são caracterizados pela persistência de células do tecido embrionário renal, que podem derivar de falha na diferenciação celular
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(BECKWITH et al., 1990). Esses tecidos embrionários são reconhecidos como possíveis lesões precursoras do TW, estando presente ao redor do rim em aproximadamente 40% das crianças (BECKWITH et al., 1990; BECKWITH,1998).
Os RN são encontrados em 1% dos rins normais dos recém-nascidos e possivelmente sofrem regressão ou terminam sua diferenciação ainda na infância (GRUNDY et al., 2002). Todavia, sob a ação de fatores de crescimento e proliferação, podem ainda involuir para tecido fibroso, ou mesmo originar tecidos neoplásicos benignos ou malignos, dentre os quais para TW. Os RN estão presentes em cerca de 25% dos TW unilaterais e em 100% dos tumores bilaterais removidos (BECKWITH, 1998).
Os RN podem ser classificados de acordo com a localização no lobo renal e com a aparência histológica (BECKWTH et al., 1990). Os restos nefrogênicos intralobares (RNIL) mais frequentemente são únicos e estão localizados em qualquer lugar do interior do lobo renal; sugerem falhas em fases precoces do desenvolvimento renal. Podem ser acompanhados de aniridia, malformação geniturinária e doença renal bilateral metacrômicas, alterações compreensíveis quando se considera a embriogênese renal (HENNIGAR et al., 2001).
Os restos nefrogênicos perilobares (RNPL), são numerosos, e encontrados na periferia do lobo renal, indicando alterações tardias no desenvolvimento renal. Estão associados à hemi-hipertrofia e à doença bilateral sincrônica, mas apresentam menor probabilidade de induzir formação do TW, por terem permanecido no estágio embrionário em fase mais tardia da embriogênese renal. Mesmo assim têm alto potencial de diferenciação, estando mais associados à presença de blastema e túbulos renais (HENNIGAR et al., 2001; RAVENEL et al., 2001; GRUNDY et al., 2002; SCHUMACHER et al., 2003; FUKUZAWA; REEVE, 2007).
Pacientes que apresentam maior incidência de RNs, também apresentam mutações dos genes WT1 e WT2 (Wilms’ Tumor Suppressor Genes), sugerindo que essas mutações estejam relacionadas com a persistência anormal das células embrionárias. O diagnóstico nos portadores de TW que apresentam RNIL ocorre
antes dos que apresentam RNPL, 23 e 36 meses respectivamente (BECKWITH, 1998).
Embora os tipos histológicos sejam considerados indicativos do prognóstico em todos os cânceres, no TW há maior valorização do estadiamento, em decorrência da invasividade desse tumor e de seu alto poder de metastatização à distância para pulmão (43%), fígado (23%), peritônio (17%) e mediastino (16%), dentre outras localizações menos frequentes (CANALE; MUECKE, 2008).
1.2.5 Relação entre estadiamento do tumor de Wilms e esquema terapêutico
Além do padrão histológico, o estadiamento é um fator prognóstico importante na estimação do prognóstico do doente (RITCHE et al., 1995; WIENER
et al., 1998; WEIRICH et al., 2001).
Enquanto a classificação histológica permite determinar o risco de recidiva, bem como, em alguns tipos, estimar a resposta à quimioterapia neoadjuvante ou mesmo adjuvante, o estadiamento possibilita avaliar a agressividade tumoral, do que decorre a estimativa do prognóstico, bem como da taxa de recidiva em cinco anos, uma vez que a conduta terapêutica cirúrgica é consagrada (GRAF et al., 2012; KALAPURAKAL et al., 2004; CANALE; MUECKE, 2008).
O estadiamento do TW e o tratamento quimioterápico têm sido alvo de controvérsias entre a National Wilms Tumor Study Group (NWTSG), sediada nos Estados Unidos da América, desde 1967, e a SIOP, representante dos centros de tratamento da Europa, desde 1993. Ambas propõem esquemas de estadiamento e recomendam condutas quimioterápicas neoadjuvante e adjuvante conforme as evidências reunidas que vão reunindo ao longo dos anos, as quais estão resumidas no Quadro 4 e que têm relevância para o tema desta tese.
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Quadro 4 – Protocolos de tratamento estratificado, baseados na extensão e nos fatores prognósticos propostos pelo NWTSG e SIOP
ÓRGÃO CIRURGIA QUIMIOTERAPIA OU RADIOTERAPIA
NWTSG–1 Nefrectomia radical antes de quimioterapia
Actinomicina D + vincristina dão melhores resultados para estadios II e III
NWTSG-2
No estadio I, terapia por 6 ou 15 meses dão resultados similares
Adição de adriblastina em estadio IV aumentou sobrevida de 63% para 77%
NWTSG-3
No estadio I, tratamento por 6 meses ou 10 semanas, dão mesmo resultado
Radioterapia no estadio II não adiciona vantagem
Aumento da irradiação de 1000 Gy para 2000 Gy não representa melhora no estadio III No estadio IV, acrescentar ciclofosfamida, não melhora sobrevida
NWTSG-4
O risco de recorrência aumenta se houver disseminação celular ou ausência de investigação linfonodal
Acrescer actinomicina D e adriblastina à quimioterapia pode ser seguro e reduz custos
NWTSG-5
Perda de heterozigosidade dos cromossomos 1p e 16q
aumentam risco de recidiva independente de estadiamento e histologia
NWTSG-6
Nefrectomia sem quimioterapia para pacientes < 2 anos, tumor < 550 g, estadio I com histologia favorável
SIOP-1 Quimioterapia neoadjuvante seguida de nefrectomia
Uso de radioterapia pré ou pós-operatória não melhora sobrevida e aumenta risco de ruptura tumoral
SIOP-2 Ruptura tumoral é mais frequente sem quimioterapia neoadjuvante
SIOP-5 Quimioterapia isolada é tão eficaz quanto
radioterapia para prevenção de ruptura tumoral SIOP-6 Taxa de recidiva no estadio I, com vincristina + actinomicina D por 17 semanas = 38 semanas
SIOP-9 Quimioterapia neoadjuvante de 4 ou 8 semanas
são similares
SIOP-93-01 Quimioterapia pós-operatória de 18 semanas =
4 semanas, com redução dos efeitos colaterais Fonte: Adaptado de Kalapurakal et al. (2004)
A análise dos dados apresentados no Quadro 4 deixa perceber que o estadiamento tem sido mais valorizado que a classificação histológica no tratamento do TW, assim como o manejo desses pacientes ainda se constitui em desafio quanto à avaliação de risco de recidiva.
O Quadro 5 mostra os cinco estadios que as duas agências admitem para o TW, no qual se observa como principais diferenças, e únicas, a classificação tumoral em presença de biópsia anterior à excisão do tumor (considerada estadio III para a SIOP e II para a NWTSG) e a ruptura tumoral durante o ato cirúrgico, considerada apenas pela SIOP para graduar em estadio III (BOCCON-GIBOD et
al., 2000; PRITCHARD-JONES, 2002; DE KRAKER et al., 2004; METZGER;
DOME, 2005).
Quadro 5 – Critérios de estadiamento do tumor de Wilms, segundo SIOP e NWTSG
ESTADIO SIOP NWTSG
I
Tumor limitado ao rim ou com presença de pseudocápsula, a qual pode estar invadida, desde que sua face externa não esteja comprometida
Protusão do tumor no interior do sistema piélico e no ureter, sem invasão de suas paredes.
Ausência de invasão dos vasos do seio renal. Vasos intrarrenais podem estar invadidos
Tumor confinado ao rim e completamente ressecado
II
O tumor se estende além do rim ou penetra a cápsula renal ou a pseudocápsula fibrosa até a gordura perirrenal, mas é completamente ressecado. Infiltração do seio renal ou dos vasos sanguíneos e linfáticos, invasão dos órgãos adjacentes ou da veia cava
O tumor se estende além do rim, mas é completamente ressecado (penetração na cápsula, invasão de vasos do seio renal, biópsia antes da cirurgia, dispersão tumoral local durante a remoção)
III
Excisão incompleta do tumor, linfonodos
abdominais envolvidos, ruptura do tumor antes ou durante procedimento cirúrgico, presença de tumor na superfície peritoneal, presença de trombo tumoral nas margens da ressecção de vasos ou ureter, biopsia prévia
Permanência de intenso ou microscópico resíduo tumoral (tumor inoperável, margens cirúrgicas positivas, dispersão celular para peritônio, trombo transectado, metástase linfonodal) IV Metástases hematogênicas Metástases hematogênicas
V Tumor bilateral ao diagnóstico Tumor bilateral ao diagnóstico Fonte: Metzger e Dome (2005)
Além dos dois grupos citados, deve-se ressaltar a atuação do Grupo Cooperativo Brasileiro para Tratamento do TW (GCBTTW) e do grupo inglês,
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United Kingdom Children’s Cancer Study Group (UKCCSG), que também têm
contribuído para o tratamento do TW com sugestão de protocolos (PRITCHARD-JONES, 2002; D’ANGIO, 2003, GLEASON et al., 2014).
É importante ressaltar que tanto nas pesquisas visando a tratamento dos pacientes com vistas à redução de recidiva quanto no estadiamento, a classificação histológica não é valorizada e o fato tem sua explicação nos avanços da identificação de marcadores tumorais que podem auxiliar na avaliação desses parâmetros com maior acurácia, empregando métodos de biologia molecular
1.3 BIOLOGIA MOLECULAR NO TUMOR DE WILMS
A compreensão da biologia molecular nas alterações genéticas inerentes às neoplasias é de fundamental importância para definição terapêutica de algumas doenças em crianças, dentre elas o TW (GRUNDY et al., 2002).
O TW cresce em virtude das modificações genéticas, culminando na proliferação anormal das células renais, o que leva à perda do controle do desenvolvimento com aumento no potencial tumorigênico (BOULANGER et al., 1999; GRUNDY et al., 2002;). Nesses eventos genéticos, diferentes genes estão envolvidos e já foram identificados, porém parece haver na gênese desse tumor participação preferencial de genes supressores de tumor, com perda de função, mais do que da inativação de oncogenes (GRUNDY et al., 2002).
Particularidades encontradas no TW, como distribuição na população, acometimento na faixa etária infantil, bilateralidade do tumor, história familiar e sua associação com diferentes anomalias congênitas e síndromes genéticas, foram fundamentais para a identificação de sua relação com alterações genéticas (KNUDSON, 1971; KNUDSON; STRONG, 1972; GREEN et al., 1996; BOULANGER et al., 1999; FUKUZAWA; REEVE, 2007).
A primeira evidência de que uma alteração especifica estaria associada ao TW foi observada em análise do cromossomo 11 (11p13), em indivíduos com
síndrome de WARG, na qual está presente alteração do gene WT1 (LITTLE et al.,
2004). Esses pacientes apresentam deleção germinativa no cromossomo 11 (11p13). Para que ocorresse o desenvolvimento do TW foi necessário acrescentar uma mutação ou uma deleção no alelo remanescente (LEOB; SUKUMAR, 2002).
Em outro grupo de pacientes com TW, havia perda da heterozigose do cromossomo 11 (11p15.5), o que indicou a possibilidade de nesse locus estar outro gene relacionado ao TW. O outro gene do TW é o WT2 (11p15.5), relacionado à Síndorme de Beckwith-Wiedemam (STRONG, 2003). Dois loci independentes situados no cromossomo 11 (11p13 e 11p15.5) se mostraram relacionados ao TW. Em adição, foi possível observar a localização de outros genes nessa região, como o PAX6, associados à aniridia (DOMME; COPPES, 2002).
Para atender ao objetivo desta tese, selecionamos alguns genes e marcadores tumorais de interesse para nossos resultados.
1.3.1 Genes relacionados ao tumor de Wilms
a. WT1
O gene WT1, localizado no braço curto do cromossomo 11, região 1, banda 3, codifica um fator de transcrição que pode atuar como supressor tumoral ou como oncogene, dependendo do contexto em que a célula se encontra, o que sugere que ele desempenha diferentes papéis no crescimento e desenvolvimento celular (SUGIYAMA, 2010).
Além da ação supressora, o WT1 também está envolvido nos mecanismos de regulação do crescimento celular e da apoptose. O tipo celular e a isoforma do
52
WT1 é que define sua atuação nos mecanismos apoptóticos. Vários autores
descrevem a atividade antiapoptótica resultante da supressão de genes pró-apoptóticos ou ativação de genes indispensáveis para a apoptose, enquanto que outros relatam o favorecimento do mecanismo de apoptose através da alteração entre os membros da família BCL-2 (MORISON et al., 2005).
O gene WT1 é composto por 10 éxons, e codifica um fator de transcrição do tipo “zinc fingers” (dedos de zinco) de 55 kDa, ligado ao DNA e homólogo ao EGR1 e EGR2, com distribuição nuclear (NAKATSUKA et al., 2006). É responsável pelo controle da expressão e da proliferação de vários genes entre eles a E-caderina, o fator II de crescimento insulina-like (IGF2), o receptor do fator
I de crescimento derivado de plaqueta, o Syndecan 1, a PAX-2, a DAX-1 e amphireglus (COPPES; PRITCHARD-JONES, 2000).
Várias isoformas de WT1 podem ser geradas a partir de dois eventos de
splincings alternativos e do uso de translação de múltiplos locais de inicialização
(NAKATSUKA et al., 2006). A inserção de três aminoácidos - lisina, tirosina e serina (KTS) ocorre em um dos eventos de splicing (KIM, et al., 2007). A habilidade de suprimir a expressão desses genes que codificam fatores de crescimento pode contribuir para a função do WT1 como supressor tumoral.
O WT1 é expresso em vários tecidos, preferencialmente nas células presentes no processo de transição epitélio-mesenquimal e mesênquima-epitelial, durante o seu desenvolvimento renal, e no epitélio glomerular maduro (podócitos) (HASTIE, 1994).
A expressão do WT1, além do rim, é encontrada nas gônadas fetais e no mesotélio, justificando que as alterações germinativas desse gene e da proteína a ele associada podem atuar na determinação de alterações do desenvolvimento do trato geniturinário (PRITCHARD-JONES et al., 1990).
Durante a nefrogênese, o WT1 participa da indução de vários genes que atuam como fatores de crescimento ou secreção, proteínas de membrana e sinalizadoras, fatores transcricionais e fatores de splicing (KIM et al., 2007). Entre os alvos de atuação do WT1 durante a nefrogênese está o Wnt4, que
desempenha papel na via sinalizadora do Wnt, essencial para a nefrogênese e também atua sobre a transição epitélio-mesenquimal (KIM et al., 2009).
Mutações específicas do WT1 estão associadas à síndrome de WARG, à Síndrome de Denys-Drash e à Síndrome de Frasier (MROWKA; SCHEDL, 2000). Mutações germinativas do WT1 na presença de TW, frequentemente, estão associadas a tumor bilateral, a síndromes e à idade precoce de ocorrência das alterações clinicamente detectáveis do TW (ROYER-POKORA et al., 2008). A presença de deleções e mutações intragênicas do WT1 são encontradas em 10,4% a 26,7% dos casos de TW (YANG et al., 2007; ROYER-POKORA et al., 2008; RUTESHOUSER et al., 2008).
De acordo com a teoria de Knudson (KNUDSON, STRONG, 1972), para o desenvolvimento de um tumor, é necessária a perda funcional de dois alelos. No entanto alterações específicas em um único alelo de WT1 podem colaborar para um crescimento celular anormal. Essas alterações são verificadas nas mutações pontuais disfuncionais em um único alelo do gene WT1, nas quais a proteína alterada exerce efeito inibitório sobre a proteína selvagem, resultando em um fenótipo mais grave em comparação ao da síndrome de WARG. As mutações pontuais ou completas do WT1 são raras em TW esporádicos, porém estão associadas principalmente a síndromes que predispõem ao TW, como também à malformações do trato urinário, como gonadoblastoma e pseudo-hermafroditismo característicos da síndrome de Frasier (DILLER et al., 1998; LAI; TAY, 1999; DOMME; COPPES, 2002; GRUNDY et al., 2002).
Alterações cromossômicas em 1p, 7p, 16q, 17q, 19q também têm sido associados à tumorigênese e prognóstico do nefroblastoma. Possivelmente, esses
loci contêm genes importantes para o desenvolvimento do TW, como também
parecem contribuir para a ocorrência de outras alterações cromossômicas (COPPES; PRITCHARD-JONES, 2000; DOME; COPPES, 2002).
De acordo com Schumacher et al. (1997), crianças com TW unilateral, que apresentam mutações constitucionais de WT1, não apresentam obrigatoriamente anormalidades do trato geniturinário, o que dificulta a identificação de indivíduos
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que carregam a mutação germinativa desse gene. No entanto dois fatores parecem estar associados com essa mutação: idade precoce do acometimento e TW com predomínio do componente estromal.
Apenas 10% dos TW não expressam o WT1 selvagem, mas aqueles com WT1 selvagem e histologia com predomínio dos componentes blastematoso e epitelial apresentam altos níveis da proteína WT1 (LOEB; SUKUMAR, 2002).
b. WT2
Um segundo locus no cromossomo 11 foi identificado, contendo o gene ou os genes responsáveis pela Síndrome de Beckwith-Wiedemam (EHRLICH, 2007). Essa síndrome está associada a anormalidades do locus 11p15.5, no gene que se convencionou denominar WT2, por se tratar de um locus diferente do gene WT1 (SCOTH, 2008). Esta síndrome é resultante da expressão exagerada do gene
WT2, normalmente expresso somente por um alelo (DUMOUCEL et al., 2014).
Algumas crianças com Síndrome de Beckwith-Wiedemam têm uma duplicação constitucional do fragmento paterno do 11p15.5 (trissomia do 11p15.5). Outras, que parecem ter duas cópias normais do cromossomo 11, teriam herdado as duas cópias do pai e nenhuma da mãe (isodissomia uniparental). A identificação destes mecanismos genéticos pouco frequentes sugere que o gene
WT2 é normalmente expresso somente por um alelo paterno. Daí decorre que a
herança de duas cópias paternas do gene WT2, sob a forma de trissomia ou de isodissomia uniparental, duplicaria a expressão gênica resultando no perfil de supercrescimento característico da síndrome (PRITCHARD-JONES; et al.,1997; STRONG, 2003; ALGAR et al., 2007).
Na perda de heterozigosidade, existem teoricamente chances iguais dos alelos do cromossomo 11, tanto maternos quanto paternos, serem funcionantes. No entanto parece que o alelo materno é silenciado no TW com a persistência do alelo funcionante paterno. O alelo é silenciado na expressão de seu acido
