LA GLOBULINA GAMMA ANTIRRABICA HUMANA*
THOMAS S. HOSTY, PH.D.
Director de Laboratorios, Deparatmento Estatal de Sanidad, Montgomery, Alabama, Estados Unidos R. E. KISSLING, D.V.M., M. SCHAEFFER, M.D.,t GORDON A. WALLACE, D.V.M. Sección de Virus y Rickettsias, Centro de Enfermedades Transmisibles, Servicio de Salud Ptiblica,
Secretaria de Salud, Educación y Bienestar, Montgomery, Alabama, Estados Unidos E. H. DIBBLE, M.D.
Director, John Andrew Memorial Hospital, Tuskegee Institute, Tuskegee, Alabama, Estados Unidos
En el Estado de Alabama, Estados Uni- dos, se ha venido preconizando, en los últi- mos cuatro años, la administración de un suero equino hiperinmune antirrábico simul- táneamente con la vacunación, en ciertos casos de exposición a la rabia, en particular en los mordidos en la cara. Según experien- cias anteriores, cabía esperar un número de casos de enfermedad sérica entre los 5 y 8 días después de administrar el suero de ca- ballo (1). Además, la dosis de suero se admi- nistraba con arreglo al peso, y por lo tanto, había una mayor propensión a reacciones por parte de los adultos. Estas reacciones no justificaban la renuncia a emplear con pru- dencia este suero en los casos indicados, como hoy recomienda la Organización Mundial de la Salud.
Dado el crecido número de individuos sen- sibles al suero de caballo, se trató de pro- ducir un suero hiperinmune antirrábico de origen humano. Se hicieron las gestiones necesarias con el Instituto Tuskegee, Escuela de Medicina Veterinaria, Tuskegee, Ala., para obtener voluntarios que se sometieran a la vacunación antirrábica y a la extracción periódica de sangre a fin de determinar los anticuerpos. Se consiguieron para este es- tudio 34 voluntarios.
METODOS
Plan de inmunización y pruebas de sangre Para reducir al mínimo las posibles reac- ciones del tejido nervioso, se utilizó una
* Este trabajo se publica en inglés en el Bulletin oj the World Health Organization, Vol. 20, No. 6, 1959.
t Jefe de la Sección de Virus y Riekettsias.
vacuna de virus rábico muerto procedente de huevos de pato (Eli Lilly y Cía.) para el primer curso de inmunización. El día cero se recogieron muestras de sangre de todos los voluntarios, y se administró por vía hipo- dérmica, en la región escapular de cada parti- cipante, 1 ml. de vacuna preparada en huevo de pato. Este procedimiento se repitió cada 4 días hasta llegar a un total de 5 inyecciones de vacuna. A los 30 días después de la quinta inyección (es decir, el 46” día) se tomaron nuevas muestras de sangre para determinar los anticuerpos, y se administró por vía hipo- dérmica 0,2 ml. de vacuna Flury HEP (de elevado numero de pases en huevo) prepa- rada en embrión de pollo (Lederle). A los 17 días después de la inoculación de vacuna Flury HEP, se tomaron muestras de sangre para el estudio serológico. El 77” día, se extrajeron 500 ml. de sangre de cada uno de los participantes que presentaban índices de neutralización no menores de 80, y la mezcla de los sueros fue convertida en globu- lina gamma. A causa de un accidente du- rante el envío se perdió casi toda esta globu- lina y hubo que esperar al próximo año académico para continuar el experimento. El día 288” se tomó una muestra de sangre de 26 individuos del mismo grupo de voluntarios para determinar los niveles de anticuerpos y se les administró de nuevo 1 ml. de vacuna preparada en huevo de pato. Durante la vacunación sólo se observaron unas cuantas reacciones de importancia secundaria, tales como eritema en el sitio de la inoculación y, en un caso, una ligera induración y malestar.
Doce días después, se extrajeron muestras de sangre y se determinaron nuevamente los
310 BOLET’CN DE LA OFICINA SANITARIA PANAMERICANA
índices de neutralización de todos los partici- pantes asequibles. El 312” día (24 días des- pués de administrar la última dosis reactiva- dora) se extrajeron 500 ml. de sangre de cada individuo que presentaba niveles significa- tivos de anticuerpos, se mezclaron los sueros y fueron convertidos en globulina gamma. A cinco voluntarios que no mostraron ningún anticuerpo neutralizante antirrábico en una prueba preliminar, se les inoculó por vía intramuscular globulina gamma inmune an- tirrábica humana (solución al 8 % aproxima- damente) en la proporción de 0,5 ml. por kilo de peso corporal. Se tomaron sucesiva- mente muestras de sangre a intervalos di- versos, desde el 5” día hasta el 90” inclusive; el plan y los resultados de las pruebas de es- tas muestras figuran en el cuadro No. 3. Los sueros se sometieron a prueba por un pro- cedimiento modificado que se describe más adelante.
Preparación de globulina gamma
La separación inicial del plasma en cinco fracciones y el subfraccionamiento de las fracciones II y III se llevó a cabo por los métodos de Cohn et al. (2) y Oncley et al. (3). Al fraccionar el suero para obtener la mayor producción de globulina gamma se encontró lipoprotefna en cantidad mayor que la habi- tual, en la solución al 8% reconstit,ufda de globulina gamma.
Técnicas de neutralización
Por las razones expuestas más adelante, se utilizaron en este estudio tres técnicas de neutralización.
Método 1. Se mezclaron partes alícuotas de suero sin diluir con cantidades iguales de virus fijo de rabia (CVS (virus de prueba estándar) ll) en diluciones décuplas crecien- tes. Un suero normal tratado de manera simi- lar sirvió de testigo. Las mezclas se incuba- ron de un dfa para otro a la temperatura de 4°C. antes de inocularlas intracerebralmente a ratones. La razón del título del virus en el suero de prueba con respecto al título en el suero testigo se expresa como fndice de neu- tralización. Este método carece de la sensi-
bilidad de los métodos 2 y 3, pero sus resulta- dos ofrecen mayor uniformidad de una prueba a otra. Siendo conveniente seguir la respuesta de anticuerpos a medida que pro- gresaba el plan de inmunización, se utilizó este método 1 para esta fase del estudio.
Método 2. Este método consistió en la prueba “ordinaria” de neutralización utili- zada por Atanasiu et al. (4). En resumen, se mezclaron diluciones séricas quíntuplas cre- cientes con una sola dosis de virus que se calculó que contenía 30 DL60 por dosis de ratón. El virus se tituló en presencia de suero normal para determinar la verdadera dosis utilizada en cada prueba. Después de una incubación de 90 minutos a la temperatura de 37”C., las mezclas fueron inoculadas en ratones. Los resultados se expresan como aquella dilución de suero que permite una supervivencia de un 50% de ratones.
Método S. Este método consistió en la prueba de neutralización “modificada” de Atanasiu et al. (4). Se mezclaron nueve partes de suero con una de virus, que se calculó que contenía, aproximadamente, 10.000 DLbo por dosis de ratón. Después de una incubación de 90 minutos a la temperatura de 37”C., se prepararon diluciones quíntuplas de la mezcla y se inocularon intracerebralment,c a ratones. Los resultados se expresan en logaritmos de base 10, como diferencia entre el título del virus en el suero de prueba y su tftulo en un suero testigo normal manipulado de manera similar.
Los métodos 2 y 3 se utilizaron para que los resultados de este estudio pudieran com- pararse más estrechamente con los de Atana- siu et al. (4).
RESULTADOS
Octubre 19591 GLOBULINA GAMX4 ANTIRRABICA HUMANA 311
antes. Desde el punto de vista retrospectivo, resultados como la vacuna de virus vivo no hay razón para creer que la vacuna de Flury HEP modificado. La mezcla de sueros virus muerto preparado en huevo de pato obtenidos el 77” día, dio un índice de neutra- no habría producido por lo menos tan buenos lización de 2.000.
CUADRO No. l.-Indices individuales de neutralizaci6n de voluntarios sometidos a la vacunación anti- rrábica.
312= 1, Día
Indi-‘\, I- 0 4 8 12 16 46 63 77* 28sb 3ooc
viduos - - - - -
1 - ‘3, 3 - 50 20 10 620 800 160 1.000 (4) 800
2 - ‘3, 3 - 630 600 500 2.500 2.500 630 3.200 (16) 4.000
3 - - 20 - - - 63 200 (8) NE
4 50 30 32 160 50 25 620 1.000 .ooo 500 (4) 500
5 - - - - 50 50 2.500 1.600
6 - - - - 20 8 62 63 2.000 (16) 800
7 - - 32 20 50 320 !5.000 16.000
8 - - - - 16 250 NE
9 - - - 50 63 32 62
10 - 50 200 32 100 200 100 1.600 (4) 1.000
ll - - - 112 50 16 620 320 63 1 .ooo (4) 800
13 - - - 100 80 32 1.000 5.000 63 500 (8) 250
14 - 320 100 320 500 5.000 630 4.000 (16) 5.000
16 10 10 16 160 160 80 2.500 8.000
17 - - 1.000 000 200 160 200 63 2.000 (16) 800
18 - 32 100 32 25 250 32 63 1 .ooo (4) NE
19 - 6,: 3 - 100 50 250 4.000 1.000 125 1.600 (8) 8.000
20 - - - 50 500 250 4.000 1.000
21 - - 500 000 .600 2.500 10.000 .200 2.000 (16) 25.000
22 - - 16 200 50 16 25 63 160 (4) NE
23 - - - 200 320 160 1.000 2.000 500 1.600 (8) 800
24 - - 32 100 80 - - NE 63 20 (8)
25 - 16 100 100 8 160 80
26 - 12 16 100 500 100 1.600 NE 63 1.600 (16) 2.500
27 - - - - 20 25 50 NE 63 500 (8) 250
28 - - - 16 - 25 NE 63 32 (32)
30 32 116 160 32 500 1.600 160 2.000 (16) 500
31 - - 16 200 000 80 500 320 63 1.600 (16) 4.000
33 - - - 116 50 8 250 100 63 500 (4) 80
35 - - t 63 80 YE 25 80 160 160 1.600 (8) 500
36 - 16 50 160 .600 2.500 1.600 160 1.000 (8) 5.000
37 - t 53 - - 32
38 32 - 3: 20 - - NE NE NE 63 320 NE
39 32 - 80 8 1.000 8.000 63 320 NE
Mezcla de Mezcla de
sueros: ín- sueros: ín-
dice de dice de neu-
neutrali- tralización,
zación, 5.000
2.000
- - - - - -
Nota: La vacuna preparada mediante huevos de pato se administró los días 0,4,8,12 y 16; la vacuna Flury HEP se administró el 46” día.
8 Se extrajeron 500 ml. de sangre.
b Se tomó muestra de sangre y se administró vacuna reactivada preparada mediante huevo de pato.
312 BOLETIN DE LA OFICINA SANITARIA PANAMERICANA
Para comparar nuestros resultados con los obtenidos en investigaciones similares de suero inmune antirrábico de origen equino
(4), se determinaron los títulos de neutrali- zación por el método 2 de esta mezcla de sueros y de globulina gamma (77” día). Utilizando 32 dosis DL,,, de virus rábico, la mezcla sérica dio un título de 1:22. Se reconstituyó la globulina gamma y se probó en dos concentraciones distintas, es decir de 0,7 % y 7 %, dando títulos de anticuerpos de 1:2 y 1: 28 respectivamente, en compara- ción con un título de 1: 630 de un suero están- dard (caballo) de la OMS.
Este suministro de globulina gamma no bastó para las pruebas humanas, y fue tam- bién de concentración baja, por lo que no se prosiguió la evaluación.
El suero obtenido el 312” día presentó un título de 1: 100 y de 1: 300 para la globulina gamma en comparación con 50 dosis DL50 de virus por el método 2. Esta globulina gamma se utilizó para su inoculación en seres humanos. En cambio, el suero untirrá- hico comercial utilizado por Atanasiu et al.
(4) mostró un título protector de 1: 5164 en comparación con 239 DL,o de virus rábico fijo.
Se efectuaron estudios electroforéticos de 10 sueros seleccionados para determinar la concentración de globulina gamma. Se com- pararon 5 sueros que presentaban bajos ín- dices de neutralización con otros 5 que los mostraban altos. En el cuadro No. 2 se muestran los resultados de este examen. En este estudio limitado no hubo correlación entre los niveles de globulina gamma y los
CUADRO No. Z.-Comparación de los inclices de neutralización resultantes cle la vacunación antirrá- bica con los niveles de globulina gamma* de 10 sueros humanos.
Niveles de globulina gamma
Indices de neutra- 320 20 5.000 32
lización 16.000 25 8.000 5.000
25 10.000 * Determinados por estudios electroforéticos.
títulos de anticuerpos de los sueros cuyo contenido de globulina estuvo comprendido dent,ro del ámbito normal. Las pruebas de fijación del complemento efectuadas en sue- ros del 300” día tampoco mostraron correla- ción al compararlas con los fndices de neu- tralización (cuadro KO. 1).
El cuadro No. 3 muestra los resultados de las determinaciones de anticuerpos en los 5 individuos que recibieron globulina gamma inmune antirrábica humana. A los efectos de comparación, se incluyen los resultados ob- tenidos por Atanasiu et al. (4) con suero de caballo inmune. De un período al siguiente se observó una considerable disparidad en los titulos de neutralización, tanto en los individuos que recibieron suero de caballo como en los que recibieron globulina gamma humana. Los factores causantes de esta di- versidad han sido examinados ya (4).
Partiendo del supuesto de que un fndice de neutralización de 0,50 6 mayor es signifi- cativo, 4 de los 5 individuos tratados con globulina gamma mostraron tftulos signifi- cativos al 15” día, y los 3 individuos que re- cibieron suero de caballo presentaron un ele- vado nivel de anticuerpos en aquel momento (cuadro No. 3). La misma proporción per- sistía el 21” día. El 42” día, 2 de los 3 indi- viduos a los que se había inoculado suero de caballo seguían teniendo títulos adecuados, mientras que, de los 5 que recibieron glo- bulina humana, sólo uno poseía adecuados niveles de anticuerpos. Después de este pe- ríodo, no se observaron niveles de anticuer- pos significativos.
DISCUSION
Los resultados de estos experimentos apor- taron pruebas suficientes para alentar la creencia de que en la profilaxis antirrábica es factible la transferencia pasiva eficaz de anticuerpos procedentes de fuentes hu- manas. Los inconvenientes del suero animal son bien sabidos y las ventajas de substituirlo por antisuero humano, demasiado evidentes para que requieran más aclaraciones.
Octubre 19591 GLOBULINA GAMiK4 ANTIRRABICA HUMANA 313
CUADRO No. 3.-Comparación de los indices de neutralización obtenidos con globulina gamma homóloga antirricbica (A) y con suero inmune de caballo (B).
GLT8_1 0 1 2 / 5 1 6 1 10 ( 15 ( 21 ( 28 1 35 1 42 1 49 j 60 1 68 1 90
A. Globulina gamma humana
832 - NE 1,OS NE 1,08 1,OS 1,08 NE 0,69 NE 1,31 NE 0,o 0,52
833 - NE -0,22 NE 0,O 1,Ol 1,18 1,Ol 0,O NE -0,34 NE -0,lo 0,13
834 - NE 1,40 NE 1,63 0,98 1,05 NE 0,48 NE 0,22 NE 0,22 0,22
874 - NE 0,70 XE 0,44 0,82 0,58 0,12 0,35 NE 0,12 NE 0,o 0,26
875 - XE 0,07 NE 0,67 0,48 0,22 0,67 -0,13 NE -0,50 NE -0,50-0,36
B. Suero inmune de caballo*
I 1
* Resultados de Atanasiu’et al. 11957). NE = No experimentado.
dos en aquella ocasión, aportan por ahora la mejor prueba de la eficacia de la profilaxis sérica en el ser humano después de haber su- frido graves mordeduras de animales rabio- sos.
La experiencia obtenida en Alabama in- dica que la rabia en individuos vacunados, si se presenta, suele ocurrir entre el 15” y 20” días, aproximadamente, después de la expo- sición. En el cuadro KO. 3 de muestra que 4 de los 5 voluntarios tratados con suero humano presentaron el 15” día niveles de anticuerpos de más de 0,50, en comparación con los 3 que recibieron suero de caballo. Sin embargo, mientras los sueros de caballo mostraron, en comparación con la globulina gamma, un contenido de anticuerpos mucho más elevado, esta disparidad no fue tan manifìesta en los receptores humanos a los 15 días de haberlo administrado. En el cua- dro No. 3 se observará que el título del suero de caballo descendió marcadamente a los 10 días, mientras que el del suero de origen humano se mantuvo en general durante 21 días. Esto concuerda con los hallazgos de otros investigadores según los cuales el anti- cuerpo homólogo en el ser humano es muy superior al de caballo sobre una base uni- taria (6).
De los 26 voluntarios sometidos a prueba en la segunda parte del experimento (cuadro
No. l), 6 (23 %) mostraron índices finales de neutralización de 4.000 ó más, el 312” día. Este porcentaje de inmunizadores signifi- cativos concuerda con los hallazgos de otros investigadores (7).
De este estudio preliminar, que necesita ser confirmado con un mayor número de in- dividuos y pruebas más detalladas, se puede llegar, provisionalmente, a una conclusión alentadora: la globulina gamma de origen humano puede servir para proporcionar a un individuo tratado anticuerpos inmedia- tos con los que se inactivará el virus proce- dente de la exposición y acaso proteja por un período lo suficientemente prolongado que permita la inducción de la inmunización activa por la vacuna. Se recomienda que ésta se administre simultáneamente. Ade- más, se prevé la posibilidad de obtener títu- los más altos de globulina gamma inoculando a los individuos vacunas más activas. Si, posteriormente, sólo se seleccionan para la obtención de mezcla serica a los que respon- den con títulos altos, los títulos resultantes de globulina gamma aumentarán todavía más.
AGRADECIMIENTO
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Leclerle, Inc., el habernos facilitado sus respecti- vas vacunas antirrábicas, y al Dr. Benjamín E. Sanders, Instituto Merck para Investigaciones Terapéuticas, y al Dr. Robert B. Pennell, Blood Characterization and Preservation Laboratory of Protein Foundation, que convirtieron el plasma en globulina gamma en el primero y segundo ex- perimentos, respectivamente.
Asimismo expresamos nuestro reconocimiento al Dr. Gerald Cooper, Centro de Enfermedades Transmisibles, Servicio de Salud Pública de Estados Unidos, por su colaboración técnica en los estudios electroforéticos.
RESUMEN
Para evitar las reacciones a las proteínas extrañas producidas por el suero hiperin- mune inyectado a individuos expuestos a la rabia, se trató de producir un antisuero rá- bico de origen humano.
Se administraron a 34 voluntarios 5 dosis de una vacuna antirrábica inactivada y pre- parada en huevos de pato, a intervalos de 4 días (por ejemplo en los días 0, 4, 8, 12 y 16). El 46” día se administró una dosis adi- cional de vacuna atenuada procedente de embrión de pollo Flury HEP (de elevado número de pases en huevo), y luego, el 288” día, una dosis de reactivación de vacuna elaborada en huevos de pato. Después de 24 días, o sea al 312” día se haberse adminis-
trado la primera dosis, se extrajo sangre de los individuos en estudio, se mezclaron los sueros y se convirtieron en globulina gamma.
Estos individuos, que al comienzo no po- seían ningún anticuerpo, respondieron con títulos diversos, siendo el título de la mezcla de sueros de 1: 100 contra 50 DLbo de virus rábico en las pruebas de neutralización, y la globulina gamma preparada a base de esta mezcla presentó un título de 1:300.
Las muestras de sangre de 5 individuos inoculados con globulina gamma antirrábica, sometidas a prueba, a intervalos, para de- terminar los anticuerpos residuales, mostra- ron títulos significativos durante 21 días.
Los niveles de anticuerpos pasivos resul- tantes de la inoculación de un suero de ca- ballo inmune, más activo, fueron mucho más altos que los obtenidos con la globulina gamma antirrábica humana, menos activa, utilizada; en cambio, la disminución de los titulos fue más gradual con la globulina humana. Se cree que, con más inoculaciones reactivadoras en un mayor grupo de volun- tarios, se podría producir una globulina gamma antirrábica humana del mismo efecto que el de suero inmune de caballo. En el presente artículo se examinan las ventajas de una fuente humana de anticuerpos en la profilaxis de la rabia.
REFERENCIAS
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