Avaliação da atividade hipoglicemiante do extrato hidroalcoólico das folhas de Calotropis procera (AITON) W. T. AITON

Texto

(1)UNIVERSIDADE FEDERAL DE PERNAMBUCO CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE DEPARTAMENTO DE CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS. MÁRIO CORREIA LIMA NETO. AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE HIPOGLICEMIANTE DO EXTRATO HIDROALCOÓLICO DAS FOLHAS DE Calotropis procera (AITON) W. T. AITON. RECIFE-PE 2011.

(2) UNIVERSIDADE FEDERAL DE PERNAMBUCO CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE DEPARTAMENTO DE CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS. MÁRIO CORREIA LIMA NETO. AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE HIPOGLICEMIANTE DO EXTRATO HIDROALCOÓLICO DAS FOLHAS DE Calotropis procera (AITON) W. T. AITON Dissertação submetida ao Programa de Pós-Graduação em Ciências Farmacêuticas do Centro de Ciências da Saúde da Universidade Federal de Pernambuco, como requisito parcial para a obtenção do grau de Mestre em Ciências Farmacêuticas. Orientador: Prof. Dr. Almir Gonçalves Wanderley Co-orientadores: Prof. Dr. Antonio Fernando Morais de Oliveira Prof. Dr. Fabiano Ferreira.. RECIFE 2011.

(3) Lima Neto, Mário Correia Avaliação da atividade hipoglicemiante do extrato hidroalcoólico das folhas de Calotropis procera (AITON) W. T. AITON / Mário Correia Lima Neto. – Recife: O Autor, 2011. 71 folhas: il., fig.; 30 cm. Orientador: Almir Gonçalves Wanderley. Dissertação (mestrado) – Universidade Federal de Pernambuco. CCS. Ciências Farmacêuticas, 2011. Inclui bibliografia. 1. Calotropis procera. 2. Apocynaceae. 3. Diabetes mellitus. 4.Estreptozotocina. 5. Antihiperglicemiante. I. Wanderley, Almir Gonçalves. II.Título.. 583.72. CDD (22.ed.). UFPE CCS2012-02.

(4) . RECIFE 2011.

(5) UNIVERSIDADE FEDERAL DE PERNAMBUCO. REITOR Prof. Dr. Anísio Brasileiro de Freitas Dourado. VICE-REITOR Prof. Dr. Silvio Romero de Barros Marques. PRÓ-REITOR PARA ASSUNTOS DE PESQUISA E PÓS-GRADUAÇÃO Prof. Dr. Francisco de Sousa Ramos. DIRETOR DO CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE Prof. Dr. José Thadeu Pinheiro. VICE-DIRETOR DO CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE Prof. Dr. Márcio Antônio de Andrade Coelho Gueiros. CHEFE DO DEPARTAMENTO DE CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS Prof. Dr. Dalci José Brondani. VICE-CHEFE DO DEPARTAMENTO DE CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS Prof. Dr. Antonio Rodolfo de Faria. COORDENADOR DO PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS Profª. Drª. Nereide Stela Santos Magalhães VICE-COORDENADORA DO PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS Profª. Drª. Ana Cristina Lima Leite.

(6) “Não é que eu sou tão esperto, é que apenas eu fico com os problemas por mais tempo”. (Albert Einstein).

(7) Dedico aos meus pais Jeane e João e a minha irmã pelo amor, carinho e dedicação. Dedico em especial a minha noiva Karla Figueiredo pelo amor, dedicação, companheirismo e motivação, para finalizar este trabalho..

(8) AGRADECIMENTOS. A Deus, em primeiro lugar por ter me dado a força necessária para o desenvolvimento deste trabalho, por guiar meus passos em todos os momentos. Ao Prof. Dr. Almir Gonçalves Wanderley, por ter me recebido da melhor forma possível em seu laboratório, pela confiança depositada, orientação, incentivo e amizade disponibilizada. Ao Prof. Antonio Fernando Morais de Oliveira, por ter sido um dos incentivadores deste mestrado, pela colaboração durante as analises químicas e por ter aceitado continuar a me ajudar durante este mais estes 2 anos. A Karla Viviane Figueiredo, por ter estado ao meu lado durante todos os minutos, por sua imensa colaboração durante todos os passos. Aos amigos Mariana Oliveira, Ricardo Silva, do LEAF, Iggor Mâcedo, Germana Freire, Carlos Brasileiro e Cristiano Lima do Laboratório de Farmacologia, além de Valerium Thijan, do LAPRONAT, sem a colaboração de vocês seria impossível realizar este trabalho. Aos meus familiares por sua colaboração e suporte nos momentos difíceis durante todo o percurso desta jornada..

(9) LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS. OMS:. Organização Mundial de Saúde. UV:. Ultravioleta. a.p.:. active principle. p.o.:. per oral. i.v.:. intravenoso. i.p.:. intraperitoneal. DM :. Diabetes mellitus. DMID:. Diabetes mellitus insulino dependente. DMNID:. Diabetes mellitus não-insulino dependente.. HbA1C:. Hemoglobina glicada. PPAR-γ:. Receptor ativador da proliferação de peroxissomos (peroxisome proliferator activated receptor). LDL:. Lipídeos de baixa densidade. HDL:. Lipídeos de alta densidade. STZ:. Estreptozotocina. ROS:. Espécies reativas de oxigênio. FDA:. Food and drug administration.. AGL:. Ácidos graxos livres. GLUT 2:. Transportador de glicose tipo 2. GLUT 4:. Transportador de glicose tipo 4. α:. alfa. β:. beta. KATP:. Canais de potássio sensíveis a ATP. Ca2+:. Íon cálcio. g:. Grama. kg:. quilograma. mg/dL:. miligrama por decilitro. mg/kg:. miligrama por quilograma -1. g/kg= g.kg : grama/quilograma.

(10) LISTA DE FIGURAS. Figura 1: Aspecto geral de Calotropis procera (Aiton) W.T. Aiton (Apocynaceae)................ 28 Figura 2: Aspecto geral das flores de Calotropis procera (Aiton) W.T. Aiton (Apocynaceae).............................................................................................................. 28. Figura 3: Glicosídeos característicos de Calotropis procera calotropina e calotoxina..30 Figura 4: Metabólitos presentes em Calotropis procera ................................................ 31. ARTIGO: Evaluation of antihyperglycaemic activity of Calotropis procera (Apocynaceae) leaves extract on streptozotocin-induced diabetes in Wistar rats.. Figure 1. Thin Layer Chromatography (TLC) of flavonoid and cardenolide glycosides.. Figure 2. Effect of hydroalcoholic extract of Calotropis procera (Cp) on fasting blood glucose (mg/dL) of diabetic rats. (NDC: non-diabetic control; DC: diabetic control, MTD: diabetic rats treated with metformin 500 mg/kg; Cp: diabetic rats treated with hydroalcoholic extract of the leaves of Calotropis procera 300 and 600 mg/kg; ITD: diabetic rats treated with insulin 6 U). The results are expressed as mean ± S.E.M. (n=6/group). aStatistically different from DC and MTD, b. Statistically different from DC (ANOVA followed by Newman-Keuls, p<0.05).. Figure 3. Effect of hydroalcoholic extract of Calotropis procera (Cp) on body mass gain (g) of diabetic rats. (NDC: non-diabetic control; DC: diabetic control, MTD: diabetic rats treated with metformin 500 mg/kg; Cp: diabetic rats treated with hydroalcoholic extract of the leaves of Calotropis procera 300 and 600 mg/kg). The results are expressed as mean ± S.E.M. (n=6/group).. Figure 4. Effect of hydroalcoholic extract of Calotropis procera (Cp) on food intake (g/day/animal) of diabetic rats. (NDC: non-diabetic control; DC: diabetic control, MTD: diabetic rats treated with metformin 500 mg/kg; Cp: diabetic rats treated with hydroalcoholic extract of the leaves of Calotropis procera 300 and 600 mg/kg). The results are expressed as mean ± S.E.M. (n=6/group)..

(11) a. Statistically different from DC and MTD, bstatistically different from DC, cstatistically different. from MTD (ANOVA followed by Newman-Keuls, p<0.05).. Figure 5. Effect of hydroalcoholic extract of Calotropis procera (Cp) on water intake (mL/day/animal) in Wistar rats. (NDC: non-diabetic control; DC: diabetic control, MTD: diabetic rats treated with metformin 500 mg/kg; Cp: diabetic rats treated with hydroalcoholic extract of the leaves of Calotropis procera 300 and 600 mg/kg). The results are expressed as mean ± S.E.M. (n=6/group). aStatistically different from DC and MTD, bstatistically different from DC (ANOVA followed by Newman-Keuls, p<0.05).. Figura 6. Effect of hydroalcoholic extract of Calotropis procera (Cp) after oral administration of dglucose (2.0g/kg b.w) in Wistar rats. (NDC: non-diabetic control; DC: diabetic control, MTD: diabetic rats treated with metformin 500 mg/kg; Cp: diabetic rats treated with hydroalcoholic extract of the leaves of Calotropis procera 300 and 600 mg/kg). The results are expressed as mean ± S.E.M. (n=6/group). bStatistically different from DC (ANOVA followed by Newman-Keuls, p<0.05). .

(12) LISTA DE TABELAS. ARTIGO: Evaluation of antihyperglycaemic activity of Calotropis procera (Apocynaceae) leaves extract on streptozotocin-induced diabetes in Wistar rats. Table 1. Biochemical parameters of normoglycaemic and diabetic rats.. Table 2. Effect of the hydroalcholic extract of the leaves of Calotropis procera on tissues masses of diabetic rats..

(13) RESUMO. Calotropis procera (Aiton) W. T. Aiton (Apocynaceae) conhecida popularmente como algodão-deseda é um arbusto selvagem de origem africana rico em substâncias bioativas que determinam o potencial medicinal dessa espécie. Visto que o Diabetes mellitus é uma doença que atinge cerca de dez por cento da população mundial.e que o látex de C. procera já demonstou ser eficaz contra esta doença. Este trabalho buscou avaliar a atividade hipoglicemiante do extrato hidroalcoólico das folhas de Calotropis procera de ocorrência no litoral de Pernambuco - Brasil. Foram usados cinco grupos (n=6/grupo) de ratos Wistar machos para indução do diabetes com estreptozotocina (50 mg/kg, i.p). Em seguida, os animais foram tratados por via oral durante 4 semanas consecutivas com extrato liofilizado das folhas de Calotropis procera (300 e 600 mg/kg), metformina (500 mg/kg), insulina (6U, s.c.) e controle (água). Ao final do período de tratamento foram determinados a variação de massa corporal, o consumo de água e ração e indicadores bioquímicos (glicose, uréia, ácido úrico, creatinina, aminotransferases, colesterol total e triglicerídeos). Também foi conduzido o teste de tolerância oral à glicose (2 g/kg). Os resultados mostraram que o extrato de Calotropis procera (300 e 600 mg/kg) reduziu significativamente o nível de glicemia dos animais diabético durante o período integral de avaliação e melhorou o estado metabólico dos animais. Em adição, no teste de tolerância oral a glicose o extrato produziu diminuição estatisticamente significativa na glicemia aos 30 e 60 minutos. A triagem fitoquímica revelou e quantificou a presença de fenóis totais e flavonóides em 29,1 e 2,9% em unidades de ácido gálico e rutina, respectivamente. Desta forma conclui-se que o extrato das folhas de Calotropis procera possui atividade antihiperglicemiante possivelmente relacionado à presença de fenóis totais e flavonóides.. Palavras chaves: Calotropis procera, Apocynaceae, Diabetes mellitus, estreptozotocina, antihiperglicemiante. .

(14) ABSTRACT Calotropis procera (Aiton) W. T. Aiton (Apocynaceae), popularly known Algodão-de-seda is a wild African bush rich in bioactive substances determine the medicinal potential of this species. Diabetes mellitus is a disease that affects about 10% of the population. This study aimed to evaluate the activity hypoglycemic hydroalcoholic extract of the leaves of Calotropis procera of occurrence in coast of Pernambuco, Brazil. The hydroalcholic extract of the leaves of Calotropis procera (300 and 600 mg/kg/day), vehicle, insulin (6 U, s.c.) and metformin (500 mg/kg/day) were administered orally to streptozotocin-induced diabetic rats (n=7/group) for 4 weeks. Changes in body weight, food and water intake, biochemical markers, fasting glucose levels and oral glucose tolerance were evaluated. The results show that the Calotropis procera dried extract (300 and 600 mg/kg) reduced significantly the level of blood glucose throughout the evaluation period and improved metabolic status of animals and, interfered with the oral tolerance test glucose. The phytochemical screening revealed and quantified the presence of phenolic compounds and flavonoids in 29.1 and 2.9% respectively. Thus we conclude that the extract of the leaves of Calotropis procera has antihyperglycaemic activity possibly related to the presence of total phenols and flavonoids. Keywords: Calotropis procera, Apocynaceae, Diabetes mellitus, streptozotocin, antihyperglicaemic. .

(15) SUMÁRIO 1.0. Introdução ........................................................................................................................ 14. 2.0. Revisão Bibliográfica........................................................................................................ 17. 2.1. Diabetes mellitus – Considerações Gerais......................................................................... 18 2.2. Tratamento Farmacológico do Diabetes mellitus............................................................... 20 2.3. Modelos experimentos do Diabetes mellitus..................................................................... 24. 2.4. Plantas Medicinais............................................................................................................ 24. 2.5 Apocynaceae e Atividade Hipoglicemiante....................................................................... 26. 2.6 Calotropis procera (Aiton) W. T. Aiton (Apocynaceae)............................................... 27 3.0. Objetivos.......................................................................................................................... 32. 3.1. Objetivo geral................................................................................................................... 33. 3.2. Objetivos específicos....................................................................................................... 33. 4.0. ARTIGO: (Apocynaceae). Evaluation of antihyperglycaemic activity of Calotropis procera leaves. extract. on. streptozotocin-induced. diabetes. in. rats.......................................................................................................................................... 5.0 Conclusão…………………………………………………………………................... Wistar 36. 62. 6.0 Referência…………………………………………………………………….............. 64.

(16) 14 . 1. Introdução.

(17) 15 . 1.0 Introdução A utilização de plantas com fins medicinais para o tratamento, a cura e a prevenção de doenças é uma das mais antigas formas de prática medicinal da humanidade (PINTO, 2002). Atualmente, os produtos naturais são responsáveis por cerca de 40% dos fármacos disponíveis para o tratamento de várias doenças, além do que há um grande interesse das indústrias farmacêuticas pelo uso da biodiversidade como fonte de novos fármacos (CALIXTO, 2003). Assim sendo, a fitoterapia constitui uma forma de terapia medicinal que vem crescendo nos últimos anos e que movimenta no mercado mundial U$$ 22 bilhões anuais (PINTO, 2002). Em 2006, as 20 maiores empresas de fitoterápicos do Brasil venderam aproximadamente R$ 460 milhões, valor equivalente a 84,7% do total faturado neste segmento (BRASIL, 2007). Segundo a Organização Mundial de Saúde (OMS), 80% da população mundial faz uso de terapias alternativas como formas de tratamento e as plantas medicinais são os principais medicamentos utilizados. Apesar do uso tradicional e do elevado consumo de plantas medicinais, apenas isso não comprova a sua efetividade nem a ausência de toxicidade, é necessário conhecer a dose eficaz e aquela que produz toxicidade, portanto, é fundamental o estudo farmacodinâmico e toxicológico padronizado (AGRA et al., 2007). O Brasil possui uma biodiversidade abundante se comparada a de outros países e o número de espécies alcança cerca de 20% do número total existente no planeta (CALIXTO, 2003). Da flora brasileira, menos de 5% das espécies representam a fitoterapia mundial, significando que um verdadeiro arsenal terapêutico de princípios ativos podem ser extraídos da natureza (BARATA, 2005). Isso é um ponto importante no que se refere à capacidade de uso e aproveitamento dos recursos biológicos que nos são oferecidos. Atualmente o Diabetes mellitus (DM) está sendo tratado como um problema de importância crescente em saúde pública, sua incidência e prevalência estão aumentando, alcançando proporções epidêmicas. Estima-se que o número de portadores da doença, em todo o mundo era de 177 milhões no ano de 2000, devendo chegar em 2025 a 350 milhões de indivíduos (BARCELÓ et al., 2003). No Brasil, esta síndrome afeta aproximadamente oito milhões de indivíduos. A taxa de morbimortalidade relacionada ao DM é elevada (SBD, 2006). Neste trabalho foi avaliada a atividade anti-hiperglicemiante das folhas de Calotropis procera (Ait) Ait. R. BR. Essa espécie é um arbusto selvagem pertencente à família Apocynaceae e é conhecida popularmente no nordeste brasileiro como algodão de seda. Seu látex apresenta diversas atividades farmacológicas como antiinflamatória, analgésica, antidiarreica e anti-.

(18) 16 . hiperglicemiante e sendo os poliisoprenos e triterpenoídes como seus principais componentes. Considerando que suas folhas é a parte menos tóxica, visto que os cardenolídeos nela presente são degradados no trato gastrointestinal, da planta levantou-se a hipótese de testar sua potencial atividade anti-hiperglicemiante em ratos diabéticos induzidos por estreptozotocina.. .

(19) 17 . 2. Revisão Bibliográfica.

(20) 18 . FUNDAMENTAÇÃO TEÓRICA. 2.1 Diabetes mellitus - Considerações Gerais. O Diabetes mellitus (DM) está entre as dez principais causas de morte nos países ocidentais e, apesar dos progressos em seu controle clínico, ainda não foi possível controlar de fato suas consequências letais. Diabetes é considerada uma doença crônica que ocorre quando o pâncreas não produz quantidade suficiente de insulina ou a mesma não é efetivamente utilizada pelo organismo. Caracteriza-se também por uma desordem endócrina no metabolismo de carboidratos e gorduras que promovem hiperglicemia (BRANSOME, 1992) que ao longo do tempo pode provocar graves danos aos vasos e nervos (WHO, 2011). Além de está associada a uma série de sintomas comuns tais como sede e fome excessivas, fraqueza muscular, perda de massa corporal e elevação do nível de glicose no sangue, o que resulta na excreção da glicose pela urina (SHOELSON, 1995; SAID et al., 2002). O diagnóstico do DM está baseado na identificação dos sintomas clínicos como: polidipsia, poliúria, polifagia e perda de massa corporal; e em resultados de exames laboratoriais como a glicemia de jejum ≥ 126 mg/dL e o teste de tolerância oral à glicose, realizado 2 horas após a ingestão de uma sobrecarga de 75 g de glicose, superior a 200 mg/dL (ENGELGAU et al., 1997). Pode-se ainda considerar pacientes que apresentem glicemia de jejum entre 100-125 mg/dL e no teste de tolerância oral à glicose, uma glicemia entre 140 -199 mg/dL como pré-diabéticos por apresentarem a glicemia de jejum alterada, sendo tais indivíduos susceptíveis a obesidade, dislipidemias e hipertensão, provavelmente desencadeadas por resistência a insulina (ADA, 2011). Outras complicações associadas ao DM são aquelas relacionadas ao aumento dos níveis de glicemia como, por exemplo, retinopatias (NAKAZAWA, 2008), isquemias cerebrais (ERGUL, 2009), além de obesidade, resistência à insulina e hipertensão (SACHIDANANDAM, 2008). O Diabetes mellitus é classificado como insulino-dependente (DMID) ou tipo 1 e não insulino-dependente (DMNID) ou tipo 2. Cerca de 90% dos pacientes são DMNID, no qual a resistência à insulina tem um papel fundamental no desenvolvimento da doença (FULLER et al., 1980)..

(21) 19 . O diabetes tipo 1 é caracterizada por uma falta absoluta de insulina somada com uma destruição auto imune das células-β do pâncreas sendo ainda caracterizada por uma forte presença genética, representa 5 a 10% do total de diabéticos e geralmente atinge crianças e adultos jovens (FULLER et al., 1980). A diabetes tipo 2 que representa mais de 90% dos casos e caracterizada por resistência a insulina (YANG, 2008). Além disto, a diabetes tipo 2, tem se tornado uma epidemia, devido ao aumento do número de idosos, e o aumento da prevalência da obesidade e do estilo de vida sedentário (FULLER et al., 1980). Um outro tipo de DM é o gestacional em que ocorre a diminuição da tolerância à glicose, diagnosticada pela primeira vez na gestação, podendo ou não persistir após o parto. Compreende os casos de DM e de tolerância à glicose diminuída detectados na gravidez. Pertence a categoria outros tipos de DM as formas menos comuns, cujos defeitos ou processos causadores podem ser identificados. Estão incluídos nessa categoria defeitos genéticos associados com outras doenças, com uso de fármacos diabetogênicos e outras condições (KORO et al., 2004). Dados divulgados pela Organização Mundial de Saúde (OMS) alertam para o crescente número de casos de pessoas portadoras de DM. Em 2004 cerca de 3,4 milhões de pessoas morreram em virtude dos elevados níveis de glicose no sangue. Estima-se ainda que 220 milhões de pessoas possuam diabetes, e que entre 2005 e 2030 o número de mortes poderá dobrar (WHO, 2011). Estima-se que no Brasil no ano 2000 havia 4,6 milhões de diabéticos em nosso país, e estima-se que no ano de 2030 pode chegar aos 11,3 milhões de diabéticos em nosso país que deixaria de ocupar o 8º e alcançaria o 6º lugar entre os que apresentam maiores números de diabéticos no mundo (WILD et al., 2004). Apesar dos riscos à saúde que a DM pode ocasionar, a disponibilidade de hipoglicemiantes orais que sejam eficientes e seguros é baixa (NAIR, 2006). Não havendo ainda uma terapia que possa minimizar todos os sintomas ou que possa curar (PARI, 2004). O diabetes traz também um grande impacto econômico para as nações. Só nos Estados Unidos, por exemplo, os custos diretos e indiretos com a doença em 2002 foram estimados em 132 bilhões de dólares (ADA, 2003). Apesar da introdução de novos fármacos e da melhor compreensão dessa entidade clínica nos últimos anos, o controle dessa doença permanece insatisfatório na grande maioria da população. Dados americanos, analisando os níveis de hemoglobina glicada (HbA1c), teste clínico que avalia a glicemia do paciente durante as últimas 4 semanas, visto que as hemácias utilizam a glicose como fonte de energia e esta permanece marcada pelo carboidrato durante um período de até 3 meses, evidenciaram que menos de 50% dos portadores de diabetes mantêm sua.

(22) 20 . doença adequadamente tratada, tendo havido até piora no controle metabólico, quando comparados os anos de 1988-1994 (44,5%) e 1999-2000 (35,8%) (KORO et al., 2004). A presença de sobrepeso/obesidade é uma situação cada vez mais presente no mundo atual (KUMANYIKA et al., 2002). E é um incremento significativo no risco para o desenvolvimento de DMNID, sendo a resistência insulínica um importante elo entre esse tipo de diabetes e a obesidade. Portadores de obesidade abdominal, com maior deposição de gordura visceral, também apresentam maior risco para o desenvolvimento do DMNID (CHAN et al., 1994). A gordura visceral apresenta um alto turnover metabólico, com expressiva atividade lipolítica, drenando expressivas concentrações de ácidos graxos livres (AGL) diretamente no fígado através da veia portal. Os AGL ao nível hepático, por sua vez, reduzem o clearance da insulina e aumentam a produção hepática de glicose. Toda a ação que vise à perda ponderal de gordura, portanto, tende a reduzir a progressão dos quadros de tolerância diminuída a glicose e glicemia de jejum alterada. No tocante à perspectiva de grande incremento no número de portadores de DMNID, a susceptibilidade genética não pode justificar isoladamente esse quadro, sendo indubitavelmente os fatores ambientais parte fundamentais desse cenário (COLDITZ et al., 1995).. 2.2. Tratamento farmacológico do Diabetes mellitus. O tratamento usado atualmente é focado no controle e manutenção da glicemia em níveis fisiológicos. Os principais mecanismos utilizados para estes fins são: estimulação das células βpancreáticas para liberação da insulina, inibição dos hormônios que aumentam a glicemia, aumento do número e sensibilidade dos receptores de insulina, diminuição da degradação do glicogênio, eliminação dos radicais livres e inibição da peroxidação dos lipídeos, melhora da microcirculação e correção do metabolismo das proteínas e lipídeos (NEGRI, 2005). As principais classes de fármacos clinicamente utilizadas para o tratamento do diabetes são (LI et al., 2004): a) Preparações de Insulinas, ex: insulinas de ação rápida, intermediária e longa.. As preparações de insulina têm apresentado excelentes resultados na clínica quando utilizados em pacientes com diabetes tipo 1, pois favorecem a diminuição da glicemia em.

(23) 21 . níveis normais mais rapidamente, além de apresentar diminuição de fatores complicadores da diabetes como retinopatias (76%), neuropatias (60%) e nefropatias (39%), demonstrando portanto uma melhora no controle metabólico. As insulinas de ação rápida possui curta duração de ação variando de 4-8 horas sendo necessária a utilização de 2-4 administrações diárias, já as de ação intermediária atuam por cerca de 12 horas, o que favorece o tratamento, entretanto o seu uso sugere um controle mais rígido e com diminuição de lanches, fator não necessário para a de curta duração. As insulinas de proporções fixas podem ser utilizadas por ambos os tipos de diabetes e não apresentam facilidades de ajuste de doses quando necessário. Por último encontram-se as de ultra longa duração que apresentam maior segurança de uso, menor quantidade de aplicações, além de mimetizar mais eficazmente a insulina endógena, no entanto tal produto ainda encontra-se em fase de estudo para a América do Norte e a maior parte de Europa (SCHMID, 2007).. b) Sulfoniluréias, ex: glibenclamida. Aumentam a secreção de insulina. As sulfoniluréias possuem mecanismo de ação mediado pela regulação dos canais de KATP, presente na membrana das células beta pancreáticas. A inibição destes canais produzido pela sulfoniluréias promove acúmulo de potássio no interior da célula e posterior despolarização da membrana e consequente influxo de Ca2+ que culmina com a secreção de insulina. Tal efeito é bastante eficaz durante os seis primeiros meses de uso desta classe de medicamentos, no entanto após este tempo a secreção de insulina pode ser igual ou até diminuída, mas os efeitos mantém-se por conta dos efeitos extra pancreáticos. As sulfoniluréias de primeira geração possuíam meia vida muito longa (36-40h), já as de segunda e terceira geração como a glibenclamida e glicazida, respectivamente, possuem uma meia vida de 8-16h. A última pode ainda promover diminuição na oxidação de lipoproteína de baixa densidade (LDL), enquanto que a glimepirida (2ª geração) é a que possui uma maior ligação com as proteínas hepáticas do que com as proteínas do miocárdio Sua maior indicação é para pacientes com diabetes tipo 2, (ARAUJO, BRITO e CRUZ, 2000)..

(24) 22 . c) Metiglininas, ex: repaglinina. Aumentam a secreção de insulina. Possuem mecanismo de ação similar ao das sulfoniluréias, no entanto com início de ação mais rápida e uma meia vida mais curta que as sulfoniluréias, resultando em uma diminuição do risco de hipoglicemias e melhor adaptação ao tratamento quando ingerida após as refeições. Estas duas classes de medicamentos possuem o incômodo de ação efêmera, pois geralmente promovem a morte das células hepáticas e conseqüente ineficácia (SILVA, LOPES e SOARES, 2009).. d) Biguanidas, ex: metformina. Aumenta a sensibilidade à insulina e inibe a neoglicogênese. Encontram-se disponíveis desde a década de 20, o fármaco mais conhecido desta classe é a metformina, que foi introduzida na clínica a partir dos anos 60. Atua reduzindo a absorção de glicose intestinal e da insulinoresistência periférica, além de promover a diminuição da gliconeogênese hepática, proporcionando ainda redução na síntese de triglicerídeos e também na esteatose hepática, além de reduzir as enzimas lipogênicas. Tais mecanismos promovem o controle glicêmico eficaz, perda de massa corporal, melhora do perfil lipídico e redução de fatores protrombônicos sendo, portanto indicada para o controle da síndrome metabólica no controle do risco cardiovascular (ARAUJO, BRITO e CRUZ, 2000 e SILVA, LOPES e SOARES, 2009).. e) Glitazonas, ex: roziglitazona. Aumenta a sensibilidade à insulina. Seu mecanismo de ação é esclarecido pela sensibilização à ação da insulina em músculos, adipócitos e células hepáticas além de promover diminuição da resistência à insulina periférica, ativando receptores intracelulares (PPPAR- γ - peroxisome proliferator activated receptor-γ), aumentando a expressão do transporte de glicose ativado por GLUT-4, além de promover diferenciação nos adipócitos. As glitazonas ou tiazolidinedionas inibem a oxidação de ácidos graxos de cadeia longa, promovendo diminuição da gliconeogênese e disponibilidade de ácidos graxos livres..

(25) 23 . Possuem baixa toxicidade e podem ser utilizadas em conjunto com a metformina por terem efeitos aditivos. Durante o tratamento podem diminuir em aproximadamente 20% os níveis glicêmicos, 15-20% os níveis de triglicerídeos e aumento de 5-10% do HDLcolesterol e de 10-15% no LDL–colesterol, podendo ainda prevenir ateroscleroses.. f) Inibidores da α-glicosidase, ex: arcabose. Retarda a absorção de carboidratos. Promovem diminuição da absorção de glicose intestinal reduzindo a glicemia de jejum e hiperglicemia pós-prandial, através de sua ação antagonista enzimática da α-glicosidase que promove redução da atividade da sucrase e amilase, enzimas presentes na borda em escova dos enterócitos no lúmen intestinal, impedindo a degradação de oligo e dissacarídeos. Pode ser utilizada em conjunto com outros fármacos hipoglicemiantes. g) Inibidores da aldose redutase, ex: epalrestat. Inibem a formação de sorbitol.. Esta nova classe de medicamentos é utilizada principalmente para o tratamento de neuropatias decorrentes do diabetes, tendo como principal ação a inibição da formação de sorbitol gerado através da via dos poliálcoois, via esta que promove a “mudança de combustível”, ou seja, desvia parte da glicose em excesso, utilizada para gerar energia, para formação de polióis principalmente o sorbitol em sua forma fosforilada, tal desvio promove a acumulação de radicais livres que podem danificar os nervos (RAMASAMY e GOLDBERG, 2011) Estudos têm constatado que doses de 50 mg, três vezes ao dia em humanos melhoram a condução em nervos motores e sensórias quando comparados a medicamentos placebos. Um representante desta nova classe é o epalrestat, medicamento aprovado no Japão e que como efeito adverso promove a alteração nos níveis das enzimas hepáticas, bem como náuseas e vômitos (RAMIREZ e BORJA, 2008)..

(26) 24 . 2.3. Modelos experimentais do Diabetes mellitus. Vários modelos experimentais podem ser utilizados para o estudo do diabetes. Os modelos mais utilizados são roedores tratados com estreptozotocina (STZ) ou aloxano (MARLES e FARNSWORTH, 1995). A STZ é um glicosídeo nitrosouréia natural isolado do Streptomyces achromogenes que entra nas células β pelo transportador de glicose tipo 2 (GLUT 2) estimulando a produção de radicais livres, o que leva à disfunção e destruição das células β das ilhotas de Langerhans do pâncreas. Este xenobiótico tem sido usado para induzir o diabetes com concomitante deficiência de insulina. Uma dose única, entre 50 e 70 mg/kg em ratos pode produzir o modelo experimental de DMNID (MARLES e FARNSWORTH, 1995). Mas, a administração de STZ também pode produzir um diabetes severo, ocasionando lesões superiores a 60% que muitas vezes requer insulina para que os animais sobrevivam por longos períodos (RERUP, 1970). O aloxano, um derivado da pirimidina, é uma toxina muito seletiva das células βpancreáticas por causa também da formação de radicais livres. No entanto, apesar de ser um bom modelo para o Diabetes mellitus, há muitos problemas devido à sua instabilidade química, metabolismo rápido e alguns fatores, tais como dieta e idade, que tornam quase impossível estabelecer uma relação clara entre as doses de aloxano, entre 30 e 50 mg/kg em ratos, e sua concentração efetiva no pâncreas (MARLES e FARNSWORTH, 1995). Além de apresentar pequena ação oncogênica (YAMAGAMI et al., 1985).. 2.4 Plantas Medicinais. Na história da humanidade, os recursos naturais sempre foram utilizados como instrumentos de cura para o tratamento de diversas enfermidades, representando muitas vezes o único recurso terapêutico de muitas comunidades. A natureza, de forma geral, tem produzido a maioria das substâncias orgânicas conhecidas. Entretanto, é o reino vegetal que tem contribuído de maneira.

(27) 25 . mais significante para o fornecimento de compostos úteis a cura e tratamento de diversas doenças que acometem os seres humanos (MONTANARI et al., 2001). De acordo com a OMS, devido à pobreza e à falta de acesso aos medicamentos utilizados pela medicina moderna, grande parte das populações que vivem nos países em desenvolvimento dependem essencialmente de plantas medicinais para tratarem de problemas relacionados à atenção primária da saúde. Dentre as perspectivas da OMS sobre a política internacional de desenvolvimento de novos medicamentos, se destaca a importância da pesquisa de potenciais compostos produzidos a partir de plantas medicinais que apresentem comprovada eficácia, segurança e qualidade (WHO, 2002). Estima-se que aproximadamente 25% de todos os medicamentos modernos são derivados, direta ou indiretamente de plantas. Somente no período de 1983-1994, das 520 novas drogas aprovadas pela agência americana de controle de medicamentos e alimentos (FDA), 220 (39%) foram desenvolvidas a partir de produtos naturais (CALIXTO, 2003). As plantas medicinais têm se mostrado importantes para a medicina moderna. Primeiramente, por fornecer fármacos que dificilmente seriam obtidos por síntese química, como os glicosídeos cardiotônicos de Digitalis spp. As fontes naturais ainda fornecem compostos que podem ser modificados, tornando-os mais eficazes ou menos tóxicos. E por último, os produtos naturais podem ser utilizados com protótipo para obtenção de fármacos com atividades terapêuticas semelhantes a dos compostos originais. (ROBBERS et al., 1996). Desta forma avaliar plantas medicinais que possam atuar diminuindo os níveis de glicemia tem crescido nos últimos anos, principalmente devido ao grande número de substâncias e de plantas com potencial terapêutico (PUNITHA e MANOHARAN, 2006), alguns exemplos são: Origanum vulgare , Lamiaceae,(LEMHADRI et al., 2004), Pongamia pinnata,(Leguminoceae) (PUNITHA e MANOHARAN, 2006), Eugenia jambolana (Myrtaceae) (SHARMA, 2006), Gymnema sylvestre (Apocynaceae)(DAISY et al., 2009). Sabe-se também que os princípios ativos não se distribuem de maneira uniforme no vegetal, podendo concentrar-se nas sementes, raízes, cascas, folhas, flores e frutos. Os vegetais não apresentam uma concentração uniforme de seus princípios ativos durante o seu ciclo de vida, podendo variar de acordo com o ambiente, colheita e a preparação (MATOS, 2000). Esta grande variedade de compostos também vem a sugerir que há diferentes mecanismos para a que a atividade hipoglicêmiante possa permanecer, tais como a estimulação da produção de insulina pelas células β-.

(28) 26 . pancreáticas (RATHOD, 2011), ou possa ocorrer à inibição da absorção de glicose pelas células intestinais. Observa-se também a variedade de compostos que podem ser utilizados com este tipo de atividade, como por exemplo, triterpenos (WANG et al., 2010), xantinas (MURUGANANDAN et al., 2005), flavonóides, e taninos (ROY, 2005). Destes os flavonóides tem sido o grupo dentre os compostos naturais mais disseminados em plantas, sendo as principais categorias estruturais as flavonas, flavononas, flanonóis, antocianidinas e isoflavonas, tendo de acordo com Podolsky (1994) diversas atividades farmacológicas atribuídas como, por exemplo, redução da fragilidade capilar, ações antiinflamatórias, antialérgicas, antiviral, antitumoral, antimicrobianas e oxidantes. No entanto, alguns flavonóides possuem atividade pró-oxidante diminuindo a capacidade respiratória de mitocôndrias isoladas, pela sua auto-oxidação, gerando espécies reativas de oxigênio (ROS), pois os flavonóides auxiliam no processo de transporte de elétrons que ocorre no interior das mitocôndrias (SANTOS et al., 1998), anti-oxidantes, pois nos vasos e também nos músculos promovem a absorção dos elétrons impedindo assim que eles possam causar dano ao organismo, por isto sua, importante atividade hipoglicemiante (RATHOD et al., 2009), no entanto compostos poliisoprenos, como os triterpenos também tem se apresentado como possuidor destas características como relatado por MELO (2010).. 2.5 Apocynaceae e Atividade Hipoglicemiante.. A família Apocynaceae apresenta 415 gêneros e 4.555 espécies e encontra-se representada em todas as áreas do globo exceto na Antártida. Nos últimos anos tem sido bastante estudada quanto a sua atividade hipoglicemiante, Nos últimos anos tem sido bastante estudada quanto a sua atividade hipoglicemiante, visto que foram identificadas algumas espécies com atividade hipoglicemiante. Tabernanhte iboga Baill, Apocynaceae estudada como possuidora de atividade hipoglicemiante, que apresentou atividade estimulante da secreção de insulina em testes in vitro na concentração de 1 µg/mL nas células pancreáticas com dose dependência (SOUZA, MBATCHI e HERCHUELZ, 2011)..

(29) 27 . Caralluma attenuata Wight (Apocynaceae) apresentou atividade hipoglicemiante, em suas folhas, por dose oral de 250 mg/kg do extrato butanólico em ratos induzidos com aloxana e tratados por 10 dias, bem como promoveu diminuição na glicemia em teste de absorção oral a glicose (VENKATESH et al., 2003). Catharantus roseus (L.) G. Don (Apocynaceae) é mais uma espécie desta família com atividade hipoglicemiante, em sua parte aérea,. em ratos induzidos por STZ, promovendo. diminuição de aproximadamente 60% da glicemia nos animais, na dose de 500 mg/kg por via oral, além disto, promoveu diminuição das enzimas envolvidas no processo de estresse oxidativo, bem como na peroxidação de lipídeos através da presença de fenóis e triterpenos (SINGH et al., 2001).. 2.6 Calotropis procera (Aiton) W. T. Aiton (Apocynaceae). Calotropis procera (Aiton) W. T. Aiton (Apocynaceae) conhecida popularmente no nordeste brasileiro como algodão de seda (figuras 1 e 2) é um arbusto selvagem (GOMES, RODAL e MELO, 2006; SINGHAL e KUMAR, 2009) que pode atingir de 1 a 2 metros de altura (KAMATH e RANA, 2002). Apresenta característica xerofítica, com vasto crescimento em regiões tropicais. (CIRCOSTA, SANOGO e OCCHIUTO, 2001) Além disso, apresenta flores brancas (SHARMA e SHARMA, 1999), sendo ainda lactífera. Ocorre predominantemente na Ásia, África e na América do Sul, sendo abundante no Nordeste do Brasil, onde foi trazida como ornamental (SILVA et al., 2011). Essa espécie é utilizada como medicinal, além de ser a madeira comercializada e usada como carvão vegetal. Outros usos incluem bioindicadora e como ração para animais..

(30) 28 . Figura 1: Aspecto geral de Calotropis procera (Aiton) W. T. Aiton (Apocynaceae).. Figura 2: Aspecto geral das flores de Calotropis procera (Aiton) W.T. Aiton (Apocynaceae).. A parte aérea de C. procera tem sido largamente utilizada, principalmente no Oriente, para tratar muitas doenças como, por exemplo, artrite, diabetes, hepatotoxicidade e câncer incluindo a hanseníase (SINGHAL e KUMAR, 2009), além de ser utilizada para distúrbios do sono, epilepsia e úlceras (RASIK et al., 1999). Estudo realizado por Basu e Nag Chaudhuri (1991) quanto à atividade de extratos clorofórmicos das raízes, mostrou que estes possuem potencial antiinflamatório em doses menores (de 5 e 15 mg/kg por via i.p.) que a aspirina..

(31) 29 . Kamath e Rana (2002) verificaram a atividade antiimplantação, durante 4 semanas, em extrato etanólico das raízes por via oral na dose de 250 mg/kg. Além disso, Setty e colaboradores (2007) constataram efeito hepatoprotetor e antioxidante do extrato hidroalcoólico das flores do algodão-de-seda, efeito este conseguido com doses menores que o paracetamol (2 g/kg), enquanto que do algodão de seda foram utilizadas doses de 200 e 400 mg/kg por via oral. O látex de Calotropis procera é o componente da planta mais estudado, apresentando atividade antidiarréica significativa em animais (KUMAR, SANGRAULA e KUMAR, 2001) e analgésica opióide quando testada nas doses de 12,5 a 50 mg/kg, em que promoveu uma inibição entre 68 e 99% respectivamente. Segundo Cavalcante (2007), em ratos, o látex de Calotropis procera por via intravenosa não promoveu alteração nas funções renais e hepáticas nas doses de 3 a 100 mg/kg e não houve alteração da massa corporal ou do leucograma, quando testados por 28 dias. Em testes de atividade hemolítica utilizado como teste in vitro para avaliação de toxicidade C. procera, conhecidamente irritante para os olhos, não apresentou esta característica, assim como outras plantas, tais como: Crotalaria retusa, Ipomoea asarifolia, Ipomoea fistulosa, Datura stramonium, Nerium oleander, Ricinus communis, Lantana camara, Dieffenbachia picta e Alocacia sp., que são conhecidas como tóxicas. (PEQUENO e SOTO-BLANCO, 2006). Esta ação irritante ocular foi comprovada por Basak (2009), que testou o látex de C. procera tendo este provocado dor, fotofobia e edema de córnea em 80% dos pacientes estudados e estes resultados foram correlacionados com glicosídeos cardenolídeos tais como calotropina e calotoxina (figura 3)..

(32) 30 O. O. O. O HO. CHO. HO. H OH O. HO. OH. OH O. CHO OH O. O. H. O. calotoxina. O. calotropina. Figura 3: Glicosídeos característicos de Calotropis procera calotropina e calotoxina.. Nas flores, os metabólitos mais abundantes são os flavonóides, sendo esta classe sugerida como tendo atividade antioxidante e hepatoprotetora (SETTY et al., 2007) além de serem utilizados na quimiotaxonomia da família Apocynaceae segundo Heneidak et al. (2006). Já no látex, a quantidade de metabólitos secundários quer sejam eles proteínas, poliisoprenos, cardenolídeos como calotropina e calotoxina são cardenolídeos descritos nas folhas de C. procera como antipiréticos (AHMAD e BEG 2001), além destes lignanas, flavonol entre outros compostos também estão presentes em suas folhas (SINGHAL e KUMAR, 2009). No entanto o constituinte das raízes não foram descritos. Segundo Lima et al. (2011) o látex de C. procera pode causar sérios efeitos tóxicos quando da exposição, as doses de 0,1 a 1,0 mL de látex/kg, por via intraperitoneal, visto que ratos e cabras quando expostos apresentaram necrose nas fibras cardíacas e vacúolos nos hepatócitos além de taquicardias e arritmias respectivamente. As folhas de C. procera também se têm mostrado eficiente quanto a sua atividade antiinflamatória e gastroprotetora quando testada suas frações hexânica, clorofôrmica, butanólica e acetílica (TOUR e TALELE, 2011). C. procera, nas doses de 100, 200 e 400 mg/kg por via oral, também apresenta metabolitos secundários variados como os novos compostos encontrados por Shaker et al. (2010), E que podem representar compostos de interesse científico visto que flavonóides e terpenoídes são duas classes que demonstram ter atividades hipoglicemiantes, abaixo representado na figura 4..

(33) 31 . 1. 4. 5 . Figura 4: Metabólitos secundários recentemente identificados em Calotropis. Onde o 1 é representado por 5-hydroxy-3,7-dimethoxyflavone-40-O-b-glucopyranoside, 4 é representado por - 2b,19-epoxy-3b,14b-dihydroxy-19-methoxy-5a-card-20(22)-enolide, 5 é representado por b-anhydroepidigitoxigenin-3b-O-glucopyranoside . Nesse contexto, a avaliação da eficácia, baseada em uma investigação farmacológica da atividade antihiperglicemiante do extrato hidroalcoólico de Calotropis procera (Aiton) W. T. Aiton (Apocynaceae) se constitui numa hipótese de pesquisa atraente e necessária para a obtenção de um potencial fitomedicamento para o tratamento do Diabete mellitus..

(34) 32 . 3. Objetivos.

(35) 33 . 3.1 OBJETIVO GERAL:. Investigar o efeito anti-diabético do extrato hidroálcoolico das folhas de Calotropis procera (AITON) W. T. AITON, sobre o metabolismo de ratos diabéticos induzidos por estreptozotocina.. 3.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS. - Identificar e caracterizar (triagem inicial) os metabólitos secundários presentes no extrato hidroalcoólico das folhas de C. procera. - Estimar a DL50 por via oral do extrato hidroalcóolico das folhas de C.procera. - Verificar o efeito anti-hiperglicemiante do extrato hidroalcóolico das folhas de C.procera. - Verificar o efeito do tratamento sub-crônico por via oral com o extrato hidroalcoólico das folhas de C.procera sobre os níveis séricos de glicose, uréia, creatinina, ácido úrico, aminotransferases, triglicerídeos e colesterol total de ratos diabéticos induzidos. - Averiguar se extrato hidroalcoólico das folhas de C. procera promove tolerância oral à glicose após uma carga de glicose..

(36) 34 . 4. Artigo (Enviado para Brazilian Journal of Pharmacognosy).

(37) 35 . Evaluation of antihyperglycaemic activity of Calotropis procera (Apocynaceae) leaves extract on streptozotocin-induced diabetes in Wistar rats.. Mário C. L. Neto1, Valerium N. Thijan1, Hélida M. L. Maranhão1, Carlos F. B. de Vasconcelos1, Alice V. Araújo2, João H. Costa-Silva3, Elba Amorim1, Fabiano Ferreira2, Antonio F. M. de Oliveira4, Almir G. Wanderley1,2* 1. Departamento de Ciências Farmacêuticas, Universidade Federal de Pernambuco, Zip code 50670-901, Recife - PE, Brasil.. 2. Departamento de Fisiologia e Farmacologia, Universidade Federal de Pernambuco, Zip code 50670-901, Recife - PE, Brasil. 3. Departamento de Educação Física, CAV - Universidade Federal de Pernambuco, Zip code 55608-680, Vitória de Santo Antão - PE, Brasil. 4. Departamento de Botânica, Universidade Federal de Pernambuco, Zip code 50670-901, Recife - PE, Brasil.. *Corresponding author at: Department of Physiology and Pharmacology, CCB, University Federal of Pernambuco, Av. Prof. Moraes Rego, s/n, CEP 50670-901 – Cidade Universitária, Recife, PE, Brazil – Tel.: +55 81 21268530; fax.: +55 81 21268976. E-mail address: almirgw@globo.com (A. G. Wanderley)..

(38) 36 . Abstract. Calotropis procera (Aiton) W. T. Aiton (Apocynaceae), popularly known as Algodão-de-seda, is a wild African bush, rich in bioactive substances that determine the medicinal potential of this species. Diabetes mellitus is a disease that affects about 10% of the population. This study aimed to evaluate the antihyperglycaemic activity of the hydroalcoholic extract of the leaves of Calotropis procera of occurrence in coast of Pernambuco, Brazil. The hydroalcholic extract of the leaves of Calotropis procera (300 and 600 mg/kg/day), vehicle, insulin (6U, s.c.) or metformin (500 mg/kg/day) were administered orally to streptozotocin-induced diabetic rats (n=7/group) for 4 weeks. Changes in body weight, food and water intake, biochemical markers, fasting glucose levels and oral glucose tolerance test were evaluated. The results show that the Calotropis procera dried extract (300 and 600 mg/kg) reduced significantly the level of blood glucose throughout the evaluation period and improved metabolic status of the animals and ameliorate the oral tolerance glucose test. The phytochemical screening revealed and quantified the presence of phenolic compounds and flavonoids in a percentage of 29.1 and 2.9%, respectively. Thus we conclude that the extract of the leaves of Calotropis procera has antihyperglycaemic activity, possibly related to the presence of phenols and flavonoids.. Keyword: Antihyperglycaemic, Apocynaceae, Calotropis procera, Diabetes, streptozotocin,.

(39) 37 . 1.0. Introduction Diabetes mellitus is a disorder characterized by increased levels of blood glucose, consequence of impaired insulin production, insulin resistance or both. It is associated to long-term damage of eyes, liver, kidneys, nerves, blood vessels and it may cause degenerative diseases in central nervous system (Bhutada et al., 2011). Plant compounds such as triterpenes (Wang et al., 2010), xanthines (Muruganandan et al., 2005), flavonoids, tannins (Roy et al., 2005), proteins (Ahmad & Beg, 2001), lignans, flavonol (Singhal & Kumar, 2009), among others, have been related to the improvement of hyperglycaemia in diabetes. Calotropis procera (Aiton) W. T. Aiton (Apocynaceae) is a wild bush originated from Africa, India and Persia (Gomes et al., 2006; Singhal & Kumar, 2009). In Brazil, it was introduced as an ornamental plant and in northeastern Brazil it is popularly known as cotton silk, silk flower, and “queimadeira” (Lima et al., 2011). In addition, C. procera has biologically active substances such as flavonoids, cardioactive glycosides, triterpenoids, alkaloids, resins, anthocyanins, tannins, saponins and proteolytic enzymes (Shaker et al., 2010). The latex of Calotropis procera has been widely studied due to its antihyperglycaemic (Roy et al., 2005), anti-inflammatory, gastroprotective (Tour & Talele, 2011), antinociceptive and selective cytotoxic effects (Teixeira et al., 2011). However there is no information in the literature about the potential antidiabetic activity of secundary metabolites present in the leaves this species. In this way, the present study was designed to investigate the antihyperglycaemic activity of the leaves of Calotropis procera.. 2.0. Material and methods. 2.1. Plant material.

(40) 38 . The plant material (Calotropis procera (Aiton) W. T. Aiton (Apocynaceae)) was collected in Paulista, Pernambuco, Brazil (S 07°50`32” W 34°50`22”). The voucher specimen of the plant was deposited at the Geraldo Mariz herbarium from Federal University of Pernambuco, under the number 63707.. 2.2. Preparation of hydroalcoholic extract of leaves of Calotropis procera. The collected leaves of Calotropis procera were subjected to a screening for exclusion of damaged leaves and removal of midribs from leaves. Then, they were dried in circulating air oven (45 ± 2°C), crushed and macerated until exhaustion in 50% ethanol solution at ratio of 1:10 (w/v) which was replaced every 72 hours. The final extract was concentrated in rotary evaporator under reduced pressure at temperature of 60°C and subsequently lyophilized and kept at 4°C until use.. 2.3. Chromatographic analysis The methods described by Wagner and Bladt (1996) and Harborne (1998) were used to screen the leaves extract for the reducing sugars, alkaloids, coumarins, cinnamic derivatives, flavonoids, cardenolide glycosides, tannins, triterpenes, total phenols, flavonoids and saponins. The phytochemical profile was drawn up using thin layer chromatography (TLC) on aluminum plates 20x20 cm (Fluka®) using the appropriate mobile phase, reagents and standards (Sigma Aldrich).. 2.4. Animals Male Wistar rats (220 - 260 g) obtained from the Federal University of Pernambuco’s Department of Physiology and Pharmacology and Swiss mice (35 - 40 g) obtained from the Aggeu Magalhães Research Center (CPqAM/Fiocruz/UFPE), Pernambuco, Brazil, were used. They were.

(41) 39 . kept under standard environmental conditions (12 h dark/light cycle) and temperature (22 ± 2 °C). Water and industrialized dry food (Labina®, Purina, Brazil) were available ad libitum. All the experimental protocols were submitted to and approved by the Animal Experimentation Ethics Committee of the Federal University of Pernambuco, under license no. 051739/2010-81 in accordance with the National Institute of Health Guide for the Care and Use of Laboratory Animals.. 3.5. Acute toxicity “Up and down” acute toxicity studies were performed on male Swiss mice as described by OECD 420 (2001), with slight modifications. The animals were randomly divided into four groups (n = 5/group) and deprived of feed for 12 h with access to water ad libitum. The treated groups received hydroalcoholic extract of the leaves of Calotropis procera in a single oral dose of 5.0 g/kg and the control groups received water (10 mL/kg). The observations were performed at 30, 60, 120, 180 and 240 minutes after the oral treatments and daily for 14 days. Behavioral changes, weight, food and water consumption, clinical signs of toxicity and mortality were recorded daily (Malone, 1977).. 3.6. Induction of experimental diabetes Diabetes was induced using streptozotocin (STZ) from Sigma-Aldrich®, St. Louis, MO, USA. The animals were fasted overnight and diabetes was induced by way of a single intra peritoneal injection of a freshly prepared solution of STZ (50 mg/kg b.w.) in a 0.1M citrate buffer (pH 4.5). On the third day of STZ-injection, the animals with fasting glycaemia higher than 200 mg/dL and with signs of polyuria and polydipsia were considered to be diabetic and included in the study (Siddique et al., 1989)..

(42) 40 . 4. Diabetic animals 4.1. Treatment In the experiment, the animals were randomly divided into six groups (n=6/group): Group 1 (NDC: non-diabetic control) and group 2 (DC: diabetic control) consisted of rats treated with vehicle (water); group 3 (MTD: diabetic rats treated with metformin 500 mg/kg/day b.w.), groups 4 and 5 (diabetic rats treated with hydroalcoholic extract of the leaves of Calotropis procera 300 and 600 mg/kg/day b.w., respectively) and group 6 (ITD-diabetic rats treated with insulin 6 U, s.c). Treatment was administered orally on a daily basis in a single dose for 28 consecutive days. Fasting glucose and body weight were recorded weekly, while food and water intake were monitored daily.. 4.2. Oral glucose tolerance test (OGTT) in STZ-diabetic rats On the 25th day of treatment, the animals from groups 1-5 were fasted for 12h. Fasting glycaemia was measured and defined as zero time. After this procedure, animals received their treatment orally and after 30 minutes, all groups received an oral load of d-glucose (2.0 g/kg b.w). Blood glucose levels were measured five minutes before and 30, 60, 120 and 150min after glucose administration (Vasconcelos et al., 2011). Blood samples were obtained from the tail vein and glucose concentration determined using a blood glucose device monitor (Accu-Chek® active, Roche diagnostics Gmbh-Germain).. 4.3. Biochemical parameters At the end of treatment, blood samples were collected and centrifuged at 1500×g for 10min to obtain the serum, which was stored at -20 ºC until the following parameters had been.

(43) 41 . determined: glucose, blood urea nitrogen (BUN), creatinine, uric acid, aspartate aminotransferase (AST), alanine aminotransferase (ALT), triglycerides and total cholesterol (TC). Dosages were made using Architect (Abbott®) automation with Boehringer Ingelheim® biochemical kits (Silva et al., 2009).. 4.4. Liver and tissue mass analysis Once blood had been collected, the animals were euthanized with an excess of Nembutal® (140 mg/kg, i.p). Liver, epididymal adipose tissue, soleus and extensor digitorium longus muscles were carefully removed and individually weighed and the data was expressed in absolute and relative terms (g and g/100g b.w., respectively) in accordance to Lima et al. (2009).. 4.5. Statistical analysis The results were expressed as mean ± standard error of mean (S.E.M). Statistical analysis was performed using Graph Pad Prism 5.0® software. The difference between groups was assessed by analysis of variance (ANOVA), followed, when necessary, by Newman-Keuls test. The significance level for rejection of the null hypothesis was always ≥ 5% (p<0.05).. 5. RESULTS 5.1. Phytochemical analysis The phytochemical analysis of the hydroalcoholic extract of C. procera in TLC showed the presence of reducing sugars, flavonoids identified in the first moment as luteolin and kaempferol, and cardenolide glycosides (figure 1). The content of phenols and flavonoids were 29.3 and 3,0 % respectively..

(44) 42 . Figure 1. 5.2. Acute toxicity It was observed that the hydroalcholic extract of the leaves of Calotropis procera (5.0 g/kg, v.o.) did not induce changes in the behavior of male mice during the first 30 minutes and for a period of up to 4 h after administration. No death was recorded during the 14 days of observation. No significant changes in intake of food and water or in body weight were observed throughout the period (data not shown). The LD50 could not therefore be estimated and it is possibly higher than 5.0 g/kg.. 5.3. STZ-Diabetic animals. 5.3.1. The effect of Calotropis procera on fasting blood glucose Oral administration of Calotropis procera 300 and 600 mg/kg/day b.w. in diabetic rats showed significant reductions in fasting glucose levels of more than 60% already in the first week of treatment when compared to DC and more than 45% in relation to MTD group. At the end of treatment, this reduction was of 68 and 51%, respectively, only in relation to DC (Figure 2). Figure 2. 5.3. The effect of Calotropis procera on body mass gain, food and water intake Figures 3, 4 and 5 show the evolution of body mass gain, food and water intake in the experimental groups during the 28-day treatment, respectively..

(45) 43 . During the period there was no significant difference in body mass gain in groups Cp (300 and 600 mg/kg) when compared to DC and MTD (Figure 3). The results shown in Figure 4 reveal a significant reduction in food intake in the group receiving Calotropis procera 300 mg/kg/day from the first week of the study until the end of the treatment when compared with DC. Statistical reduction in relation to MTD occurred from the third week. The group treated with Calotropis procera 600 mg/kg/day showed reductions in food intake only in the first and third week of the study when compared with DC. Polydipsia was significantly reduced in the group receiving Calotropis procera 300 mg/kg/day already in first week of treatment compared to DC and, in the following weeks, this reduction was also significant for the DC and MTD. The administration of 600 mg/kg/day of Calotropis procera did not show statistical differences for this parameter when compared to the DC (Figure 5). 5.4. The effect of Calotropis procera on oral glucose tolerance test Figure 6 shows the blood glucose levels of the NDC, DC, ITD, MTD and Calotropis procera 300 and 600 mg/kg b.w groups after oral administration of d-glucose (2.0g/kg b.w). Calotropis procera 300 and 600 mg/kg showed significant decrease in glycaemia from 30min after glucose administration when compared to DC group. Reductions of 35.6, 36.7, 43.7 and 39.1% and 43.9, 37.2, 40.9 and 40.9% were observed in glycaemic levels of this group in 30, 60, 120 and 150min, respectively, when compared to diabetic control. Figure 6. 5.5. The effect of Calotropis procera on biochemical parameters.

(46) 44 . Rats treated with Calotropis procera 300 and 600 mg/kg showed statistically significant reductions in uric acid, AST and ALT levels when compared to DC and significant increases in creatinine, total cholesterol and triglycerides in relation to same group (Table 1). Table 1. 5.6. Effect of Calotropis procera on the mass of organs and tissues. The effects of Calotropis procera 300 and 600 mg/kg on masses of liver, kidney, epididymal adipose tissue (EAT), soleus and extensor digitorium longus (EDL) muscles are given in table 3. Calotropis procera 300 mg/kg induced a significant increase in EAT and soleus muscle relative mass, but reduced the relative mass of the kidneys in relation to DC group. While Calotropis procera 600 mg/kg produced statistical increase in mass of the EAT when compared to DC group. Both doses of Calotropis procera increased the mass of the EDL.. Table 2 . 6.0. Discussion Considering the wide use of this herb in folk therapeutics for the treatment of diabetes, the present study was conducted to investigate the antihyperglycaemic activity of Calotropis procera in streptozotocin-induced diabetic rats. Nowadays, herbal drugs are gaining popularity in the treatment of diabetes and its complications due to their efficacy, low incidence of side effects and low cost (Valiathan, 1998)..

(47) 45 . This is the first study to show that the treatment with the hydroalcoholic extract of the leaves of Calotropis procera for four weeks exhibited significant antihyperglycaemic effect in streptozotocin-induced diabetic rats. The results of the acute toxicity test indicated that the hydroalcholic extract of leaves of Calotropis procera when administered orally at a dose of 5.0 g/kg did not produce any sign of toxicity or death in the treated animals, suggesting an LD50 of above 5.0 g/kg. Kennedy et al. (1986) reported that substances that present LD50 higher than 5.0 g/kg after oral administration can be considered practically non-toxic. Therefore, it can be suggested that acute toxicity for Calotropis procera is practically nil when administered in this way. The phytochemical analysis of the hydroalcoholic extract of the leaves of Calotropis procera showed the presence of redutors sugars, phenols and flavonoids. The latex of this species has been shown to contain cardinolides, lignans and flavanol glycosides that have been considered to contribute to its antioxidant properties (Mueen Ahmed et al., 2003). In the same way, Roy et al. (2005) reported that the dry latex (100 and 400 mg/kg) has anti-hyperglycaemic and antioxidant effects against alloxan-induced diabetes in rats. Indeed the role of oxidative stress and altered antioxidant level in the pathogenesis of diabetic complications is well established (Maxwell et al., 1997). Persistent hyperglycaemia leads to increased production of free radicals through glucose autooxidation and protein glycation (Zhang & Tan, 2000). The streptozotocin destroys pancreatic β cells, giving rise to severe diabetes (Szkudelki, 2001). In our study, the induction of diabetes was confirmed by high levels of fasting glucose, and as expected, the diabetic rats had polyphagia, polydipsia and polyuria. Calotropis procera induced a decrease in blood glucose that was similar to the standard antidiabetic drug metformin and this effect was also reflected by the decrease of daily water and food intake. In addition, the oral glucose tolerance test performed at the end of treatment showed clearly that the animals treated daily with Calotropis procera not only had fasting glucose levels lower than.

(48) 46 . the DC group, but also improved their metabolic state through increased glucose tolerance in a manner similar to the metformin-treated group. The group ITD presented an intense hypoglycaemia after 60 minutes and, therefore, the administration was stopped to prevent animal death. The effect of Calotropis procera on the biochemical parameters and tissue mass were punctual. In general, the extract improved the metabolic status of animals in relation to the DC group. In diabetic rats, there was an increase in urea and uric acid levels in blood. The values of uric acid were diminished in the treated groups. There was also a tendency to decrease (not significant) in the urea levels. Hyperuricemia and uremia has a direct relationship with augmented protein catabolism (Gutman & Yu, 1973), which is found during decompensated diabetes. The treatment with the leaves extract of Calotropis procera ameliorate this parameters. The treatment with Calotropis procera also diminished the high levels of AST and ALT. There is a relationship between high levels of ALT, AST and alkaline phosphatase and increased levels of abnormal metabolites in diabetes (Perera et al., 2008). The reduction in the levels of these enzymes in animals treated with the Calotropis procera may be explained by the hepatoprotective effect that according to Tsuchiya (2001) alter the fluidity of the hepatocyte membrane. Regarding the tissue mass, the extract of Calotropis procera produced a beneficial effect by increasing the mass of the epididymal adipose tissue and soleus and extensor longus digitorium muscles. These results indicate a decrease in protein catabolism through increasing glucose uptake. According to Umesh et al. (2005), during uncompensated diabetes, there is a decrease in body mass due to energy deficit and the cellular catabolic process characterized by glycogenolysis, lipolysis and proteolysis. In conclusion, our results show that the hydroalcoholic extract of the leaves of Calotropis procera has antihyperglycaemic activity in streptozocin-induced diabetic rats. This action may have initially the contribution of phenols and flavonoids. However, the mechanism of action remains to.

(49) 47 . be established. Some hypotheses include an antioxidant action, interference with insulin levels and the enzymatic pathways of protein kinase B and AMP-activated protein kinase.. Conflicts of interest There is no conflict of interest.. Acknowledgements The authors would like to thank Rejane de Souza for technical assistance. . 7.0 REFERENCES Ahmad I, Beg AZ 2001. Antimicrobial and phytochemical studies on 45 Indian medicinal plants against multi-drug resistant human pathogens. J Ethnopharmacol 74: 113-123.. Bhutada P, Mundhada Y, Bansoda K, Tawari S, Patil S, Pankaj Sudhir D, Sudhir U, Mundhada D 2011. Protection of cholinergic and antioxidant system contributes to the effect of berberine ameliorating memory dysfunction in rat model of streptozotocin-induced diabetes. Behav Brain Res 220: 30–41.. Gomes AP, Rodal MJN, Melo AL 2006. Florística e fitogeografia da vegetação arbustiva subcaducifólia da chapada de São José, Buíque, PE, Brasil, Acta Botan Brasil 20(1): 37-48.. Harborne JB 1998. Phytochem Methods. 3a ed. London: Kluwer Academic Publishers..

(50) 48 . Kennedy GL, Ferenz RL, Burgess BA 1986. Estimation of acute oral toxicity in rats by determination of the approximate lethal dose rather than the LD50. J App Toxicol 6: 145148.. Lima LB, Vasconcelos CFB, Maranhão HML, Leite VR, Ferreira PA, Andrade BA, Araújo EL, Xavier HS, Lafayette SSL, Wanderley AG 2009. Acute and subacute toxicity of Schinus terebinthifolius bark extract. J Ethnopharmacol 126: 468-473.. Lima JM, Freitas FJC, Amorim RNL, Câmara ACL, Batista JS, Soto-Blanco B 2011. Clinical and pathological effects of Calotropis procera exposure in sheep and rats. Toxicon 57: 183185.. Malone MH 1977. Pharmacological approaches to natural products screening and evaluation. In: Wagner H, Wolf P (eds.). Natural products and plant drugs with pharmacological, biological or therapeutical activity. Berlin: Springer-Verlag, 23-53.. Maxwell SRJ, Thomason S, Sandier D, Leguen C, Baxter MA, Thorpe GHG, Jones AF, Barnett AH 1997. Antioxidant status in patients with uncomplicated insulin-dependent and non-insulin dependent diabetes mellitus. Eur J Clin Invest 27: 484–490.. Mueen Ahmed KK, Rana AC, Dixit VK 2003. Free radical scavenging activity of Calotropis species. Indian Drugs, 40: 654–655..

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