Análise proteômica de Chromobacterium violaceum: acúmulo estacionário e diferencial após exposição à luz UVC

Texto

(1)Universidade Federal do Rio Grande do Norte Centro de Biociências Departamento de Biologia Celular e Genética Laboratório de Biologia Molecular e Genômica Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia - RENORBIO. Análise proteômica de Chromobacterium violaceum: acúmulo estacionário e diferencial após exposição à luz UVC. Aluna: Viviane Katielly Silva Medeiros Orientador(a): Profª Drª Silvia Regina Batistuzzo de Medeiros. Área de Concentração: Biotecnologia em Saúde. NATAL DEZEMBRO/2011.

(2) VIVIANE KATIELLY SILVA MEDEIROS. Análise proteômica de Chromobacterium violaceum: acúmulo estacionário e diferencial após exposição à luz UVC. Tese. de. Doutorado. apresentada. ao. Departamento de Biologia Celular e Genética da Universidade Federal do Rio Grande do Norte como requisito para a obtenção do título de Doutor(a) em Biotecnologia.. Orientadora: Prof.a Dr.a Silvia Regina Batistuzzo de Medeiros. NATAL DEZEMBRO/2011.

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(4) VIVIANE KATIELLY SILVA MEDEIROS. Análise proteômica de Chromobacterium violaceum: acúmulo estacionário e diferencial após exposição à luz UVC. Tese de Doutorado apresentada ao Departamento de Biologia Celular e Genética da Universidade Federal do Rio Grande do Norte como requisito para a obtenção do título de Doutor(a) em Biotecnologia.. Aprovada em:. /. /. ___________________________________________________ Prof.a Dr.a Silvia Regina Batistuzzo de Medeiros (Orientadora) Departamento de Biologia Celular e Genética – UFRN ___________________________________________________ Prof.a Dr.a Lucymara F. Agnez Lima Departamento de Biologia Celular e Genética – UFRN ___________________________________________________ Prof.º Dr.º João Paulo Matos Santos Lima Departamento de Bioquímica – UFRN ___________________________________________________ Prof.º Dr.º Carlos Priminho Pirovani Departamento de Ciências Biológicas, Genética e Bioquímica – UESC ___________________________________________________ Prof.º Dr.º Thalles Barbosa Grangeiro Departamento de Biologia - UFC.

(5) Aos meus pais, Louro e Socorro, que mesmo distante sempre estiveram ao meu lado.. ii.

(6) Agradecimentos. Agradeço à Professora Silvia Batistuzzo pelos ensinamentos, paciência e apoio. Aos meus anjos de Ilhéus professor Priminho e Ângela. Priminho, um exemplo de pessoa e pesquisador que me ajudou no momento em que mais precisei e com quem aprendi a ser uma pesquisadora e, acima de tudo, uma pessoa melhor. Ângela que me recebeu como uma irmã, me dando força e coragem para não desistir frente às inúmeras dificuldades. Aos meus amigos do LBMG que tornaram os dias estressantes bem mais alegres. Em especial ao grupo prote-chromo (Daniel e Fábio) que me recebeu de braços abertos, sempre dispostos a ajudar e a tornar os problemas mais fáceis de serem resolvidos. Em especial a Fábio por todo o apoio e incentivo,. mesmo. à. distância. compartilhou. todos. os. momentos. do. desenvolvimento desta tese, você é meu orgulho! Aos colegas do grupo de células-tronco que participaram do primeiro projeto da tese, obrigada pela ajuda e pelos bons momentos. Aos amigos da UNIVASF Kyria, Luciana Andrade, Rodrigo, Serginho, Luciana Macatrão e Karen, sem vocês eu não teria conseguido. Em especial a Lu Andrade que mais que uma amiga, é como uma irmã pra mim. A Tia Milagres, Ana e Linardo que deram apoio nos momentos mais difíceis, vocês são mais que família. Aos membros da banca por aceitarem participar desta defesa. Ao CNPq pelo financiamento do projeto. A FACEPE pela bolsa concedida.. iii.

(7) RESUMO. Chromobacterium violaceum é um bacilo de vida-livre, Gram-negativo comumente encontrado no solo e nas águas de regiões tropicais e subtropicais. Uma das principais características deste organismo é sua capacidade de produzir o pigmento violaceína, o qual apresenta inúmeras atividades biológicas. Em 2003, o genoma deste organismo foi completamente sequenciado e revelou informações importantes sobre a fisiologia desta bactéria. Porém, poucos estudos pós-genômicos tem sido realizados. Este trabalho avaliou o perfil proteico de C. violaceum cultivada em meio LB a 28ºC, o que permitiu a identificação de proteínas relacionadas a um possível sistema de secreção ainda não identificado e caracterizado em C. violaceum, ao sistema quorum sensing, a processos regulatórios da transcrição e tradução, adaptação ao estresse e ao potencial biotecnológico. Além disso, a resposta desta bactéria à radiação UVC foi avaliada. A comparação do perfil protéico, analisado por eletroforese 2-D, do controle versus tratado possibilitou a identificação de 52 proteínas que surgiram após a indução do estresse. Os resultados obtidos permitiram a elaboração de uma via de resposta de C. violaceum ao estresse gerado pela luz UVC. Esta via, que parece ser de resposta geral ao estresse, envolve a expressão de proteínas relacionada à divisão celular, metabolismo de purinas e pirimidinas, choque térmico ou chaperonas, fornecimento de energia, regulação da formação de biofilme, transporte, regulação do ciclo lítico de bacteriófagos, além de proteínas que ainda não apresentam função caracterizada. Apesar da reposta apresentar similaridades com a SOS clássica de E. coli, ainda não podemos afirmar que C. violaceum apresenta uma resposta SOS-like, principalmente devido a ausência da caracterização de um proteína LexA-like neste organismo.. Palavras-chave: C. violaceum, UVC, T6SS, proteome, resposta SOS, biofilme. iv.

(8) ABSTRACT. Chromobacterium violaceum is a free-living bacillus, Gram-negative commonly found in water and sand of tropical and subtropical regions. One of its main characteristic it's the ability to produce the purple pigment named violacein, that shows countless biological activities. In 2003, the genome of this organism was totally sequenced and revealed important informations about the physiology of this bacteria. However, few post-genomics studies had been accomplished. This work evaluated the protein profile of C. violaceum cultivated in LB medium at 28ºC that allowed the identification and characterization of proteins related to a possible secretion system that wasn't identified and characterized yet in C. violaceum, to the quorum sensing system, to regulatory process of transcription and translation, stress adaptation and biotechnological potential. Moreover, the response of the bacteria to UVC radiation was evaluated. The comparison of the protein profile, analyzed through 2-D electrophoresis, of the control group versus the treatment group allowed the identification of 52 proteins that arose after stress induction. The obtained results enable the elaboration of a stress response pathway in C. violaceum generated by the UVC light. This pathway, that seems to be a general stress response, involves the expression of proteins related to cellular division, purine and pirimidine metabolism, heat chock or chaperones, energy supply, regulation of biofilm formation, transport, regulation of lytic cycle of bacteriophages, besides proteins that show undefined function. Despite the response present similarities with the classic SOS response of E. coli, we still cannot assert that C. violaceum shows a SOS-like response, mainly due to the absence of characterization of a LexA-like protein in this organism.. Key-words: C. violaceum, UVC, T6SS, proteome, SOS response, biofilm. v.

(9) LISTA DE FIGURAS. Figura 1. Estrutura molecular da violaceína.. 10. Figura 2. Estrutura esquemática do sistema de secreção tipo III indicando proteínas que formam cada componente. vi. 13.

(10) LISTA DE TABELAS. Tabela 1. Principais categorias de proteínas de membrana relacionadas ao transporte anotadas no genoma de C. violaceum. 17. Tabela 2. Proteínas relacionadas à resposta SOS em C. violaceum. 19. vii.

(11) LISTA DE ABREVIATURAS. DNA: ácido desoxirribonucléico EROs: Espécies Reativas de Oxigênio MMS: metilmetanosulfonato MMC: mitomicina-C TTSS: sistema de secreção tipo III UVA: radiação ultravioleta A UVB: radiação ultravioleta B UVC: radiação ultravioleta C. viii.

(12) SUMÁRIO. RESUMO. iv. ABSTRACT. v. LISTA DE FIGURAS. vi. LISTA DE TABELAS. vii. LISTA DE ABREVIATURAS. viii. 1. INTRODUÇÃO. 7. 2. REVISÃO DA LITERATURA. 8. 2.1. Breve histórico. 8. 2.2. Chromobacterium violaceum: um organismo com alto potencial biotecnológico. 9. 2.3. A violaceína e suas propriedades. 10. 2.4. Patogenicidade. 12. 2.5. Tolerância ao estresse e adaptabilidade ambiental de C. violaceum. 14. 2.6. Proteínas de transporte em C. violaceum. 16. 2.7. Sistema SOS e C. violaceum. 18. 2.8. Proteômica como ferramenta para o entendimento do metabolismo bacteriano. 20. 3. OBJETIVOS. 22. 3.1. Objetivo geral. 22. 3.2. Objetivos Específicos. 22. 4. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS. 23. 5. MANUSCRITOS. 32. 6. CONSIDERAÇÕES GERAIS. 147. 7. PERSPECTIVAS. 148. i.

(13) 3. OBJETIVOS. 22 .

(14) 4. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS. ANTONISAMY, P.; KANNAN, P.; IGNACIMUTHU, S. Anti-diarrhoeal and ulcerprotective effects of violacein isolated from Chromobacterium violaceum in Wistar rats. Fundamental & Clinical Pharmacology 23(4):483-90, 2009. ANTONISAMY, P.; IGNACIMUTHU, S. Immunomodulatory, analgesic and antipyretic effects of violacein isolated from Chromobacterium violaceum. Phytomedicine. 17(3-4):300-4. Epub 2009 Jul 2, 2010. AUGUST, P.R.; GROSSMAN, T.H.; MINOR, C.; DRAPER, M.P.; MACNEIL, I.A.; PEMBERTON, J.M.; CALL, K.M.; HOLT, D.; SOSBURNE, M.S.; Sequence analyses and functional characterization of the violacein biosynthetic pathway from Chromobacterium violaceum. J. Mol. Microbiol. Biotechnol. v.4, pp. 513-519, 2000. BALLANTINE, J.A., BEER, R.J.S., CRUTCHLEY, D.J., DODD, G.M., & PALMER, D.R. The synthesis of violacein and related compounds. J. Chem. Soc. p.232– 233, 1958. BARAÚNA,. R.A.,. CIPRANDI,. A.,. SANTOS,. A.V.,. CAREPO,. M.S.P.,. GONÇALVES, E.C., SCHNEIDER, M.P.C. and SILVA, A. Proteomics Analysis of the Effects of Cyanate on Chromobacterium violaceum Metabolism. Genes, 2, 736-747, 2011. BATISTA, J.S.S., TORRES, A.R and HUNGRIA, M. Towards a two-dimensional proteomic reference map of Bradyrhizobium japonicum CPAC 15: Spotlighting ‘‘hypothetical proteins’’. Proteomics 10, 3176–3189, 2010. BERGONIZI, C. Sopra un nuovo bacterio colorato. Annuar Soc. Nat. Modena, Series 2, v. 14, p. 149-158, 1881. BOISBAUDRAN, L. Matière colorante se formant dans la colle de farine. Comp. Rend. Acad. Sci. v. 94, p.562-562, 1882. 23.

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(22) J.; Brigido, M.M.; Brito, C.A.; Brocchi, M.; Buryti, H.A.; Camargo, A.A.; Cardoso, D.D.P.; Carneiro, N.P.; Carraro, D.M.; Carvalho, C.M.B.; Cascardo, J.C.M.; Cavada, B.S.; Chueire, L.M.O.; Creczynski-Pasa, T.B.; Cunha Junior, N.C.; Fagundes, N.; Falcão, C.L.; Fantinatti, F.; Farias, I.P.; Felipe, M.S.S.; Ferrari, L.P.; Ferro, J.A.; Ferro, M.I.T.; Franco, G.R.; Freitas, N.S.A.; Furlan, L.R.; Gazzinelli, R.T.; Gomes, E.A.; Gonçalves, P.R.; Grangeiro, T.B.; Grattapaglia, D.; Grisard, E.C.; Hanna, E.S.; Jardim, S.N.; Laurino, J.; Leoi, L.C.T.; Lima, L.F.A.; Loureiro, M.F.; Lyra, M.C.C.P.; Madeira, H.M.F.; Manfio, G.P.; Maranhão, A.Q.; Martins, W.S.; Mauro, S.M.Z.; Medeiros, S.R.B.; Meissner, R.V.; Moreira, M.A.M.; Nascimento, F.F.; Nicolas, M.F.; Oliveria, J.G.; Oliveira, S.C.; Paixão, R.F.C.; Parente, J.A.; Pedrosa, F.O.; Pena, S.D.J.; Pereira, J.O.; Pereira, M.; Pinto, L.S.R.C.; Pinto, L.S.; Porto, J.I.R.; Potrich, D.P.; Ramalho Neto, C.E.; Reis, A.M.M.; Rigo, L.U.; Rondinelli, E.; Santos, E.B.P.; Santos, F.R.; Schneider, M.P.C.; Seuanez, H.N.; Silva, A.M.R.; Silva, A.L.C.; Silva, D.W.; Silva, R.; Simões, I.C.; Simon, D.; Soares, C.M.A.; Soares, R.B.A.; Souza, E.M.; Souza, K.R.L.; Souza, R.C.; Steffens, M.B.R.; Steindel, M.; Teixeira, S.R.; Urmenyi, T.; Wassen,. R.;. Zaha,. A.;. Simpson,. A.J.G.. The complete. genome. of. Chromobacterium violaceum reveals remarkable and exploitable bacterial adaptability. Proc. Natl. Acad. Sci. USA v.100, p. 11660-11665, 2003. UEDA, H.; NAKAJIMA, H.; HORI, Y.; GOTO, T.; OKUHARA, M. FR901228, a novel antitumor bicyclic depsipeptide produced by Chromobacterium violaceum. Biosci. Biotechnol. Biochem. 58, 1579–1583, 1994. WOOLEY, P.G. Bacillus violaceus manila (a pathogenic organism). Bull John Hopkins Hospital v. 16, p. 89-93, 1905. ZIMMERMAN, B. Review of Bergonizi on Chromobacterium, Bo. Centralbl. v.4, p. 1528-1530, 1881.. 31.

(23) 6. CONSIDERAÇÕES GERAIS. Os resultados obtidos nos dois manuscritos apresentados auxiliaram no entendimento mais detalhado acerca do metabolismo basal de C. violaceum e nas mudanças deste metabolismo frente ao estresse gerado pela radiação UV. Os artigos são pioneiros no estudo proteômico deste organismo e abre possibilidades no que se refere aos estudos pós-genômicos realizados até então.. 142.

(24) 7. PERSPECTIVAS. Outros experimentos além dos apresentados nesta tese foram realizados. Entre eles podemos citar a proteômica de uma cepa mutante no operon de síntese da violaceína, exposta ou não a radiação UVC. A proteômica desta cepa mutante sem exposição à radiação UVC foi realizada com o intuito de auxiliar no entendimento da função deste pigmento no contexto fisiológico bacteriano. O gel de referência das proteínas desta bactéria mutante apresentou 365 spots. Quando comparado com o gel de referência da cepa selvagem (Artigo: Medeiros, et. al., 2011) foram observados apenas 165 spots em comum. Os resultados da expressão diferencial na ausência da violaceína mostram que este pigmento bloqueia a produção de algumas proteínas, todavia na sua ausência surgem 200 spots, os quais já foram tripisinisados e estão sendo identificados por MS. A exposição da cepa mutante à radiação UVC também foi realizada. No controle foram identificados 148 spots e 243 no tratado, onde apenas 81 spots foram comuns a ambas. Todos os spots que sugiram após o tratamento foram tripsinisados e 73 foram identificados, correspondendo a 57 proteínas diferentes. A análise da resposta da bactéria na ausência da violaceína poderá ser útil para verificar a existência de um possível papel protetor deste pigmento frente ao estresse gerado pela luz UVC. Estes resultados possibilitarão a publicação de, pelo menos, mais dois artigos científicos oriundos desta tese de doutorado.. 143.

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