II
Dissertação de Investigação
Artigo de investigação no âmbito das ciências básicas
“Estudo das caraterísticas clínico-patológicas e da expressão
dos elementos da via de sinalização EGFR/HER2-Akt-mTOR
em adenomas pleomórficos e carcinomas ex-adenomas
pleomórficos da glândula salivar – sua relação com o
prognóstico”
Autor:
Ana Cristina Pedrosa Beleza Carvalho
Aluna do 5ºano do Mestrado Integrado em Medicina Dentária Faculdade de Medicina Dentária da Universidade do Porto mimd09044@fmd.up.pt
Orientador:
Professora Doutora Catarina Alexandra Pires Eloy Professora Auxiliar Convidada
Faculdade de Medicina Dentária da Universidade do Porto celoy@fmd.up.pt
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Lista de abreviaturas
Akt – Proteína cinase B AP – Adenoma pleomórfico
CAP – Carcinoma ex-adenoma pleomórfico EDTA - Ácido etilenodiamino tetra-acético EGFR – Epidermal growth factor receptor HE – Hematoxilina-eosina
HER2 - Human Epidermal growth factor Receptor 2 HMGA2 - High-mobility group AT-hook 2
PI3K - Phosphatidylinositol 3-kinase PLAG1 – Pleomorphic adenoma gene 1 mTOR – Mammalian target of rapamycin
IV
Índice
Resumo ... 1 Abstract ... 2 Introdução ... 3 Objetivos ... 7 Materiais e métodos ... 8 Resultados ... 11 Discussão ... 19 Conclusões ... 24 Referências bibliográficas ... 25 Agradecimentos ... 28 Anexos ... 291
Resumo
Introdução: O adenoma pleomórfico é a neoplasia mais frequente das glândulas salivares, tem tendência para recidivar e apresenta potencial de transformação maligna. O carcinoma ex-adenoma pleomórfico resulta da transformação maligna do adenoma pleomórfico. A via de sinalização EGFR/HER2-Akt-mTOR é uma via intracelular na qual têm sido descritas alterações na expressão dos seus elementos associadas ao desenvolvimento de vários tipos de neoplasias.
Objetivos: Estudar, numa série de adenomas pleomórficos e carcinomas ex-adenomas pleomórficos, a relação das caraterísticas clínico-patológicas e da expressão dos elementos da via de sinalização EGFR/HER2-Akt-mTOR com o comportamento destes tumores.
Materiais e Métodos: Numa série de 16 tumores de glândulas salivares (11 adenomas pleomórfico e 5 carcinomas ex-adenomas pleomórficos) os dados clínicos foram colhidos das fichas clínicas e os dados histopatológicos foram obtidos através do estudo das lâminas dos tumores primários ao microscópio ótico. Foi avaliada a expressão imuno-histoquímica dos elementos da via de sinalização EGFR/HER2-Akt-mTOR nos tumores primários e nas recidivas tumorais.
Resultados: Verificou-se uma maior tendência para a ocorrência de recidiva do adenoma pleomórfico em pacientes do sexo feminino e em tumores com tamanho inferior a 2 cm. Em todos os casos de adenoma pleomórfico que não recidivaram o componente predominante era o estroma. A presença de cistos e de inflamação no tumor são caraterísticas de benignidade nestes tumores. Verificou-se a existência de uma associação estatisticamente significativa entre a expressão de mTOR nos tumores primários e a ocorrência de transformação maligna. A expressão de HER2 nos adenomas pleomórfico primários foi significativamente menos que nos recidivantes. Conclusões: As caraterísticas clínico-patológicas permanecem como bons indicadores do prognóstico do adenoma pleomórfico. A expressão de mTOR e HER2 em adenomas pleomórfico está associada a comportamento biológico diferencial nestas neoplasias.
Palavras–chave: adenoma pleomórfico, carcinoma ex-adenoma pleomórfico, glândula salivar, EGFR, HER2, Akt, mTOR, imuno-histoquímica.
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Abstract
Introduction: Pleomorphic adenoma is the most common salivary gland tumor, it has a tendency to recur and it can undergo malignant transformation. Carcinoma ex-pleomorphic adenoma is a malignant neoplasm that arises from ex-pleomorphic adenoma. The EGFR/HER2-Akt-mTOR pathway is an intracellular pathway in which have been described changes in the expression of its elements that have been associated with the development of several types of cancer.
Objectives: To study, in a series of pleomorphic adenomas and carcinomas ex-pleomorphic adenomas, the relationship between clinico-pathological characteristcs and immunohistochemical expression of EGFR/HER2-Akt-mTOR pathway with tumor’s behavior.
Materials and Methods: In a series of 16 salivary gland tumors (11 pleomorphic adenomas and 5 carcinomas ex-pleomorphic adenomas) the clinical data were obtained from patients’ medical records and the histopathological data were obtained through the analysis of primary tumor’s section in the optic microscope. The immunohistochemical expression of EGFR/HER2-Akt-mTOR pathway was evaluated in primary and recurrent tumors.
Results: Recurrent pleomorphic adenoma occured more often in female patients and when the primary tumor had a size smaller than 2 cm. All of the pleomorphic adenomas that did not recur had stroma as the major component. Presence of cysts and inflammation in tumor are benign characteristics. mTOR expression in primary tumors was significantly associated with malignant transformation. HER2 expression was significantly less intense in primary pleomorphic adenomas than in recurrent ones. Conclusions: The clinico-pathological characteristics remain good indicators of prognosis of pleomorphic adenoma. mTOR and HER2 expression in pleomorphic adenoma is associated with differential biologic behavior in these tumors.
Keywords: pleomorphic adenoma, carcinoma ex-pleomorphic adenoma, salivar gland, EGFR, HER2, Akt, mTOR, immunohistochemistry.
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Introdução
As glândulas salivares são órgãos exócrinos responsáveis pela produção e secreção de saliva, que são classificadas em glândulas major (parótida, submandibular e sublingual) e minor (intra-orais e extra-orais) [1]. A incidência global anual de neoplasias das glândulas salivares varia, geograficamente, entre 0,4 e 13,5 casos por 100000 indivíduos [2]. A maioria destas neoplasias é benigna (cerca de 54% a 79%) [1, 3].
O adenoma pleomórfico (AP) é a neoplasia mais frequente das glândulas salivares e representa cerca de 80% das neoplasias benignas e 60% de todas as neoplasias destas glândulas [3-6]. Os AP ocorrem com mais frequência na glândula parótida, durante a terceira e quarta década de vida, e mais vezes em mulheres do que em homens [1, 5, 6].
Morfologicamente, o AP caracteriza-se pela presença de três componentes: epitelial, mioepitelial e estromal (Figura 1) [6]. A variabilidade de proporções e expressão destes três componentes contribui para o vasto espetro de caraterísticas histológicas que o AP pode apresentar [6].
O AP tem tendência para recidivar e apresenta potencial de transformação maligna em 6,2% dos casos [7-9]. O risco de recidiva local do adenoma pleomórfico após a primeira cirurgia está associado com a presença de variáveis clínico-patológicas que incluem: idade inferior a 30 anos aquando do diagnóstico, presença de neoplasia extra-capsular sob a forma de nódulos satélites, variante rica em estroma e excisão cirúrgica incompleta [1, 5, 6, 10].
A entidade que resulta da transformação maligna do AP (recidiva ou primário) designa-se por carcinoma ex-adenoma pleomórfico (CAP) e pode ocorrer sob a forma de vários tipos histológicos [11, 12]. O risco de transformação maligna do AP aumenta Figura 1 – Adenoma pleomórfico: aspeto morfológico dos componentes epitelial, mioepitelial e estromal (HE, 400x).
4 com tempo de evolução da
neoplasia desde o diagnóstico e, provavelmente, resulta da acumulação de alterações genéticas [1, 7]. Outros fatores de risco para a transformação maligna do AP incluem a origem da neoplasia na glândula submandibular, idade mais avançada (média de 61 anos) do paciente e maior tamanho da neoplasia [13].
O CAP representa menos de 4% de todas as neoplasias das glândulas salivares e 12% das neoplasias malignas das glândulas salivares [12, 14, 15]. O seu pico de incidência etária ocorre na sexta e sétima década de vida, afetando predominantemente as glândulas major e as minor do palato (Figura 2) [1, 7].
O CAP é uma neoplasia maligna de alto grau de malignidade que é constituída por áreas de AP e por um componente maligno (Figura 3) [12, 14]. O CAP apresenta, comparativamente com o AP,
um aumento de frequência das seguintes caraterísticas histológicas: hipercromasia e pleomorfismo nuclear, aumento da atividade mitótica, necrose, hialinização da matriz e infiltração dos tecidos peri-tumorais [1, 13]. Os locais mais frequentes de metastização do CAP são os pulmões e os ossos [1].
Existem alterações moleculares típicas do AP e do CAP já descritas na literatura, nomeadamente a sobreexpressão de PLAG1, devido à perda de heterozigotia no Figura 2 – Imagem de ressonância magnética evidenciando recidiva de carcinoma ex-adenoma pleomórfico, verificando-se prévia remoção da parte da mandíbula e osso temporal direito devido à invasão pelo tumor.
Figura 3 - Transformação maligna do adenoma pleomórfico, apresentando-se sob a forma de carcinoma mucoepidermóide (HE, 100x)
5 cromossoma 8q, e sobreexpressão de HMGA2, por perda de heterozigotia no cromossoma 12q [7, 16, 17].
A via de sinalização EGFR/HER2-Akt-mTOR é uma das vias intracelulares que se pensa ter importância na regulação do crescimento, sobrevivência, proliferação, motilidade e diferenciação celular (Figura 4) [18-21]. Alterações na expressão dos elementos desta via de sinalização têm sido associadas ao desenvolvimento neoplásico, nomeadamente, em modelos de cancro de mama, cancro colo-rectal, cancro da bexiga, cancro do ovário, e carcinoma epidermóide da cabeça e pescoço [22].
O epidermal growth factor receptor
(EGFR), também conhecido como ErbB1/HER1, é um oncogene que codifica uma glicoproteína da membrana de 170-kDa, que funciona como um receptor de tirosina cinase finamente regulado [23]. O gene ErbB2/Neu/HER2 pertence à mesma família do EGFR e codifica também uma glicoproteína da membrana de 185-kDa [21, 23]. As neoplasias que apresentam atividade aumentada do EGFR tendem a ter um comportamento mais agressivo, associado a um pior prognóstico [23]. Quer o EGFR, quer o HER2, constituem alvos terapêuticos anti-neoplásicos para os fármacos cetuximab (anticorpo anti-EGFR) e trastuzumab (anticorpo anti-HER2), constituindo exemplos de terapêutica oncológica dirigida e personalizada [21, 22, 24].
Na via de sinalização EGFR/HER2-Akt-mTOR, o EGFR e o HER2 ligam-se à PI3K que catalisa reações levando ao recrutamento e ativação da proteína cinase serina-treonina Akt [19, 22]. A Akt é ativada pela ligação de fatores de crescimento ao recetor tirosina cinases e adquire capacidade para fosforilar a proteínas mTOR, que intervêm no desbloqueio da fase G1/S de transição do ciclo celular [20, 22].
Recentemente, um estudo realizado por Ettl et al. [24] mostrou a existência de uma correlação positiva entre a sobreexpressão e aumento do número de cópias dos genes EGFR e HER2 e a presença de histologia de alto grau de malignidade em neoplasias malignas das glândulas salivares. Num outro estudo realizado por Ettl et al. Figura 4 – Esquema da via celular EGFR/HER2-Akt-mTOR. (Adaptado de Suzuki et al., 2012 [21] )
6 [20] os autores concluíram que a via PI3K-Akt-mTOR está ativa em neoplasias de glândulas salivares e que os tumores com sobreexpressão citoplasmática das proteínas Akt e mTOR apresentavam pior prognóstico. Este é o primeiro estudo que procura determinar a relação da expressão dos elementos da via EGFR/HER2-Akt-mTOR com as caraterísticas clínico-patológicas em AP e CAP.
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Objetivos
Os objetivos deste trabalho de investigação são:
1. Identificar as caraterísticas clínico-patológicas numa série de casos de AP e CAP que se relacionam com o comportamento e o prognóstico destes tumores.
2. Pesquisar a existência da expressão dos elementos da via de sinalização EGFR/HER2-Akt-mTOR numa série de tumores de glândulas salivares que inclui AP e CAP.
3. Identificar, numa série de AP e CAP, a relação entre a expressão dos elementos da via de sinalização EGFR/HER2-Akt-mTOR, as caraterísticas clínico-patológicas e com o comportamento destes tumores.
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Materiais e métodos
Amostra
Trata-se de um estudo retrospetivo com uso de material de arquivo dos Serviços de Anatomia Patológica do Hospital de São João do Porto e do Instituto Português de Oncologia do Porto (IPO). A amostra deste estudo engloba 16 tumores de glândulas salivares minor e major, que incluem 11 AP com mais de 8 anos de vigilância clínica e 5 CAP com mais de 5 anos de vigilância clínica, diagnosticados entre Janeiro de 1999 e Abril de 2008. Foram registados os seguintes dados das fichas clínicas dos pacientes: sexo, idade aquando do primeiro diagnóstico, localização do tumor, ocorrência de recidivas, existência de metástases e estado atual do paciente.
Análise histopatológica
Foram colhidas dos arquivos todas as lâminas coradas com hematoxilina-eosina (HE) obtidas dos blocos de parafina dos tumores primários e respetivas recidivas incluídos na amostra em estudo. As lâminas referentes a cada caso foram estudadas ao microscópico ótico por dois observadores (AC e CE). Para cada caso foram registados os seguintes dados: tipo histológico, tamanho do tumor, estado da margem cirúrgica, componente predominante (epitelial, mioepitelial ou estromal), assim como a existência de cápsula, invasão da cápsula, nódulos satélites, invasão vascular, índice mitótico, atipia citológica, necrose, inflamação, cistos e metaplasia escamosa. O índice mitótico foi determinado contando as mitoses presentes em 10 campos de observação do microscópio ótico (ampliação de 400x). As margens cirúrgicas foram classificadas em margem com neoplasia e margem sem neoplasia.
Análise imuno-histoquímica
A análise imuno-histoquímica foi realizada nos tumores primários e nas recidivas tumorais. Para cada caso foram feitos cortes de 3 µm a partir do bloco de parafina representativo do tumor. Nestas seções foi realizada a coloração imuno-histoquímica. Em resumo, após a desparafinação das lâminas com EZ prep®, foi realizada a recuperação antigénica com uma solução à base de EDTA e com um tampão
9 citrato a uma temperatura de
95ºC. Foi utilizado o aparelho Ventana - Bench Mark Ultra® (Ventana, Medical Systems, Tucson, AZ, USA). Os anticorpos foram usados da seguinte forma: EGFR fosforilado (p-EGFRTyr1068, policlonal, Cell Signaling Technology, Beverly, MA, USA) com uma diluição 1:100 e incubação de 32
minutos, HER2 (PATHWAY anti-HER-2/neu, clone 4B5, Roche, Basel, Switzerland) pré-diluído e 12 minutos de incubação, mTORser2481 (clone 7C10, Cell Signaling Technology) com uma diluição 1:50 e incubação de 48 minutos, Akt fosforilado (p-AktSer473 (clone 736E11, Cell Signaling Technology) com uma diluição 1:50 e incubação de 48 minutos. Depois da lavagem aplicou-se o Kit DAB de revelação do Ventana (Ventana, Medical Systems) e hematoxilina para marcação nuclear. Foram usados os controlos positivos e negativos apropriados.
A expressão imuno-histoquímica de EGFR e HER2 foi membranar e foi avaliada segundo os seguintes critérios descritos na Tabela I.
Graduação Avaliação da expressão
0 não expresso ou expresso em <10% das células +1 expressão parcial a fraca em ≥ 10% das células +2 expressão moderada a fraca em ≥ 10% das
células, e a toda a volta da membrana
+3 expressão forte em todas as células, e a toda a volta da membrana
Tabela I – Critérios de avaliação da expressão imuno-histoquímica de EGFR e HER2
Figura 5 – Aparelho utilizado para a realização das colorações imuno-histoquímicas.
10 A expressão imuno-histoquímica de mTOR foi citoplasmática e foi avaliada segundo os seguintes critérios descritos na Tabela II.
Graduação Avaliação da expressão
0 não expresso ou expresso em <10% das células +1 expressão fraca em ≥ 10% das células
+2 expressão moderada em ≥ 10% das células +3 expressão forte em ≥ 10% das células
Tabela II - Critérios de avaliação da expressão imuno-histoquímica de mTOR
A expressão de Akt nas colorações imuno-histoquímicas não foi avaliável porque, por motivos técnicos, não se conseguiu otimizar a reação do anticorpo para deteção de expressão da proteína Akt.
Para a análise estatística considerou-se marcação negativa para valores de 0 e +1, e marcação positiva para valores de +2 e +3.
Análise estatística
Todos os dados registados foram analisados no programa SPSS® para Windows, versão 20.0 (SPSS, Erkrath, Germany). As relações entre dados dicotómicos clinico-patológicos e imuno-histoquímicos foram estudados utilizando o teste exato de probabilidades de Fisher (p<0,050).
11
Resultados
Na Tabela III resumem-se as caraterísticas clinico-patológicas nas neoplasias estudadas. A amostra de AP compreendia 5 homens e 6 mulheres, com uma média de idade aquando do diagnóstico de 47,6 anos. Atualmente, os 11 dos pacientes estão vivos e sem doença. Dos AP estudados, 8 (72,7%) eram da glândula parótida, 1 (9,1%) da glândula submandibular e 2 (18,2%) de glândulas minor do palato. Recidivaram 6 (54,5%) dos 11 AP, sendo que 5 eram da glândula parótida 1 era do palato.
A amostra de CAP compreendia 2 homens e 3 mulheres, com uma média de idade aquando do diagnóstico de 46,4 anos. Atualmente, 4 dos pacientes estão vivos e sem doença e 1 paciente está vivo e com doença. Dos CAP estudados, 2 eram da glândula submandibular (40%) e 3 eram da glândula parótida (60%). Recidivaram 2 (40%) dos 5 CAP, sendo que era um da glândula parótida e outro da glândula submandibular. Em nenhum dos casos havia registo de metástases ganglionares regionais ou à distância. Não se verificou a presença de necrose em nenhum dos casos de AP e CAP estudados.
Em nenhum dos AP estudados existia invasão vascular, que estava presente em 40% dos CAP. Em nenhum dos CAP analisados se verificou a presença de inflamação ou cistos, que estavam presentes em 36,4% e 18,2%, respetivamente, dos AP. Todos os CAP e 81,8% dos AP apresentavam margem cirúrgica com neoplasia.
Figura 6 – Caraterísticas histopatológicas do adenoma pleomórfico. A – Metaplasia escamosa (HE,200x); B- Cistos (HE, 40x); C – Nódulo satélite (HE,100x); D – Invasão da cápsula (HE, 40x).
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Tabela III – Caraterísticas clínico-patológicas das neoplasias estudadas.+ -Presente; - - Ausente; M-Masculino; F-Feminino; VS – Vivo e sem doença; VC – Vivo e com doença; Es- Estromal; Ep – Epitelial; Mio-Mioepitelial; x – não se aplica; CDuc – Carcinoma Ductal; CMuc – Carcinoma mucoepidermóide; CMio – Carcinoma mioepitelial; * - as caraterísticas descritas correspondem ao componente benigno.
C arat erí st icas cl ín ico -pa tol ó gi cas Sexo Idade L ocal izaç ã o do tumo r Nº R ec idiva s E st ado a tual T am anh o tumo r (c m) E st ado d a m a rge m ci rúr gi ca C om pon en te p re dom inan te C ápsul a Invasão d a cápsu la N ódu los s at él it es Invasão v asc u lar Índi ce m it ó ti co A ti pi a ci to lógi ca N ec ros e Inf lam a ção C ist o s Me tap las ia esc a m osa T ipo h ist o lóg ico com pon ent e m al igno Casos AP 1 M 31 Parótida 0 VS 3,5 C/neoplasia Es + - - - 0 - - - x 2 F 54 Palato 2 VS 1,5 C/neoplasia Ep - x - - 0 - - + - + x
3 F 48 Parótida 2 VS 0,5 C/neoplasia Mio + - - - 0 - - - x
4 M 42 Parótida 0 VS 2,5 S/neoplasia Es - x - - 1 - - - x
5 M 58 Palato 0 VS 2,0 C/neoplasia Es - x - - 0 - - - + + x
6 F 36 Parótida 1 VS 0,8 S/neoplasia Es + + - - 0 - - - x
7 M 21 Parótida 1 VS 2,7 C/neoplasia Mio - x + - 0 - - + - - x
8 M 64 Submandibular 0 VS 3,0 S/neoplasia Es + + - - 5 - - + + + x
9 F 55 Parótida 1 VS 1,8 S/neoplasia Mio + - - - 3 + - - - - x
10 F 72 Parótida 0 VS 4,5 S/neoplasia Es + - - - 0 - - - - + x
11 F 43 Parótida 2 VS 1,4 C/neoplasia Es + - + - 0 - - + - - x
Casos CAP *
12 M 40 Submandibular 1 VS 1,2 C/neoplasia Mio - x + + 0 - - - - + CDuc
13 M 65 Submandibular 0 VS 3,5 C/neoplasia Es + + - - 8 + - - - - CDuc
14 F 37 Parótida 0 VS 1,0 C/neoplasia Es + - - - 3 - - - - + CMuc
15 F 29 Parótida 4 VC 2,5 C/neoplasia Mio - x + - 0 - - - CMio
13 Na Tabela IV resume-se a expressão imuno-histoquímica de EGFR, HER2, e mTOR nas neoplasias. A expressão imuno-histoquímica de EGFR no tecido salivar peri-tumoral aparentemente normal (Figura 8A), nos casos em que foi possível avaliar, foi negativa em 85,7% dos casos e positiva em 14,3% dos casos (corresponde apenas ao caso 9). No tecido neoplásico, dos casos de neoplasia primária e considerando os AP e o componente benigno dos CAP, a expressão imuno-histoquímica de EGFR (Figura 8B) foi positiva em 62,5% dos casos e negativa em 37,5% dos casos. Nos casos de CAP, a expressão de EGFR (Figura 8C) no componente maligno foi semelhante à do componente benigno. Nos tumores recidivantes, a expressão de EGFR manteve-se igual à do tumor primário em 62,5% dos casos, diminuiu em 25% dos casos e aumentou em 12,5% dos casos.
A expressão imuno-histoquímica de HER2 no tecido salivar peri-tumoral aparentemente normal (Figura 8D), nos casos em que foi possível avaliar, foi negativa em todos os casos. No tecido neoplásico, dos casos de neoplasia primária e considerando os AP e o componente benigno dos CAP, a expressão imuno-histoquímica de HER2 (Figura 8E) foi negativa em 93,7% dos casos e positiva em 6,3% dos casos (corresponde apenas a um caso de CAP - caso 14). A expressão de HER2 foi negativa em todos os AP que não sofreram transformação maligna. Nos casos de CAP, a expressão de HER2 no componente maligno foi semelhante à do componente benigno. Nos tumores recidivantes, a expressão de HER2 (Figura 8F) manteve-se igual à do tumor primário em 62,5% dos casos e aumentou em 37,5% dos casos. Comparando a expressão de HER2 nos AP primários e nos AP recidivantes
Figura 7 – Caraterísticas histopatológicas do carcinoma ex-adenoma pleomórfico. A – anaplasia (HE, 400x); B – Transformação maligna do adenoma pleomórfico, apresentando-se sob a forma de carcinoma mucoepidermóide (HE, 400x)
14 verifica-se uma diferença estatisticamente significativa (p=0,029), sendo que esta nunca se verificou nos AP primários.
A expressão imuno-histoquímica de mTOR no tecido salivar peri-tumoral aparentemente normal (Figura 8G), nos casos em que foi possível avaliar, foi negativa em 12,5% dos casos e positiva em 87,5% dos casos. No tecido neoplásico, dos casos de neoplasia primária e considerando os AP e o componente benigno dos CAP, a expressão imuno-histoquímica de mTOR foi negativa em 50 % dos casos e positiva em 50 % dos casos. A expressão de mTOR foi positiva no componente benigno de todos os casos de CAP. Nos casos de CAP, a expressão de mTOR (Figura 9H e I) no componente maligno foi igual à do componente benigno em 80% dos casos. Nos tumores recidivantes, a expressão de mTOR manteve-se igual à do tumor primário em 75% dos casos, aumentou em 12,5% dos casos e diminui em 12,5% dos casos.
Figura 8 - A – Expressão de EGFR em parênquima de glândula salivar peritumoral (400x); B- Expressão de EGFR em adenoma pleomórfico (200x); C- Expressão de EGFR em carcinoma ex- adenoma pleomórfico (200x); D – Expressão de HER2 em parênquima de glândula salivar peritumoral (200x); E- Expressão de HER2 em adenoma pleomórfico (100x); F- Expressão de HER2 em recidiva de adenoma pleomórfico (200x); G – Expressão de mTOR em parênquima de glândula salivar peritumoral (100x); H e I- Expressão de mTOR em carcinoma ex-adenoma pleomórfico (200x).
15 Caraterísticas Imuno-histoquímicas EGFR peri-tumoral EGFR neoplasia primária EGFR recidiva HER2 peri-tumoral HER2 neoplasia primária HER2 recidiva mTOR peri-tumoral mTOR neoplasia primária mTOR recidiva Casos AP 1 NA + x NA - x NA - x 2 NA + + NA - - NA - - 3 NA - + NA - - NA + + 4 - - x - - x + - x 5 - - x - - x + - x 6 - - - + + - + 7 NA - - NA - + NA + - 8 NA + x NA - x NA - x 9 + + - - - + + - - 10 - + x - - x - + x 11 NA + - - - - + - - Casos CAP B M B M B M B M B M B M 12 NA + + + + NA - - - - NA + + - - 13 NA + + x x NA - - x x NA + + x x 14 - + + x x - + + x x + + - x x 15 NA + + + + NA - - - - NA + + - - 16 - - - x x NA - - x x + + + x x
Tabela IV - Caraterísticas imuno-histoquímicas das neoplasias estudadas. + - positivo ; - - negativo; NA- não avaliável por falta de representatividade no bloco da parafina selecionado; B - componente benigno; M-componente maligno; x – caso sem recidiva.
16 A relação entre as caraterísticas clínico-patológicas e a expressão imuno-histoquímica de HER2, EGFR e mTOR nos casos de AP, e a ocorrência de recidiva nestes tumores está descrita na Tabela V. Verificou-se uma maior tendência para a ocorrência de recidiva do AP em pacientes do sexo feminino (p=0,080) e em tumores com tamanho inferior a 2 cm (p=0,080). Dos 6 tumores com tamanho inferior a 2 cm, 4 apresentavam margem cirúrgica com neoplasia. Verificou-se também que, em todos os casos de AP que não recidivaram, o componente predominante era o estroma (p=0,061). Apenas os casos de AP com recidiva apresentavam nódulos satélites.
Na Tabela VI sumarizam-se as caraterísticas clínico-patológicas e a expressão de HER2, EGFR e mTOR nos AP e no componente benigno dos CAP e a sua relação com a transformação maligna. Nenhum dos fatores clínico-patológicos estudados apresentou associação significativa com a transformação maligna do tumor. Nenhum dos AP que sofreu transformação maligna apresentava inflamação. Verificou-se a existência de uma associação estatisticamente significativa entre a expressão de mTOR nos tumores primários e a ocorrência de transformação maligna (p=0,026). Dos tumores que sofreram transformação maligna apenas um não apresentava expressão de EGFR.
17
Caraterística Com recidiva (n=6) Sem recidiva (n=5) p
Idade ≤ 47 > 47 3 3 2 3 1,000 Sexo Masculino Feminino 1 5 4 1 0,080
Margem cirúrgica Margem sem neoplasia
Margem com neoplasia
2 4 3 2 0,567 Tamanho tumor ≤ 2 cm > 2 cm 5 1 1 4 0,080 Componente predominante Epitelial ou Mioepitelial Estroma 4 2 0 5 0,061 Índice mitótico ≤ 2 > 2 5 1 4 1 1,000 Cápsula Presente Ausente 3 3 3 2 1,000 Invasão da cápsula ou nódulos satélites Presente Ausente 3 3 1 4 0,545
Metaplasia escamosa Presente
Ausente
1 5
3
2 0,242
Atipia citológica Presente
Ausente 1 5 0 5 1,000 Inflamação Presente Ausente 3 3 1 4 0,545 Cistos Presente Ausente 0 6 2 3 0,182 Expressão mTOR no tumor primário Presente Ausente 2 4 1 4 1,000 Expressão EGFR no tumor primário Positivo Negativo 3 3 3 2 1,000
Tabela V – Análise das características clínico-patológicas e expressão imuno-histoquímica de EGFR e mTORe a sua relação com a ocorrência de recidiva nos adenomas pleomórficos.
18 Tabela VI - Análise das características clínico-patológicas e a expressão imuno-histoquímica de HER2, EGFR e mTORnas áreas de adenoma pleomórfico dos tumores estudados e a sua relação com a ocorrência de transformação maligna. Caraterística AP com transformação maligna (n=5) AP sem transformação maligna (n=11) p Idade ≤ 40 > 40 3 2 3 8 0,299 Sexo Masculino Feminino 2 3 5 6 1,000 Tipo de margem cirúrgica
Margem sem neoplasia Margem com neoplasia
0 5 5 6 0,119 Componente predominante Epitelial ou Mioepitelial Estroma 3 2 4 7 0,596 Índice mitótico ≤ 2 > 2 9 2 2 3 0,245 Cápsula Presente Ausente 2 3 6 5 1,000 Invasão da cápsula ou nódulos satélites Presente Ausente 3 2 4 7 0,596
Invasão vascular Presente
Ausente
2 3
0
11 0,083
Metaplasia escamosa Presente
Ausente
2 3
4
7 1,000
Atipia citológica Presente
Ausente 2 3 1 10 0,214 Inflamação Presente Ausente 0 5 4 7 0,245 Cistos Presente Ausente 0 5 2 9 1,000
Expressão mTOR Positivo
Negativo
5 0
3
8 0,026
Expressão HER2 Positivo
Negativo
1 4
0
11 0,313
Expressão EGFR Positivo
Negativo
4 1
6
19
Discussão
O AP apresenta uma maior tendência para recidivar do qualquer outro tumor das glândulas salivares e tem capacidade de malignização, pelo que é relevante perceber o que influencia a sua recidiva e a sua transformação maligna [5]. Não existem muitos estudos sobre os fatores de risco clínico-patológicos relacionados com a recidiva do AP.
Alguns estudos realizados evidenciaram que a recidiva do AP é mais frequente em pacientes mais jovens, pois quanto mais novo for o paciente maior será, teoricamente, o número de anos que ainda tem de vida [5, 10, 25, 26]. Porém, outros estudos não verificaram qualquer relação entre a idade e a recidiva do AP [27-29]. Neste estudo, a média de idades aquando do primeiro diagnóstico foi de 47,6 anos, o que está de acordo com os valores médios encontrados na literatura [5, 27, 30, 31], que variam entre 41-49, mas não se verificou uma associação significativa ente a idade aquando do primeiro diagnóstico e a ocorrência de recidiva do AP. Apesar da série estudada ser limitada em termos de número de casos, estes têm um tempo de vigilância clínica elevado, o que confere significado a estes resultados.
Verificou-se uma maior tendência para a ocorrência de recidiva do AP em pacientes do sexo feminino (p=0,080). Resultados semelhantes foram encontrados por Wittekindt et al. e Friedrich et al. [26, 32]. No entanto, noutros estudos não se verificou relação significativa entre a ocorrência de recidiva do AP e o sexo [25, 27-29].
A patogénese exata do CAP ainda não está bem estabelecida. Gerughty et al. [33] apresentaram a hipótese destes tumores serem malignos desde o princípio, visto que 60% dos pacientes da sua amostra não tinham qualquer registo de um tumor pré-existente. Por outro lado, Katabi et al. [14] defenderam a ocorrência de transformação maligna de um tumor benigno, baseando-se na idade média de surgimento dos tumores, que é menor nos tumores benignos, e na presença prévia de uma massa relatada pela maioria dos pacientes. No nosso estudo todos os CAP apresentavam, no exame histológico, um componente benigno, pelo que se tratam de casos de AP que sofreu transformação maligna.
Alguns dos fatores que têm sido associados com uma maior probabilidade de ocorrência de transformação maligna do AP são a idade acima de 40 anos aquando do tratamento inicial e o sexo masculino [5]. No nosso estudo 60% dos apresentavam idade inferior a 40 anos aquando do diagnóstico de CAP, e não se verificou correlação significativa entre a idade do paciente e a ocorrência de transformação maligna, nem
20 entre o sexo e a ocorrência de transformação maligna. Estes achados, tais como os anteriormente descritos, terão de ser enquadrados nas limitações da amostra.
Verificou-se uma relação próxima da significância estatística entre o componente predominante do AP e a ocorrência de recidiva (p=0,061). Todos os casos de AP sem recidiva apresentavam como componente predominante o estroma. O estroma é um elemento importante do AP e pode assumir diversas formas: mixóide/mucóide, cartilagíneo ou hialino [1]. Este resultado não está de acordo com o estudo realizado por Stennert et al. [34], que observou uma predominância do tipo mixóide nas recidivas de AP, sendo que este tipo está associado a um maior risco de recidiva, pois estes tumores apresentam zonas focais de ausência de encapsulação e nódulos satélites. Por outro lado, os estudos realizados por Soares et al. e Park et al. [5, 30] não encontraram nenhuma evidência da existência de uma relação entre o estroma mixóide ser o componente predominante em AP com recidiva. O resultado obtido no nosso estudo pode ser explicado pelo enviesamento resultante de a amostra ser pequena, e por não se ter feito uma classificação diferencial do subtipo de estroma.
Também a relação entre o tamanho do AP e a ocorrência da recidiva foi próxima da significância estatística (p=0,080), tendo verificado que esta era maior nos tumores mais pequenos. O estudo realizado por Redaelli de Zinis et al. [27] encontrou resultados semelhantes, mas sem significância estatística. Este resultado pode ser explicado pela tendência a efetuar cirurgias menos mutilantes nos casos de tumores pequenos, que depois são complicadas por dificuldades operatórias. Os tumores desta série que eram pequenos e que se localizavam na parótida (proximidade de estruturas nervosas derivadas do nervo facial) e no palato (difícil pela localização e caraterísticas da mucosa), podem eventualmente enquadrar-se neste grupo e ter tido como consequência desta abordagem a não remoção total do tumor [30, 35, 36]. De facto, dos 6 casos com tamanho inferior a 2 cm, 4 apresentavam margem cirúrgica com neoplasia, que é um dos principais fatores de risco para a ocorrência de recidiva do AP [1, 5]. Neste estudo a ocorrência de recidiva não está significativamente associada ao estado da margem cirúrgica, no entanto, existe um número muito elevado de casos em que a margem apresenta neoplasia numa amostra pequena, pelo que pode existir enviesamento dos resultados.
Apenas os casos de AP com recidiva apresentavam nódulos satélites. O facto dos nódulos satélites serem pequenos e nem sempre serem detetados nos exames imagiológicos pode ter como consequência a sua não remoção durante o procedimento
21 cirúrgico, permitindo que estas células tumorais permaneçam no local e se continuem a dividir, levando à recidiva do tumor [5]. Soares et al. [5] reportaram a presença de nódulos satélites em todos os casos de AP recidivantes que analisaram. Stennert et al. [34] num estudo histológico prospetivo, reportaram a existência de nódulos satélites em cerca de 90% dos AP recidivantes. Park et al. [30] encontraram uma correlação entre a existência de nódulos satélites e a ocorrência de recidiva.
A invasão vascular é tida uma como uma caraterística típica das neoplasias malignas, mas alguns estudos mostraram que, excecionalmente, pode ocorrer no AP [37, 38]. No entanto, pensa-se que é difícil para as células do AP sobreviveram por muito tempo na corrente sanguínea devido às defesas imunitárias do hospedeiro, o que justificaria a ausência de desenvolvimento de metástase em AP [37, 38]. Na série estudada, verificou-se que a invasão vascular foi exclusiva dos tumores com transformação maligna, o que está de acordo com a maioria das séries descritas na literatura.
Nenhum dos casos de AP com recidiva ou AP com transformação maligna apresentava cistos. A degeneração cística é uma caraterística histopatológica que pode ocorrer nos AP, e por vezes tem como consequência o diagnóstico incorreto de carcinoma mucoepidermóide [1, 39-41]. Nos casos descritos na literatura não existe referência à ocorrência de recidiva nem de transformação maligna destes tumores [39-41], pelo que se deve aprofundar a possibilidade de esta ser uma caraterística indicativa de não recidiva e não malignidade.
Nenhum dos casos de AP com transformação maligna apresentava inflamação. De acordo com o estudo realizado por Weichhart et al. [42] em monócitos humanos isolados e células dendríticas mieloides, a ativação do mTOR inibe a produção de citocinas pró-inflamatórias e estimula a libertação de citocinas anti-inflamatórias. Nesta série, nos tumores estudados onde ocorreu transformação maligna verificou-se sobreexpressão de mTOR, o que pode estar relacionado com esta ausência de inflamação nestas neoplasias e que pode ser encarada como um fator promotor da transformação maligna no AP. Resultados semelhantes tinham já sido obtidos por Murayma et al. [43] no estudo do carcinoma gástrico, que verificaram que a expressão citoplasmática de mTOR estava positivamente relacionada com a profundidade de invasão de tumor e envolvimento de gânglios linfáticos, que são marcadores de malignidade. Sabe-se que o mTOR é responsável pela regulação da proliferação celular através da fosforilação de p70S6 na fase de transição de G1/S do ciclo celular, pelo que
22 a sua expressão alterada pode conduzir a uma proliferação celular desregulada, que é caraterística das células malignas [44]. O mTOR é um alvo da rapamicina, um fármaco antineoplásico cuja eficácia foi já avaliada com bons resultados em vários tumores sólidos, incluindo neoplasias renais, da mama e do pâncreas [44-47]. Seria útil efetuar estudos do tipo ensaio clínico para tratamento de CAP da glândula salivar com inibidores do mTOR.
A amplificação/sobreexpressão do gene EGFR tem sido associada ao desenvolvimento de várias neoplasias malignas no ser humano [48]. No que respeita aos carcinomas de glândulas salivares, não existem muitos estudos e estes têm resultados contraditórios. No estudo realizado por Katori et al. [49] verificou-se uma associação entre a sobreexpressão do EGFR e o desenvolvimento de CAP. No estudo realizado por Sugano et al. [50] os AP não apresentavam sobreexpressão de EGFR, mas esta existia nos CAP estudados em áreas com caraterísticas consideradas transitórias entre componentes benignos e malignos. No nosso estudo não se verificou nenhuma associação estatisticamente significativa entre a expressão de EGFR e transformação maligna do AP, mas nos tumores que sofreram transformação maligna apenas um não apresentava expressão de EGFR. Estas observações podem indicar que a amplificação do EGFR constitui uma etapa inicial no processo de transformação neoplásica, principalmente porque a sua expressão é muito mais frequente em AP e CAP do que no tecido peri-tumoral aparentemente normal. No caso do carcinoma do pulmão, a sobreexpressão de EGFR é um dos sinais precoces de transformação neoplásica, estando presente nos estádios pré-malignos [51].
Verificou-se que a expressão de HER2 era maior nas recidivas de AP quando comparada com a expressão no AP primários, sendo que esta diferença é estatisticamente significativa e não está documentada na literatura. A expressão de HER2 em AP foi apenas estudada por Di Palma et al. [52], que não encontrou sobreexpressão desta proteína.
Existe uma grande quantidade de evidências científicas que associam a sobreexpressão de HER2 à malignidade em várias neoplasias humanas, incluindo as neoplasias de glândulas salivares [21, 24]. No estudo realizado por Suzuki et al., verificou-se uma sobreexpressão do HER2 em 43% dos CAP estudados [21]. Também o estudo realizado por Ettl et al. [24] demonstrou que a sobreexpressão HER2 está presente em várias neoplasias malignas de glândulas salivares, tendo impacto no prognóstico. No nosso estudo não foi encontrada nenhuma associação significativa entre
23 a expressão de HER2 e a transformação maligna, nem uma maior expressão deste nos tumores com componente maligno, mas verificou-se que a expressão de HER2 era negativa em todos os tumores que não sofreram transformação maligna. Deveria realizar-se um estudo na população portuguesa com uma amostra maior, para poder aferir se esta relação, de facto, existe. O estudo da expressão de HER2 reveste-se de especial importância pois esta proteína é um alvo de terapêutica oncológica dirigida e personalizada. Na literatura existem já casos descritos da utilização de trastuzumab no tratamento de CAP com expressão significativa de HER2, tendo-se obtido bons resultados [53, 54].
O nosso estudo apresenta algumas limitações. Como a amostra estudada é pequena possíveis relações estatisticamente significativas existentes entre os dados clínico-patológicos e imuno-histoquímicos, e entre estes e a ocorrência de recidiva e transformação maligna podem não ser evidentes.
Como na amostra estudada, à exceção de um caso, todos os pacientes se apresentavam vivos e sem doença, não foi possível calcular curvas de sobrevivência, nem relacionar fatores clínico-patológicos e imuno-histoquímicos com a sobrevivência e a presença de doença. Para tal, devem ser realizados estudos que englobem uma amostra maior.
24
Conclusões
Tal como noutras séries, verificou-se na série estudada que o sexo feminino, o tamanho dos tumores menor que 2 cm e a presença de nódulos satélites estão associados a uma maior frequência de recidivas de AP. Nesta série, os casos de AP que não recidivaram tinham o estroma como componente predominante.
Nenhum dos CAP apresentava inflamação tumoral ou cistos, que parecem ser caraterísticas patológicas associadas a comportamento benigno.
O EGFR está expresso com mais frequência nos AP e CAP que no tecido de glândula salivar peri-tumoral aparentemente normal, sugerindo um papel importante desta proteína na transformação neoplásica.
O HER2 está expresso com mais frequências nas recidivas de AP e nos CAP do que nos AP primários, indicando um papel desta proteína na progressão neoplásica deste modelo tumoral. A confirmação desta associação em séries maiores poderá justificar o uso de terapia dirigida anti-HER2 em CAP resistentes ao tratamento cirúrgico.
A expressão de mTOR em AP e CAP está associada à ausência de inflamação tumoral e ao comportamento destas neoplasias, parecendo ser um indicador de transformação maligna do AP. A confirmação desta associação em séries maiores poderá justificar o uso de terapia dirigida anti-mTOR em CAP resistentes ao tratamento cirúrgico.
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Imagem capa:
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Agradecimentos
À Professora Doutora Catarina Eloy agradeço pela enorme ajuda e apoio que me disponibilizou ao longo da realização deste trabalho e pela exigência das suas correções. Agradeço também tudo o que me ensinou durante este percurso sobre a realização de investigação científica e por me ter proporcionado a oportunidade de aprender técnicas que, de outra forma, não teria aprendido.
Às técnicas Sandra Relvas, Salomé Pereira, Bárbara Gomes e Helena Pereira, do Serviço de Anatomia Patológica do Hospital de S.João, agradeço a amabilidade e disponibilidade, e a colaboração na preparação das lâminas histológicas e na realização das colorações imuno-histoquímicas.
Ao Dr. Manuel Jacóme e Dra. Diana Felizardo, do IPO do Porto, agradeço a colaboração na realização deste trabalho de investigação.
À Novartis Oncoloy, pelo financiamento deste projeto de investigação.
À minha família, por me ter proporcionado as melhores condições para que pudesse estudar e desenvolver todas as minhas capacidades. Saliento o papel da minha mãe, Dra. Ana Pedrosa, na escolha da minha profissão e o seu exemplo como Médica Dentista.
Aos meus colegas de curso, em especial o meu binómio Fábio, Carolina e Henrique, agradeço o apoio, a ajuda e todos os bons momentos que vivemos ao longo do curso.
Às minhas amigas de sempre, Catarina, Andreia e Rita, por todo incentivo e apoio e por 18 anos de amizade verdadeira.
Ao Bruno, o meu melhor amigo, agradeço todo o amor, toda a compreensão, paciência inesgotável e ajuda ao longo deste percurso. Agradeço também por me incentivar sempre com otimismo e nunca me deixar desistir ou esmorecer.
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30 Anexo 1 – Parecer da Comissão de Ética da FMDUP
31 Anexo 2 – Declaração de autoria
32 Anexo 3 – Parecer do Orientador
