Efeitos anti-inflamatório, antitumoral e analgésico de nanopartículas de ouro e antibacteriano de nanopartículas de prata

UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE

CENTRO DE CIÊNCIAS EXATAS E DA TERRA

INSTITUTO DE QUÍMICA

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM QUÍMICA

Nanopartículas de ouro e prata aplicadas a sistemas biológicos

Heloiza Fernanda Oliveira da Silva Athayde

Tese de Doutorado

Heloiza Fernanda Oliveira da Silva Athayde

EFEITOS ANTI-INFLAMATÓRIO, ANTITUMORAL E ANALGÉSICO E DE

NANO-PARTÍCULAS DE OURO E ANTIBACTERIANO DE NANONANO-PARTÍCULAS DE PRATA

Tese de doutorado submetida ao Programa de Pós-

Graduação em Química do Instituto de Química da

Universidade Federal do Rio Grande do Norte em

cumprimento as exigências para a obtenção do

título de Doutora em Química.

Orientador: Prof. Dr. Luiz Henrique da Silva

Gasparotto

NATAL-RN

2019

CDU 54(043.2)

RN/UF/BSQ

1. Nanopartículas de ouro - Tese. 2. HT-29 - Tese. 3.

Nanopartículas de prata - Tese. 4. Escherichia coli - Tese. I.

Gasparotto, Luiz Henrique da Silva. II. Título.

Athayde, Heloiza Fernanda Oliveira da Silva.

Efeitos anti-inflamatório, antitumoral e analgésico de

nanopartículas de ouro e antibacteriano de nanopartículas de

prata / Heloiza Fernanda Oliveira da Silva Athayde. - Natal:

UFRN, 2019.

160f.: il.

Tese (Doutorado) - Universidade Federal do Rio Grande do

Norte. Centro de Ciências Exatas e da Terra - CCET, Instituto de

Química. Programa de Pós-Graduação em Química (PPGQ).

Orientador: Dr. Luiz Henrique da Silva Gasparotto.

Universidade Federal do Rio Grande do Norte - UFRN

Sistema de Bibliotecas - SISBI

Catalogação de Publicação na Fonte. UFRN - Biblioteca Setorial Prof. Francisco Gurgel De Azevedo - Instituto Química

- IQ

AGRADECIMENTOS

Agradeço ao Pai Celestial que sempre cumpre Suas promessas. Uma delas é este momento.

Aos meus pais e aos demais familiares pelo apoio e oportunidades de estudo.

Ao meu esposo por toda paciência em suportar com bom ânimo minha ausência em alguns

momentos e por todo amor e incentivo para que eu conquistasse mais esse objetivo. E ao

nosso filho Noah por mesmo me mostrar que sou capaz de muito mais do que já imaginei.

Amo vocês!

Ao professor Luiz Henrique da Silva Gasparotto pela orientação, pelas oportunidades,

dedicação, pela confiança, apoio e paciência.

A professora Mª Celeste de Melo por me receber em seu laboratório e pela oportunidade de

aprendizado.

Ao professor Raimundo Fernandes por também me receber em seu laboratório e me dar

oportunidade de colaborar com seus alunos. Sou muito grata pela confiança!

Ao professor Luiz Seixas das Neves pelos conselhos sempre edificantes.

Aos meus queridos amigos. Vocês são os melhores! Gostaria de agradecer especialmente

a:

 Fernanda, Leomir e Camilo por sempre atenderem aos meus pedidos, tais como

ficar até mais tarde, caronas, por me ouvirem após cada momento de frustração e de

conquista, por suas palavras de incentivo, por pensar juntos a CHEMOVECTOR.

 Rayane, Isadora, Rubens e Eryka pela companhia e ajuda com os experimentos;

 Ana Luiza, Rômulo e Vinícius pela boa amizade e auxílio nas discussões dos

ensaios biológicos;

 Aos demais integrantes do Grupo de Química Biológica e Quimiometria - QBQ e

Laboratório de Eletroquímica e Nanopartículas Aplicadas - LENA pela boa

convivência e apoio.

A técnica de laboratório Ana e ao professor Hugo pela ótima recepção e auxílio durante o

treinamento no laboratório de cultura celular. Luíza e a professora Viviane pela recepção e

confiança nas ideias que levei para discutirmos.

Ao Celso pelas análises de TEM, ao técnico Joadir por sempre atender com atenção e

confiança para o uso do fluorímetro, aos integrantes do Laboratório de Bioquímica pela

água ultrapura, ao técnico Antônio Marcos por auxiliar nas análises de FTIR-ATR, ao

professor Edgar Moraes por me ajudar com os questionamentos quimiométricos.

“Se eu enxerguei mais longe, foi porque me apoiei sobre os ombros de gigantes”.

Isaac Newton

Por vezes sentimos que aquilo que fazemos

não é senão uma gota de água no mar. Mas o

mar seria menor se lhe faltasse uma gota.

RESUMO

SILVA, H. F. O. Nanopartículas De Ouro E Prata Aplicadas A Sistemas Biológicos.

[Gold and Silver Nanoparticles Applied to Biological Systems]. 2019. Tese (Doutorado

em Química) – Instituto de Química, Universidade Federal do Rio Grande do Norte,

Natal, 2019.

A neoplasia e a resistência bacteriana estão entre os principais desafios na área

biomédica atualmente, cenário este que demanda estudo e desenvolvimento de

tratamentos alternativos. Nanopartículas metálicas tem se mostrado promissoras em

aplicações dessa natureza. Esta tese apresenta aplicações de nanopartículas de ouro e

prata (NanoAu e NanoAg, respectivamente) a sistemas biológicos. NanoAu são

consideradas como potenciais plataformas para drug delivery. Entretanto, é essencial o

entendimento da interação dessas partículas com os organismos vivos antes da sua

utilização como nanocarreadores. Assim, o primeiro estudo apresenta a síntese e

caracterização de NanoAu e a investigação dos efeitos anti-inflamatório, analgésico e

antitumoral, além da biodistribuição das mesmas e o seu efeito sobre vários tipos de

tecidos. As NanoAu foram sintetizadas por meio de uma rota de baixo impacto

ambiental e caracterizadas com microscopia eletrônica de transmissão (TEM) e

espectroscopia na região do UV-Visível (UV-vis). Posteriormente, células HT-29 foram

expostas às NanoAu e avaliou-se a apoptose por meio da atividade da caspase-3. Em

relação a ensaios in vivo, NanoAu foram administradas a camundongos Swiss fêmeas e

ratos machos para posterior avaliação das suas propriedades anti-inflamatórias e

analgésicas. A biodistribuição das NanoAu e seu impacto sobre os tecidos foram

estudados por espectroscopia de UV-Vis e análise histopatológica, respectivamente. A

apoptose das células foi dependente da dose para concentrações de NanoAu entre 40 g

ml

e 80 g ml

(p < 0,05). A melhor atividade anti-inflamatória foi observada na dose

de 1500 g kg

, o que ocasionou uma redução de 49,3% na migração de leucócitos.

NanoAu mostraram analgesia periférica na dose de 1500 g kg

e foram encontradas no

fígado, baço, rim e pulmão dos camundongos Swiss. O exame histopatológico revelou

extravasamento de hemácias no pulmão. Já o segundo estudo, aborda a investigação do

efeito sinérgico metabólico das NanoAg combinadas ao hiclato de doxiciclina. Para isso

foi utilizada a bioespectroscopia ATR-FTIR de amostras bacterianas de Staphylococcus

aureus. A PCA foi aplicada ao grupo de espectros mostrando um padrão de

diferenciação entre as classes

.

Devido à complexidade dos dados obtidos (apresentarem

bandas de sobreposição e bastante variância dentro da mesma classe), foi necessário o

emprego da ferramenta de seleção de variáveis PLS-DA. Foram identificados que todos

os antimicrobianos desse estudo interferem na síntese protéica

.

Valores de sensibilidade

de 75%, 100% e 75 % para Controle, NanoAg e hiclato de doxiciclina respectivamente

.

Ainda foi determinado se havia ou não diferença estatística nos valores médios de

absorbância, isso permitiu apontar em quais casos os biomarcadores eram mais

expressos o que sugeriu a possível causa da sinergia do efeito antibacteriano das

NanoAu combinadas com hiclato de doxiciclina. Os resultados obtidos nos dois estudos

confirmam a potencialidade das nanopartículas sintetizadas em nosso grupo de pesquisa

como possíveis nanocarreadores.

ABSTRACT

SILVA, H. F. O. Gold and Silver Nanoparticles Applied to Biological Systems

[Nanopartículas De Ouro E Prata Aplicadas A Sistemas Biológicos]. 2019. Tese

(Doutorado em Química) – Instituto de Química, Universidade Federal do Rio Grande do

Norte, Natal, 2019.

Neoplasia and bacterial resistance are among the main challenges in the biomedical área. It

requires study and development of alternative. Metal nanoparticles have shown promise in

such applications. This thesis presents applications of gold and silver nanoparticles

(NanoAu and NanoAg, respectively) to biological systems. NanoAu are considered as

potential drug delivery platforms. However, understanding the interaction of these particles

with living organisms before their use as nanocarriers is essential. Thus, the first study

presents the synthesis and characterization of NanoAu and the investigation of anti-

inflammatory, analgesic and antitumor effects, as well as their biodistribution and their

effect on various tissue types. The NanoAu were synthesized by enviromental friendly

route and characterized by transmission electron microscopy (TEM) and UV-Vis

spectroscopy (UV-vis). Subsequently, HT-29 cells were exposed to NanoAu and apoptosis

was evaluated by caspase-3 activity. Regarding in vivo assays, NanoAu were administered

to female Swiss mice and male rats for further evaluation of their anti-inflammatory and

analgesic properties. NanoAu biodistribution and its impact on tissues were studied by UV-

Vis spectroscopy and histopathological analysis, respectively. Cell apoptosis was dose

dependent for NanoAu concentrations between 40 µg ml -1 and 80 µg ml -1 (p <0.05). The

best anti-inflammatory activity was observed at 1500 g kg-1, which led to a reduction of

49.3% in leukocyte migration. NanoAu showed peripheral analgesia at 1500 g kg-1 and

were found in the liver, spleen, kidney and lung of Swiss mice. Histopathological

examination revealed extravasation of red blood cells in the lung. The second study

addresses the investigation of the metabolic synergistic effect of NanoAg combined with

doxycycline hiclate, DO. ATR-FTIR biospectroscopy of bacterial samples of

Staphylococcus aureus was used. PCA was applied to the spectrum group showing a

pattern of differentiation between the classes. Due to the complexity of the obtained data

(presenting overlapping bands and enough variance within the same class), it was

necessary to use the PLS-DA variable selection tool. It was identified that all

antimicrobials in this study interfere with protein synthesis. Sensitivity values of 75%,

100% and 75% for Control, NanoAg and doxycycline hyclate respectively. It was also

determined whether or not there was a statistical difference in the mean absorbance values,

which allowed us to indicate in which cases the biomarkers were more expressed, which

suggested the possible cause of the synergy of the antibacterial effect of NanoAu combined

with doxycycline hyclate. The results obtained in both studies confirm the potential of

synthesized nanoparticles in our research group as possible nanocarriers.

LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS

ATR-FTIR – Espectroscopia de Reflectância Total Atenuada no infravermelho com transformada de

Fourier (do inglês, Attenuated total reflectance Fourier transform infrared)

BHI - Caldo de infusão de cérebro e coração. (do inglês, Brain Heart Infusion)

CAPES - Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior

DNA –

ácido desoxirribonucleico (do inglês,

deoxyribonucleic acid)

DO - Hiclato de doxiciclina

E. coli - Escherichia coli

FT – Transformada de Fourier (do inglês, Fourier transform)

HAuCl

Ácido cloroáurico

HT29 - Linhagem celular de câncer de cólon humano

IHQ – Imuno-histoquímica

IUPAC - União Internacional de Química Pura e Aplicada (do inglês, International Union of

Pure and Applied Chemistry)

MEC - Ministério da Educação

MET - Microscopia Eletrônica de Transmissão

MIR - Espectroscopia na região do infravermelho médio (do inglês, Medium Infrared

Spectroscopy)

Nano - Nanopartículas

NanoAg - Nanopartículas de prata

NanoAu - Nanopartículas de ouro

NanoM - Nanopartículas metálicas

PCA - Análise por componentes principais (do inglês, Principal Component Analysis)

PLS- Mínimos quadrados parciais (do inglês partial least squares )

PLS-DA - Análise de discriminante pelos mínimos quadrados parciais (do inglês partial

least

squares discriminant analysis)

PVP - Polivinilpirrolidona.

RNA - Ácido Ribonucléico (do inglês, Ribonucleic acid)

RPS - Ressonância de Plasmon de Superfície

S. aureus - Staphylococcus aureus

TSA - Ágar Triptona de Soja. (do inglês, Tryptic Soy Agar)

SUMÁRIO

Capítulo 1

INTRODUÇÃO GERAL ... 11

Capítulo 2

Anti-inflammatory, analgesic and anti-tumor properties of gold

nanoparticles.

R. F. de Araújo Júnior, A. A. de Araújo, J. B. Pessoa, F. P. Freire Neto, G. R. da

Silva, A. L. C. S. L. Oliveira, T. G. de Carvalho, H. F. O. Silva, M. Eugênio, C.

Sant‘Anna, L. H. S. Gasparotto.

Pharmacological Reports, 2017, Vol. 69, 119- 129 ... 56

Capítulo 3

On the synergy between silver nanoparticles and doxycycline towards

the inhibition of Staphylococcus aureus growth.

H. F. O. Silva, R. P. de Lima, F. S. L. da Costa, E. P. Moraes, M. C. N. Melo,

C.Sant‘Anna, M. Eugenio, L. H. S. Gasparotto.

RSC Advances, 2018, Vol. ,8, 23578–23584 ... 68

Capítulo 4

CONCLUSÕES E PERSPECTIVAS ... 76

Apêndice A

Environmentally compatible bioconjugated gold nanoparticles as

efficient contrast agents for inflammation-induced cancer imaging

Garcia, V. B.; de Carvalho, T.G.; da Silva Gasparotto, L. H.; da Silva, H. F. O.; de

Araújo, A. A.; Guerra, G. C. B.; Schomann, T.; Cruz, L. J. ; Chan, A. B.; de Araújo

Júnior, R. F..

Nanoscale Research Letters, v. 14, p.xx, 2019 ...77

Apêndice B Functionalization of gold nanoparticles with two aminoalcohol-based

quinoxaline derivatives for targeting phosphoinositide 3-kinases

(PI3K).

J. Araújo, F. G. Menezes, H. F. O. Silva, D. S. Vieira, S. R. B. Silva, A.J. Bortoluzzi,

C. Sant‘Anna, M. Eugenio, J. M. Neri, L. H. S. Gasparotto.

New Journal of Chemistry, v. 43, p. 1803-1811, 2019 ... 90

Apêndice C Spherical neutral Gold nanoparticles improve anti-inflammatory

response, oxidative stress and fibrosis in alcohol-methamphetamine-

induced liver injuryin rats.

T. G. Carvalho, V. B. Garcia, A. A. Araújo, L. H. S. Gasparotto, H. F. O. Silva, G.

C. B. Guerra, E. C. Miguel, R. F. C. Leitão, D. V. S. Costa, L. J Cruz, A. B. Chan, R.

F. de Araújo Jr.

International Journal of Pharmaceutics, 2018, Vol. 548, 1–14 ....100

Apêndice D Lipopolysaccharides and peptidoglycans modulating the interaction of

Au nanoparticles with cell membranes models at the air-water

interface.

Apêndice E Apoptosis in human liver carcinoma caused by gold nanoparticles in

combination with carvedilol is mediated via modulation of

MAPK/Akt/mTOR pathway and EGFR/FAAD proteins.

Araújo RF Jr, Pessoa JB, Cruz LJ, Chan AB, De Castro Miguel E, Cavalcante RS,

Brito GAC, Silva HFO, Gasparotto LHS, Guedes PMM, Araújo AA.

International Journal of Oncology, 2018, Vol. 52, 1, 189-200……. 124

Apêndice F

How the Interaction of PVP-stabilized Ag Nanoparticles with Models

of Cellular Membranes at the Air-Water Interface is Modulated by the

Monolayer Composition

R. L. C. G. Silva, H. F. O. Silva, L. H. S. Gasparotto, L. Caseli.

Journal of Colloid and Interface Science, 2018, Vol. 512, 792-800. 137

Apêndice G

Dual Role of a Ricinoleic Acid Derivative in the Aqueous Synthesis of

Silver Nanoparticles.

I. D. Costa, A. O. Wanderley Neto, H. F. O. Silva, E. P. Moraes, E. T. D. Nóbrega,

C. Sant‘Anna, M. Eugenio, L. H. S. Gasparotto.

Journal of Nanomaterials, 2017, Vol. 2017, 1-8 ... 147

Anexo I

MINI-CURRICULUM ... 157

Anexo II

CARTA DE CONCLUSÃO ... 160

Capítulo 1 - Introdução geral

1

REVISÃO BIBLIOGRÁFICA. ... 11

2

ORGANIZAÇÃO DA TESE. ... 34

3

OBJETIVOS ... 36

4

METODOLOGIAS EMPREGADAS ... 36

Referências. ... 46

1-

REVISÃO BIBLIOGRÁFICA

1.1

Nanomedicina

A utilização de nanopartículas em aplicações biomédicas é conhecida desde o final da

década de 1970. Entretanto o termo nanomedicinasó passou a ser usado na virada do presente

século. A Fundação Européia para a Ciência definiu o termo da seguinte forma:

A nanomedicina utiliza ferramentas de tamanho nano para o diagnóstico, a prevenção e o tratamento de doenças e

para aumentar a compreensão da complexa base fisiopatológica da doença. O objetivo final é melhorar a qualidade

de vida [1].

De acordo com a definição acima, as aplicações da nanotecnologia na biomedicina podem ser

divididas em três grandes áreas conforme exposto na tabela a seguir:

Tabela 1: Aplicações da nanomedicina.

Aplicações da nanomedicina

Área I

Diagnóstico, biosensores e próteses externas.

Área II

Agentes de imagem e técnicas de monitorização que atuem nas células.

Área III

Inovação de biomateriais para drug delivery (a administração pode ser ex vivo ou não,

incluindo implantes) e engenharia tecidual.

Fonte: Adaptada da Referência [5].

Resumidamente, as tecnologias são de diagnóstico, agentes de imagem e administração de

medicamentos com nanopartículas [2,3]. A proposição de soluções para cada uma dessas áreas é

a utilização da nanotecnologia na investigação de processos fisiopatológicos, ou seja, a obtenção

de nanoestruturas com tamanho similares aos das moléculas biológicas com o objetivo de

investigar sua interação com células humanas. Há estudos voltados para a melhoria das

propriedades dos fármacos, exemplos disso são a solubilidade, a

estabilidade e a disponibilidade. Diversos estudos relatam a aplicação de nanoestruturas na

administração de fármaco que vão desde a radiofreqüência a novos sistemas de drug delivery [4-

6]. Duncan e Gaspar [5] destacaram em seu trabalho de revisão que dependendo do tipo de

material suas propriedades físico-químicas são bem distintas e isso influencia diretamente na

faixa de tamanho a ser utilizada, e consequentemente no alvo da aplicação. Assim, torna-se

essencial a compreensão dos tipos de nanomateriais que podem ser empregados. A Figura 1

apresenta um esquema dos principais nanomateriais e uma ideia dos tamanhos relativos de

nanomedicamentos.

Figura 1: Esquema mostrando as principais classes de nanomedicamentos de primeira geração em ensaio e uso

clínico de rotina. A inserção dá uma ideia dos tamanhos relativos dos nanomedicamentos, já que os desenhos

em cada região não estão em escala. Por exemplo, lipossomas, nanocristais, e algumas nanopartículas

poliméricas são ≥ 100 nm, e algumas nanopartículas poliméricas, conjugados de polímero e os dendrímeros

estão no intervalo 5-25 nm.

Fonte: Adaptada da Referência [5].

Tais nanomedicamentos geralmente atendem a faixa de tamanho de 1 a 1000 nm [7].

Entretanto, nem todos os nanomateriais conservam o desempenho diferenciado em toda essa

faixa. Cada material apresentará um tamanho crítico onde acima dele não são observadas as

propriedades peculiares que os distinguem dos de maiores tamanhos, e consequentemente os

efeitos biológicos. Em alguns casos, Toxicidades clínicas, incluindo efeitos colaterais, têm

sido amplamente estudadas e algumas vezes apontam para a individualização do paciente.

Ainda dentro da temática dos nanomedicamentos, um termo mais recente foi introduzindo

que são os teranósticos, que remete a um nanomedicamento que apresenta as propriedades

multimodais [7-9]. As nanopartículas de ouro (NanoAu) são representantes desse termo,

especialmente nas proposições relacionadas ao câncer [10,11]. Já as nanopartículas de prata

(NanoAg) são mais utilizadas visando a diminuição da resistência bacteriana [12, 13]. Nesta

tese apresentaremos um

trabalho envolvendo o estudo de células HT-29 expostas às NanoAu

(capítulo 2) e outro envolvendo NanoAg combinadas ao hiclato de doxiciclina (DO) em contato

com células bacterianas do tipo Staphylococcus aureus (capítulo 3). Ambas nanopartículas foram

obtidas via síntese química com condições que atendem a demanda da química verde, tais como

redução/ eliminação do uso de reagentes tóxicos e energia. No próximo tópico apresentaremos

algumas características das nanopartículas e as diferentes formas de obtenção das mesmas.

1.2

Métodos de obtenção das NanoAu e NanoAg

De acordo com o Golden Book da IUPAC (1972) [14], um sistema contendo partículas ou

moléculas que possuam uma de suas dimensões entre 1,0 nm e 1,0 m, ou que tenham descontinuidades

com distâncias dessa ordem dispersas em um meio é chamado de colóide. Assim, podemos classificar a

solução homogênea resultante da síntese de NanoAu e de NanoAg, que serão apresentadas neste

trabalho, como uma solução coloidal. Partículas metálicas em regime nanométrico passam a apresentar

propriedades físico-químicas bem diferentes do material bulk (sólido estendido), visto que sua razão

superfície/volume ou fração de átomos superficiais é bem elevada quando comparado com o bulk do

mesmo metal. Nanopartículas de metais nobres (ouro, prata e cobre), por exemplo exibem bandas na

região visível do espectro eletromagnético, chamadas de bandas de plasmon. Tal fenômeno é atribuído à

oscilação coletiva dos elétrons de condução quando estes são submetidos à radiação eletromagnética de

comprimento de onda maior do que a partícula.

Resumidamente, a incidência de um campo elétrico

homogêneo sobre a nanopartícula metálica, resulta no deslocamento dos seus elétrons no

sentido contrário ao do campo elétrico da onda incidente. Tal deslocamento das cargas promove

a indução de um dipolo elétrico na nanopartícula. Por sua vez, o dipolo induzido promove o

aparecimento de um campo elétrico restaurador na partícula, o qual tem a função de recompor o

Figura 2: Ilustração esquemática do fenômeno de RLPS para nanopartículas esféricas.

equilíbrio dado pela distorção das cargas. Esta força restauradora e a indução do dipolo, quando

vinculadas, geram a Ressonância Localizada de Plasmon de Superfície, RLPS. A Figura 2

ilustra o dipolo elétrico induzido e a força restauradora criada devido a separação de cargas na

partícula. Com base nisso, pode-se concluir que a banda de LPS é fortemente dependente dos

fatores: a) tamanho das partículas, b) forma (esfera, bastões, triângulos, pirâmides, cubos); c)

distribuição de tamanho, d) meio no qual as NanoMs estão imersas (viscosidade, constante

dielétrica, íons e/ou moléculas coordenadas a superfície). Uma propriedade das NanoMN é a cor

característica que advém das oascilações coletivas coerentes dos elétrons livres na banda de

condução. No caso das NanoM utilizadas neste trabalho (todas esféricas), a cor observada foi

vermelho para as NanoAu e amarelo castanho para as NanoAg. A espectroscopia na região do

Ultravioleta Visível, UV-Vis se torna uma ferramenta essencial no acompanhamento da

obtenção de nanopartículas de metais nobres e nas inferências iniciais a respeito dos fatores e

propriedades citados [16-20],

As NanoM, de maneira geral, podem ser obtidas por dois métodos principais o top-

down e botton-up (Figura 3). O primeiro consiste na manipulação do macromaterial e por meio

de processos físicos, fragmenta-se o material até que estejam em escala nanométrica. E o

segundo, fundamenta-se em reações químicas e se usa percursores moleculares ou atômicos

para a aquisição de nanopartículas. Este método é o mais utilizado, visto que é mais simples e

permite um controle maior dos parâmetros do processo tal como o tamanho e a forma das

NanoM, além da possibilidade de obtenção de partículas muito menores que as obtidas pelo

método top-down [21].

Dentro dos métodos bottom-up a síntese coloidal é a mais utilizada por ser mais barata.

São muitos os trabalhos na literatura que funcionam como prova de conceito para tal [22-24].

Esta síntese baseia-se na formação de átomos do metal por meio da utilização de um agente

químico redutor em solução. No instante que são formados, os átomos metálicos passam por

processo de nucleação e posterior crescimento para só depois resultar em nanopartículas. É

importante frisar que é necessária a presença de um agente químico estabilizante, visto que

sistemas coloidais são essencialmente instáveis termodinamicamente devido à razão

volume/superfície que influencia a agregação e posterior coalescência, gerando assim partículas

maiores. Essa estabilização pode se dar de maneira eletrostática ou eletroestérica, são exemplos

íons e polímeros, respectivamente [22,25].

Metal bulk

Figura 3: Principais métodos de obtenção de nanopartículas metálicas (NanoM).

Fonte: Autor.

As rotas clássicas utilizam como agentes redutores íons citrato, borohidreto e hidrazina

[22,26]. No trabalho desenvolvido foi empregado o método desenvolvido por Gasparotto e

colaboradores [27] que supera a utilização de agentes redutores e estabilizantes tão tóxicos

como o íon borohidreto e também condições tão drásticas de temperatura. Esta rota utiliza

glicerol em meio básico como agente redutor e a polivinilpirrolidona (PVP) como agente

estabilizador sob temperatura ambiente. Este método se mostrou válido para a obtenção tanto

das NanoAu, quanto das NanoAg que foram obtidas não só nos estudos que serão

compartilhados aqui, mas também nos demais realizados em nosso grupo.

1.2.1 Nanopartículas de ouro

Em 1856 o cientista Michel Faraday sintetizou uma solução de NanoAu. O interessante é

que se deu de forma acidental enquanto ele estava na montagem de folhas finas de ouro em

lâminas de microscópios. O mais incrível é que a solução coloidal de ouro obtida naquela época

continua estável mesmo após mais de 160 anos. O que intriga é não ser possível saber o porquê

de tamanha estabilidade, uma vez que não é possível abrir os frascos sem danificá-los. Isso

aconteceu mesmo antes do termo ―nano‖ ser introduzido na ciência [28]. As NanoAu são

certamente as nanopartículas mais estudadas. Seu uso tão expressivo é atribuído a fácil

preparação de colóides, bem como sua bioafinidade. Como uma nanopartícula metálica, as

NanoAu podem ser obtidas com diferentes formas, tamanhos e combinadas a outros materiais.

Como exemplos, temos os nanobastões de ouro, nanoconchas de ouro-sílica, as nanocelas e

as ocas [29, 30]. O estudo oficial utilizando as NanoAu já é reportado a bastante tempo,

Horisberger mostrou que pelo fato das NanoAu possuírem a propriedade ópticas peculiares elas

poderiam ser conjugadas a diferentes moléculas que seriam marcadores [29]. Roth publicou um

trabalho de revisão cujo título era ―O aniversário de prata do ouro: 25 anos do sistema de

marcação de ouro coloidal para imuno-histoquímica e histoquímica‖, neste trabalho de revisão

ele aborda a conjugação de NanoAu a proteínas e lectinas que permite a localização de

receptores [31]. Já no início dos anos 2000, a literatura mostrou que sais de ouro tem

açãosignificativa no tratamento de artrite reumatóide, em geral a via de administração indicada é

a intramuscular [32]. De todos os estudos já realizados com as NanoAu, a terapia do câncer é a

aplicação mais relatada. Fazendo o cruzamento no portal de periódicos da CAPES/MEC de

“gold nanoparticles and cancer” até julho de 2019 vê-se que dos 200.935 artigos publicados

envolvendo apenas tema “gold nanoparticles”, 48.727 (equivalendo a 24,2%) tinham o câncer

como aplicação. Assim, vê-se que o desenvolvimento e estudo de NanoAu nessa área ainda é

bastante relevantes. No primeiro trabalho que será compartilhado nesta tese (capítulo 2), foram

utilizadas nanopartículas de ouro esféricas e estudados seus efeitos analgésico, anti-

inflamatório e anticâncer, além de sua biodistribuição em diversos tecidos [33].

1.2.2

Nanopartículas de prata

Segundo relatos da literatura, nanopartículas de prata foram utilizadas sem nenhuma

intenção de obter nanomateriais por aproximadamente 1000 anos. Elas eram apenas

incorporadas em matrizes vítreas para obtenção de vitrais coloridos. Entretanto, a real

descoberta das NanoAg se deu há mais de 120 anos [34]. Em 1889, Lea MC sintetizou a

partir de citrato nanopartículas de prata com estabilidade coloidal e diâmetro médio para as

partículas entre 7,0 e 9,0 nm. A prata coloidal era utilizada no tratamento de doenças e

infecções antes da descoberta da penicilina, em 1928 [34-36]. Em 1954, nos EUA, foi

registrada nanopartículas de prata como biocida e desde então este material tem sido

utilizado com essa finalidade. A aplicação de partículas de prata em regime nano aumentou a

eficácia no controle de microrganismos patógenos (bactérias e fungos), uma vez que passa a

apresentar uma grande área superficial das nanopartículas e, consequentemente, maior

contato com os microrganismos [37]. Ou seja, aumenta a disponibilidade de íons liberado

que é tida como um dos fatores responsáveis pela inibição do crescimento e/ou morte celular

[34]. Abordagens mais recentes apontam para uma possível sinergia do efeito bacteriano e/ou

bactericida quando é utilizada NanoAg combinadas a antibióticos [38- 41]. Realizando busca

semelhante ao item anterior no portal periódico da CAPES/MEC, com o cruzamento dos

termos “silver nanoparticles and bacteria” até julho de 2019 vê-se que dos 132.290 artigos

publicados envolvendo apenas tema “silver nanoparticles”, 25.776 (equivalendo a 19,5%)

tinham bactérias como alvo da aplicação. Assim, nesse caso também se constata que o

desenvolvimento e estudo de NanoAg nessa área ainda são bastante relevantes. No segundo

trabalho que será compartilhado nesta tese (capítulo 3), foram utilizadas nanopartículas de

prata esféricas, sintetizadas pela mesma rota utilizada nas NanoAu, combinadas ao DO e

avaliada o efeito no metabolismo de bactérias do tipo Staphylococcus aureus quando

expostas ao combinado [42].

1.3

Problemáticas abordadas nos estudos

1.3.1

Estudo com as NanoAu (capítulo 2)

1.3.1.1 Câncer colorretal: uma ponderação

Dentre os diagnósticos de neoplasias, o câncer de intestino grosso (câncer colorretal ou

de cólon) é o terceiro mais comumente diagnosticado. Em 2018 o número de novos casos foi de

33.750, sendo 17.380 homens e 16.370 mulheres no Brasil [43]. Isso poderia ser modificado se

a cultura da prevenção fosse adotada (tais como hábitos saudáveis de alimentação e realização

de exames), já que a maioria dos casos é iniciada por meio de pólipos que são tumores pré-

cancerosos no colón e no reto. Entretanto nem todos os pólipos desenvolverão câncer, mas

retirando-os após identificação no processo de triagem garante uma prevenção eficaz. Além de

que se detectado nos estágios iniciais o tratamento é mais eficiente [44]. O colón pode ser

dividido em quatro partes, conforme mostrado na Figura a seguir:

Figura 4: Anatomia do Cólon e Reto. Adaptada.

Fonte: Adaptada da referência [44].

O cólon e o reto constituem o chamado intestino grosso. Voltando aos pólipos, o mais comum

nesse tipo de segmento é o adenomatoso ou adenoma que nada mais é do que células

glandulares que são responsáveis pela produção de muco para a lubrificação [45, 46]. Trabalhos

na literatura apontam que pelo menos um terço da população irá desenvolver esse tipo de

pólipo, mas menos de 10% se tornarão tumores malignos [47, 48]. O câncer será mais invasivo

à medida que ele se desenvolva por meio de células glandulares denominadas adenocarcinoma

que correspondem a 96% dos casos de câncer colorretal. Esse tipo de neoplasia é de

desenvolvimento lento, geralmente na faixa de 10 a 20 anos [49] o que remete mais uma vez a

importância da prevenção e diagnóstico por meio de triagem. A Figura 5 apresenta os

principais fatores que causam o câncer colorretal:

Figura 5: Principais causas do câncer colorretal.

Fonte: Autor.

A maioria envolve nossas escolhas diárias, mas quando não podemos mais prevenir passamos a

focalizar no que ocorre após o diagnóstico do câncer colorretal que é o tratamento. Em 2017,

18867 pessoas morreram vítimas desse tipo de câncer, dos quais 9207 eram homens e 9660

eram mulheres [43]. Isso nos alerta para a necessidade de estudos na área do tratamento dessa

doença. Para esse tipo de neoplasia o tratamento indicado, na maioria dos casos, é a cirurgia

para remoção do(s) tumor (es) e uma terapia adjuvante. Independente da ordem das etapas de

tratamento, temos que a cirurgia, quimioterapia, radioterapia e a terapia-alvo proporcionam

efeitos adversos [44]. Isso instiga a busca para o desenvolvimento e prospecção de novos

materiais e métodos com o objetivo de proporcionar um tratamento menos agressivo e mais

eficiente. Nosso trabalho apresentado no capítulo 2 desta tese se encaixa nessas iniciativas.

Células HT29

Para o estudo da ação de diferentes candidatos a quimioterápicos são utilizados modelos

tanto celulares quanto modelos animais. Com o objetivo de economia de ensaios com animais e

pela conveniência de poder fazer testes em batelada com o controle das condições ambientais,

os primeiros testes são realizados com modelos celulares [50]. Com relação aos testes para

avaliação do efeito anticâncer de cólon, um dos modelos celulares mais utilizados é a linhagem

HT-29 [51-54]. Fogh e Trempe isolaram tal linhagem de um carcinoma de cólon humano e

foram mantidas tanto as características do tecido normal, quanto dos receptores hormonais [55,

56]. No estudo que será apresentado no capítulo 2 foi utilizada a linhagem celular de

adenocarcinoma de cólon humano HT-29 para o estudo do efeito antitumoral das NanoAu

sintetizadas pela rota ambientalmente correta utilizada em nosso laboratório. Nesse mesmo

estudo também foram avaliados os efeitos analgésico e anti-inflamatório das NanoAu utilizando

também modelo animal.

1.3.2

Estudo com as NanoAg (capítulo 3)

1.3.2.1 Resistência bacteriana e bactérias do tipo Staphylococcus aureus

No mundo, 20% dos casos novos de câncer são associados a infecções virais e

bacterianas. Esse fato já é o suficiente para justificar todo investimento em pesquisa e

desenvolvimento de estratégias para o combate a resistência bacteriana. Entretanto, a

problemática é preocupante, uma vez que de maneira geral o sistema de saúde tem enfrentado

casos de infecções bacterianas cada vez mais resistentes [57]. Uma bactéria é considerada

resistente quando níveis terapêuticos da droga perdem a eficácia no processo de morte ou

controle do seu crescimento. O uso indiscriminado de antibióticos colabora para esse fenômeno,

assim cepas cada vez menos sensíveis vêm surgindo. O governo brasileiro, por meio do

ministério da saúde, vem investindo em ações contra resistência aos antimicrobianos mais

incisivamente desde 2018. Mas esse problema não é só nacional, na realidade faz parte de um

desafio de saúde pública mundial [58, 59, 60]. A resistência antibiótica tanto pode ser um

processo natural (ou seja, algumas bactérias são naturalmente resistentes a determinados

antibióticos) quanto pode ser induzida por meio de uma mutação genética ou contraindo

resistência de outra bactéria. Tal fenômeno se dá quando uma bactéria assimila elementos

genéticos móveis de outra bactéria, tais como os plasmídeos (DNAs separados do cromossomo,

com habilidade de replicação) e os transposons (regiões de DNA que são móveis). Os processos

dessas mutações sejam naturais ou adquiridas podem de dar das seguintes maneiras: (a) com

redução da permeabilidade da membrana (produzindo o biofilme), evitando a entrada do

composto na célula; (b) coma modificação do alvo do antibiótico; (c) com o desenvolvimento

de uma via bioquímica resistente, que pode ser promovida por transferência genética; (d) com a

transformação enzimática, produzindo enzimas que atuam na composição química dos

medicamentos, inativando-os; (e) o efluxo que se trata da retirada dos antibióticos de dentro da

célula [61, 62, 63]. Os antimicrobianos que a serem propostos necessitam contornar um ou mais

mecanismos dos citados acima.

Bactérias e Staphylococcus aureus

Trata-se de organismos unicelulares procariontes que podem ser encontrados em

colônias ou isolados. A classificação procariótica é pelo fato desse tipo de célula não apresentar

núcleo definido nem outras organelas ligadas à membrana. O inverso trata-se de células

eucarióticas. Outras peculiaridades das bactérias é que sua reprodução é do tipo assexuado, por

meio de mitoses sucessivas. Esses microrganismos apresentam tamanho na faixa de 1,0 a 5,0

m. Eles podem ser classificados como gram-positivos e gram-negativos. Tal atribuição é dada

de maneira empírica, onde o resultado de um ensaio realizado por um método denominado de

Gram o classificará como positivo ou negativo. Esse ensaio consiste no tratamento de bactérias

com dois corantes, um violeta e outro rosa. Bactérias que absorvem ambos são classificadas

como gram-positivas, e aquelas que absorvem apenas a rosa são ditas gram-negativas. A

divergência nos testes é atribuída à composição da parede celular bacteriana. O diagrama

simplificado do envelope celular de bactéria gram-positiva e gram-negativa apresentado na

Figura 6 ajuda a compreender que as gram- positivas possuem uma camada espessa de

peptídeoglicanos , enquanto as gram-negativas possuem uma camada mais fina envolta por uma

segunda membrana lipoproteica [64, 65]. As representantes mais comuns são: Escherichia coli

(E. coli), gram-negativa e a Staphylococcus aureus, (S. aureus), gram-positiva. No estudo que

será apresentado no capítulo 3, foi avaliada a resposta metabólica de S. aureus frente às NanoAg

combinadas ao DO. Essa bactéria é normalmente encontrada em indivíduos saudáveis, especifi-

Figura 6: Diagrama simplificado do envelope celular de bactéria gram-positiva e gram-negativa.

Fonte: Adaptado da Referência [57].

camente nas regiões da pele e das fossas nasais. S. aureus, cocos gram-positivos, enquanto

patógenos são capazes de provocar desde pequenas infecções na pele até graves infecções que

podem levar a óbito.

Algumas dessas infecções são: pneumonia, endocardite, osteomielite, septicemia, entre

outros. Essa patogenia é atribuída ao uso indiscriminado de antibióticos, como discutido

anteriormente quando tratamos das causas da resistência bacteriana, e também ao fato dessa

bactéria passar a habitar tecidos que não lhe são comuns de habitar. Isso causa infecções muito

graves, especialmente quando entra na corrente sanguínea a que geralmente leva a infecção

generalizada (ou sepse) e a óbito. Com o desenvolvimento dos antibióticos, como discutimos,

acreditava-se ter encontrado uma solução para o fim dessas infecções, no entanto, estudos

mostram que o S. aureus é uma das bactérias que possui resistência a diversos

antimicrobianos, o que tem estimulado novas pesquisas a fim de solucionar essa problemática

[66-70].

1.4

Técnicas Instrumentais

1.4.1

Técnicas Espectroscópicas

O espectro completo da radiação eletromagnética (vide Figura 7) é o intervalo completo

da radiação eletromagnética que contém as ondas de rádio, as micro-ondas, o infravermelho, os

raios X, a radiação gama, os raios violeta e a luz visível ao olho humano. Diferentes substâncias

Figura 7: Esquema do espectro eletromagnético.

Fonte: Autor.

interagem de forma distinta com a radiação eletromagnética, assim a compreensão desse

espectro permite utilizar a radiação para o estudo de caracterização de diversos materiais

relacionando o que se deseja observar/estudar com a quantidade de energia radiante a ser

utilizada. Com base nisso, diversos equipamentos instrumentais de análise e metodologias

surgiram e continuam a ser aperfeiçoados. Dentre as técnicas de caracterizações utilizadas nos

trabalhos dessa tese estão as espectroscopias. A IUPAC em seu Golden Book [71] define

espectroscopia como:

O estudo de sistemas físicos pela radiação eletromagnética com a qual eles

interagem ou que eles produzem. Espectrometria é a medida de tais radiações

como um meio de obter informações sobre os sistemas e seus componentes. Em

certos tipos de espectroscopia óptica, a radiação origina-se de uma fonte externa

e é modificada pelo sistema, enquanto que em outros tipos, a radiação se origina

dentro do próprio sistema.

As técnicas espectroscópicas utilizadas nesse trabalho foram: UV-Visível e ATR-FTIR. Mais a

frente elas serão fundamentadas, e o seu uso em cada ensaio dos trabalhos justificado.

Basicamente, cada substância apresentará um perfil espectral característico. Para aqueles

obtidos na região do UV-Visível, isso acontece por causa dos grupos denominados cromóforos

que é definido pela IUPAC [71] como:

A parte (átomo ou grupo de átomos) de uma entidade molecular na qual a

transição eletrônica responsável por uma determinada banda espectral é

aproximadamente localizada.

1.4.1.1 Espectroscopia no UV-Visível

A espectroscopia de UV-Vis baseia-se na absorção de radiação, por uma amostra, na

região UV-Vis-IV

(190-1100 nm). Certos compostos têm a capacidade de absorver

radiação nessa faixa do espectro eletromagnético, passando para um estado excitado. Na figura

8 são apresentados dois espectros de absorção com os máximos de absorção, tanto de

molécula(DO) como de nanopartículas metálica (NanoAg). Quando se trata de nanopartículas

metálicas, esses máximos de absorção são definidos pelo fenômeno da Ressonância de

A

B

Figura 8: Espectros no UV-Visível simulados de (A) Hiclato de doxiciclina e de (B) NanoAg, ambas em solução

aquosa.

Fonte: Autor.

A Figura 9 apresenta um esquema da absorção de luz por uma solução de concentração

C acondicionada numa cubeta. A absorção de radiação UV ou visível por uma espécie atômica

Figura 9: Esquema da absorção de luz e as etapas de excitação e relaxação eletrônica.

Fonte: Autor.

ou molecular pode ser considerada como um processo que ocorre em duas etapas: excitação e

relaxação, elas foram equacionados na figura acima. São três tipos de transições eletrônicas: a)

elétrons p, s e n (moléculas e íons inorgânicos), b) elétrons d e f (íons de metais de transição), c)

transferência de carga (complexos metal-ligante). Se N* sofrer decomposição ou formar novas

espécies, o processo é chamado de reação fotoquímica. Como resposta, a técnica fornece o

quanto de luz é absorvido pela amostra, por meio da medida da luz transmitida. Para a análise

Figura 10: Esquema da absorção de luz por uma espécie atômica ou molecular e análise quantitativa por

meio da relação da quantidade de luz absorvida e transmitida.

Fonte: Autor.

A absorbância é dependente da concentração da espécie absorvedora. Com base na relação

acima, é possível verificar que quanto maior a concentração do analito, maior a

absorbância. Entretanto, o valor dessa capacidade intrínseca também é dependente do

espaço físico ocupado pela amostra (caminho óptico) e da absortividade molar de cada

substância. A última nada mais é do que a habilidade que uma espécie apresenta em

absorver uma radiação em determinada frequência. A relação entre absorção e

concentração pode ser realizada com base na Lei de Lambert-Beer (vide esquema da

Figura 11). Observações realizadas pelos cientistas Johann Heinrich Lambert (1728 –

Figura 11: Relação entre absorção e concentração (Lei de Lambert-Beer) e relação linear entre Absorbância

e Concentração se as medidas são feitas em condição de caminho óptico constante (aplicação da equação da

reta para determinar o valor de  para obter o de .

1777) e August Beer (1825 – 1863) deram origem a tal relação. O primeiro, em seus

estudos observou que a intensidade da luz transmitida por um meio absorvedor

proporcional à espessura do meio pelo qual a luz passava. E o segundo, observou que a

intensidade da luz transmitida por um meio absorvedor era proporcional à concentração da

espécie absorvedora. Como toda lei, essa também apresenta limitações e elas são: só é

válida para soluções diluídas (C < 0,01 mol L

), necessita de radiação monocromática e

não devem estar presentes na mesma solução mais de uma substância absorvedora de luz

[72-74]. Isso quando buscamos fazer a relação de proporcionalidade entre concentração e

absorbância. Em nossos estudos utilizamos os dados obtidos via espectroscopia na região

do UV-Visível de maneira qualitativa, onde se buscou observar o perfil espectral tanto das

soluções de NanoAu quanto as de NanoAg a medida que a síntese progredia. Além de

utilizar também para avaliar a estabilidade dessas soluções após o ajuste do pH do meio.

Outro uso dessa técnica foi observar o resultado da combinação de DO com as NanoAg

antes de expô-las às bactérias S. aureus. Como discutido, a espectroscopia UV-Visível

(UV-Vis) mede a extinção (dispersão + absorção) da luz que passa através de uma amostra.

As nanopartículas têm propriedades ópticas únicas que são sensíveis ao tamanho, forma,

concentração, estado de aglomeração e índice de refração próximo à superfície das

nanopartículas, o que torna o UV-Vis uma ferramenta valiosa para identificar, caracterizar

e estudar nanomateriais.

1.4.1.2 Espectroscopia na infravermelho médio (MIR)

O fundamento desta técnica é similar ao discutido no item anterior, diferenciando

apenas na energia da radiação que é incidida na amostra. Nesse caso ela abrange a faixa de

4000 cm

a 400 cm

do espectro eletromagnético (também conhecida como região

fundamental ou infravermelho médio, MIR). Da mesma maneira que a espectroscopia no

UV-Visível, essa técnica pode ser utilizada par relações quantitativas desde que respeite a

Lei de Lambert-Beer. Os dados obtidos por essa técnica geram um gráfico de

Transmitância (%) X Número de onda (cm

), que pode ser facilmente convertido em

Absorbância (%) X Número de onda (cm

) conforme a relação apresentada anteriormente

na figura 11. Esse espectro é obtido quando um feixe de radiação com energia na faixa

mencionada é absorvida em frequências específicas por moléculas que possuam a

capacidade de ter uma alteração no seu momento de dipolo. Essa alteração se dá pelo fato

de que as ligações químicas da espécie em análise vibram em frequências específicas. Isso

está diretamente relacionado com os níveis de energia da molécula, nesse caso os níveis

vibracionais. Essas vibrações específicas são diretamente dependentes da geometria da

molécula, das massas dos átomos envolvidos, do formato da superfície de energia potencial

da molécula e, algumas vezes do acoplamento vibrônico (t

ambém conhecido como efeito

pseudo-Jahn-Teller).

As ligações podem vibrar de seis modos: estiramento simétrico,

estiramento assimétrico, tesoura, torção, balanço e rotação, conforme apresenta- do na

Figura 12.

Essas diversas possibilidades de vibração, que são dependentes da composição e

estrutura química, fazem com que cada molécula exiba um espectro singular podendo ser

feita uma analogia com a impressão digital. Para que os espectros sejam cada vez mais

claros, a maior parte dos equipamentos tem utilizado um sistema óptico (chamado

interferômetro de Michelson) aliado a transformações matemáticas (conhecida como

transformada de Fourier, sigla em inglês FT).

As análises podem se feitas em amostras nos estados: sólido, líquido e gasoso. A

ressalva é que alguns equipamentos dependendo da fase em que a amostra se encontra, é

necessário um pré-tratamento para garantir uma boa resolução espectral e

reprodutibilidade. Com a finalidade de suplantar a necessidade de pré-tratar as amostras

líquidas e sólidas (incluindo amostras de difícil manipulação) surgiu equipamentos de es-

Figura 12: Tipos de vibrações das ligações.

pectroscopia com transformada de Fourier aliada à análise por Reflectância Total Atenuada

(sigla em inglês ATR). Brevemente, O modo em reflectância total atenuada consiste no uso

de um cristal com índice de refração maior do que o da amostra e baixa absorção no

infravermelho, como representado na Figura 13.

Figura 13: Esquema do fundamento da técnica de Espectroscopia de Infravermelho por Reflectância Total

Atenuada (ATR-FTIR).

Fonte: Adaptado da Referência [75].

De acordo com o ângulo de incidência da radiação infravermelha, pode-se obter uma

reflexão considerada completa. A partir desse ângulo crítico o feixe de luz incidente age

como se penetrasse na amostra (gerado a onda evanescente), possibilitando assim medidas

de absorção. O feixe que chega ao detector é atenuado, uma vez que ocorre o fenômeno da

onda evanescente (penetração de 0,5 a 5,0 m) [76-78].

Com base no discutido até aqui, a técnica de ATR-FTIR se torna uma ferramenta

bastante interessante quando se deseja analisar amostras biológicas, já que é menos

predisposta à influência da água. Isso é extremamente relevante, uma vez que as

amostras biológicas apresentam uma porção considerável de água em sua constituição.

A análise de amostras biológicas por meio de técnicas espectroscópicas foi

nomeada bioespectroscopia. Os primeiros trabalhos utilizando essa perspectiva

buscavam por marcadores de doenças (carcinoma de bexiga, carcinoma mamário

humano e fibroadenoma mamário humano). Utilizaram como amostras sangue e tecido

leucêmico e os analisaram via espectroscopia na região do infravermelho [79, 80]. No

trabalho desenvolvido no capítulo 3 utilizamos bioespectroscopia ATR-FTIR para

analisar amostras de S. aureus após exposição aos antimicrobianos NanoAg, DO e o

combinado dos dois.

1.4.2

Fluorescência

Baseia-se num fenômeno denominado luminescência que tem como definição a

emissão espontânea de radiação por uma espécie excitada eletronicamente. Basicamente,

para que tal fenômeno ocorra é necessário que espécies que se encontram em seu estado

fundamental absorvam energia suficiente para que atinjam estados eletrônicos de maior

energia (excitado). Nesse caso, o tipo de radiação a ser absorvida é na faixa do ultravioleta

(> 200 nm) e visível do espectro eletromagnético. Quando tais espécies são moléculas

(especialmente as que possuem estruturas aromáticas, rígidas, planares e que possuem

duplas ligações conjugadas) as transições envolvidas são entre os elétrons não-ligantes

(elétrons do tipo ―n”) e elétrons de ligações  (do tipo n





e 





). Já quando se trata de

nanopartículas metálicas o fenômeno da luminescência está relacionado à presença de

pequenos clusters (aglomerados) de alguns átomos desse metal, que se adsorvem na

superfície da partícula. Em ambos os casos, após o processo de excitação as espécies

voltam ao estado de mais baixa energia emitindo parte da energia (regra de Stokes) que

outrora foi absorvida na forma de luz [81-83].

O fenômeno da luminescência pode ser dividido em fluorescência e

fosforescência. O que diferencia os dois processos é a natureza do estado excitado que a

espécie atinge. No primeiro, o elétron que participa da transição para o estado excitado

conserva a orientação do seu spin prosseguindo emparelhado com o elétron que

permaneceu em seu orbital de origem, gerando o estado excitado do tipo singlete. Já o

segundo caso é quando a orientação do spin do elétron não é conservada, gerando assim

o estado triplete (vide Figura 14).

Figura 14: Representação do estado fundamental e dos estados excitados singleto e tripleto

Fonte: Autor

O diagrama de Jablonski (apresentado na Figura 15) é comumente utilizado para expressar

os processos de excitação e emissão envolvidos no fenômeno da luminescência [84,85].

Figura 15: Diagrama de Jablonski para fluorescência e fluorescência retardada.

Fonte: Autor

Existem diversas técnicas de análise instrumental que utilizam o fenômeno da

fluorescência como base. No trabalho que será apresentado no capítulo 2, utilizamos as

técnicas da microscopia confocal de varredura a laser e citometria de fluxo. Essas técnicas

são bastante utilizadas tanto para a detecção de espécies que possuem auto-fluorescência,

quanto para espécies marcadas com fluoróforo. Quando se fala em metodologia de

―marcar‖ moléculas na área biológica, logo se remete a imuno-histoquímica (IHQ) que

nada mais é do que uma metodologia que se baseia na identificação seletiva de antígenos

(proteínas) em células presentes em uma sessão de tecido. Basicamente, o método é

fundamentado no conhecimento de que anticorpos se ligam de maneira específica a

antígenos. Albert Coons conceituou e implementou tal procedimento pela primeira vez em

1941 [86]. Os ensaios de IHQ são amplamente utilizados no diagnóstico de células

anormais, como as encontradas em tumores cancerígenos. Marcadores moleculares

específicos são característicos de eventos celulares específicos, como proliferação ou

morte celular (apoptose) [87,88]. A IHQ também é vastamente utilizada em pesquisas

básicas com a finalidade de compreender a distribuição e localização de biomarcadores e

proteínas expressas de maneira diferencial em diversas partes de um tecido biológico.

1.4.2.1 Microscopia Confocal

Essa técnica consiste na iluminação de uma amostra com raios de um

determinado comprimento de onda (que sabemos ser na faixa do comprimento da luz

ultravioleta) com o auxílio de um laser. Os dados obtidos originam uma imagem que é o

resultado da emissão de radiação eletromagnética (denominada emissão secundária)

com base no fenômeno da fluorescência que foi apresentado anteriormente. Trata-se de

uma ferramenta de imagem óptica com a finalidade de aumentar a resolução óptica e o

contraste de uma micrografia por meio do uso de um orifício espacial para bloquear a

luz fora de foco na formação de imagens. A captura de várias imagens bidimensionais

em profundidades distintas de uma amostra possibilita a reconstrução de estruturas

tridimensionais (processo conhecido como corte óptico) dentro de um objeto. Esse

processo também conhecido como corte ótico, se faz agrupando esses cortes por fim

resultando numa imagem tridimensional da topografia de objetos complexos. Permite

também a eliminação de informações fora de foco da imagem, o que favorece a análise

de amostras mais espessas, como, estruturas fúngicas, biofilmes bacterianos, tecidos

dentários e dentre outros tipos celulares. A microscopia confocal pode ser empregada

para: (a) observação do estado fisiológico das células e tecidos, (b) construção de

Imagens em 3D, (c) colocalização e (d) observação de células e tecidos marcados com

fluorocromos por imunofluorescência [89, 90]. A última aplicação foi utilizada no

estudo do capítulo 2 desse trabalho, onde foi avaliada por meio da ação da enzima

Caspase-3 que o as NanoAu provocaram preferencialmente um processo apoptótico.

1.4.2.2 Citometria de fluxo

Essa técnica também pode utilizar os princípios do processo de fluorescência,

onde são utilizados marcadores fluocrômicos por meio de ensaios de IHQ. Brevemente,

as células e partículas são analisadas enquanto fluem por meio de uma célula de fluxo

muito estreita. Após ser marcada com um marcador fluorescente que se liga de maneira

específica (vide item 1.4.2 onde se apresentou em que se baseiam os ensaios de IHQ)

aos ácidos nucléicos. Posteriormente a amostra é constantemente transportada para a

célula de fluxo e iluminada por um laser semicondutor, que consegue separar as células

utilizando três sinais diretos que são eles: (a) dispersão frontal de luz (do inglês, forward

scatter ou FSC), (b) dispersão lateral de luz (do inglês, side scatter ou SSC) e (c)

fluorescência lateral (do inglês, side fluorescence ou SFL). Cada um dos sinais fornece

informações distintas, onde FSC indica o volume celular, SSC indica elementos sobre o

conteúdo celular tais como grânulos e núcleos; e a SFL indica de maneira quantitativa

DNA e RNA presentes na célula. Os resultados são expressos por meio de diagramas de

dispersão que agrupam as células com propriedades físico-químicas semelhantes [91,92].

No estudo do capítulo 2, utilizamos o kit Anexina V-FITC como marcadores

fluorescentes e o ensaio apoptótico das células de HT-29 após tratamento com as

NanoAu e cisplatina foi realizado por meio dessa técnica.

1.4.3 Microscopia eletrônica de transmissão (MET)

Esse tipo de microscopia se baseia na passagem de um feixe de elétrons da amostra

que resulta em diversos tipos de espalhamentos. Essa diversidade está relacionada com as

características da amostra. Essa técnica gera como resultado micrografias que nada mais

são do que imagens em escala de cinza, onde as regiões mais claras são referentes aos

elétrons pouco desviados e as mais escuras aos que são refratados [93]. Essa técnica foi

utilizada para avaliação da forma e tamanho médio das nanopartículas obtidas nos dois

estudos que serão apresentados nos capítulos 2 e 3.

1.4.4 Microscopia de contraste de fase

Levando em conta o fato de que as células vivas não tratadas previamente com

marcadores possuem baixa absorção de luz, e que isso leva a diferenças extremamente

pequenas na distribuição de intensidade na imagem tornando-as quase imperceptíveis, ou

invisíveis em um microscópio óptico simples. A microscopia de constraste de fase

(realizado em nosso estudo com um microscopio invertido) surge como alternativa, uma

vez que suplanta as interferências na imagem que são causadas pela proximidade das

densidades ópticas e, índices de refração das diferentes partes do material biológico. Essa

técnica consiste na conversão das diferenças do índice de refração em diferenças de

intensidades que passem a ser visíveis. O que ocorre é que as ondas de luz que atravessam

os componentes celulares (com densidades ópticas diferentes) assim fazem em diferentes

velocidades. Assim, as ondas luminosas que atravessam núcleos, mitocôndrias e inclusões

celulares emergirão em tempos e fases diferentes, de um elemento em relação ao outro

possibilitando a observação. Como resposta tem imagens em escala de cinza [94,95]. No

estudo apresentado no capítulo 2 essa técnica com o objetivo de observar alterações

morfológicas associadas à apoptose nas células de HT-29 .