LUÍS EDUARDO BARBALHO DE MELLO
ESTUDO GENÔMICO PARA IDENTIFICAÇÃO DE LOCI DE RISCO PARA CARCINOMA FAMILIAL NÃO MEDULAR DA TIREOIDE
Tese apresentada ao Programa de Pós-graduação em Ciências da Saúde da Universidade Federal do Rio Grande do Norte como requisito para obtenção do título de Doutor em Ciências da Saúde.
Orientador: Prof. Dr. José Brandão Neto
Coorientadora: Profa. Dra. Janete Maria Cerutti
NATAL/RN 2019
ii Mello, Luís Eduardo Barbalho de.
Estudo genômico para identificação de loci de risco para carcinoma familial não medular da tireoide / Luís Eduardo Barbalho de Mello. - 2019.
49f.: il.
Tese (Doutorado) - Programa de Pós-Graduação de Ciências da Saúde, Centro de Ciências da Saúde, Universidade Federal do Rio Grande do Norte. Natal, RN, 2019.
Orientador: José Brandão Neto.
1. Câncer Papilífero da Tireoide - Tese. 2. Carcinoma familial não medular Tese. 3. Genes Tese. 4. Patogênese -Tese. 5. Prognóstico - -Tese. I. Brandão Neto, José. II. Título. RN/UF/BS-CCS CDU 616.441-006.6
Universidade Federal do Rio Grande do Norte - UFRN Sistema de Bibliotecas - SISBI
Catalogação de Publicação na Fonte. UFRN - Biblioteca Setorial do Centro Ciências da Saúde - CCS
iii
MINISTÉRIO DA EDUCAÇÃO E CULTURA
UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS DA SAÚDE
Coordenadora do Programa de Pós-graduação em Ciências da Saúde Profa. Dra. Ana Katherine da Silveira Gonçalves de Oliveira
iv
LUIS EDUARDO BARBALHO DE MELLO
ESTUDO GENÔMICO PARA IDENTIFICAÇÃO DE LOCI DE RISCO PARA CARCINOMA FAMILIAL NÃO MEDULAR DA TIREOIDE
Aprovada em 19/07/2019
Banca examinadora:
Presidente:
Prof. Dr. José Brandão Neto (UFRN)
Membros internos:
Profa. Dra. Tirzah Braz Petta Lajus (UFRN)
Profa. Dra. Ana Katherine da Silveira Gonçalves de Oliveira (UFRN)
Membros externos:
Profa. Dra. Adriana Bezerra Nunes (UFPB) Profa. Dra. Ana Maria de Oliveira Ramos (UnP)
v
RESUMO
A incidência de carcinomas diferenciados da tireoide no Rio Grande do Norte, Brasil, é relativamente elevada. Casualmente, observamos uma destacada ocorrência de casos de carcinomas papilíferos em membros de mesmas famílias identificados em nossa casuística, a partir de observações clínicas de rotina. Em algumas famílias detectamos três ou mais casos de carcinomas papilíferos diagnosticados entre pacientes de primeiro e segundo grau de parentesco. Assim, decidimos aprofundar o estudo no que se refere à etiopatogenia desses tumores com o objetivo de estabelecer se há alguma expressão coincidente entre essas pessoas, que possa justificar tal prevalência e traçar um perfil clínico e genético a partir da análise do sequenciamento do exoma por meio do estudo do DNA extraído de coletas de amostras sanguíneas desses pacientes e de seus familiares. Constatamos que o sequenciamento do exoma realizado na família IV, portadora de Câncer Familiar de Tireoide Não Medular, em quatro pacientes afetados com carcinoma papilífero da tireoide em três gerações consecutivas, identificou uma mutação no gene X, quando ocorreu a substituição de adenina por citosina (A>C) no exon X. E esta alteração de nucleotídeos causou o deslocamento de isoleucina para metionina na posição X (p.xM). Esta variante foi classificada como deletéria e provavelmente prejudicial. Este gene X é um componente importante da membrana basal e evidências científicas mostraram que ele tem função relacionada à migração, invasão e progressão tumoral. Com a informação fornecida pelo sequenciamento genético de nova geração, apontando genes associados ao carcinoma diferenciado da tireoide, será possível o aperfeiçoamento do diagnóstico, condução do tratamento e rastreamento de membros familiares afetados por doença nodular tireoideana, impactando nos diversos índices de aferição de resultados de promoção da saúde. Este projeto é original uma vez que aborda um tema de investigação ainda não esclarecido na literatura e inédito no nosso país.
Palavras-chave: carcinoma familial não medular, carcinoma papilífero, genes, patogênese, prognóstico.
vi
ABSTRACT
The incidence of thyroid differentiated carcinomas in Rio Grande do Norte, Brazil, is relatively high. Incidentally, we observed a prominent occurrence of cases of papillary carcinomas in members of the same families identified in our series, based on routine clinical observations. In some families we have detected three or more cases of papillary carcinoma diagnosed among first and second degree, kinship patients. Thus, we decided to deepen the study regarding the etiopathogenesis of these tumors in order to establish if there is any coincident expression among these people, which may justify such prevalence and draw a clinical and genetic profile from the analysis of exome sequencing through from the study of DNA extracted from blood samples collected from these patients and their families. We found that exome sequencing performed in family IV, with non-medullary thyroid cancer, in four patients with papillary thyroid carcinoma in three consecutive generations, identified a mutation in the gene X, when adenine was replaced by cytosine (A> C) in exon X. And this nucleotide change caused the shift from isoleucine to methionine at position X (p.xM). This variant was classified as deleterious and probably harmful. This gene X is an important component of the basement membrane and scientific evidence has shown that it has a function related to migration, invasion and tumor progression. With the information provided by the new generation genetic sequencing, pointing out genes associated with differentiated thyroid carcinoma, it will be possible to improve the diagnosis, treatment management and screening of family members affected by thyroid nodular disease, impacting the various indexes of measurement of the results health promotion. This project is original as it addresses a research topic not yet clarified in the literature and unpublished in our country.
Keywords: non-medullary familial carcinoma, papillary carcinoma, genes,
vii LISTA DE ABREVIATIURAS E SIGLAS
CNMT - Carcinoma Não Medular da Tireoide
CFNMT - Carcinoma Familial Não Medular da Tireoide CPT - Carcinomas Papilíferos de Tireoide
SRGAP1 - SLIT-ROBO Rho GTPase Activating Protein FOXE1 - Forkhead Box E1
SRRM2 - Serine/Arginine Repetitive Matrix 2 NKX2.1 - NK2 Homeobox 1
MNG1 - Multinodular goiter 1
TCO - Thyroid carcinoma, nonmedullary, with cell oxyphilia fPTC/PRN - Familial PTC with PRN
PTEN - Phosphatase and tensin homolog NMTC1 - Nonmedullary Thyroid Carcinoma 1
hTERT - Transcriptase reversa da telomerase humana APC - Adenomatous Polyposis Coli
TSHR - Thyroid stimulating hormone receptor
BRAF - Human gene that encodes a protein called B-Raf
RAS - A family of genes that make proteins involved in cell signaling pathways that control cell growth and cell death
TTF2 - Transcription termination factor 2 WSG - Whole Genome Sequencing
SisGen – Sistema Nacional de Gestão do Patrimônio Genético e do Conhecimento Tradicional Associado
viii LISTA DE FIGURAS
Figura 1. Eletroferograma do sequenciamento do gene HABP2 G534E encontrada em quatro pacientes.
Figura 2. Esta figura divide a análise bioinformática em três etapas: primeira etapa - geração das reads com seu score de qualidade; segunda etapa – alinhamento das reads contidas no arquivo FASTQ ao genoma humano de referencia (hg19); terceira etapa – anotações das variantes do arquivo VCF, usando diferentes bancos de dados, para identificação da frequência na população.
ix LISTA DE TABELAS
x SUMÁRIO 1 INTRODUÇÃO ... 11 2 JUSTIFICATIVA ... 14 3 OBJETIVOS ... 15 3.1 Objetivo geral ... 15 3.2 Objetivos específicos ... 15 4 MÉTODOS ... 16
4.1 Caracterização dos pacientes ... 16
4.2 Considerações éticas ... 16 4.3 Critérios de Elegibilidade ... 16 4.4 Local de estudo... 16 4.5 Ato cirúrgico ... 17 4.6 Heredograma ... 17 4.7 Avaliação histopatológica ... 17
4.8 Amostra sanguínea dos pacientes ... 17
4.8.1 Extração de DNA ... 17
4.8.2 Análise de ligação com marcadores polimórficos... 18
5 ARTIGOS PRODUZIDOS ... 20
6 COMENTÁRIOS, CRÍTICAS, SUGESTÕES E CONCLUSÕES ... 30
REFERÊNCIAS ... 42
APÊNDICE 1 ... 46
1 INTRODUÇÃO
O câncer é um problema de saúde pública no mundo, espera-se que até 2020 o impacto dessa doença na população mundial corresponda a mais de 17 milhões de casos, dos quais mais 342 mil deverão ser câncer de tireoide1.
Constitui-se em uma das neoplasias malignas endócrinas mais comuns, representando cerca de 95% delas2. A incidência de câncer de tireoide está aumentando em todo o mundo e, nos EUA, quase triplicou nos últimos 30 anos2,3. O Carcinoma Não Medular da Tireoide (CNMT) representa mais de 95% dos cânceres tireoidianos, dos quais 8% são familiares4. Este tipo de câncer tem origem folicular e são compostos em sua grande maioria, de carcinomas papilíferos (85%), seguidos dos carcinomas foliculares (11%), células de Hürthle (3%) e anaplásticos (1%). Os 5% restantes dos cânceres de tireoide, são constituídos do carcinoma medular, que surgem das células C parafoliculares5.
No Brasil, para o biênio 2016-2018, aponta-se a ocorrência de cerca de 600 mil casos novos de câncer, esperando-se que destes, 6.960 sejam câncer de tireoide, com um risco estimado de 1,08 casos a cada 100 mil homens e 5,70 casos a cada 100 mil mulheres. Na região Nordeste, se não considerarmos os tumores de pele não melanoma, o câncer de tireoide é o 13º que mais afeta homens e o 6º mais frequente em mulheres, e no estado do Rio Grande do Norte, atinge 30 homens e 130 mulheres a cada 100 mil habitantes6.
O CNMT mostra hereditariedade significativa, com um risco aumentado de 8 a 10 vezes em parentes de primeiro grau de indivíduos afetados7. Há relato de que o câncer de tireoide não medular não-sindrômico, representa cerca de 3,5-10% de todos os CNMT8. O Carcinoma Familial Não Medular da Tireoide (CFNMT), não sindrômico é definido pela presença de câncer de tireoide de origem celular folicular em dois ou mais parentes de primeiro grau, na ausência de uma síndrome de câncer familiar reconhecida e de fatores ambientais associados com o desenvolvimento dos carcinomas da tireoide9. Tanto a forma familiar como a esporádica, é mais comum nas mulheres do que nos homens10.
O primeiro relato de CFNMT foi reportado por Robinson e Orr (1955)11, os quais descreveram dois gêmeos de 24 anos de idade com Carcinomas Papilíferos de Tireoide (CPT). É descrito na literatura que, famílias com três ou mais membros afetados com CFNMT, a probabilidade de possuir este traço familiar é de 96%, com predomínio do CPT12. Há relatos de que ocorrem mais precocemente e de que seriam mais agressivos dos que os tumores bem diferenciados não hereditários. O CPT cursaria com multifocalidade, elevadas taxas de extensão extratireoideana e metástases linfonodais12,13. Consequentemente, os pacientes teriam menor sobrevida livre de doença do que aqueles com doenças esporádicas. Alguns estudos apontam que pacientes com CFNMT podem apresentar maior risco para o desenvolvimento de câncer de mama, rim, cólon, bexiga, melanoma e linfomas14.
A distinção entre as formas esporádica e familial é complexa, pois os tumores esporádicos e familiares são histologicamente indistinguíveis e os genes responsáveis pela grande maioria dos casos de CFNMT ainda não foram identificados.
À despeito de parecer evidente que há uma base hereditária para o CFNMT não sindrômico, até recentemente, nenhuma mutação genética específica foi descoberta com um papel confirmado na etiologia15. Estudos que investigam a base do CFNMT identificaram, até o momento, os genes de susceptibilidade, SRGAP1 (SLIT-ROBO Rho GTPase Activating Protein 1),
FOXE1 (Forkhead Box E1), SRRM2 (Serine/Arginine Repetitive Matrix 2) e NKX2.1 (NK2 Homeobox 1)16,17,18. Também foram identificados vários loci cromossômicos candidatos à susceptibilidade, potenciais regiões que possam abrigar genes associados ao CFNMT: locus 14q31 (MNG1 [MIM 138800]), onde se localiza o gene do receptor de hormônio tireoestimulante19; locus 19p13.2 (TCO [MIM 603386]) que poderia estar associado apenas a tumores da tireoide com células oxífilas (TCO)20; locus 1q21 (fPTC/PRN [MIM 605642])21; 8p23.1–p2211 PTEN22; locus 2q21 (NMTC1 [MIM 606240])23; complexo telômero-telomerase, onde um estudo verificou diminuição significativa no tamanho dos telômeros e, maior atividade e expressão da transcriptase reversa da telomerase humana (hTERT) em pacientes portadores de CPT familial quando comparado aos CPT esporádicos24,25,26,27.
A herança genética do CFNMT permanece desconhecida, mas em análises descritas em famílias acometidas relatadas na literatura, acredita-se que a doença apresenta padrão autossômico dominante, com penetrância variável, mas o modo exato de herança permanece desconhecido21,28. Alternativamente, o CFNMT pode ser uma doença poligênica causada por um número baixo a moderado de alelos de baixa penetração7.
Alguns genes sabidamente associados à patogênese dos carcinomas bem diferenciados da tireoide já foram excluídos como causadores do CFNMT. Entre estes, os supressores de tumor APC (Adenomatous Polyposis Coli) associado à polipose adenomatosa familiar ou síndrome de Cowden e a síndrome de Gardner e PTEN (Phosphatase and Tensin Homolog) associado à síndrome de Cowden20,23,29,30. Mutações no locus do gene TSHR foram encontradas em adenomas tiroidianos esporádicos25,30, mas não associadas ao CFNMT20,30,31.
Por outro lado, foram identificadas mutações somáticas no gene
BRAF (B-Raf proto-oncogene, serine/threonine kinase MIN 164757) e nos
genes da família RAS (HRAS, KRAS e NRAS). Cavaco et al. (2008)32 identificaram mutações somáticas em 53% dos CPT pertencentes a 27 pacientes com CFNMT. A mutação V600E no gene BRAF foi identificada em 41% (9/22) dos casos e mutações nos genes RAS em 23% (5/22) dos casos. Recente estudo feito por Na et al. (2012)33 mostraram a avaliação de 29 tumores de CFNMT e 34 tumores esporádicos de CPT. Embora as casuísticas analisadas tenham sido variadas e os resultados ambíguos, os autores demonstraram que o CFNMT não parece ser causado por uma mutação somática no gene BRAF ou nas isoformas do gene RAS. Importante, mutações germinativas nestes genes não foram identificadas nos pacientes, afastando a hipótese que estes genes possam estar associados aos casos de CFNMT. Reforçando a hipótese de que mutações nestes oncogenes não seria o evento genético responsável pela suscetibilidade ao CFNMT. Mutações no gene BRAF não foram identificadas nos 40 casos pertencentes em 23 famílias analisadas34. Os autores sugerem que as mutações somáticas identificadas neste gene podem estar associadas à progressão tumoral.
Recentemente, três estudos Genome Wide Association (GWA) demonstraram relação de transcription termination factor 2 (TTF2) e FOXE1,
com o aumento do risco de carcinoma de tireoide na população do Reino Unido, Japão e Islândia25,35,36. E também numa série de casos de carcinomas papilíferos ocorridos na população vítima de radiação da Bielorrússia37.
Somente um amplo estudo do exoma por meio de sequenciamento gênico, poderá estabelecer alguma correlação clínico-patológica com as informações genéticas. Portanto, é necessário o aprofundamento de análises genéticas que possam contribuir com a identificação de genes diretamente relacionados com essa doença, auxiliando no diagnóstico e aconselhamento familiar, dada a alta prevalência em nosso meio.
2 JUSTIFICATIVA
Carcinoma Familial Não Medular da Tireoide (CFNMT) não sindrômico é definido pela presença de câncer de tireoide de origem celular folicular em dois ou mais parentes de primeiro grau, na ausência de uma síndrome de câncer familiar reconhecida e de fatores ambientais associados com o desenvolvimento dos carcinomas da tireoide.
Como forma de tratamento, os indivíduos são submetidos à tireoidectomia total, o que justifica a necessidade de realizar análise de segregação da mutação nos familiares por meio das técnicas de biologia molecular, objetivando responder questões frequentemente suscitadas por indivíduos portadores dessa doença e sugerir orientações, incluindo o aconselhamento terapêutico, pois não se encontra abordagem dessa natureza descrita na literatura médica.
Ademais, não está bem definido se esses casos cursam com pior prognóstico do que os carcinomas não familiares. Se houver confirmação, es nacional.
15
3 OBJETIVOS
3.1 Objetivo geral
Traçar o perfil genético de pacientes com Carcinoma Familial Não Medular de Tireoide assistidos na Cidade de Natal/RN.
3.2 Objetivos específicos
• R ;
• I loci de suscetibilidade ao CFNMT já descritos na literatura e exames histopatológicos dos casos;
• S é averiguação por meio de WSG (Whole Genome Sequencing).
4 MÉTODOS
4.1 Caracterização dos pacientes
Foram estudados indivíduos com diagnóstico confirmado de CFNMT e que apresentam pelo menos três casos confirmados de doença em familiares de primeiro grau.
4.2 Considerações éticas
Os participantes foram informados sobre sua participação voluntária por meio de um Termo de Consentimento Livre e Esclarecido, constando dados sobre a pesquisa, assim como os riscos e benefícios. Os participantes foram entrevistados conforme a ficha de coleta de dados para levantamento de dados clínicos. O projeto foi aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa da Liga Norte Riograndense contra o Câncer, parecer consubstanciado nº. 860.934, CAAE 36183214.0.0000.5293 (Apêndice 1). Adicionalmente, este projeto foi cadastrado no Sistema Nacional do Patrimônio Genético e do Conhecimento Tradicional Associado (SisGen - AA46A4F) (Apêndice 2).
4.3 Critérios de Elegibilidade
Os participantes foram distribuídos em dois grupos distintos: (1) afetados e (2) controle.
No grupo afetados foram incluídos todos os indivíduos submetidos à tireoidectomia por CFNMT no período compreendido entre janeiro/1996 e dezembro/2017 e estes foram recrutados na Clínica de Cirurgia de Cabeça e Pescoço - Natal/RN.
No grupo controle, foram incluídos os familiares de primeiro grau não afetados pelo câncer. Estes foram convidados a participar do estudo por intermédio do parente correlato participante do grupo afetado.
Foram incluídos participantes sem distinção de sexo, cor ou idade. Não houve critérios de exclusão para este estudo.
4.4 Local de estudo
A centralização do estudo encontra-se na Clínica de Cirurgia de Cabeça e Pescoço - Natal/RN. Assim, a avaliação de dados
clínico-17 epidemiológicos continua sendo mantida, em entrevistas com os pacientes, pelo Dr. Luís Eduardo Barbalho de Mello e os dados de prontuários anotados em formulários específicos para esse fim e mantidos em sigilo. Em seguida, todos os dados são informatizados em um banco de dados, o qual é mantido atualizado permanentemente. As coletas sanguíneas continuam sendo coletadas no local de estudo ou nas residências dos pacientes, a maioria no interior do Estado. Posteriormente, são feitas a separação e estocagem do material biológico.
4.5 Ato cirúrgico
O ato cirúrgico continua sendo realizado em parceria com a Liga Norte Riograndense Contra o Câncer, Natal/RN.
4.6 Heredograma
Elaborado pela doutoranda Thaise Nayane Ribeiro Carneiro e pós-doutoranda Camila Xavier Alves, utilizando-se do software HaploPainter (http://haplopainter.sourceforge.net/index.html), sob a supervisão da coorientadora Profa. Dra. Janete Maria Cerutti, Laboratório As Bases Genéticas dos Tumores da Tireoide – UNIFESP.
4.7 Avaliação histopatológica
A coleta de lâminas e blocos de parafina, com respectivos laudos para confirmação diagnóstica de CFNMT, continua sendo realizada no Laboratório Médico de Patologia Dr. Getúlio de Oliveira Sales, Natal/RN. Todos os exames patológicos continuam sendo realizados pelo mesmo observador, Dr. Alexandre de Oliveira Sales.
4.8 Amostra sanguínea dos pacientes
4.8.1 Extração de DNA
A extração de DNA e análises continuam sendo feitas no Laboratório As Bases Genéticas dos Tumores da Tireoide – Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP).
O DNA é extraído de sangue periférico dos pacientes, com a utilização do kit Gentra Puregene Blood (Qiagen, Dusseldorf, Germany), de acordo com indicações do fabricante. O protocolo descrito abaixo é para purificação de DNA genômico a partir de amostras de 3 mL de sangue. O protocolo é ajustado para 1 mL de sangue total.
As amostras de 3 mL de sangue são misturadas com 9 mL do RBC
Lysis Solution, por inversão, incubadas por 5 min e centrifugadas por 2 min a
2000 x g para agregar as células brancas (pellet). O sobrenadante é descartado deixando apenas 200 µL do líquido e o pellet ressuspendido no líquido residual por agitação no vortex. À amostra são adicionados 3 mL do tampão Cell Lysis Solution que é agitada por 10 seg no vortex e, em seguida, 1 mL de Protein Precipitation Solution com agitação de 20 seg novamente no
vortex. O tubo é agitado por 5 min a 2000 x g para formação de pellet de
proteína. Em um tubo limpo serão pipetados 3 mL de isopropanol e adicionado o sobrenadante gerado na centrifugação. A solução é misturada até que o DNA esteja visível e em seguida realizada a centrifugação por 3 min a 2000 x g para a formação do pellet de DNA. O sobrenadante será descartado, e em seguida são adicionados 3 mL de etanol 70% para lavar o pellet de DNA. A solução é centrifugada por 1 min a 2000 x g e o sobrenadante descartado. Ao pellet de DNA são adicionados 250 µL de DNA Hydratation Solution. O tubo é incubado a 65 °C por 1 h para dissolver o DNA, e incubado overnight, em temperatura ambiente, com agitação suave. As amostras são brevemente centrifugadas e transferidas para tubos de armazenamento. Uma alíquota da amostra é quantificada e avaliada quanto ao grau de pureza, utilizando um espectrofotômetro (NanoDrop, Thermo Scientific 2000, FL, USA).
4.8.2 Análise de ligação com marcadores polimórficos
Para analisar esses dados, as reads geradas no sequenciamento são as raw reads e, sob essa denominação se apresentam na forma bruta; elas são então mapeadas/alinhadas contra um genoma de referência (hg19), processo para encontrar a posição da read sequenciada no genoma de referência. Antes do mapeamento, ferramentas como o FASTX-toolkit ou Trimmomatic são utilizadas para descartar reads e bases de baixa qualidade e, também, para remover os adaptadores.
19 Dois algoritmos são utilizados para fazer predição do potencial patogênicos das variantes detectadas no sequenciamento: o primeiro deles, o
SIFT Prediction, o qual verifica se a substituição/perda/inserção de nucleotídeo
(s) da variante não sinônima detectada afeta a função da proteína; essa ferramenta se baseia na homologia da sequência, propriedades físicas e conservação do(s) aminoácido(s) afetados pela alteração. O segundo é o
PolyPhen-2, que prediz o impacto de substituição/perda/inserção de
nucleotídeo(s) da variante em questão na estrutura e função da proteína, considerando para isso as propriedades físicas.
As variantes também são selecionadas com base em qualidade e cobertura. Na filtragem de qualidade são utilizados alguns scores, como o
Phred quality score e o genotype quality, ambos em escala logarítmica e que
estimam, respectivamente, as probabilidades do sequenciamento da base e do genótipo estarem corretos. As variantes com um phred score ≥ 20 à probabilidade de 1 base errada a cada 1000 sequenciadas ou uma acurácia de 99,9%; genotype quality ≥ 20 corresponde a uma probabilidade de 99,9% do genótipo estar correto. Com relação a cobertura, as variantes com menos de 10 reads são eliminadas.
Antes de aplicar os filtros, as variantes detectadas nos indivíduos de uma família são unidas em um único arquivo, e após o processo de filtragem descrito acima, são selecionadas aquelas variantes que estão presentes nos afetados, e não estão presentes nos controles, considerando assim a possibilidade de mutações de novo como causadoras daquele quadro clínico; e também são selecionadas mutações recessivas (homozigose e heterozigose composta) nos afetados que podem ser consideradas como causativas daquele fenótipo, as quais devem estar possivelmente presente nos controles (um alelo mutado), caracterizando-os como portadores. Na análise de bioinformática, foi utilizada a anotação Hg19 do genoma humano.
5 ARTIGOS PRODUZIDOS
5.1 O ―The G534E variant in HABP2 is not associated with increased risk of familial nonmedullary thyroid cancer in Brazilian Kindreds‖ Clinical Endocrinology que possui fator de impacto 3.487 Q 2 P S II. 10.1111 .13352
5.2 O ―Whole exome identifies novel susceptibility gene associated with
familial non-medulllary thyroid carcinoma‖ á em fase de elaboração e será
submetido ao The New England Journal of Medicine que possui fator de impacto 79.258 Q 1 P S II.
Rascunho do manuscrito
Title: Whole exome identifies novel susceptibility gene associated with familial
non-medulllary thyroid carcinoma
Luis Eduardo Barbalho de Mello1,2, Thaise Nayane Ribeiro Carneiro1, Pedro Alexandre Favoretto Galante3, Aline Neves Araujo1, Vanessa Candiotti Buzatto4, Camila Xavier Alves1,5, Karina Marques Vermeulen2, Sancha Helena de Lima Vale2,6, Maria das Graças Almeida2,7, Fernando José de Pinto Paiva1,2, José Brandão-Neto2,8 and Janete M Cerutti1
1
Genetic Bases of Thyroid Tumors Laboratory, Division of Genetics, Department of Morphology and Genetics, Escola Paulista de Medicina, Universidade Federal de São Paulo, São Paulo, Brazil;
2
Postgraduate Program in Health Sciences, Center for Health Sciences, Federal University of Rio Grande do Norte, Natal, RN, Brazil;
3Department of Bioinformatics, Sírio-Libanês Hospital, São Paulo, SP, Brazil; 4Postgraduate Program in Health Sciences, Sírio-Libânes Hospital, Laboratory of Bioinformatics, São Paulo, SP, Brazil;
5
Postgraduate Program in Pharmaceutical Sciences, Center for Health Sciences, Federal University of Rio Grande do Norte, Natal, RN, Brazil;
6
Department of Nutrition, Center for Health Sciences, Federal University of Rio Grande do Norte, Natal, RN, Brazil;
7
Department of Clinical and Toxicological Analyses, Center for Health Sciences, Federal University of Rio Grande do Norte, Natal, RN, Brazil;
8
Department of Internal Medicine, Center for Health Sciences, Federal University of Rio Grande do Norte, Natal, RN, Brazil.
23
Abstract
The detection of gene and susceptibility loci associated with Familial Non Medular Thyroid Cancer (FNMTC) is greatly important for molecular diagnosis, prevention, appropriated clinical treatment, and genetic screening for family relatives. Whole exome sequencing was performed in a family with FNMTC, four patients affected with thyroid papillary microcarcinoma in three consecutive generations without any syndromic symptom associated. We identify a mutation in the gene X, the nucleotide change leads to amino acid shift of isoleucine into methionine in the position X (p.xM). This variant was classified as deleterious by SIFT (score 0.02) and probably damaging by PolyPhen2 (score 0.98). The gene is an important component of the basement membrane, which is essential to maintain the cellular phenotype, tissue compartmentalization and contribute to . R ’ w function of gene X as migration, invasion and tumour progression. Our study supports that gene X may play a role as predisposing gene in FNMTC.
Introduction
The prevalence of thyroid cancer is steadily rising1. Sporadic nonmedullary thyroid cancer accounts for nearly 90% of the cases and familial nonmedullary thyroid (FNMTC) cancer occurs in nearly 3-9% of thyroid cancer cases. FNMTC is defining as two or more first-degree relatives diagnosed as thyroid cancer of follicular cell origin without another familial syndrome. Importantly, the risk that the patient displays a familial syndrome increases to > 95% when there are three or more affected family members.2,3
Nearly 90% of FNMTC are papillary thyroid carcinomas (PTC), followed by follicular thyroid cancer (FTC), undifferentiated thyroid cancer (UTC) and Hurthle cell carcinoma (HCC).2 The large majority (95%) of FNMTC are non-syndromic, with very few susceptibility genes described in the last decade. However, as studies about FNMTC accumulate, candidate chromosomal loci and predisposition genes have been recently unveiled including SRGAP14, NKX2.15, FOXE16, HAPB27 and telome-relomerase complex8 and MAP2K59.
We have recently showed no cosegregation of HABP2 G534E variant with the disease in 16 families with 3 or more first or second-degree relatives
with PTC, suggesting that in these families other susceptibility genes might be involved.10
As FNMTC is associated with more aggressive disease and shorter disease-free survival, the detection of gene and susceptibility loci is of greatly importance, as they will certainly help genetic test of family members, appropriate surveillance, prophylactic surgery and genetic counselling.11
Whole exome sequencing (WES) approaches has been used to systematically investigate genetic mutations associated with sporadic or hereditary cancer and, therefore, to identify driver mutations that may help cancer diagnosis.12
We here used a WES to investigate germline variants that could be associated with cancer risk in a family with a positive history of PTC. This family studied, originated from Rio Grande do Norte state (Brazil), and had a history of PTC. The four patients were affected with thyroid papillary microcarcinoma in three consecutive generations without any syndromic symptom associated.
Materials and Methods
Patients
The proband and other four family members affected by non-medullary papillary thyroid cancer documented by thyroidectomy and pathological analysis were submitted to whole exome sequencing (II-7, II-10, III-2, IV-2). Whole exome analysis was performed in additional family members diagnosed with adenomatoid nodule (IV-3) and normal control (III-1) (Figure 1). For validation analysis, DNA obtained from 39 probands and affected members from 16 non-related Brazilian families with FNMTC and 35 non-affected members the same geographic region.
25
Figure 1. a) Genetic Pedigree of the family with a positive history of papillary thyroid carcinoma.
Black symbols indicated the affected individuals and the grey symbolized the patient with adenomatoid nodule. b) Sanger sequencing validation shows that in this family the gene 1 mutation segregates with the disease. All affected members showed the nucleotide change (A/C) proved. The V-1 (3-year child), daughter of patient IV-2 harbour the same gene 1 mutation saw in all affected. No mutation was found in the family member with benign lesion (IV-III) and non-affected member (IV-1).
DNA extraction
Genomic DNA from peripheral blood samples was extracted, according to phenol:chloroform protocol as previously described (de Mello et al., 2017). For extraction of genomic DNA paraffin-embedded tissues we used the DNA FFPE Tissue kit from QIAGEN (São Paulo, SP, Brazil).
Whole Exome Sequencing
DNA samples were diluted according to protocol and submitted to enzymatic fragmentation. Exome library was constructed using SureSelect human all exons v6 kit from Agillent Technologies, Inc. (Santa Clara CA, USA). The fragments were blunt-ended and adapters were added to both ends of the fragments. The library was hybridized with biotinylated RNA library for exon enrichment and for the capture was used streptavidin coated with magnetic beads, and nonhybridized fragments were washed out. After quality control, the captured library was sequenced on Hiseq2000 platform (Illumina, San Diego, CA, USA). The sequencing was paired-end.
a)
b)
III- 1
IV- 3
II- 7
II- 10
III- 2
IV- 2
V- 1
Mapping and variants annotation
The raw reads were aligned to the NCBI human reference genome (GRCh37/hg19) using Burrows-Wheeler Aligner (BWA-MEM). Duplicates were
marked by Picard MarkDuplicates v.2.17.6
(http://broadinstitute.github.io/picard/). SNV (single nucleotides variants) and indels were called using Genome Analyses Toolkit (GATK) with default parameters. SNVs and indels were annotated using ANNOVAR. The frequency of the variants was annotated using ExAC database, only the ones considered y ( ≤0.05) passed the filter. We also considered y w ≥10 y y ≥ 20 give an accuracy of more than 99%. After filtering process we look for recurrent variants among those with the thyroid cancer phenotype, using as control those of the same family that had not any thyroid alterations. Besides ExAC, we also used ABRAOM (Online Archive of Brazilian Mutations) to access the frequency of our mutations in a Brazilian cohort. The first cohort of this database contains exomic variants of 609 elderly individuals from a census-based sample from the city of São Paulo.13 The pathogenicity prediction was made using two algorithms: SIFT and PolyPhen2.
Validation
Candidate variant was validated in all family members by Sanger sequencing. Primers were designed using Primer3 (v.0.4.0) to amplify target region flanking mutation site. PCR products were sequenced on ABI x (Applied Biosystems, Waltham, MA, USA). Additionally, the mutation was validated in over 100 patients found in exome analysis in a larger cohort with controls and affected patients by analyzing the peripheral blood DNA.
Results and Discussion
In this family we identify a substitution of adenine to cytosine (A>C) in the exon X of gene X, already described by dbSNP. The nucleotide change leads to amino acid shift of isoleucine into methionine in the position X (p.xM). This variant was classified as missense with the frequency of 0.000098 according to ExAC database. We looked for the frequency of this alteration on ABraOM
27 database (Online Archive of Brazilian Mutations), which repository contains genomic variants of Brazilians. The frequency of A/C change in gene X was 0.000821 in this database. The mutation was classified as deleterious by SIFT (score 0.02) and probably damaging by PolyPhen2 (score 0.98).
The gene X mutation was present only in the four patients with PTC (II-7, II-10, III-2, IV-2), while it was absent in the patient with benign lesion (IV-3) and family member not affect with thyroid disease (III-1). Sanger sequencing analysis confirmed the results obtained from the exome analyses.
Interestingly, the DNA of the non-affected 3 years old female (V-1) was evaluated for the presence of the mutation, as her father was diagnosed with PTC and harboured the mutation in gene X. The result of Sanger sequencing for this possible pathogenic variant was positive for the child (Figure 1). The thyroid tissue of IV-2 was disponible so it was check for the presence of the mutation, with positive result. No mutation in gene X was found in over 70 non-related FNMTC and controls (Figure 1).
The online software HOPE (http://www.cmbi.ru.nl/hope/method/) was used to verify the effect of amino acid change in the protein (p.xM). Hope showed that the original wild-type residue and newly introduced mutant residue often differ in size, charge, and hydrophobicity-value properties. Methionine is bigger than isoleucine. The mutation introduces an amino acid with different properties, which can disturb this domain and abolish its function. The residue is buried in the core of a domain (Figure 2a-b). The differences between the wild-type and mutant residue might disturb the core structure of this domain. Pspired (http://bioinf.cs.ucl.ac.uk/psipred/) was used to show if the new amino acid will change the protein secondary structure.
Figure 2: 3D protein simulation was made by HOPE (cmbi.ru.nl/hope). a) Exact location of our
mutated residue is coloured magenta. The wild-type aminoacid (isoleucine) and the mutant (methionine) differ in their hydrophobic and charge propriety, the mutant residue is bigger than the wild-type residue. b) Close up of the mutation. The protein is grey and the side chains of both wild-type and mutant aminoacid are coloured green and red respectively.
In conclusion, in this study we described the presence of a specific mutation in gene X classified as pathogenic be predictors algorithms, which leads. This alteration was only detected in all patients with PTC. Gene X mutation is a candidate for predisposing gene for FNMTC. Thus the mutation in the aminoacid (p.xM) found in gene X, in this family, probably alter the gene/protein normal function. We are currently doing additional functional studies to evaluate the specific function of this alteration in thyroid cancer.
Acknowledgments
This work was supported by grants from the São Paulo Research Foundation (FAPESP—2014/06570-6).
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6 COMENTÁRIOS, CRÍTICAS, SUGESTÕES E CONCLUSÕES
No decorrer do curso, acredito que houve apreciável evolução dos meus conhecimentos. Minhas atribuições se ampliaram, o que só fez aumentar cada vez mais meu conteúdo teórico-prático, respaldando-me para a continuação da pesquisa e dos seus resultados aplicá-los à prática médica e à divulgação nacional e internacional mediante publicações e congressos.
O presente projeto foi realizado com a participação de vários acadêmicos, por exemplo, médicos, nutricionistas, biólogos geneticistas, técnicos de enfermagem e estatista. Esta interdisciplinaridade foi inovadora para o meu desenvolvimento acadêmico uma vez que não havia ainda vivenciado este tipo envolvimento.
Assim, desde meu ingresso no PPGCSA, tenho me empenhado para o meu crescimento científico, procurando diferentes formas de participação: 1. Publicação de artigos; 2. Congressos nacional e internacional; 3. Conferências e palestras; 4. Apresentação de trabalhos.
Artigo publicado
1 de Mello LEB, et al. The G534E variant in HABP2 is not associated with increased risk of familial nonmedullary thyroid cancer in Brazilian Kindreds. Clin Endocrinol 2017;87:113–114.
Artigo em preparação
1 de Mello LEB, et al. Whole exome identifies novel susceptibility gene associated with familial non-medulllary thyroid carcinoma. Será submetido ao N Engl J Med 2019.
Participação em Congresso
1 1er Congreso Internacional AACCyC-IAOO. Cabeça e Pescoço. 2017. 2 3rd World Congress on Thyroid Cancer. 2017.
31 3 V Congresso da Liga Contra o Câncer. Câncer de cabeça e pescoço.
2017.
4 XVI Latin American Thyroid Congress. Kocher Lecture. 2017.
5 XXVI Congreso Argentino de la AACCyC. Cabeça e Pescoço. 2017.
6 XXXII Congresso Brasileiro de Cirurgia. Arena temática cirurgia de cabeça e pescoço - módulo II - tratamento e acompanhamento - com o tema discussão de casos. 2017.
7 V Congresso Ítalo Brasileiro de Cirurgia de Cabeça e Pescoço. Presidente. 2016.
8 XIV Congresso Norte-Nordeste de Otorrinolaringologia. Traqueostomias. 2016.
9 I N ā x S ú (N XS ) 7 Internacional Conference of Nutritional Oncology (ICNO) / Congresso B N ā ( BN ) G N PÃO. 2016. ( ).
Participação em Encontro
1 Jornada Avançada em Craniossinostoses e Anomalias Congenitas. Reconstrução Craniana. 2017.
2 IFHNOS World Tour - Conceitos Atuais em Cirurgia de Cabeça e Pescoço. Minimally Invasive Surgery. 2016.
3 II Encontro Nacional de Conselhos de Medicina. 2016.
4 VI Thyroid Cancer International Meeting. Recurrent goint: not just "another lump in the neck". 2016.
Participação em Simpósio
1 Pre Congress Course - US course in the XVI Latin American Thyroid Congress. 2017.
Participação em Oficina
1 Simpósio Marx in Rio 2017 - Atualização em Patologia Cirúrgica dos Maxilares. Pathology 1. 2017.
2 V Curso de Atualização em Oncologia Oral. Sarcomas em cabeça e pescoço. 2017.
3 Curso de Mapeamento dos Pares Cranianos em Cirurgia de Cabeça e Pescoço. Mapeamento do Nervo Facial. 2016.
4 II Curso de Atualização em Genética Humana. 2016.
5 IV Curso de Atualização em Oncologia Oral: concentração em estomatologia e cirurgia oral. Sarcomas em cabeça e pescoço. 2016. 6 X Curso de Capacitação em Enfermagem Oncológica. Neoplasia de
Cabeça e Pescoço. 2016.
Participação em Poster
1 40th ESPEN Congress on Clinical Nutrition & Metabolism. 2018.
Participação em Outro
1 Jornada Norte-Nordeste de Fonoaudiologia. Traqueostomias. 2016.
2 Jornada Norte-Nordeste de Otorrinolaringologia Pediátrica. Traqueostomias. 2016.
3 V Jornada Paulista de Cirurgia de Cabeça e Pescoço. Presidente. 2016.
Conferências e palestras
1 Mello, Luis E. B. Lesões Neurais e Representação Eletrofisiológica. 2017.
2 Mello, Luis E. B. Sarcomas em cabeça e pescoço. 2017.
3 Mello, Luis E. B. How to manage patients with persistent detectable thyroglobulin and negative diagnostic radioiodine whole body scans.
33 When is a patient RAI refractory? 2016.
4 Mello, Luis E. B. Recurrent goiter: not just 'another lump in the neck'. 2016.
5 Mello, Luis E. B. Thyroid cancer bone metastases and high morbidity rates. How to manage? 2016.
6 Mello, Luis E. B. Systemic therapeutic approaches to advanced thyroid cancers. 2016.
7 Mello, Luis E. B. Neoplasia de Cabeça e Pescoço. 2016. 8 Mello, Luis E. B. Sarcomas em cabeça e pescoço. 2016. 9 Mello, Luis E. B. Mapeamento do Nervo Facial. 2016. 10 Mello, Luis E. B. Traquesotomias. 2016.
Organização de eventos, congressos, exposições e feiras
1 Mello, Luis E. B. XVI Latin American Thyroid Congress. 2017.
Referente ao projeto de pesquisa
O projeto foi elaborado com o objetivo de identificar alguma identidade genética coincidente entre membros de uma mesma família, em primeiro ou segundo grau de parentescos, demonstrados em heredogramas confeccionados para cada família, caracterizados como sendo portadores de CFNMT.
A seleção de um número significativo de pacientes submetidos à tireoidectomia por carcinoma papilífero dentre as 18 famílias inicialmente selecionadas, proporcionou uma ampla análise mediante sequenciamento de nova geração desses pacientes. Como grupo controle, utilizamos familiares não afetados pelo carcinoma papilífero, de cada família identificada.
A fenotipagem realizada evidenciou a seguinte distribuição: três casos de carcinomas papilíferos presentes nas famílias V, VI, VIII, IX, XIV e XVII; quatro casos nas famílias IV e XVIII e seis casos na família XII.
Durante o processo de análise dos casos, constatamos que este assunto tem sido motivo de interesse por vários autores nos diversos continentes. Exemplo
disso, foi o estudo publicado pelos autores Gara et al.,38. A partir daí, fizemos a mesma análise e chegamos à conclusão oposta a estes autores, cujo artigo fora mencionado anteriormente39.
Para determinação das alterações genéticas, foi analisada a mutação do gene HABP2, pois recentemente, dois estudos38,40 sugeriram que HABP2 é um novo gene de susceptibilidade de CFNMT não-sindrômico. A variante HABP2 G534E foi encontrada em 4 (4%) dos 100 indivíduos, no entanto não foi detectada naqueles pertencentes às famílias FMTC não sindrômicas (Tabela 1 e Figura 1).
Tabela 1. Sequenciamento do gene HABP2.
Figura 1. Eletroferograma do sequenciamento do gene HABP2
G534E encontrada em quatro pacientes.
Mutação Esperada
G→ 1601 (G534 ) Outras Afetados (69) 3 2
35 Os resultados iniciais sugerem que não existe uma relação da variante HABP2 G534E com a doença, o que indica que a variante tem uma significância clínica reduzida. Diante disso, nossos resultados suportam a hipótese de que a variante G534E deve ser considerada um polimorfismo não-patogênico de
HABP2 não associado ao aumento do risco de CFNMT. Estes resultados estão
de acordo com outras pesquisas que foram realizadas na população europeia, chinesa, oriente médio e hispânica.
Embora em fase inicial de análise, esses resultados já se mostram bastante promissores, uma vez que os pacientes são não-sindrômicos e o estudo dessas alterações é inédito e trará informações muito importantes para a determinação dos fatores genéticos envolvidos no desenvolvimento do CFNMT.
Além disso, já realizamos as análises do Whole Genome Sequencing (WSG) em 9 famílias [IV, V, VI, VIII, IX, XII, XIV, XVII e XVIII]. Essas análises ocorreram no Laboratório de Bioinformática (Bioinfo), Hospital Sírio Libanês, São Paulo-SP, sob a responsabilidade do Prof. Dr. Pedro Alexandre Favoretto Galante e a participação da doutoranda Vanessa Candiotti Buzatto. A complexidade da análise genética requer um amplo entendimento no campo da bioinformática para que possamos estabelecer a correlação etiopatogênica, a partir da tradução do sequenciamento genético desses indivíduos relacionados. Consideramos este aspecto, um fator limitante para tal análise no país, devido à difícil acessibilidade financeira e de recursos humanos especializados no assunto. Por outro lado, dada a elevada prevalência dos tumores diferenciados da tireoide em nosso meio, a identificação de genes associados à malignidade, e principalmente à consanguinidade, traria uma informação de alta relevância, cujo tratamento adequado e a contento, certamente, impactaria nos diversos índices de aferição de resultados de promoção da saúde. A nossa perspectiva é que essa pesquisa, utilizando-se da decodificação do sequenciamento genético de nova geração, aponte para genes associados ao carcinoma diferenciado da tireoide (excluindo-se os medulares), os quais possam se apresentar de forma coincidentes entres esses parentes e desse modo, firmarem o diagnóstico precoce. No primeiro momento, conseguimos identificar um novo gene, aqui denominado de gene X, na família IV.
a) Resumo dos métodos empregados
Foram três as etapas relativas às análises da bioinformática:
Primeira etapa: sequenciamento inteiro do exoma
As amostras de DNA eram diluídas de acordo com o protocolo e submetidas à fragmentação enzimática. A biblioteca Exoma era construída utilizando o kit
SureSelect Human All Exons V6 da Agillent Technologies, Inc. (Santa Clara
CA, USA). Os fragmentos eram sem corte e os adaptadores eram adicionados a ambas as extremidades dos fragmentos. A biblioteca era hibridizada com outra biblioteca de RNA biotinilada para enriquecimento de exons; para a captura eram utilizadas esferas magnéticas revestidas com estreptavidina; e os fragmentos não hibridados eram lavados. Após o controle de qualidade, a biblioteca capturada era sequenciada na plataforma Hiseq2000 (Illumina, USA). O sequenciamento era emparelhado.
Segunda etapa: mapeamento e anotação de variantes
As leituras em bruto foram alinhadas com o genoma de referência humano do
NCBI (GRCh37/ hg19) utilizando o Burrows-Wheeler Aligner (BWA-MEM).
Duplicatas foram marcadas por Picard (v.2.17.6). SNV (variantes de nucleotídeos únicos) e Indels foram chamados usando o Genome Analyzes
Toolkit (GATK) por meio de parâmetros padrão. SNVs e indels foram anotados
usando ANNOVAR. A frequência das variantes foi anotada utilizando-se o banco de dados ExAC apenas para aquelas variantes consideradas raras de acordo com sua ê ( ≤ 0 05) . ≥ 10 ≥ 20, o que garante uma precisão de mais de 99%. Após o processo de filtragem, procuramos variantes recorrentes entre aquelas com o fenótipo de câncer da tireoide e usando como controle aquelas da mesma família que não tinham alterações na tireoide. Além do ExAC, também utilizamos o ABRAOM (Arquivo Online de Mutações Brasileiras) para acessar a frequência de nossas mutações em um coorte nacional. A predição da patogenicidade foi feita usando dois algoritmos: SIFT e PolyPhen2.
37
Terceira etapa: interpretação de resultados
Na terceira etapa, as variantes que estão no arquivo chamado VCF são anatadas usando diversos bancos de dados, como: clinvar, 1000 genomes, dbSNP etc, para que possamos identificar a frequência delas na população, se já foram descritas ou não, se foram relacionadas com algum quadro clínico, por exemplo.
Os passos destas três etapas encontram-se esquematizados na Figura 2.
Figura 2. Esta figura divide a análise bioinformática em três etapas. Primeira
etapa: as reads são geradas com seu score de qualidade e essa informação fica no arquivo FASTQ. O score de qualidade da chamada de nucleotídeos é importante porque nos permite identificar qual a chance das bases chamadas serem corretas, um score de 20 por exemplo me dá uma acurácia de 99%. O nome do score é phred score. Segunda etapa: as reads do arquivo FASTQ são alinhadas ao genoma humano de referência, no nosso caso usamos a versão hg19. Após o processo de alinhamento as reads duplicadas tem que ser removidas, assim como é necessária a recalibração de variantes SNP, indel e dos scores. Tudo isso para evitar detectar mutações falso positivas ou negativas. Depois, as variantes são anotadas em um arquivo de texto chmado VCF. Terceira etapa: as variantes que estão no arquivo VCF são anatadas usando diversos bancos de dados, como: clinvar, 1000 genomes, dbSNP e etc, para que possamos identificar a frequência delas na população, se já foram descritas ou não, se foram relacionadas com algum quadro clínico etc...
b) Resumo dos resultados obtidos
Das 9 famílias estudadas, apresentamos o resultado de apenas uma, cujo artigo será submetido para publicação, brevemente. O sequenciamento total do exoma foi realizado na família IV com Câncer Familiar de Tireoide Não-Medular (FNMTC): quatro pacientes afetados com microcarcinoma papilar da tireoide em três gerações consecutivas, sem nenhum sintoma sindrômico associado.
Figura 3. a) Pedigree genético da família com história positiva de carcinoma
papilífero da tireoide. Símbolos pretos indicam os indivíduos afetados e o cinza indica o paciente com nódulo adenomatoide. b) A validação do sequenciamento Sanger mostra que, nesta família, a variante do gene X segrega com a doença. Todos os membros afetados mostram a alteração nucleotídica (A/C) comprovada. O paciente V-1 (criança de 3 anos), filha do paciente IV-2, abriga a mesma mutação do gene X de todos os afetados. Nenhuma variante foi encontrada no membro da família com lesão benigna (IV-III) e membro não afetado (IV-1).
a)
b)
III- 1
IV- 3
II- 7
II- 10
III- 2
IV- 2
V- 1
39
Figura 4. Nesta figura, por exemplo, não está nominado o gene, mas é
possível explicar e visualizar que na família IV, 4 pacientes apresentaram mutação no mesmo gene.
Figura 5. A simulação de proteína 3D foi feita por HOPE (cmbi.ru.nl/hope). a)
Localização exata da mudança de aminoácidos (p.xM) na proteína do gene X; a proteína é colorida de cinza, a cadeia lateral do resíduo mutado é de cor magenta. O aminoácido do tipo selvagem (isoleucina) e o mutante (metionina) diferem em sua propriedade hidrofóbica e de carga; o resíduo mutante é maior do que o resíduo do tipo selvagem. b) Close up da mutação. A proteína é cinza e as cadeias laterais dos aminoácidos do tipo selvagem e mutante são coloridas de verde e vermelho, respectivamente.
Nós identificamos uma mutação no gene X, quando ocorreu a substituição de adenina por citosina (A>C) no exon X, já descrita pelo dbSNP. E esta alteração de nucleotídeos causou o deslocamento de isoleucina para metionina na
posição x (p.xM). Esta variante foi classificada como deletéria pelo SIFT (escore 0,02) e provavelmente prejudicial pelo PolyPhen2 (escore 0,98). Este gene X é um componente importante da membrana basal e evidências científicas mostraram que ele tem função relacionada à migração, invasão e progressão tumoral.
c) Dificuldades e limitações
No tocante às dificuldades e limitações, a realização deste projeto está sendo muito laborioso e dispendioso. Primeiramente, os três participantes mais diretos (Dr. Luis Eduardo Barbalho de Mello, Prof. José Brandão Neto e a
post-doc Camila Xavier Alves) são obrigados a se locomover para São Paulo
(UNIFESP) com muita frequência, uma média de 6 viagens/ano. Estas idas ao Laboratório As Bases Genéticas dos Tumores da Tireoide ainda são necessárias para o envio de material biológico dos pacientes, atualização dos métodos empregados nas análises e discussões científicas sobre os resultados. Isto envolveu passagens aéreas, transportes e estadias. Além do mais, as análises dos exomas feitas no Hospital Sírio-Libanês têm implicado em longas esperas, em função das demandas, custos operacional e financeiro.
d) Sugestões
Como este projeto é abrangente, os resultados aqui apresentados são apenas preliminares. As análises das famílias V, VI, VIII, IX, XII, XIV, XVII e XVIII encontram-se na fase final. E há a expectativa de alguma outra mutação gênica ser detectada, brevemente. Além do mais, este projeto estimulou-me, juntamente com meus colaboradores, a criar o Centro de Referência de Câncer de Tireoide com o objetivo de centralizar toda a casuística do Rio Grande do Norte e realizar estudos diferenciados abrangendo a biologia molecular.
e) Conclusão
Finalmente, ressalto – como ponto positivo – que sem a Pós-graduação todo o banco de dados disponível na Clínica de Cirurgia de Cabeça e Pescoço não teria maiores serventias, pois seria considerado praticamente um arquivo morto. Contudo, trazê-lo ao mundo científico reverteu em importância, adicionando novos conhecimentos às ciências da saúde e à
41 sociedade. A medicina privada precisa incorporar-se à academia e vice-versa. Esta é a mudança que direcionará para um futuro muito mais promissor.
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