TERAPIA CELULAR NA INSUFICIÊNCIA HEPÁTICA AGUDA: ESTUDO EXPERIMENTAL COM CÉLULAS MICROENCAPSULADAS

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UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO SUL

FACULDADE DE MEDICINA

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO: CIÊNCIAS EM

GASTROENTEROLOGIA E HEPATOLOGIA

TERAPIA CELULAR NA INSUFICIÊNCIA HEPÁTICA

AGUDA: ESTUDO EXPERIMENTAL COM CÉLULAS

MICROENCAPSULADAS

CARLOS OSCAR KIELING

TESE DE DOUTORADO

Porto Alegre, Brasil

2012

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UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO SUL

FACULDADE DE MEDICINA

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO: CIÊNCIAS EM

GASTROENTEROLOGIA E HEPATOLOGIA

TERAPIA CELULAR NA INSUFICIÊNCIA HEPÁTICA

AGUDA: ESTUDO EXPERIMENTAL COM CÉLULAS

MICROENCAPSULADAS

CARLOS OSCAR KIELING

Orientadora: Profa. Dra. Themis Reverbel da Silveira Coorientadora: Profa. Dra. Ursula da Silveira Matte

Tese apresentada ao Programa de

Pós-Graduação: Ciências em

Gastroenterologia e Hepatologia da Faculdade de Medicina da Universidade Federal do Rio Grande do Sul para obtenção de título de Doutor.

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Porto Alegre, Brasil

2012

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ii

“Insulta agora daqui os deuses, ó Prometeu. Rouba-lhes as honras

divinas, para dá-las a seres que não viverão mais que um dia! Poderão, por

acaso, os mortais, minorar teu suplício? Em vão te deram os deuses o nome

de Prometeu... Tu, sim! – precisas de um Prometeu que te liberte!”

Prometeu acorrentado.

Ésquilo ÉsquiloÉsquilo Ésquilo

“Ah, tem uma repetição, que sempre outras vezes em minha vida

acontece. Eu atravesso as coisas – e no meio da travessia não vejo! – só

estava era entretido na idéia dos lugares de saída e de chegada. Assaz o

senhor sabe: a gente quer passar um rio a nado, e passa; mas vai dar na

outra banda é num ponto muito mais em baixo, bem diverso do em que

primeiro se pensou. Viver nem não é muito perigoso?”

Riobaldo em Grande Sertão: Veredas

João Guimarães Rosa João Guimarães Rosa João Guimarães Rosa João Guimarães Rosa

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iii

AGRADECIMENTOS

À minha família, pelo apoio e compreensão.

À minha orientadora e eterna professora, Profa. Dra. Themis Reverbel da Silveira, pelo seu entusiasmo incansável.

À minha coorientadora e amiga, Profa. Dra. Ursula da Silveira Matte, pelo brilhantismo, uma fonte inesgotável de idéias e sugestões.

Aos amigos Rafael Lucyk Maurer, Carolina Uribe Cruz, Ariane Nádia Backes, Mónica Luján López, Gustavo Ochs e Alessandro Bersch Osvaldt, essenciais para a concretização desse projeto.

Às equipes do Centro de Terapia Gênica, do Laboratório de Hepatologia e Gastroenterologia Experimental e do Laboratório de Patologia Experimental pela disponibilidade e auxílio.

À equipe da Unidade de Experimentação Animal, Marta Justina Giotti Cioato, Fabiola Schons Meyer e Eduardo Mottola Amaro da Silveira, pela preciosa colaboração durante os procedimentos experimentais.

À Profa. Dra. Luise Meurer e ao Prof. Dr. Carlos Thadeu Schmidt Cerski pelo auxílio na análise histopatológica.

Às Profa. Dra. Helena Ayako Sueno Goldani e Profa. Dra. Sandra Maria Gonçalves Vieira e aos colegas da Unidade de Gastroenterologia Pediátrica, Cristina Helena Targa Ferreira, Jorge Luiz dos Santos e Daltro Luiz Alves Nunes pelo apoio incondicional.

A todas as pessoas que contribuíram de forma direta ou indireta para a realização desse projeto de pesquisa e dessa tese e que, involuntariamente, deixaram de ser nominadas.

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iv SUMÁRIO

Página

LISTA DE SIGLAS E ABREVIATURAS ... vii

LISTA DE FIGURAS ... x

LISTA DE TABELAS ... xi

LISTA DE QUADROS ... xii

RESUMO... xiii

ABSTRACT... xv

1. INTRODUÇÃO ... 2

2. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA ...5

2.1. REGENERAÇÃO HEPÁTICA ... 5

2.1.1. Mecanismos envolvidos na regeneração hepática ... 7

2.1.2. Mecanismos de finalização da regeneração hepática ... 12

2.2. INSUFICIÊNCIA HEPÁTICA AGUDA... 13

2.3 RESPOSTA INFLAMATÓRIA SISTÊMICA NA INSUFICIÊNCIA HEPÁTICA AGUDA ... 15

2.4. TERAPIA CELULAR NO TRATAMENTO DA INSUFICIÊNCIA HEPÁTICA AGUDA... 17

2.4.1. Transplante de hepatócitos ... 18

2.4.2. Transplante de células da medula óssea ... 18

2.5. MODELOS EXPERIMENTAIS DE INSUFICIÊNCIA HEPÁTICA AGUDA .. 24 2.6. ISOLAMENTO CELULAR EM MICROCÁPSULAS DE ALGINATO DE SÓDIO ... 27 3. JUSTIFICATIVA ... 30 4. OBJETIVOS ... 32 4.1. OBJETIVO GERAL ... 32 4.2. OBJETIVOS ESPECÍFICOS ... 32 5. MATERIAL E MÉTODOS ... 34 5.1. ASPECTOS GERAIS ... 34 5.2. HIPÓTESES ... 34 5.3. DELINEAMENTO ...35 5.3.1. Fator em estudo ... 35 5.3.2. Desfechos ... 35

(8)

v 5.3.3. Grupos de estudo ... 35 5.3.4. Desenhos de estudo ... 36 5.4. AMOSTRA E AMOSTRAGEM ... 36 5.4.1. Critérios de inclusão ... 36 5.4.2. Critérios de exclusão ... 36 5.4.3. Tamanho amostral ... 37 5.5. VARIÁVEIS ... 37 5.6. PROCEDIMENTOS ... 40 5.6.1. Animais ... 40 5.6.2. Células ... 42

5.6.3. Encapsulação das células em microcápsulas de alginato de sódio ... 43

5.6.4. Análise laboratorial ... 44 5.6.5. Avaliação histológica ... 44 5.7. LOGÍSTICA ... 44 5.8. TRATAMENTO ESTATÍSTICO ... 44 5.9. ASPECTOS ÉTICOS ... 45 6. RESULTADOS... 48

6.1. FASE 1 - PADRONIZAÇÃO DE UM MODELO DE INSUFICIÊNCIA HEPÁTICA AGUDA POR HEPATECTOMIA PARCIAL EM RATOS ... 48

6.2. FASE 2 - AVALIAÇÃO DO EFEITO DE DIFERENTES TIPOS CELULARES NA SOBREVIDA DE RATOS SUBMETIDOS À HEPATECTOMIA DE 90% ... 53

6.3. FASE 3 - AVALIAÇÃO DO EFEITO PRECOCE DA TERAPIA CELULAR EM RATOS SUBMETIDOS À HEPATECTOMIA DE 90% ... 57

7. DISCUSSÃO ... 69

7.1. FASE 1 – MODELO DE INSUFICIÊNCIA HEPÁTICA AGUDA POR HEPATECTOMIA PARCIAL EM RATOS ... 69

7.2. FASE 2 – AVALIAÇÃO DO EFEITO DE DIFERENTES TIPOS CELULARES NA SOBREVIDA DE RATOS SUBMETIDOS À HEPATECTOMIA DE 90%... 73

7.3. FASE 3 - AVALIAÇÃO DO EFEITO PRECOCE DA TERAPIA CELULAR EM RATOS SUBMETIDOS À HEPATECTOMIA DE 90% ... 79

7.3.1. Alterações histológicas após hepatectomia ... 80

(9)

vi

7.3.3. Efeitos da terapia celular ... 85

8. CONCLUSÕES ... 99 9. CONSIDERAÇÕES FINAIS ... 102 10. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ... 105 ANEXOS ... 130 Anexo 1... 131 Anexo 2 ...133 Anexo 3... 135 Anexo 4... 137 Anexo 5... 150

(10)

vii LISTA DE SIGLAS E ABREVIATURAS

= Igual a > Maior que < Menor que % Porcentagem + Mais ± Mais ou menos

ALT Alanino aminotransferase

ANOVA Análise de variância

APA Alginato-poli-L-lisina-alginato

AST Aspartato aminotransferase

BrdU Bromodeoxiuridina

CaCl2 Cloreto de cálcio

CARS Compensatory Anti-inflammatory Response Syndrome

CCl4 Tetracloreto de carbono

CTG Centro de Terapia Gênica

ºC Grau Celsius

d Dia

DMEM Dulbecco’s Modified Eagle Medium

DNA Ácido desoxirribonucleico

DP Desvio padrão

EDTA Ethylenediamine Tetraacetic Acid

EGF Epidermal Growth Factor

ELISA Enzyme-Linked Immunosorbent Assay

ex. Exemplo

FasL Fas ligand

FM Fração mononuclear

GPPG Grupo de Pesquisa e Pós-Graduação G-CSF Granulocyte-Colony Stimulating Factor

HB-EGF Heparin-Binding EGF-Like Growth Factor

HCPA Hospital de Clínicas de Porto Alegre

HE Hematoxilina e eosina

HGF Hepatocyte Growth Factor

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viii

HTC Hepatócito

IGF-1 Insulin-like Growth Factor 1

IHA Insuficiência hepática aguda INF-gama Interferon-gama

IL Interleucina

ISOL in situ oligo ligation

JAK Janus kinase

kg Quilograma

LD Lobo direito

LEHG Laboratório Experimental de Hepatologia e Gastroenterologia

LPS Lipopolissacarídeos

mmol/L Milimol por litro

mg Miligrama

mg/kg Miligrama por quilograma mg/dL Miligrama por decilitro

mL Mililitro

mmHg Milímetros de mercúrio

MMO Mononucleares da medula óssea

MOT Medula óssea total

ng/dL Nanograma por decilitro ng/mL Nanograma por mililitro NF-kappa B Nuclear Factor-kappa B

NK Natural killer

P Nível de significância PBS Phosphate Buffered Saline

PCNA Proliferating Cell Nuclear Antigen

PDGF Platelet-Derived Growth Factor

PDGF-BB Platelet-Derived Growth Factor-BB

pg/mL Picograma por mililitro

PlGF Placental Growth Factor

Q Quartil

Q1 Primeiro quartil

Q3 Terceiro quartil

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ix

RNAm Ácido riboxinucleico mensageiro SCF Stem Cell Factor

SDF-1 Stromal cell Derived Factor-1

SFB Soro fetal bovino

SIRS Systemic Inflammatory Response Syndrome

SOCS3 Suppressor of Cytokine Signaling 3

SPSS Statistical Package for Social Sciences

STAT3 Signal Transducer and Activator of Transcription 3

TGF-alfa Transforming Growth Factor-alpha

TGF-beta Transforming Growth Factor-beta

THMO Tronco hematopoiética da medula óssea TMMO Tronco mesenquimal da medula óssea TNF-alfa Tumor Necrosis Factor-alpha

TNF-beta Tumor Necrosis Factor-beta

TLR3 Toll-Like Receptor 3

TUNEL TdTmediated dUTP-biotin nick end labeling

VEGF Vascular Endothelial Growth Factor

UAMP Unidade de Análise Molecular e de Proteínas

UEA Unidade de Experimentação Animal

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x LISTA DE FIGURAS

Figura 1 - Modelos de hepatectomia parcial em ratos. ... 26 Figura 2 – Microencapsulação com alginato de sódio: A) Unidade de Encapsulação

Nisco; B) Microcápsula sem células; C) Microcápsula com células HepG2; D) Administração das microcápsulas na cavidade peritoneal; E) Microcápsulas aderidas ao fígado; F) Fotomicrografia de microcápsula contendo células HepG2 e aderida ao tecido hepático (HE 100x)... 46 Figura 3 - Sobrevida após hepatectomia de 85% conforme a suplementação de glicose... 50 Figura 4 - Glicose (mg/dL) e lactato (mmol/L) sanguíneos em ratos submetidos à

hepatectomia de 85% conforme a suplementação de glicose. ... 50 Figura 5 - Sobrevida em 10 dias após hepatectomia de 90% conforme o regime

anestésico. ... 52 Figura 6 - Sobrevida em 10 dias após hepatectomia de 90% conforme o tipo de célula

encapsulada... 54 Figura 7 - Média da glicose sanguínea (mg/dL) em ratos submetidos à hepatectomia de

90% conforme o regime terapêutico... 56 Figura 8 - Média do lactato sanguíneo (mmol/L) em ratos submetidos à hepatectomia de

90% conforme o regime terapêutico... 56 Figura 9 - Peso dos lobos remanescentes (g) de ratos submetidos à hepatectomia de 90%

conforme o momento do sacrifício e o regime terapêutico. ... 60 Figura 10 - Razão peso dos lobos remanescentes em relação ao peso corporal do dia do

sacrifício (%) de ratos submetidos à hepatectomia de 90% conforme o momento do sacrifício e o regime terapêutico... 61 Figura 11 – Tecido hepático corado por hematoxilina e eosina (HE) (400x) de ratos

submetidos à hepatectomia de 90% conforme o momento do sacrifício e o regime terapêutico. ... 63 Figura 12 - Hepatócitos em mitoses de ratos submetidos à hepatectomia de 90%

conforme o momento do sacrifício e o regime terapêutico. ... 63 Figura 13 - IL-6 sérica (pg/mL) de ratos submetidos à hepatectomia de 90% conforme o

momento do sacrifício e o regime terapêutico... 65 Figura 14 - TGF-beta sérico (ng/mL) de ratos submetidos à hepatectomia de 90%

conforme o momento do sacrifício e o regime terapêutico. ... 65 Figura 15 - PDGF-BB sérico (ng/mL) de ratos submetidos à hepatectomia de 90%

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xi LISTA DE TABELAS

Tabela 1 – Artigos originais sobre transplante de células da medula óssea em modelos animais de insuficiência hepática aguda... 23 Tabela 2 – Lista de variáveis não laboratoriais avaliadas... 38 Tabela 3 – Lista de variáveis laboratoriais avaliadas... 39 Tabela 4 – Características dos ratos submetidos à hepatectomia de 85% conforme a

suplementação de glicose. ... 49 Tabela 5 – Peso dos lobos remanescentes (g) e razão peso dos lobos remanescentes em

relação ao peso corporal do dia do sacrifício (%) de ratos submetidos à hepatectomia de 85% conforme a suplementação de glicose. ... 49 Tabela 6 – Tipo, número de células administradas em cada animal e número de animais

por grupo... 53 Tabela 7 – Glicose sanguínea (mg/dL) em ratos submetidos à hepatectomia de 90%

conforme o regime terapêutico. ... 55 Tabela 8 – Peso dos lobos remanescentes (g) e razão peso dos lobos remanescentes em

relação ao peso corporal do dia do sacrifício (%) de ratos submetidos à hepatectomia de 90% conforme o regime terapêutico... 57 Tabela 9 – Peso dos lobos remanescentes (g) de ratos submetidos à hepatectomia de 90%

conforme o momento do sacrifício e o regime terapêutico. ... 58 Tabela 10 – Razão peso dos lobos remanescentes em relação ao peso corporal do dia do

sacrifício (%) de ratos submetidos à hepatectomia de 90% conforme o momento do sacrifício e o regime terapêutico... 59 Tabela 11 – Hepatócitos em mitoses de ratos submetidos à hepatectomia de 90%

conforme o momento do sacrifício e o regime terapêutico. ... 61 Tabela 12 – IL-6 sérica (pg/mL) de ratos submetidos à hepatectomia de 90% conforme o

momento do sacrifício e o regime terapêutico... 64 Tabela 13 – TGF-beta sérico (ng/mL) de ratos submetidos à hepatectomia de 90%

conforme o momento do sacrifício e o regime terapêutico. ... 64 Tabela 14 – PDGF-BB sérico (ng/mL) de ratos submetidos à hepatectomia de 90%

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xii LISTA DE QUADROS

Quadro 1 - Vias de sinalização relacionadas à regeneração hepática. ... 9

Quadro 2 - Tipos celulares empregados nos estudos de terapia de doenças hepáticas. ...17

Quadro 3 - Efeitos das células-tronco da medula óssea no tecido hepático. ... 21

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xiii RESUMO

A insuficiência hepática aguda resulta da perda súbita das funções vitais do fígado em conseqüência da perda maciça do tecido hepático. Em muitos casos, o transplante de fígado de urgência é o tratamento definitivo, apesar da capacidade regenerativa do fígado. Os mecanismos da regeneração envolvem intricadas vias de regulação, com ativação de fatores de crescimento e citocinas. A terapia celular com hepatócitos e células tronco da medula óssea tem sido proposta como alternativa terapêutica, mas seu emprego permanece no campo experimental.

O presente estudo teve por objetivo investigar os efeitos da terapia com células imobilizadas em microcápsulas de alginato de sódio na sobrevivência e na regeneração hepática em ratos Wistar machos adultos submetidos à insuficiência hepática aguda. Na primeira fase foi realizada a padronização de modelo de insuficiência hepática aguda por hepatectomia de 85% ou 90% com janela terapêutica adequada ao estudo da terapia celular. A segunda fase teve por objetivo avaliar os efeitos da terapia com células HepG2 e células da medula óssea total (MOT) e fração mononuclear (FM), contidas em microcápsulas de alginato de sódio colocadas no peritônio, sobre os níveis de glicose e lactato sanguíneos e sobre a sobrevida em 10 dias. Na fase 3, foram avaliados os efeitos da terapia celular com MOT e FM sobre a proliferação hepatocitária e os níveis séricos de citocinas e de fatores de crescimento nas primeiras 72 horas após hepatectomia de 90%.

Na fase 1, mesmo utilizando ketamina e xilazina como anestésico e independentemente da suplementação de glicose, hepatectomia de 85% resultou em sobrevida de 50% em 72 horas, não adequada a um modelo de insuficiência hepática aguda. Hepatectomia de 90% sob anestesia com ketamina e xilazina determinou aumento da mortalidade, com a maioria dos óbitos ocorrendo nas primeiras 6 horas do pós-operatório. A troca do regime anestésico para isoflurano reduziu o tempo de recuperação anestésica e aumentou a sobrevida imediata permitindo uma janela terapêutica adequada. A sobrevida foi de 26,7% às 72 horas e de 6,7% aos 10 dias.

Na fase 2 foram administradas microcápsulas contendo células em ratos submetidos a hepatectomia de 90%. O transplante de células da medula óssea aumentou a sobrevida em 10 dias de forma significativa em relação ao grupo sem células (MOT 1x106 células: 63,6%, P=0,002; FM 1x106: 57,1%, P=0,001 e FM 3x107: 54,5%, P=0,003). A sobrevida (30,8%) dos animais tratados com HepG2 não foi diferente do grupo sem células.

Na terceira fase, às 72 horas após a hepatectomia, o grupo sem células apresentou peso dos lobos remanescentes e razão de massa hepática significativamente superiores aos

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xiv

dos animais que receberam MOT (P=0,001 e P=0,020) e FM (P=0,002 e P=0,008). Não houve diferença estatística significativa no número de hepatócitos em mitose e nos níveis de IL-6 entre os grupos em todos os momentos avaliados. Somente às 12 horas houve diferença significativa dos níveis de TGF-beta entre os grupos, sendo maiores no grupo sem células (P=0,036). Os valores do PDGF-BB às 48 horas do grupo sem células foram significativamente inferiores aos dos ratos tratados com FM (P=0,017).

Esses resultados nos permitem concluir que hepatectomia de 90% de ratos Wistar anestesiados com isoflurano possibilita janela terapêutica adequada ao estudo da terapia celular. A terapia com células da medula óssea, imobilizadas em microcápsulas de alginato de sódio resulta em aumento da sobrevida de ratos submetidos à hepatectomia de 90%. Essa terapêutica reduziu o ganho de massa dos lobos remanescentes, mas não modificou a regeneração hepatocitária e os níveis de IL-6, de TGF-beta e de PDGF-BB durante as primeiras 72 horas após o procedimento.

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xv ABSTRACT

Acute liver failure is caused by the sudden loss of liver vital functions due to massive loss of hepatic tissue. In most cases, emergency liver transplant is the curative treatment, despite liver’s regenerative capacity. Mechanisms of liver regeneration involve intricate regulatory pathways, with the recruitment of growth factors and cytokines. Cell therapy, either with hepatocytes or with bone marrow cells, has been proposed as a therapeutic option but remains in the experimental area.

The present study aimed to investigate the effects of the therapy with cells immobilized in alginate microcapsules on the survival and hepatic regeneration of adult male Wistar rats with acute liver failure. On the first phase the acute liver failure model by 85% or 90% hepatectomy was standardized to achieve an adequate therapeutic window to study the mechanisms and effects of cell therapy. The second phase aimed to evaluate the effects of therapy using Hep G2 cells and bone marrow cells, either whole bone marrow (WBM) or mononuclear fraction (MF), in alginate microcapsules implanted in the peritoneum, on glucose and lactate levels, and 10-day survival. On phase 3, the effects of cell therapy with WBM and MF on hepatocyte proliferation and serum levels of cytokines and growth factors were evaluated in the first 72 hours after 90% hepatectomy.

On phase 1, using ketamine and xylazine as anesthetic, despite glucose supplementation, 85% hepatectomy resulted in 50% survival at 72 hours, which is not adequate for a model of acute liver failure. Ninety-percent hepatectomy under ketamine and xylazine anesthesia resulted in increased mortality, although in the first 6 hours post-operatory. The change in anesthetic regimen for isofluorane reduced recovery time and increased early survival, allowing for an adequate therapeutic window. Survival was 26.7% at 72 hours and 6.7% at 10 days.

On phase 2 microcapsules containing cells were implanted in rats after 90% hepatectomy. Bone marrow cell transplantation significantly increased 10-day survival over empty capsules group (WBM 1x106 cells: 63.6%, P=0.002; MF 1x106: 57.1%, P=0.001 and MF 3x107: 54.5%, P=0.003). Survival of animals treated with HepG2 (30.8%) was not different from empty capsules group.

On the third phase, 72 hours after hepatectomy, empty capsules group showed significantly increase in the weight of remnant liver lobe and hepatic mass ratio compared to WBM (P=0.001 and P=0.020) and MF (P=0.002 and P=0.008). There was not statistic difference in the number of mitotic hepatocytes and in the serum levels of IL-6 between groups in any of the time points analyzed. Serum levels of TGF-beta were higher in the

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xvi

empty capsules group at 12 hours only (P=0.036). Serum levels of PDGF-BB in this group were significantly lower (P=0.017) than those from the MF group at 48 hours post-hepatectomy.

These findings suggest that 90% partial hepatectomy in Wistar rats anesthetized with isoflurane provides an adequate therapeutic window to study the effects and mechanisms of cell therapy. Cell therapy with bone marrow cells microencapsulated in alginate beads leads to increased survival in rats with 90% partial hepatectomy. This therapy reduced the weight of remnant lobes but did not changed hepatocyte regeneration and serum levels of IL-6, TGF-beta and PDGF-BB in the first 72 hours after surgery.

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1. Introdução 2 1. INTRODUÇÃO

O fígado, órgão essencial à vida e responsável pela homeostase metabólica, possui capacidade de regeneração a partir da replicação de suas células. Esse processo desencadeado pela lesão hepática envolve a participação de todos os tipos celulares do fígado com o rompimento do estado celular quiescente. Os mecanismos da regeneração envolvem múltiplas e intricadas vias de regulação, com ativação de cascatas de sinalização de fatores de crescimento e citocinas que regulam a expressão gênica.

A insuficiência hepática aguda ocorre quando a extensão da necrose celular supera a capacidade regenerativa do fígado. A perda súbita das inúmeras funções do fígado compromete todo o organismo e pode determinar o óbito. A intensidade da lesão hepática determina o grau de repercussão local e sistêmica.

Em resposta à lesão hepatocelular de qualquer origem ocorre ativação simultânea de mediadores pró- e anti-inflamatórios que atuarão na sinalização da regeneração hepática e na resposta imune sistêmica. Possivelmente, a dissonância imunológica, com perda do equilíbrio entre as atividades pró- e anti-inflamatória, seja um fator determinante da evolução do paciente em insuficiência hepática aguda.

O transplante de fígado de urgência pode modificar a história natural da doença e permitir a sobrevivência do paciente em insuficiência hepática aguda. Contudo, a falta de órgão em tempo hábil pode limitar o acesso ao transplante. Os medicamentos imunossupressores utilizados continuadamente após o transplante não são isentos e possuem efeitos colaterais imediatos e em longo prazo. Os custos do transplante, da medicação imunossupressora, do acompanhamento clínico e laboratorial, e do tratamento das complicações são elevados.

Tratamentos alternativos ao transplante de fígado têm sido buscados e a terapia celular se apresenta uma proposta promissora. O transplante de hepatócitos foi realizado experimentalmente em animais e seres humanos em insuficiência hepática aguda, mas a sua aplicabilidade é limitada pela dificuldade na obtenção de um número suficiente de células. As células-tronco da medula óssea, devido a sua capacidade de diferenciação em hepatócitos e colangiócitos, têm sido estudadas como opção terapêutica nas doenças hepáticas crônicas e agudas. Os mecanismos dos efeitos benéficos dessas células sobre a regeneração hepática não estão completamente esclarecidos. A modulação da resposta imunológica e o efeito anti-inflamatório local e sistêmico poderiam, através da estimulação da regeneração hepatocitária, promover a recuperação do fígado lesado. Estudos que elucidem os processos

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1. Introdução 3

patofisiológicos da regeneração hepática e da repercussão sistêmica da insuficiência hepática aguda podem ampliar o conhecimento e aprimorar a assistência ao paciente, com consequente redução da mortalidade.

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2. Revisão bibliográfica 5

2. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA

O fígado é um órgão essencial à manutenção da vida e da homeostase metabólica corporal. Responsável pelo metabolismo, síntese, armazenamento e redistribuição de nutrientes, carboidratos, gorduras e vitaminas, o fígado produz grandes quantidades de proteínas séricas, incluindo as proteínas de fase aguda, albumina, enzimas e cofatores. É o principal órgão de desintoxicação removendo resíduos e xenobióticos por conversão metabólica e através da excreção biliar (Taub, 2004).

A presença de substâncias tóxicas ou a ocorrência de infecção no tecido hepático podem provocar lesão celular e a perda das funções do fígado. A imediata resposta regenerativa às injúrias hepáticas é um eficiente mecanismo de manutenção funcional do fígado, da viabilidade do organismo e de preservação da vida (Michalopoulos, 2007). O fígado tem a capacidade única de regular o seu crescimento e a sua massa após injúria aguda. Este processo de crescimento é denominado de regeneração hepática, embora o crescimento do fígado ocorra por hiperplasia celular compensatória ao invés de regeneração verdadeira (Fausto & Campbell, 2003; Bataller & Brenner, 2005).

O fígado é constituído por diferentes tipos celulares. Os hepatócitos correspondem a 80% dessas células. Os outros 20% da massa hepática são constituídos por células não-parenquimatosas, que incluem as células endoteliais, as células de Kupffer, os linfócitos e as células estreladas. As células endoteliais compõem a rede de sinusoides do fígado e fornecem uma grande superfície de absorção dos nutrientes que circulam pela veia porta. As células de Kupffer, também situadas nos sinusoides, são essenciais para a fagocitose de organismos infecciosos e na produção de citocinas. Os linfócitos compõem o sistema imune inato e auxiliam no controle de infecções. As células estreladas possuem várias funções entre elas a de produzir a matriz extracelular e de armazenar vitamina A (Taub, 2004).

O hepatócito é a unidade celular funcional do fígado e realiza múltiplas funções sintéticas e metabólicas. Os hepatócitos são células epiteliais polipóides, altamente diferenciadas, que formam estruturas tipo cordão. O lóbulo hepático é constituído de uma veia central rodeada por 6 tríades portais formadas pelos ductos biliares, pela artéria hepática e pela veia porta (Alison et al., 2009; Duncan et al., 2009; Kisseleva et al., 2010).

2.1. REGENERAÇÃO HEPÁTICA

A regeneração hepática, por séculos considerada um mito, tornou-se uma realidade científica no século XX. O mito da regeneração hepática tem origem grega e foi registrado

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por Ésquilo na tragédia Prometeu Acorrentado. Preso às correntes forjadas por Hefesto ao monte Cáucaso Prometeu cumpriria castigo imposto por Zeus por entregar o segredo do fogo aos homens. Durante o dia seu fígado era devorado por uma águia, mas à noite o fígado voltava a crescer. A fonte da idéia original da capacidade regenerativa do fígado de Prometeu não é conhecida, podendo ter sido fruto de observação direta ou, simplesmente de um “vôo da imaginação poética” (Fausto, 2001).

Um dos marcos da transformação do mito de Prometeu em pesquisa experimental foi a descrição por Higgins e Anderson em 1931 de um método reprodutível de realização de hepatectomia parcial em ratos. Desde então, a capacidade regenerativa do fígado tem sido intensamente investigada. Mais recentemente, a regeneração do fígado humano pôde ser demonstrada com a introdução e o desenvolvimento das técnicas de transplante de fígado reduzido e de lobos hepáticos de doadores vivos. As semelhanças entre os processos de regeneração em animais de experimentação e em seres humanos sugerem que os mecanismos que regulam a regeneração são similares entre as espécies e que os conhecimentos adquiridos com os estudos experimentais podem ser aplicados aos seres humanos (Fausto, 2001).

De acordo com Fausto e Campbell (2003), apesar de seu uso comum, a expressão regeneração hepática está incorreta (Fausto & Campbell, 2003). Em termos biológicos, regeneração significa a reconstituição de uma estrutura que tenha sido retirada, como o completo crescimento do membro de uma salamandra, incluindo pele, músculos e dígitos. Na regeneração hepática o organismo lesado busca recompor a massa hepatocitária e a estrutura funcional lobular necessária à manutenção da homeostase corporal (Fausto et al., 2006).

A capacidade de regeneração a partir de células diferenciadas (hepatócitos) é única do fígado e sua capacidade de replicação é surpreendente, pois após lesão hepática maciça poucos hepatócitos são necessários para o restabelecimento da massa hepática. Em resposta à lesão, os hepatócitos proliferam e podem se dividir até 100 vezes (Michalopoulos & DeFrances, 1997; Overturf et al., 1997; Taub, 2004).

Após hepatectomia parcial há uma resposta hiperplásica com a replicação de praticamente todas as células maduras nos lobos remanescentes (Taub, 2004). A massa hepática destes lobos se expande para compensar a perda do tecido. O processo regenerativo é compensatório porque o tamanho do fígado resultante é determinado pelas exigências metabólicas do organismo. Em roedores e em seres humanos há uma proporção entre o peso corporal e a massa do fígado. A proporção ideal corresponde ao ponto de equilíbrio entre o

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excesso e o déficit de tecido funcional hepático adequado para o atendimento das necessidades do organismo. Entretanto, os fatores regulatórios que determinam o tamanho ideal do fígado de cada indivíduo não são bem compreendidos (Michalopoulos & DeFrances, 1997; Taub, 2004; Fausto & Riehle, 2005; Michalopoulos, 2007).

A quantidade de tecido hepático remanescente compatível com a vida parece ser menor em roedores que em seres humanos. Roedores podem sobreviver mesmo após hepatectomia de 90 a 95% (Madrahimov et al., 2006; Martins et al., 2008). Em seres humanos, a perda de até 70 a 80% do fígado pode ser tolerada, mas ressecções maiores podem determinar quadros de disfunção e de insuficiência hepática (Leelaudomlipi et al., 2002; Ninomiya et al., 2003).

Em roedores, em cerca de 5 a 10 dias após hepatectomia parcial a massa hepática é restabelecida, contudo sem a reconstituição anatômica original (Michalopoulos & DeFrances, 1997; Taub, 2004). Em seres humanos, a finalização do processo regenerativo é mais lenta e possivelmente leva de 1 a 2 meses (Fausto & Campbell, 2003; Michalopoulos, 2007). Após o transplante de lobo hepático de doador vivo há rápido aumento da massa hepática nos primeiros sete dias, ocorrendo completa restauração em 3 meses (Fausto & Riehle, 2005).

2.1.1. Mecanismos envolvidos na regeneração hepática

Durante os últimos anos houve grandes avanços na compreensão dos mecanismos de regeneração hepática, sendo em grande parte o resultado do emprego de camundongos transgênicos e knock-out. A maioria dos dados sobre os mecanismos de controle da regeneração hepática foram obtidos a partir da utilização do modelo de hepatectomia parcial (Taub, 2004; Aller et al., 2009). Nesse procedimento, cerca de 2/3 do fígado são retirados, sem lesão aos lobos remanescentes e com mínima mortalidade pós-operatória (Emond et al., 1989).

A regeneração hepática após hepatectomia parcial é um fenômeno muito complexo e bem orquestrado, envolvendo a participação de todos os tipos de células maduras do fígado. Ocorre modificação no padrão quiescente normal de interação celular e a ativação de cascatas de sinalização determinando efeitos parácrinos de citocinas e fatores de crescimento. Com o objetivo de restabelecer a busca da homeostase metabólica, o processo da regeneração se inicia imediatamente após a hepatectomia no tecido hepático remanescente. Uma sequência ordenada de eventos pode ser observada a partir dos primeiros

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5 minutos e que durará de 5 a 7 dias até a recuperação da massa hepática (Michalopoulos, 2007).

A divisão celular é raramente vista em hepatócitos de fígado sadio adulto e que estão usualmente na fase G0 do ciclo de celular (Michalopoulos & DeFrances, 1997; Taub, 2004). No entanto, após hepatectomia parcial, os hepatócitos são as primeiras células a entrar em ciclo de divisão celular. O pico de replicação hepatocitária ocorre em 24 horas após a hepatectomia parcial em ratos, e em 36 a 42 horas em camundongos. Até 95% dos hepatócitos remanescentes se dividem após hepatectomia parcial e são necessárias uma a duas divisões celulares (de 1,4 a 1,6 ciclos) para a restauração completa da massa hepática (Taub, 2004; Michalopoulos, 2007; Alison et al., 2009). Ao final do processo de síntese de DNA, pode ocorrer uma onda de apoptose dos hepatócitos, sugerindo a existência de um mecanismo para a correção de uma resposta regenerativa excessiva (Sakamoto et al., 1999; Michalopoulos, 2007).

No processo regenerativo hepático também ocorre a ativação das células não parenquimatosas. Possivelmente elas tenham um papel essencial nesse processo, produzindo citocinas e fatores de crescimento que regulam a regeneração. Para a restauração da estrutura lobular, as células não parenquimatosas também proliferam, contudo a indução da síntese de DNA ocorre mais tardiamente, em torno de 48 horas para as células do epitélio biliar e de Kupffer. A proliferação das células endoteliais, começa em 2 a 3 dias e termina em torno dos 4 a 5 dias após a hepatectomia (Taub, 2004; Fausto & Riehle, 2005; Michalopoulos, 2007; Alison et al., 2009).

O estudo dos mecanismos da regeneração hepática evoluiu da busca de uma única molécula capaz de desencadear o processo completo, para a análise de vias individuais, e finalmente, para a investigação de múltiplas vias e de suas inter-relações (Fausto & Riehle, 2005). O emprego de animais knock-out para determinados genes tem sido úteis no esclarecimento do papel específico dos múltiplos genes e proteínas envolvidos no processo de regeneração hepática (Taub, 2004; Fausto & Riehle, 2005).

Há um grande número de genes envolvido na regeneração do fígado, mas ao menos 3 vias essenciais ao processo já foram individualizadas: citocinas, fatores de crescimento e metabólica (Quadro 1). A via das citocinas é a grande responsável pela entrada dos hepatócitos quiescentes em ciclo celular (de G0 a G1), em um processo denominado

priming. A via dos fatores de crescimento é responsável pela progressão do ciclo celular, de

G1 para a fase S. A terceira via envolveria a pouco estudada ligação dos sinais metabólicos à síntese ribossômica e a replicação do DNA (Taub, 2004; Fausto & Riehle, 2005). Essas vias

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não atuam de forma isolada, havendo interação, e imbricação entre elas. O padrão coordenado de expressão gênica que ocorre durante a regeneração hepática sugere que deve haver interação dos sinais que regulam a expressão gênica, como as citocinas, os fatores de crescimento e os sinais metabólicos (Fausto & Riehle, 2005). A importância do fígado na sobrevivência do organismo possivelmente seja determinante da existência de redundância das etapas entre as vias, pois dessa forma há redução da possibilidade de falha no processo regenerativo. A deficiência de um único gene pode provocar atraso ou redução da regeneração, mas raramente determina um completo bloqueio do processo (Taub, 2004; Fausto & Riehle, 2005; Alison et al., 2009).

Quadro 1 - Vias de sinalização relacionadas à regeneração hepática.

Citocinas:

- Tumor Necrosis Factor-alpha (TNF-alfa) - Interleucina-6 (IL-6)

Fatores de crescimento:

- Hepatocyte Growth Factor (HGF) - Epidermal Growth Factor (EGF)

- Transforming Growth Factor-alpha (TGF-alfa) - Insulina

- Glucagon

Metabólica:

- Ciclina D1 - Nutrientes

Via das citocinas

O sistema imune inato desempenha um papel importante na iniciação da regeneração hepática após hepatectomia parcial (Fausto et al., 2006). Os mecanismos iniciais da regeneração hepática envolvem ativação de células de Kupffer e das células estreladas, que produzem citocinas pró-inflamatórias. As principais citocinas envolvidas são o TNF-alfa (Tumor Necrosis Factor-alpha) e a interleucina-6 (IL-6) Essa sinalização possibilita ao

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hepatócito em estado de quiescência (G0) passar, através de G1, para a fase S do ciclo celular, sintetizar DNA e proliferar (Taub, 2004; Fausto & Riehle, 2005; Sudo et al., 2008). A liberação de IL-6 constitui um passo crucial no processo regenerativo e sua ação ocorre pela ativação de genes da resposta de fase aguda, pela redução da apoptose dos hepatócitos e pela indução da regeneração hepática (Wuestefeld et al., 2003; Taub, 2004).

Via dos fatores de crescimento

No processo regenerativo hepático, além da via dependente de citocinas, diversos fatores de crescimento estão envolvidos na promoção da replicação celular e incluem o HGF (Hepatocyte Growth Factor), o EGF (Epidermal Growth Factor), o TGF-alfa (Transforming

Growth Factor-alpha), a insulina e o glucagon (Taub, 2004). Esses fatores fornecem os

estímulos necessários para a sobrevivência, crescimento e proliferação dos hepatócitos após diferentes tipos de lesões. Provavelmente HGF, TGF-alfa e HB-EGF (Heparin-Binding

EGF-Like Growth Factor) têm efeitos específicos na replicação dos hepatócitos e na

sobrevivência, e são necessários para uma regeneração ideal (Fausto & Riehle, 2005). A progressão do ciclo celular hepatocitário de G1 para S requer atividade do TGF-alfa e do HGF (Fausto & Campbell, 2003).

O HGF produzido pelas células estromais estimula a proliferação das células epiteliais, a mobilidade, a morfogênese e a angiogênese em diversos órgãos através de fosforilação da tirosina em seu receptor, c-Met. Está estocado na forma inativa na matriz extracelular de vários tecidos e pode ser liberado pela ação de proteases. O HGF está envolvido em múltiplos processos de diversos tipos de células (Fausto & Riehle, 2005) e é necessário no reparo de lesões do fígado, rins, pulmões, entre outros, e possui efeito protetor sobre os órgãos através de sinalização antiapoptótica e anti-inflamatória. Pacientes em insuficiência hepática aguda ou transplantados que receberam fígado pequeno para o seu tamanho apresentam altas concentrações séricas de HGF (Ninomiya et al., 2003; Ninomiya

et al., 2010).

No fígado, o HGF é produzido pelas células não parenquimatosas, particularmente pelas células estreladas, e atua sobre os hepatócitos por mecanismo parácrino ou endócrino regulando vários processos metabólicos (Pediaditakis et al., 2001; Taub, 2004). No fígado lesionado, o HGF atua diretamente na proliferação celular e parece ocorrer tanto liberação de HGF pré-formado, como a aceleração da transcrição gênica (Taub, 2004; Fausto & Riehle, 2005). Após a lesão hepática, o precursor do HGF (pró-HGF) é ativado rapidamente por proteases como a uPA (urokinase-type plasminogen activator) e o plasminogênio

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(Pediaditakis et al., 2001; Shimizu et al., 2001; Currier et al., 2003; Shanmukhappa et al., 2009).

O TGF-alfa é um ligante membro da família dos fatores de crescimento epidérmico. É o único fator de crescimento produzido pelos hepatócitos e atua como um agente autócrino ligando-se a receptores existentes nos próprios hepatócitos (Mead & Fausto, 1989; Fausto & Riehle, 2005). A forma precursora do TGF-alfa está ancorada à membrana celular e é liberada pelo efeito das metaloproteinases (Argast et al., 2004; Fausto & Riehle, 2005). Embora tenha efeitos sobre a motilidade celular e a vascularização tecidual, o principal efeito do TGF-alfa no fígado é a promoção da proliferação hepatocitária. A expressão de RNA mensageiro (mRNA) de TGF-alfa é muito baixa no fígado normal, mas, após a hepatectomia parcial, aumenta antes do início da replicação do DNA. Contudo, estudos com camundongos knock-out para TGF-alfa não mostraram defeito na regeneração do fígado após hepatectomia parcial, possivelmente por que há sobreposição de atuação dos vários ligantes da família dos EGF (Fausto & Riehle, 2005).

Outro fator da família EGF envolvido na regeneração hepática é o HB-EGF. A expressão de HB-EGF está muito aumentada no fígado em regeneração após hepatectomia parcial. Sua expressão precede o aumento de HGF e TGF-alfa e possivelmente regula a transição da fase de sensibilização para a replicação do DNA no hepatócito (Su et al., 2002; Fausto & Riehle, 2005; Mitchell et al., 2005). Pacientes submetidos a grandes ressecções hepáticas apresentam níveis plasmáticos aumentados por 5 a 7 dias após a cirurgia (Yamada

et al., 1997). A deficiência na expressão do HB-EGF determina atraso na replicação do DNA

após hepatectomia parcial (Fausto & Riehle, 2005).

Via metabólica

Uma terceira via de regulação da regeneração hepática tem sido observada. Na via metabólica a demanda metabólica e a oferta de nutrientes estimulariam a proliferação hepatocitária na busca da homeostase sistêmica de nutrientes. A regeneração hepática seria uma resposta às exigências corporais e de todo organismo. Contudo, há poucos estudos abordando essa forma de estimulação da proliferação hepatocitária (Nelsen et al., 2003; Fausto et al., 2006).

Mecanismos de indução gênica da regeneração hepática

O mecanismo pelo qual a hepatectomia parcial leva à indução gênica de citocinas e à ativação de fatores de transcrição ainda não é totalmente conhecido (Campbell et al., 2006).

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Alguns estudos sugerem que os lipopolissacarídeos (LPS) de origem entérica podem ser o agente estimulante da produção inicial de citocinas pró-inflamatórias no processo regenerativo hepático. LPS e outros produtos bacterianos e virais se ligam a receptores específicos (TLR), os quais regulam a imunidade inata e adaptativa (Fausto & Riehle, 2005; Campbell et al., 2006). O aumento absoluto ou relativo de LPS ou de endotoxinas de origem bacteriana intestinal no tecido hepático foi sugerido como um fator mediador do aumento de TNF-alfa. Ratos tratados com antibióticos e com flora intestinal livre de bactérias têm atraso no pico da replicação do DNA após hepatectomia. A administração de LPS sensibiliza os hepatócitos aos fatores de crescimento em ratos não operados (Webber et al., 1998). Entretanto, em camundongos knock-out para TLR ou deficientes em Cd14, uma molécula que participa na ligação do LPS ao seu receptor, não houve atraso na replicação hepatocitária após hepatectomia parcial (Campbell et al., 2006). Contudo, camundongos knock-out para Myd88, uma molécula intracelular chave nas vias de sinalização do LPS e de outras citocinas, apresentaram redução na expressão do TNF-alfa tecidual e nos níveis de séricos de IL-6. Esses resultados sugerem que ligantes que compartilham a via de sinalização com LPS, ao invés do próprio LPS, poderiam desencadear a liberação de citocinas na fase inicial da regeneração hepática (Fausto & Riehle, 2005; Campbell et al., 2006).

Os complementos C3 e C5, potentes mediadores inflamatórios, foram indicados como agentes estimulantes da citocinas pró-inflamatórias na regeneração. Camundongos deficientes em C3 e C5 apresentam redução na ativação de citocinas e na replicação de DNA após hepatectomia parcial. Em particular, nos animais deficientes em ambos os complementos há redução na produção de TNF-alfa e IL-6 e pobre ativação de NF-kappa B (Nuclear Factor-kappa B) e STAT3 (Signal Transducer and Activator of Transcription 3). A administração do complemento deficiente restabeleceu a resposta regenerativa (Strey et al., 2003). Esses dados sugerem que os complementos podem ser sinalizadores do início da regeneração através da indução da produção de citocinas. Entretanto, não são conhecidos quais são os agentes responsáveis pelo aumento nos componentes dos complementos após a hepatectomia parcial (Daveau et al., 2004; Fausto & Riehle, 2005; Michalopoulos, 2007).

2.1.2. Mecanismos de finalização da regeneração hepática

Há pouco conhecimento sobre os mecanismos envolvidos na finalização do processo de regeneração hepática. Possivelmente a restauração da função e da massa hepática seja um dos controladores do processo. Entretanto, os mecanismos exatos que regulam e que reconhecem o restabelecimento do estado de equilíbrio funcional hepático não são

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conhecidos (Fausto & Riehle, 2005). A manutenção da homeostase energética, com equilíbrio entre a capacidade geradora de energia do fígado e a demanda corporal de glicose, poderia ser um dos fatores determinantes do encerramento da regeneração hepática (Michalopoulos, 2010).

A redução dos fatores estimulantes que induziram inicialmente a regeneração hepática ocorre via expressão gênica de moléculas como o SOCS3 (Suppressor of Cytokine

Signaling 3) e o TGF-beta (Transforming Growth Factor-beta). O SOCS3, induzido pela

IL-6, provavelmente interage com a JAK (Janus kinase), inibindo a expressão de STAT3 e potencialmente encerrando a sinalização da IL-6 (Taub, 2004; Fausto & Riehle, 2005). Entretanto, SOCS3 não é essencial para o término da resposta regenerativa. Camundongos

knock-out SOCS3 não apresentam diferença na massa hepática no final do processo

regenerativo (Riehle et al., 2008; Alison et al., 2009).

O TGF-beta 1 é produzido pelas células mesenquimais na maioria dos tecidos e tem ação inibidora da mitose para a maioria das células epiteliais (Michalopoulos & DeFrances, 1997). No fígado o TGF-beta é produzido principalmente pelas células estreladas hepáticas (Ikeda et al., 1998). A síntese de TGF-beta começa 2 a 3 horas após hepatectomia parcial, possivelmente induzida pelo HGF e EGF e permanece elevada por até 72 horas. Os níveis séricos também aumentam logo após a hepatectomia parcial, permanecendo elevados por várias horas. Durante a regeneração os hepatócitos se tornam resistentes aos efeitos inibitórios do TGF-beta devido à redução da expressão de seus receptores (Jakowlew et al., 1991; Michalopoulos & DeFrances, 1997; Michalopoulos et al., 2001). Ao final do processo de regeneração, sua ação é restabelecida, auxiliando no retorno dos hepatócitos ao seu estado quiescente (Michalopoulos & DeFrances, 1997; Campbell et al., 2001; Taub, 2004).

2.2. INSUFICIÊNCIA HEPÁTICA AGUDA

O fígado tem um papel sistêmico e vital para a homeostase metabólica e para a manutenção da vida. Diferentes graus de lesão hepática repercutem de formas diversas sobre os outros órgãos e sobre o organismo como um todo (Taub, 2004; Michalopoulos, 2010). A insuficiência hepática aguda é a expressão da perda da função hepática resultante da necrose aguda do fígado, que se origina de diversas causas com evolução e desfechos variados (Sass & Shakil, 2005; Lee et al., 2008). Nos Estados Unidos, a incidência de insuficiência hepática aguda é estimada em 2.300 a 2.800 casos por ano, e representa 0,1% de todas as mortes, e 6% das mortes relacionadas ao fígado (Polson & Lee, 2005). Na Alemanha ocorrem de 200 a

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500 casos a cada ano (Canbay et al., 2011). Na infância a insuficiência hepática aguda é uma condição rara e que tem, geralmente, o óbito como resultante do seu curso natural (Kelly, 2002). Diversas são as causas da insuficiência hepática aguda e as duas principais são as hepatites virais agudas e a hepatotoxicidade decorrente de medicações (Polson & Lee, 2005; Sass & Shakil, 2005; Lee, 2008). Em nosso meio, a hepatite viral A é a principal causa de insuficiência hepática aguda em crianças. Entre 1996 e 2006, de 33 crianças com hepatite fulminante avaliadas pelo Programa de Transplante Hepático Infantil do Hospital de Clínicas de Porto Alegre, 13 (39,4%) tinham hepatite A (Ferreira et al., 2008).

A insuficiência hepática aguda ocorre quando a extensão da morte das células hepáticas supera a capacidade regenerativa do fígado e expressa a perturbação das funções hepáticas, com redução na capacidade de eliminação de drogas, toxinas e bilirrubina, diminuição na síntese de fatores de coagulação, alteração na homeostase da glicose e aumento na produção de lactato (Rutherford & Chung, 2008). Como resultado os pacientes tendem a desenvolver icterícia, coagulopatia e hemorragia gastrointestinal, hipoglicemia e acidose, encefalopatia e edema cerebral, infecções bacterianas e fúngicas, síndrome da resposta inflamatória sistêmica e falência de múltiplos órgãos, e frequentemente evoluem para o óbito (Kieling, 2012).

A insuficiência hepática aguda resulta da perda súbita da função do fígado em uma pessoa sem doença hepática pré-existente. Também é chamada de insuficiência ou falência hepática fulminante, de hepatite fulminante ou de necrose hepática aguda. A definição clássica inclui o desenvolvimento de alteração da coagulação (INR >1,5) e de algum grau de alteração mental (encefalopatia) nas primeiras 8 semanas do início dos sintomas, em um indivíduo previamente saudável sem história de doença hepática, e com duração menor de 26 semanas. Tem sido proposto o emprego preferencial do termo insuficiência hepática aguda (acute liver failure) para designar a síndrome de forma geral e que abrangeria as outras nomenclaturas (Polson & Lee, 2005; Lee et al., 2008).

O aprimoramento da assistência intensiva nos últimos anos e o desenvolvimento do transplante de fígado possibilitaram a modificação da história natural e o aumento na sobrevida (Canbay et al., 2011). Devida a sua raridade, existem poucos estudos controlados sobre tratamento e não há padronização dos cuidados intensivos dos pacientes em insuficiência hepática aguda. Por isso, persistem em aberto inúmeras questões sobre o seu desenvolvimento e o seu manejo (Kelly, 2002; Polson & Lee, 2005; Lee et al., 2008).

O transplante de fígado de urgência é o único tratamento definitivo para a maioria dos pacientes em insuficiência hepática aguda e sua introdução como opção terapêutica

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modificou a sobrevida (Farmer et al., 2009; Miloh et al., 2010). Nos Estados Unidos da América, a insuficiência hepática aguda foi o motivo do transplante em cerca de 12% dos pacientes pediátricos (Baliga et al., 2004; Rhee et al., 2006). No Hospital de Clínicas de Porto Alegre (HCPA), a insuficiência hepática aguda motivou o transplante de fígado em 12 dos nossos 100 primeiros transplantes realizados de 1995 a 2006 (Oliveira et al., 2006). Contudo, a sobrevida após o transplante por insuficiência hepática aguda permanece inferior a dos pacientes com doença hepática crônica, devido à alta mortalidade operatória imediata, relacionada principalmente a falência de múltiplos órgãos, sépsis e utilização de enxertos sub-ótimos. A sobrevida em 1 ano descrita na maioria das séries é de cerca de 75% (Mahadeb et al., 2009; Strauss et al., 2009), embora relato recente apresente resultado de mais de 90% de sobrevida no primeiro ano após o transplante (Miloh et al., 2010).

Para a sobrevida dos pacientes em insuficiência hepática aguda, o momento do transplante é um fator crítico. Entretanto, a falta de órgãos disponíveis em tempo hábil dificulta o emprego do transplante como opção terapêutica, e a mortalidade em lista atinge 40% (Polson & Lee, 2005). Cerca de 15% das crianças em insuficiência hepática aguda morrem em lista de espera por um transplante nos Estados Unidos e na Europa (Miloh et al., 2010). A redução da mortalidade em lista pode ser alcançada com a realização precoce do transplante e com a utilização de enxerto partido e de doador vivo. A indicação precoce do transplante aumenta a sua probabilidade de sucesso. Contudo, a sua realização muito cedo encerra a possibilidade de recuperação espontânea através da regeneração hepatocitária (Farmer et al., 2009; Miloh et al., 2010).

2.3. RESPOSTA INFLAMATÓRIA SISTÊMICA NA INSUFICIÊNCIA HEPÁTICA AGUDA

O papel crucial da disfunção imunológica na evolução do paciente em insuficiência hepática aguda, expressa pela síndrome da resposta inflamatória sistêmica desencadeada pela lesão hepática extensa, tem sido recentemente reconhecido (Sato et al., 2004; Lee et al., 2005; Ikegami et al., 2008; Takikawa & Suzuki, 2008).

Em resposta à lesão hepatocelular de qualquer origem, uma reação inflamatória é desencadeada com ativação simultânea de mediadores pró- e anti-inflamatórios que atuarão na sinalização da regeneração hepática (Antoniades et al., 2008). Os mecanismos iniciais da regeneração hepática envolvem ativação de células de Kupffer e a sua liberação de citocinas pró-inflamatórias, como TNF-alfa e IL-6 (Karp, 2009; Liu, 2009).

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Os níveis séricos de citocinas pró-inflamatórias estão relacionados à gravidade da lesão hepática. Pacientes com insuficiência hepática aguda apresentam concentrações maiores dessas citocinas que aqueles com hepatite aguda ou voluntários sadios (Mao et al., 2011). A magnitude do aumento das citocinas pró-inflamatórias (6, TNF-alfa, 1, e IL-8) está relacionada ao desenvolvimento de resposta inflamatória sistêmica (SIRS - Systemic

Inflammatory Response Syndrome), choque circulatório, necessidade de medicação

vasopressora, edema cerebral e morte sem distinção da causa da insuficiência hepática aguda (Wigmore et al., 1998; Nagaki et al., 2000; Streetz et al., 2000; Berry et al., 2010; Chastre et

al., 2010).

A resposta anti-inflamatória inicial à lesão hepática envolve a liberação de IL-10 pelas células de Kupffer com inibição da síntese de citocinas pró-inflamatória (TNF-alfa, IL-6, IL-1 e IL-18), controlando a intensidade da cascata inflamatória (Kono et al., 2006; Tilg et

al., 2006). A IL-10 recombinante administrada em modelos animais de lesão hepática

exerceu um papel hepatoprotetor através da redução da liberação de TNF-alfa (Louis et al., 1997; Nagaki et al., 1999). Yumoto e colaboradores (2002) relataram que níveis mais elevados de IL-10 estavam associados à maior sobrevida de pacientes com hepatite aguda e insuficiência hepática aguda (Yumoto et al., 2002). Esses estudos sugerem que a resposta anti-inflamatória caracterizada pela produção de IL-10, inicialmente melhora a lesão hepática aguda (Asadullah et al., 2003; Antoniades et al., 2008).

Por outro lado, estudos têm demonstrado a associação de níveis elevados de IL-10 com pior desfecho, óbito ou transplante, em pacientes em insuficiência hepática aguda (Nagaki et al., 2000; Antoniades et al., 2006; Berry et al., 2010). A elevação da IL-10 ocorre em até 6 horas após o início do insulto inflamatório e está associada à liberação de mediadores pró-inflamatórios. Entretanto, modelos experimentais de endotoxemia e estudos em seres humanos de sépsis têm documentado uma resposta bifásica da secreção da IL-10 (Antoniades et al., 2008; Berry et al., 2010). Em pacientes queimados que morreram por sépsis um segundo pico de IL-10 foi identificado, ocorrendo nos estágios mais tardios da endotoxemia e associado com a desativação dos monócitos (Yeh et al., 2000; Antoniades et

al., 2008). Possivelmente, na evolução do paciente em insuficiência hepática aguda, o

desenvolvimento de SIRS é contrabalanceado por uma forte e persistente resposta anti-inflamatória compensatória (CARS - Compensatory Anti-inflammatory Response

Syndrome), representada pela elevação da IL-10, caracterizando uma desregulação do

sistema imune (Antoniades et al., 2008). Essa dissonância imunológica, com a perda do equilíbrio entre as atividades pró- e anti-inflamatória, determinaria a predisposição para

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sépsis, falência de múltiplos órgãos, edema cerebral, hipertensão intracraniana e morte, características do estado terminal do paciente em insuficiência hepática aguda (Nagaki et al., 2000; Jalan et al., 2002; Antoniades et al., 2008; Bemeur et al., 2010; Berry et al., 2010).

A terapia celular, pela ação anti-inflamatória das células-tronco, é uma possível opção terapêutica na insuficiência hepática aguda. A modulação da resposta imunológica e o efeito anti-inflamatório dessas células poderiam, através da estimulação da regeneração hepatocitária, promover a recuperação do fígado lesado (Yagi et al., 2009).

2.4. TERAPIA CELULAR NO TRATAMENTO DA INSUFICIÊNCIA HEPÁTICA AGUDA

A terapia através do uso de células surgiu nos últimos anos como uma alternativa promissora para o tratamento de inúmeras doenças (Almeida-Porada et al., 2010). A maioria dos estudos clínicos avaliou o emprego de terapia celular no tratamento de doenças hepáticas crônicas e metabólicas e os principais tipos celulares empregados foram os hepatócitos e as células da medula óssea (Soto-Gutierrez et al., 2009; Russo & Parola, 2011).

Quadro 2 - Tipos celulares empregados nos estudos de terapia de doenças hepáticas.

Hepatócitos:

- Isolados - Fetais

- Imortalizados

Células progenitoras hepáticas

Células-tronco da medula óssea:

- Mesenquimais - Hematopoiéticas

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2.4.1. Transplante de hepatócitos

O transplante de hepatócitos isolados foi empregado em diversos experimentos (Horslen & Fox, 2004; Fitzpatrick et al., 2009) e no tratamento de pacientes com doenças crônicas (Mito et al., 1992; Strom et al., 1997; Dhawan et al., 2005; Khan et al., 2008), metabólicas (Ellor et al., 2008; Enns & Millan, 2008; Khan et al., 2008) e em insuficiência hepática aguda (Habibullah et al., 1994; Bilir et al., 2000; Soriano et al., 2001; Schneider et

al., 2006; Meyburg et al., 2008).

A limitação do emprego de hepatócitos isolados está relacionada à incapacidade de isolamento de um número suficiente de hepatócitos (Muraca, 2011; Vosough et al., 2011). A utilização de células humanas obtidas de culturas primárias seria a opção ideal, devido à capacidade de síntese de proteínas homólogas e à redução do risco de complicações imunológicas. Os hepatócitos seriam isolados de doadores falecidos ou de parte do fígado de um doador vivo e mantidos em cultura ou congelados (Mitry et al., 2004). Contudo, a fonte dessas células é limitada e a manutenção dessas culturas apresenta dificuldades de viabilidade e de perda de funções celulares (Grad-Itach et al., 2003; Muraca, 2011; Vosough

et al., 2011).

Os hepatócitos fetais também podem ser considerados como uma fonte alternativa de células para o transplante celular em modelos animais de insuficiência hepática ou doença metabólica, contudo questões éticas limitam sua aplicabilidade em seres humanos (Horslen & Fox, 2004; Fitzpatrick et al., 2009; Kisseleva et al., 2010).

As linhagens de hepatócitos humanos imortalizados constituem uma boa fonte de células, pois apresentam crescimento ilimitado. Entretanto, além do risco de desenvolvimento de câncer, a expressão fenotípica metabólica dessas células pode estar alterada, inviabilizando a restauração da função hepática após o seu transplante (Nakamura

et al., 1997; Fitzpatrick et al., 2009).

2.4.2. Transplante de células da medula óssea

As células-tronco da medula óssea, devido a sua capacidade de diferenciação em diversos tipos celulares, entre eles hepatócitos e colangiócitos, têm sido estudadas como opção terapêutica nas doenças hepáticas agudas e crônicas (Fitzpatrick et al., 2009; Almeida-Porada et al., 2010). Elas apresentam diversas vantagens quando utilizadas como fonte alternativa aos hepatócitos, pois estão prontamente disponíveis e seu número pode ser ampliado in vitro e in vivo. As células-tronco também seriam mais resistentes à

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criopreservação e menos imunogênicas que os hepatócitos (Almeida-Porada et al., 2010; Ismail et al., 2010; Nikeghbalian et al., 2011). O uso de células autólogas, como da medula óssea, eliminaria a necessidade de imunossupressão (Lysy et al., 2008).

A medula óssea é constituída de diferente subpopulações de células, em diversos estágios de diferenciação. A fração mononuclear da medula óssea contém além dos linfócitos e macrófagos, as células-tronco hematopoiéticas e mesenquimais, e pode ser isolada por centrifugação e gradiente de densidade de Ficoll. As células-tronco mesenquimais e hematopoiéticas necessitam isolamento e purificação em cultura e não há padronização dos métodos utilizados nos diferentes laboratórios (Almeida-Porada et al., 2010; Russo & Parola, 2011).

Usualmente a regeneração hepática envolve principalmente hepatócitos maduros. Quando a lesão hepática é tão extensa que compromete o potencial de mitose dos hepatócitos, outros tipos celulares podem ser envolvidos e contribuem com o processo regenerativo (Korbling et al., 2002; Austin & Lagasse, 2003; Cantz et al., 2008; Viebahn & Yeoh, 2008). A segunda fonte de células mobilizadas na regeneração hepática se compõe das células ovais, que são células-tronco ou progenitoras situadas dentro do fígado (Thorgeirsson, 1996; Dalakas et al., 2005; Oh et al., 2007). Uma terceira fonte de células que podem participar da regeneração hepática são as células-tronco da medula óssea (Petersen et al., 1999; Korbling et al., 2002; Austin & Lagasse, 2003; Piscaglia et al., 2008). Estudos com seres humanos (Alison et al., 2000; Theise et al., 2000) e em animais (Petersen

et al., 1999; Lagasse et al., 2000; Theise et al., 2000; Oertel & Shafritz, 2008) sugerem que

as células da medula óssea podem se diferenciar em hepatócitos e repovoar o fígado sob condições especiais, tal como na radiação subletal de corpo inteiro e na doença hepática crônica (Zhang et al., 2009). Apesar disso, os mecanismos e a cinética de mobilização das células da medula óssea permanecem pouco compreendidos (Zocco et al., 2011).

Em modelos animais, o grau de contribuição das células-tronco da medula óssea parece ser proporcional à extensão de danos e à redução da capacidade regenerativa das células hepáticas (Thorgeirsson & Grisham, 2006; Zocco et al., 2011). Resultados de experimentos em modelos animais sugerem que a indução de lesão parenquimatosa é um pré-requisito para a migração e o repovoamento pelas células-tronco (Schwartz et al., 2002; Muraca, 2011).

Em seres humanos, poucos relatos foram publicados sobre a contribuição das células da medula óssea em pacientes submetidos à ressecção parcial do fígado (De Silvestro et al., 2004; Di Campli et al., 2005; Gehling et al., 2005; Lemoli et al., 2006; Herencia et al., 2011;

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Zocco et al., 2011). Alguns artigos mostraram envolvimento dessas células na regeneração hepática, enquanto outros autores não descreveram esse efeito (Di Campli et al., 2005; Menegazzo et al., 2008; Herencia et al., 2011). Os resultados relatados também foram conflitantes em termos do tipo de célula-tronco mobilizada (Di Campli et al., 2005). Essas diferenças estão provavelmente relacionadas à escassez e à heterogeneidade dos pacientes avaliados e aos diferentes desenhos de estudos (Zocco et al., 2011).

O microambiente do fígado parece ser crucial para a regulação do equilíbrio homeostático hepático e alguns sinais químicos poderiam estimular o recrutamento de células-tronco, tanto do próprio fígado, como da medula óssea através da circulação (Piscaglia et al., 2008; Zocco et al., 2011). Aparentemente o processo de recrutamento celular é finamente regulado por variações nos níveis de citocinas e enzimas proteolíticas envolvidas na degradação da matriz e na regeneração hepática (Kollet et al., 2003; Dalakas

et al., 2010; Herencia et al., 2011). As moléculas como o SCF (Stem Cell Factor) e SDF-1

(Stromal Cell-Derived Factor-1) têm papel fundamental na estimulação da proliferação e da mobilização das células-tronco e seus níveis podem ser influenciados pelo grau de lesão hepática (Hatch et al., 2002; Kollet et al., 2003; Baccarani et al., 2006; Swenson et al., 2008; Herencia et al., 2011). Alguns fatores de crescimento, como o HGF, o TGF-alfa e o G-CSF (Granulocyte-Colony Stimulating Factor) também poderiam estar relacionados à mobilização celular, atuando sobre as células-tronco do próprio fígado e da medula óssea, como um fator quimiotáxico e mitogênico autócrino e parácrino (Yannaki et al., 2005; Gaia

et al., 2006; Piscaglia et al., 2008; Jin et al., 2010; Herencia et al., 2011).

Os mecanismos pelos quais essas células da medula óssea exercem seus efeitos benéficos sobre a regeneração hepática não estão completamente esclarecidos e permanecem como uma questão em aberto (Quadro 3). Diversos possíveis efeitos têm sido sugeridos e envolveriam a ampliação do número de hepatócitos por transdiferenciação ou por fusão celular, o estímulo à regeneração através da liberação de fatores tróficos, a inibição da apoptose, e a modulação do processo inflamatório local e sistêmico (Houlihan & Newsome, 2008; Almeida-Porada et al., 2010). Por exemplo, as células-tronco mesenquimais são conhecidas por secretar diversas moléculas bioativas, que através de um efeito parácrino sobre a dinâmica celular local, estimulam a regeneração das células parenquimatosas endógenas e a recuperação dos tecidos (Caplan & Dennis, 2006; Parekkadan et al., 2007; Parekkadan et al., 2007; Meirelles Lda et al., 2009; Zhang et al., 2009; Lin et al., 2011). Em um modelo de lesão hepática aguda por D-Galactosamina, o tratamento com meio condicionado de células-tronco mesenquimais aumentou a sobrevida, melhorou a