PALAVRAS CHAVE: Antimicrobiano, extratos brutos, Petiveria alliacea. KEY WORDS: Crude extracts, Antimicrobial, Petiveria alliacea.
* Autor a quem correpondência deve ser enviada: E-mail: wpoliv@fcfrp.usp.br Lat. Am. J. Pharm. 28 (4): 520-4 (2009)
Received: March 24, 2009 Accepted: April 3, 2009
Atividade Antimicrobiana de Extratos Brutos de Petiveria alliacea L.
Rodrigo C.M. GUEDES 1,3, Natália G.P. NOGUEIRA 1, Ana M. FUSCO-ALMEIDA 1,2,Cláudia R.F. SOUZA 3& Wanderley P. OLIVEIRA 3*
1Faculdade de Ciências Farmacêuticas, Universidade de Ribeirão Preto, Ribeirão Preto- SP-14096-900, Brasil.
2Faculdade de Ciências Farmacêuticas de Araraquara,
Universidade Estadual Paulista Júlio de Mesquita Filho, UNESP, Araraquara-SP-14801-902, Brasil 3Faculdade de Ciências Farmacêuticas de Ribeirão Preto, Universidade de São Paulo,
Ribeirão Preto- SP-14040-903, Brasil.
RESUMO. Petiveria alliacea L. (Phytolaccacea) é uma planta herbácea nativa da floresta Amazônica e das áreas tropicais da América do sul, central, Caribe e África, de grande importância na medicina tradicio-nal. Essa espécie vegetal tem sido amplamente utilizada em diversas aplicações como, por exemplo, anti-reumático, antineoplásico, antigripal, antitussígeno, analgésico, inseticida, ascaricida, bactericida e fungi-cida. Atualmente os microrganismos patogênicos estão adquirindo resistência aos antibióticos tradicionais, e a procura por novos agentes antimicrobianos a partir de plantas vem sendo intensificada. Nesta perspec-tiva, avaliou-se o efeito antimicrobiano de extratos brutos (partes aéreas) de P. alliacea frente às bactérias
(Bacilus subtilis, Pseudomonas aeruginosa, Escherichia coli, Streptococcus mutans, Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis, Enterococcus faecalis) e leveduras (Candida parapsilosis, Candida kefyr e Can-dida albicans) utilizando técnicas de microdiluições. Resultados promissores foram observados para o
ex-trato etanólico 70% v/v que apresentou concentração mínima inibitória (CMI) entre 250-760 μg/mL para leveduras. Para bactérias a CMI variou entre entre 240-3960 μg/mL, dependente das soluções extrativas analisadas.
SUMMARY. “Antimicrobial activity of crude extratcs of Petiveria alliacea L.”. Petiveria alliacea L. (Phytolac-cacea) is an herbaceous plant of great importance in traditional medicine. This species have been widely used in several applications such as antirheumatic, anticarcinogenic, anti-flu, antitussive, analgesic, insecticidal, acarici-dal, as well as bactericide and fungicide. Currently, the pathogenic microorganisms are acquiring resistence against the traditional antibiotics, and the search for new herbal antimicrobial agents has been intensified. The objective of this study was to evaluate the antifungal and antibacterial activity of several leaf crude extracts of P. alliacea against several strains of bacterias and yeasts namely Bacilus subtilis, Pseudomonas aeruginosa, Es-cherichia coli, Streptococcus mutans, Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis, Enterococcus fae-calis, Candida parapsilosis, Candida kefyr and Candida albicans, using microdilution method. Promising results were observed for the 70% v/v ethanolic extract which presented minimum inhibitory concentration (MIC) from 250 to 760 μg/mL for yeast. For the bacteria strains tested the MIC ranged between 240 to 3960 μg/mL, depend-ing of the extractive solution tested.
INTRODUÇÃO
Nos países em desenvolvimento as doenças estão relacionadas com a falta de saneamento básico, desnutrição e dificuldade de acesso aos medicamentos. Por essa razão, e decorrente do uso etnomedicinal, a fitoterapia é amplamente praticada. Segundo Organização Mundial da Saúde, seja por motivo de pobreza ou precarie-dade no sistema de saúde, entre 65 a 80% da
população mundial buscam as plantas medici-nais para fins terapêuticos 1.
Entre as plantas medicinais mais utilizadas pela população poucas têm ação comprovada cientificamente. Entretanto, o uso popular tradi-cionalmente consolidado tem sido utilizado co-mo guia para pesquisas farmacológicas 2. As plantas são inestimáveis fontes de produtos far-macêuticos e a coleção destas plantas inseridas
em vários biomas brasileiros, tem despertado a atenção de etnofarmacologistas ao redor do mundo 3.
Atualmente, a busca por novos agentes anti-microbianos se faz necessária devido ao surgi-mento de microrganismos resistentes e de infec-ções oportunistas fatais, associadas a AIDS, qui-mioterapia antineoplásica e transplantes. O estu-do de agentes antimicrobianos tem grande abrangência, sendo ponto crucial em vários se-tores do campo farmacêutico e cosmético. O Brasil oferece uma imensa biodiversidade que pode contribuir significativamente no desenvol-vimento do campo da saúde em nível mundial, fornecendo substâncias mais eficazes e menos tóxicas na corrida contra a resistência e o surgi-mento de microrganismos patogênicos 4. As plantas medicinais têm sido freqüentemente uti-lizadas no tratamento de várias doenças, consti-tuído uma importante fonte de novos compo-nentes biologicamente ativos. Compocompo-nentes an-timicrobianos presentes em plantas podem ini-bir o crescimento bacteriano e fúngico por dife-rentes mecanismos de ação possuindo um signi-ficativo valor clínico 5.
De uma forma geral, a atividade antimicro-biana de extratos vegetais é avaliada através da determinação da quantidade mínima de substân-cia necessária para inibir o crescimento do mi-crorganismo, sendo esse valor conhecido como Concentração Mínima Inibitória (CMI). Na deter-minação da CMI, o método da microdiluição, desenvolvido por Eloff 6, vem sendo bastante utilizado, principalmente devido à sua sensibili-dade e quantisensibili-dade mínima de reagentes, o que possibilita um maior número de réplicas, au-mentando a confiabilidade dos resultados 4. Um aspecto bastante relevante na determinação da CMI de extratos vegetais é a preocupação em relação a aspectos toxicológicos, microbiológi-cos e legais pertinentes aos compostos naturais ou suas combinações.
Petiveria alliacea L. (guiné) é um subarbusto perene, nativa da floresta Amazônica e das áreas tropicais da América do sul, central, Caribe e África 7. Preparações a base de P. alliacea L. têm sido extensivamente utilizadas na medicina tradicional da América do Sul e Central para o tratamento da muitas doenças. Segundo a litera-tura, esta planta pode exibir efeitos antiinflama-tórios, antihelmíntico, antimicrobianos, antineo-plásicos e estimulantes, além de inúmeras outras indicações terapêuticas 7-9. P. alliacea contém uma diversidade de compostos biologicamente ativos presentes no óleo essencial (petiverina),
glicosídeos saponínicos, isoarborinoltriterpeno, isoarborinol-acetato, isoarborinol-cinamato, este-róides, alcalóides, flavonóides e taninos. De acordo com a literatura, as análises químicas de raízes e folhas do guiné têm revelado cumari-nas, sulfetos (trissulfeto de hidroxi-etil-benzila, dissulfeto de dibenzila e trissulfeto de dibenzi-la), estilbenos (cis e trans-estilbenos), benzal-deído, ácido benzóico, álcool benzílico, benzoa-to de benzila, nitrabenzoa-to de potássio, β-sitosterol, ácidos urônicos, álcool ducosílico, lupenona, isoarborinol, acetato de isoarborinol, cinamato de isoarborinol, polifenóis, tritiolaniacina, pini-tol, ácido linocérico, ácido resinoso, α-friedeli-nol, glicose e glicina 7,8.
O presente trabalho teve por objetivo o pre-paro e avaliação de extratos brutos em diferen-tes sistemas solvendiferen-tes, quantificando polifenóis e flavonóides totais como marcadores químicos determinando-se a atividade antimicrobiana frente a cepas padrões de bactérias e leveduras. MATERIAL E MÉTODOS
Material vegetal Colheita e secagem
Partes aéreas de Petiveria alliacea foram co-lhidas na região de Ribeirão Preto, SP, Brasil, no período de dezembro de 2007. As folhas foram separadas, limpas e posteriormente secas em es-tufa com circulação de ar à temperatura de 40 °C pelo período de 2 dias. Após a secagem os materiais vegetais foram moídos em moinho de facas até uma granulometria média de 300 mm. Preparação das soluções extrativas
A obtenção dos extratos brutos do material vegetal foi realizada por maceração dinâmica, à temperatura de 50 °C e tempo de extração de 90 min. Os sistemas solventes empregados fo-ram hexano, álcool metílico, álcool etílico, eta-nol 70% v/v, água purificada. A Figura 1 apre-senta o fluxograma do processo extrativo e so-luções extrativas obtidas. Após a extração, as soluções extrativas resultantes foram filtradas em sistema de filtração a vácuo, sendo poste-riormente concentradas até a secura em evapo-rador rotativo, eliminando-se desta forma qual-quer resíduo de solventes para a realização dos ensaios microbiológicos. As soluções extrativas foram analisadas quanto ao seu teor de sólidos, concentração de flavonóides e polifenóis totais. Caracterização das soluções extrativas
As soluções extrativas obtidas foram caracte-rizadas através da determinação do teor de
sóli-dos, teor de flavonóides totais e de polifenóis totais. O teor de sólidos totais foi determinado pelo método gravimétrico segundo especificado pela Farmacopéia Brasileira 10. A metodologia para a dosagem de flavonóides totais por espec-trofotometria de UV-Vis foi baseado no método descrito e validado por Souza 11, que consiste na reação dos flavonóides com o cloreto de alu-mínio, sendo o comprimento de onda desloca-do para 425 nm. A metodesloca-dologia para a desloca-dosagem dos polifenóis totais foi baseada no método de Folin-Denis que consiste na redução do ácido fosfomolibdico-fosfotúngico pelos compostos fe-nólicos em meio básico produzindo uma colora-ção azul intensa a qual é mensurada por espec-trofotometria em comprimento de onda de 760 nm 12,13.
Avaliação da atividade antimicrobiana A atividade antimicrobiana dos diferentes ex-tratos obtidos foi realizada através da determina-ção da concentradetermina-ção mínima inibitória, concen-tração mínima bactericida e concenconcen-tração míni-ma fungicida, empregando-se cepas padrões de bactérias e leveduras.
Atividade antibacteriana
Os ensaios para determinação da atividade antibacteriana foram desenvolvidos de acordo com documento M7-A414 do CLSI (Clinical and Laboratory Standards Institute) com modifica-ções, empregando-se como controle positivo a Ampicilina. Foram selecionadas as bactérias Gram-positivas: Bacilus subtilis ATCC6633,
Figura 1. Fluxograma processo extrativo e tipos de extratos obtidos.
Streptococcus mutans ATCC27175, Staphylococ-cus aureus ATCC25923, StaphylococStaphylococ-cus epider-midis ATCC27853, Enterococcus faecalis ATCC29212 e Gram-negativa: Pseudomonas ae-ruginosa ATCC27853, Escherichia coli ATCC25922. As cepas foram inoculadas nas mi-croplacas com concentração final de 0.5-1.5 x 104UFC/mL. Os extratos vegetais foram diluídos em DMSO e BHI. Subsequentemente foram fei-tas diluições seriadas, obtendo assim concentra-ções decrescentes.
As microplacas foram incubadas em estufa bacteriológica a 37 °C, durante 24 horas. Decor-rido este intervalo de tempo foram determina-das a CMB (concentração mínima bactericida) em cada uma das placas de Mueller-Hinton Agar. Posteriormente acrescentou-se a cada um dos orifícios uma solução aquosa de TTC (clore-to de trifenil tetrazolium), e as microplacas fo-ram novamente re-incubadas por mais três ho-ras a 37 °C. Após esta última incubação a pre-sença de uma coloração vermelha nos orifícios era interpretada como prova negativa inibitória do extrato. Todos os ensaios foram realizados em triplicatas.
Atividade antifúngica
Os ensaios para determinação da atividade antifúngica foram desenvolvidos de acordo com o documento M27-A2 15 do CLSI (Clinical and Laboratory Standards Institute) com modifica-ções, empregando-se como controle positivo o Fluconazol. Os ensaios foram realizados utili-zando-se as leveduras Candida parapsilosis ATCC22019, Candida kefyr ATCC6258 e Candi-da albicans ATCC90028. Estas cepas foram ino-culadas na concentração final nas placas de 0.5-1.5 x 104 UFC/mL. Os extratos vegetais foram diluídos em DMSO e RPMI e acrescentados no segundo poço das microplacas. Subsequente-mente foram feitas as diluições seriadas, obten-do assim concentrações decrescentes.
As microplacas foram incubadas com agita-ção a 37 °C durante 24 horas. Decorrido este in-tervalo de tempo foi determinada a CMF (con-centração mínima fungicida) em cada uma das microplacas de Saubouroud Agar. Posteriormen-te foi acrescido a cada um dos orifícios uma so-lução aquosa de TTC (cloreto de trifenil tetrazo-lium), sendo as microplacas novamente re-incu-badas por mais três horas a 37 °C. A CMI foi de-finida como a menor concentração do extrato em µg/mL capaz de impedir o crescimento de levedura. Os ensaios foram realizados em qua-driplicatas.
RESULTADOS E DISCUSSÃO
As soluções extrativas obtidas foram caracte-rizadas quanto ao teor de sólidos, teor de flavo-nóides e teor de polifenóis totais. A Tabela 1 apresenta os resultados obtidos. Não foi realiza-da a caracterização realiza-da solução hexânica devido à baixa concentração de flavonóides e polife-nóis. O extrato aquoso forneceu maior concen-tração de sólidos em relação ao extrato etanóli-co 70%, o que foi atribuído parcialmente à pou-ca seletividade da água, que pode ter sido res-ponsável pela extração de substâncias indesejá-veis como sais inorgânicos e impurezas orgâni-cas. Por essas razões, a água é raramente em-pregada para a extração de constituintes ativos a partir fontes vegetais 16. O extrato etanólico à 70%, permitiu a obtenção de um extrato com maior concentração de polifenóis totais e flavo-nóides totais. A solubilidade em um sistema misto (etanol e água) em geral é maior do que a
Extratos Ts 1 PT 2 FT 3 (%) (µg/mL) (µg/mL) Etanol 70% 1,37 3,42 1,68 Água 2,22 3,40 0,97 Folhas Etanol 0,46 2,24 0,51 Metanol 1,42 1,88 1,21 Hexano 0,35 NC NC
Tabela 1. Quantificação química dos extratos brutos 1 Teor de sólidos dos extratos brutos em %; 2 Polife-nóis totais expresso em (µg/mL); 3 Flavonóides totais expresso (µg/mL); NC não caracterizado.
prevista a partir da solubilidade da substância em cada um dos solventes separados 16,17.
A Tabela 2 apresenta os resultados de con-centração mínima inibitória (CMI) dos extratos brutos de P. alliacea determinados pelo método de microdiluição em caldo. A CMI variou entre 240-3960 µg/mL, dependendo do solvente extra-tor empregado. As Concentrações Mínina Bacte-ricida (CMB) e fungicida (CMF) seguiram os mesmo comportamentos observados na CMI. Os resultados evidenciam uma maior inibição de microrganismo para o extrato etanólico 70%, o que pode ter relação com a maior concentração de polifenóis e flavonóides totais. A avaliação das soluções extrativas hexânica e metílica apre-sentaram CMI de 240 µg/mL, respectivamente para o S. aureus e E. faecalis, resultando uma maior eficácia em relação ao extrato etanólico 70% para estas duas bactérias.
O extrato etanólico 70% demonstrou ativida-de antifúngica em concentrações na faixa ativida-de 250-760 µg/mL, para as diferentes cepas de le-veduras avaliadas. Ensaios realizados por Kim et al. 18, onde avaliou-se a concentração mínima inibitória de compostos derivados da cisteína isolados de P. alliacea, demonstrou intervalo de inibição para Candida albicans de 128-256 µg/mL, e para o Staphylococcus aureus de 512 µg/mL, não sendo observada inibição para a Es-cherichia coli. Outra classe de compostos como benzil polissulfetos apresentou CMI para o Stap-hylococcus aureus na faixa de 64-256 µg/mL.
Parte
Solvente ATCC ATCC ATCC ATCC ATCC ATCC ATCC ATCC ATCC ATCC vegetal 25923 27853 29212 27175 6633 25922 27853 22019 6258 90028 Folhas Hexanico 240 - - - -Metílico - - 240 - - - -Etanol 70% 3960 3960 3960 3960 3960 3960 3960 250 760 760 Aquoso - - - -Etanólico - - - -Controle + Amplicilina 0,976 0,976 0,976 0,976 0,976 0,976 0,976 Fluconazol 2 16 0,125
Tabela 2. Atividade antimicrobiana dos extratos de P. alliacea, avaliado através da CMI. (-) ausência de inibi-ção. Todas as concentrações acima estão expressas em µg/mL, os CMB e CMF apresentaram valores respectivos à concentração mínima inibitória.
Bactérias
Gram-positivas Gram-negativas
Extratos
Leveduras
Para a Candida albicans algumas substâncias apresentaram concentração de inibição superior à 512 µg/mL.
Kubec 19isolou um óleo ardente de cor ama-rela estimulante do sistema lacrimal e avaliou atividade antimicrobiana frente a vários microor-ganismos entre eles a Candida albicans, que apresentou halo de inibição com concentração de 20 µg/mL, o Staphylococcus aureus na con-centração de 100 µg/mL e Escherichia coli com concentração de 40 µg/mL. Para a Pseudomonas aeruginosa não foi observada inibição. Estes re-sultados estão em nítida concordância com os resultados deste estudo uma vez que os efeitos terapêuticos de muitas plantas medicinais não resultam da ação isolada de um único compos-tos químico e sim da complexa ação de sinergis-mo e antagonissinergis-mo de várias substâncias 20.
CONCLUSÃO
Os resultados deste trabalho demonstraram que os extratos etanólicos à 70% possuem am-plo espectro de ação antimicrobiana, provavel-mente relacionada com a maior quantidade de polifenóis totais e flavonóides totais obtidos pa-ra esse extpa-rato (3,42 e 1,68 µg/mL). Entretanto os valores de CMI para os extratos etanólicos 70% para as bactérias avaliadas foram elevados (≈3960 µg/mL). Para as leveduras valores de CMI na faixa de 250 a 760 µg/mL foram obser-vados. As soluções extrativas hexânica e metíli-ca apresentaram CMI de 240 µg/mL, para o S. aureus e E. faecalis, resultando em maior eficá-cia em relação ao extrato etanólico 70% para es-tas duas bactérias. O amplo espectro de ação detectado deve-se provavelmente ao sinergismo entre vários componentes presentes no extrato etanólico 70% de P. alliacea. Os resultados aqui reportados são promissores e justificam a reali-zação de futuros estudos visando a semi-purifi-cação de frações bioativas, bem como a avalia-ção in vivo da atividade antimicrobiana e a rea-lização de estudos toxicológicos com extratos e frações de P. alliacea.
Agradecimentos. Os autores agradecem à Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FA-PESP) e ao Centro Nacional de Pesquisa (CNPq) pelo apoio financeiro. Agradecimentos também ao Labora-tório de Microbiologia da Faculdade Ciências Farma-cêuticas - Universidade de Ribeirão Preto (UNAERP) pela realização dos testes antimicrobianos.
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