UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO FACULDADE DE MEDICINA DE RIBEIRÃO PRETO DEPARTAMENTO DE GENÉTICA

UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO

FACULDADE DE MEDICINA DE RIBEIRÃO PRETO DEPARTAMENTO DE GENÉTICA

ANÁLISE DA EXPRESSÃO GÊNICA NO DERMATÓFITO Trichophyton rubrum MIMETIZANDO A INFECÇÃO IN VITRO: pH E DIFERENTES FONTES DE

CARBONO REGULANDO GENES

FERNANDA CRISTINA DE ALBUQUERQUE MARANHÃO

Ribeirão Preto – SP 2008

FERNANDA CRISTINA DE ALBUQUERQUE MARANHÃO

ANÁLISE DA EXPRESSÃO GÊNICA NO DERMATÓFITO Trichophyton rubrum MIMETIZANDO A INFECÇÃO IN VITRO: pH E DIFERENTES FONTES DE

CARBONO REGULANDO GENES

Orientação: Profa. Dra. Nilce Maria Martinez Rossi

Ribeirão Preto – SP 2008

Tese apresentada ao Departamento de Genética da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto, da Universidade de São Paulo, como requisito parcial para a obtenção do Título de Doutor em Ciências: Área de concentração Genética.

FICHA CATALOGRÁFICA

Maranhão, Fernanda Cristina de Albuquerque

Análise da expressão gênica no dermatófito Trichophyton rubrum mimetizando a infecção in vitro: pH e diferentes fontes de carbono regulando genes. Ribeirão Preto, 2008.

117p. il. 30cm.

Tese apresentada ao Departamento de Genética da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto, da Universidade de São Paulo. Área de concentração Genética.

Orientação: Profa. Dra. Nilce Maria Martinez Rossi

1. Trichophyton rubrum, 2. Fontes de carbono e pH, 3. Virulência,

Dedico

Às pessoas mais importantes da minha vida, meus pais Fátima e Fernando, pelo Amor, atenção e esforço constante. À vocês, dedico toda a minha vida.

AGRADECIMENTOS

Agradeço incansavelmente aos meus pais, Sra. Fátima Dias e Sr. Fernando Maranhão, e ao meu irmão Fábio Maranhão, pelo constante apoio nos meus estudos, carinho e incentivo nas horas de dificuldades, e pelas palavras sinceras que me empurraram para frente nas horas em que a queda parecia inevitável. Obrigada pela presença constante nos mais de 5 anos em que estive longe e mesmo com quase 2.400 km de distância.

À Profa. Dra. Nilce Maria Martinez-Rossi, pela oportunidade de trabalho em seu grupo de pesquisa, orientação e assistência.

Aos amigos Wesley C. Brandão, Cleyde H. Vega, Daniela Pedrosa, Edna do Sim e Ronai F. Ramos, pela amizade e auxílio em todas as horas, por estarem comigo nos momentos de felicidade e de tristeza, e pelas intervenções determinantes na minha saúde física. Amigos que nunca esquecerei, e que estarão comigo independente de onde a Vida me levar.

Aos companheiros de trabalho, Fernanda Gonzales Paião, Jeny Cursino-Santos, Roseli Aquino-Ferreira e Rodrigo A. Cazzaniga, pelas valiosas discussões e auxílios experimentais, pelas palavras de incentivo, companheirismo e convívio que renderam boas risadas. E claro, pelo indiscutível apoio emocional, crucial em determinadas etapas.

À FAPESP (Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo) pela concessão da bolsa de Doutorado, a CAPES, CNPq e FAEPA que deram suporte financeiro em várias etapas desse trabalho e no projeto temático em que estive envolvida, propiciando a efetivação e divulgação dos resultados obtidos.

Aos funcionários do Departamento de Genética, em especial às queridas meninas da Secretária, Susie Adriana Penha Nalon, Maria Aparecida O. S. Elias e Silvia Sant’anna Consiglieri, pela cordialidade e presteza, sempre prontas a dar qualquer suporte.

A todos os colegas atuais e àqueles que já passaram pelo Laboratório de Biologia e Genética Molecular de Microrganismos e do Laboratório de Bioquímica de Fungos, coordenado pelo Prof. Dr. Antônio Rossi.

À Ana Lúcia Fachin e Roseli Aquino-Ferreira, pela parceria técnica nas análises da linhagem mutante ∆TruMDR2. Aos técnicos, Mendelson Mazucato e Pablo Rodrigo Sanches, que dão conta de toda a demanda de sequenciamento e análises bioinformáticas do nosso laboratório, e foram imprescindíveis na elaboração do meu projeto, bem como a ajuda do técnico Marcos D. Martins.

E finalmente, gostaria de agradecer a todos que cruzaram meu caminho positivamente nessa fase, que acreditaram que tudo daria certo e sempre me incentivaram. Obrigada pela chance de aprendizado e amizade.

“Meus amigos quando me dão a mão Sempre deixam outra coisa Presença Olhar Lembrança Calor Meus amigos quando me dão a mão

Deixam na minha a sua mão” (Paulo Leminski)

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Figura 1: (A) Aspecto macroscópio de T. rubrum cultivado em meio Sabouraud Agar durante 14 dias (28 _°C) e (B) microscopia do perfil de conídios de T. rubrum, evidenciando a maior presença de microconídios em relação aos macroconídios...3 Figura 2: Dermatofitoses causadas por T. rubrum: (A) Tinea corporis, (B) Tinea

pedium e (C) Tinea unguium ... 6 Figura 3: Modelo de infecção proposto para dermatófitos, baseado na regulação

de enzimas proteolíticas secretadas em resposta ao pH ambiente. (Martinez-Rossi et al., 2004) ... 12 Figura 4: Representação esquemática da síntese de cDNA fita dupla a partir do Kit

SMART® _{da Clontech ... 34} Figura 5: Esquema do procedimento de subtração de cDNA com o uso de PCR

supressivo. Boxes marcados ou em aberto representam partes distintas dos adaptadores 1 e 2 (Gurskaya et al., 1996)... 40 Figura 6: Etapas resumidas da construção da biblioteca TRSSHQue: (A) Gel de

agarose-formaldeído desnaturante 1,5% com RNA total das condições controle-glicose (G) e teste-queratina (Q); (B) Gel agarose 1,2% com 1 kb DNA ladder (PM) e cDNA fita dupla das condições G e Q; (C) Gel de agarose 1,2% com λ HindIII (PM) e o produto de Nested PCR ... 53 Figura 7: Reverse Northern Blot. Autoradiografias apresentando o rastreamento

de clones. Seis membranas em duplicata contendo clones da Biblioteca Subtrativa de T. rubrum (TRSSHQue) (forward), hibridizadas com sonda de pool de cDNAs obtidos na Nested-PCR da condição controle (Taglicht & Michaelis) e teste (Que)...55 Figura 8: Northern Blot. Validação de transcritos diferencialmente expressos e

similares a proteases (Subtilisina 5, Metaloprotease 4 e Subtilisina 3), após contato de T. rubrum com queratina durante 72 h. (C) controle, micélio cultivado em glicose; (Q) teste, micélio cultivado em queratina. Abaixo estão representados os respectivos géis desnaturantes contendo RNAs equalizados das condições citadas. Ao lado, gráficos representando as intensidades relativas da expressão gênica de cada transcrito, através da comparação entre controle (G) e teste (Q)...66

Figura 9: Northern Blot. Validação de transcritos diferencialmente expressos e similares a proteína TINA, No Match (sem similaridade), Gag-poliproteína e Hsp30, após contato de T. rubrum com queratina durante 72 h. (C) controle, micélio cultivado em glicose; (Q) teste, micélio cultivado em queratina. Abaixo estão representados os respectivos géis desnaturantes contendo RNAs equalizados das condições citadas. Ao lado, gráficos representando as intensidades relativas da expressão gênica de cada transcrito, através da comparação entre controle (G) e teste (Q) ... 67 Figura 10: Northern Blot. Validação de transcritos diferencialmente expressos e

similares a transportadores transmembranas, após contato de T. rubrum com queratina durante 72 h. (C) controle, micélio cultivado em glicose; (Q) teste, micélio cultivado em queratina. Abaixo estão representados os respectivos géis desnaturantes contendo RNAs equalizados das condições citadas. Ao lado, gráficos representando as intensidades relativas da expressão gênica de cada transcrito, através da comparação entre controle (G) e teste (Q) ... 68 Figura 11: Otimização dos ciclos de PCR para amplificação dos cDNAs controle e

teste, evitando o “platô” para manter a variação quantitativa dos diferentes genes em cada condição. Fixou-se 20 ciclos para o controle e 27 para o teste. PM1: 1Kb DNA ladder; PM: padrão de peso molécula λHind...69 Figura 12: Nested-PCR. (PM) 1Kb Plus DNA Ladder; (1) cDNAs da condição teste

(azeite de oliva, 1%); (2) cDNAs da condição controle (glicose 55 Mm)... 70 Figura 13: Reverse Northern Blot. Autoradiografias apresentando o rastreamento

de clones. Sete membranas em duplicata contendo clones da Biblioteca Subtrativa de T. rubrum (TRSSHLip) (forward), hibridizadas com sonda de pool de cDNAs obtidos na Nested-PCR da condição controle e teste (Lip) ... 72

Figura 14: Northern Blot. Validação de transcritos diferencialmente expresso, sem (Gorani et al., 2002)a glicoproteína de 43 kDa, após contato de T. rubrum com lipídeos durante 72 h. (C) controle, micélio cultivado em glicose; (L) teste, micélio cultivado em azeite de oliva (1%). Abaixo está representado o respectivo gel desnaturante contendo RNAs equalizados das condições citadas. O gráfico representa a intensidade relativa da expressão gênica do transcrito, após a comparação entre controle (G) e teste (L)...75 Figura 15: Northern Blot. Comparação do padrão de expressão gênica de

transcritos diferencialmente expressos e similares a proteases nas linhagens H6 (selvagem) e ∆PacC-1 (mutante) de T. rubrum, após cultivo durante 72 h: (1) H6 cultivado em glicose; (2) H6 cultivado em queratina; (3) ∆PacC-1 cultivado em glicose; (4) ∆PacC-1 cultivado em queratina. O respectivo gel desnaturante contendo RNAs equalizados das condições citadas está representado. Os gráficos representam as intensidades relativas da expressão gênica de cada transcrito após a comparação entre as linhagens (2) selvagem H6 e (4) mutante ∆pacC-1...77 Figura 16: Ensaio de infecção mostrando o crescimento de diferenes linhagens de T.

rubrum cultivadas em fragmentos de unhas humanas durante 6 dias a 28 °C. O crescimento fúngico nas unhas foi avaliado por microscopia óptica e as imagens capturadas através do Axion vision System (Zeiss) com objetiva (plan neofluar) 20x/0.5. As partes pretas no lado esquerdo das figuras são os fragmentos de unhas. (A) Controle negativo (sem inóculo); (B) H6 (linhagem selvagem H6) e (C) linhagem mutante ∆TruMDR2. Esses resultados são representativos de dois experimentos distintos...78

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Tabela 1: Sequência dos oligonucleotídeos para uso na RT-PCR ... 35 Tabela 2: Alteração do pH quando várias linhagens de T. rubrum foram cultivadas

em meio mínimo com glicose (controle) (55 mM), queratina (teste 1) (2,5g/L) e fonte lipídica (teste 2) (1 %) ... 52 Tabela 3: Contigs e singlets identificados a partir de sequências expressas no

dermatófito T. rubrum após tratamento com queratina durante 72 h ... 57 Tabela 4: Análise bioinformática e anotação funcional de unigenes selecionados

da Biblioteca Subtrativa Supressiva de T. rubrum cultivado em meio contendo fonte lipídica ... 73 Gráfico 1: Classificação funcional dos unigenes gerados após a análise dos clones

que compõem a Biblioteca Subtrativa Supressiva TRSSHQue, de acordo com banco de dados do MIPS (Munich Information Center for Protein Sequences) ... 64 Gráfico 2: Classificação funcional dos unigenes gerados após a análise dos clones

que compõem a Biblioteca Subtrativa Supressiva TRSSHLip, de acordo com banco de dados do MIPS (Munich Information Center for Protein Sequences) ... 74

RESUMO

Dermatófitos são fungos filamentosos com a habilidade de invadir substratos queratinizados e causar dermatofitoses em humanos e animais, penetrando profundamente apenas em hospedeiros imunocomprometidos. Trichophyton rubrum é um fungo antropofílico e cosmopolita, o mais comum agente de micoses superficiais, que usa componentes celulares como proteínas e lipídeos após uma específica regulação de sua expressão gênica governada pelo pH ambiente e sensoriamento celular. A virulência de T.

rubrum é relacionada com a secreção de enzimas proteolíticas, um importante fator

determinante na invasão, utilização e subseqüente disseminação através do estrato córneo. O objetivo desse estudo foi identificar através de Hibridização Subtrativa Supressiva (SSH) genes de T. rubrum preferencialmente expressos durante o crescimento na presença de queratina e lipídeos, quando T. rubrum degrada fontes de carbono tipicamente encontradas em células epidérmicas. Inicialmente, nós avaliamos as mudanças no pH extracelular durante seu crescimento em queratina e lipídeo (depois de 6, 12, 24, 48, 72 h e 7 dias) em pH inicial 5,0, onde foi observado um gradual aumento do pH basal sob ambas as condições de teste, comparado com a condição glicose (controle). Também identificamos 576 transcritos de T. rubrum diferencialmente expressos por SSH usando conídios cultivados por 72 h em queratina como teste e em glicose como controle. Os genes de T. rubrum ativados codificam proteínas putativas que foram validadas por cDNA

dot-blot e northern blot, mostrando similaridade com proteínas fúngicas envolvidas no

metabolismo básico, crescimento e virulência, p. ex., transportadores ABC-MDR, MFS e ATPase de cobre, permease, NIMA interactive protein, poliproteína Gag-Pol, fatores de virulência subtilisinas serino-proteases (Sub 3 e 5) e metaloproteases (Mep 3 e 4) e Hsp30. Adicionalmente, entre os 762 clones obtidos na biblioteca da condição lipídeo (72 h), 80 transcritos superexpressos foram confirmados por cDNA dot-blot, revelando 14 unigenes similares à proteínas de vários organismos patogênicos, como glicoproteína 43 kD, transportador MDR, proteína G, quitina sintase e serino/treonina fosfatase.

Transcritos do gene TruMDR2, codificador de um transportador ABC, foi isolado tanto na presença de queratina quanto em lipídeo, e a análise da linhagem mutante ∆TruMDR2 de T. rubrum mostrou uma redução na atividade infectante, caracterizada pelo baixo crescimento em unhas humanas comparada com o tipo selvagem. A alta expressão de transportadores por T. rubrum em condições que mimetizam a infecção e a redução na

virulência de ∆TruMDR2 durante o modelo in vitro sugerem que transportadores estão envolvidos na patogenicidade de T. rubrum. Outro linhagem mutante (∆pacC-1) com um nocaute no gene pacC que codifica um fator de transcrição regulado pelo pH local, mostrou a expressão de proteases (Sub 3 e 5 e Mep 4) diminuída após o crescimento em queratina em comparação com o tipo selvagem em análises de northern blots. Essas proteases tem uma atividade ótima em pH alcalino, e nossos resultados indicam uma regulação defectiva do gene pacC de T. rubrum na ativação de proteases.

Em conclusão, através do uso de SSH foi possível identificar genes de T. rubrum ativados após tratamentos específicos, o que sugere a importância dos mesmos na interação dermatófito-hospedeiro, instalação e manutenção da doença. Esses resultados disponibilizam novos dados sobre T. rubrum que levarão a um melhor entendimento dos mecanismos moleculares envolvidos no crescimento, metabolismo geral e patogenicidade, e também auxiliar na identificação de novos e efetivos alvos de drogas para dermatófitos.

ABSTRACT

Dermatophytes are a group of fungi filamentous that have the ability to invade keratinized substrates, causing dermatophytosis in humans and animals and only penetrate deeper if the host is immunocompromised. Trichophyton rubrum is an anthropophilic and cosmopolitan fungi, the most common agent of superficial mycoses, which uses cell components such as proteins and lipids after a specific regulation of its gene expression governed by pH environment and sensing cell. The virulence T. rubrum is related to secretion of proteolytic enzymes, an important factor determinant in the invasion, utilization and subsequently dissemination through the stratum corneum. The aim of this study was to indentify by Suppression Subtractive Hybridization (SSH) T. rubrum genes preferentially expressed during growth in the presence of keratin and lipids, upregulated when this fungus degrades carbon source typically found at epidemic cells. Initially, this work evaluated the changes in the extracellular pH during its growth in keratin and lipid (after 6, 12, 24, 48, 72 h and 7 days) at initial pH 5.0, where we observed a gradual increase of basal pH under both tests when compared to glucose condition (control). Also, we identified 576 T. rubrum transcripts differentially expressed by SSH using conidia cultivated for 72 h in keratin as tester, and in glucose as driver. The T. rubrum genes upregulated encode putative proteins that were validated by cDNA dot-blot and northern blot, showing similarity to fungi proteins involved in basic metabolism, growth and virulence, i.e., transporters ABC-MDR, MFS and ATPase of copper, permease, NIMA interactive protein, Gag-Pol polyprotein, virulence factors serine-protease subtilisins (Sub 3 and 5) and metalloproteases (Mep 3 and 4) and Hsp30. Additionally, among the 762 clones obtained in a library of lipid condition (72 h), 80 over-expressed transcripts were confirmed by cDNA dot-blot, revealing 14 unigenes similar to proteins of several pathogenic organisms, like glicoprotein 43 kD, MDR transporters, G protein, chitin synthase and serine/threonine-protein phosphatase.

Transcripts of TruMDR2 gene, encoding an ABC transporter in T. rubrum, were isolated in the presence of keratin and lipid, and the examination of ∆TruMDR2 mutant T.

rubrum showed a reduction in infecting activity, characterized by low growth in human

nails compared to wild-strain. The high expression of transporter by T. rubrum in conditions that mimetize the infection and the virulence reduction of ∆TruMDR2 in an in

mutant, ∆pacC-1 with a knockout in PacC gene that encodes a transcription factor regulated by local pH, showed the expression of proteases (Sub 3, Sub 5 and Mep 4) decreased after growth in keratin (72 h) in comparison to wild-strain in northern blot analyzes. These proteases have an optimal activity in alkaline pH, and our results indicate a defective regulation of T. rubrum pacC gene in the activation of proteases.

In conclusion, by means of SSH to identify genes upregulated in T. rubrum after specific treatments, their importance in the dermatophyte-host interaction, installation and maintenance in the disease is suggested. These results provide new insights about T.

rubrum that will contribute to a better understanding of molecular mechanisms about the

growth, metabolism and pathogenicity, and may also aid in the identification of novel effective drug targets for dermathophytes.

APRENDIZADO

Do mesmo modo que te abriste à alegria abre-te agora ao sofrimento que é fruto dela

e seu avesso ardente. Do mesmo modo

que da alegria foste ao fundo e te perdeste nela

e te achaste nessa perda deixa que a dor se exerça agora sem mentiras

nem desculpas

e em tua carne vaporize toda ilusão

que a vida só consome o que a alimenta.

1. IInnttrroodduuççããoo

1.1. OOssffuunnggoossnnaassddooeennççaassiinnffeecccciioossaas s

Os fungos são organismos eucarióticos, uni ou pluricelulares, heterotróficos, quimiorganotróficos, aeróbios ou microaerófilos, sendo que alguns possuem parede celular constituída de quitina ou quitina e celulose. Essa diversidade morfológica e fisiológica permite que tais organismos sejam encontrados em variados ambientes, sendo delimitados em um reino próprio por possuírem características peculiares que os distinguem dos seres de outros reinos. Com relação à nutrição, os fungos fazem absorção do alimento, acumulam glicogênio como substâncias de reserva, com estilo de vida saprobiótico, comensal, simbionte ou parasitário (Tortora et al., 2005). Estes organismos são importantes por trazerem benefícios em diversos aspectos, p.ex., na cadeia alimentar como decompositores, servindo de alimento ou na produção de pão e drogas, no controle biológico e com grande influência biotecnológica por inovar na produção de enzimas utilizadas industrialmente.

Ao longo da última década, a incidência de infecções causadas por fungos tem aumentado, seja em infecções hospitalares afetando principalmente indivíduos debilitados imunologicamente ou como fitopatógenos, infectando plantas economicamente importantes. Os fungos de interesse médico (agentes de micoses) podem ser leveduras, fungos filamentosos ou apresentar-se com as duas formas (fungo dimórfico) a depender das condições ambientais como pH e temperatura. As micoses são classificadas em cinco grupos de acordo com o grau de envolvimento no tecido e o modo de entrada no hospedeiro: sistêmica, subcutânea, cutânea, superficial ou oportunista. A criptococcose causada por Cryptococcus neoformans var. neoformans, principalmente o sorotipo A, é caracterizada como infecção oportunista iniciada pelas vias aéreas que pode se tornar sistêmica em hospedeiros com imunosupressão, enquanto membros do gênero Aspergillus

podem provocar doenças em homens e animais através de vários mecanismos com características variadas, sendo a maioria das espécies fúngicas considerada oportunista (Sidrim & Rocha, 2004).

As dermatofitoses estão entre as micoses superficiais mais comuns e determinam lesões limitadas ao extrato queratinizado da pele e seus anexos. São causadas por fungos filamentosos denominados dermatófitos, que através de um longo processo evolutivo tornaram-se altamente capazes de invadir e colonizar tecidos queratinizados. Estes compreendem cerca de 30 espécies classificadas de acordo com o habitat preferencial (antropofílicos, zoofílicos ou geofílicos), e em 3 gêneros anamórficos (assexuado ou imperfeito): Epidermophyton, Microsporum e Trichophyton (Weitzman & Summerbell, 1995; Graser et al., 2000). Os dermatófitos antropofílicos têm específica afinidade por queratina de tecidos humanos como cabelo, pele e unha para utilizá-los como fonte de nutrientes. Eles afetam cerca de 25% da população mundial, como constatado pela Organização Mundial da Saúde (Marques et al., 2000). Menos freqüentemente, os dermatófitos estão relacionados às infecções subcutâneas e profundas com quadros clínicos mais complexos como abcessos, granulomas e micetomas em indivíduos imunodeprimidos (Speth et al., 2008). A infecção pode ser branda ou severa, e depende de vários fatores, p. ex., relacionados com a capacidade infectante do fungo para superar os mecanismos de defesa do hospedeiro, local da infecção, pH ambiente, concentração de nutrientes (Ogawa

et al., 1998) e outros aspectos, podendo gerar diferentes manifestações clínicas a depender

1.2. OOaannttrrooppooffíílliiccooTrTriicchhoopphhyyttoonn rruubbrruumm

Entre os representantes do gênero, Trichophyton rubrum (Castellani; Sabouraund, 1911) tem sido o agente etiológico isolado com maior freqüência nos casos de dermatofitoses humanas. Quando cultivado em placa de Petri contendo meio adequado, apresenta crescimento lento e colônias brancas com textura algodonosa ou aveludada (Fig. 1A), com pregas radiais e pigmentação vermelha no lado reverso (Kwon-Chung & Bennett, 1992; Cervelatti et al., 2004), mas variedades com aspecto granular e ausência de pigmentação podem ocorrer. Os microconídios são piriformes localizados geralmente ao longo de hifas hialinas não ramificadas, com macroconídios pouco abundantes, longos e com formas fina e claviformes (Ferreira & Ávila, 2001) (Fig. 1B). Os artroconídios de T.

rubrum são bem resistentes às adversidades dos fatores ambientais e capazes de sobreviver

por longos períodos, sendo os principais elementos infecciosos (Coelho et al., 2008).

A B

Figura 1: (A) Aspecto macroscópio de T. rubrum cultivado em meio Sabouraud Agar durante 14 dias (28 °C) e (B) microscopia do perfil de conídios de T. rubrum, evidenciando a maior presença de microconídios

Para o diagnóstico, geralmente é feita coleta e cultivo em meio Sabouraud, fazendo-se análifazendo-se da formação de conídios e de caracteres morfológicos das colônias com ou fazendo-sem uso de microscopia para distinguir as espécies (Gorani et al., 2002). Várias técnicas moleculares vêm sendo utilizadas e dão resultados mais rápidos e confiáveis, como por exemplo, PCR utilizando primers de regiões repetitivas conservadas, análise de RAPD, DNA mitocondrial e do número de repetições da região espaçadora não transcrita (ITS) do RNA ribossômico (Kano et al., 1997; Kano et al., 2000; Nascimento & Martinez-Rossi, 2001). Recentemente foi proposto o seqüenciamento do genoma do T. rubrum por pesquisadores de várias universidades (Projeto Fungal Genome Initiative do Broad Institute; http://www.broad.mit.edu/) pela sua importância e prevalência, e sua efetivação auxiliará em diversos estudos sobre taxonomia, epidemiologia e processos metabólicos gerais, dando melhores condições para o surgimento de terapias mais eficientes. A cariotipagem molecular deste dermatófito, utilizando a técnica CHEF (Contour-clamped homogeneous eletric field), foi definida por Cervelatti et al (2004) que identificou cinco bandas cromossomais de peso molecular entre 3,0 a 5,8 Mb.

1.3. AAssppeeccttoosseeppiiddeemmiioollóóggiiccoos s

Quanto à distribuição geográfica, os dermatófitos são encontrados atualmente em diferentes regiões do mundo, havendo variações regionais em relação às freqüências de determinadas espécies. Muitas espécies têm distribuição mundial (cosmopolita), como o T.

rubrum, que infecta os humanos e pode eventualmente causar dermatofitoses em animais

(Chermette et al., 2008; Seebacher et al., 2008), sendo a espécie mais prevalente deste gênero e o dermatófito mais comumente encontrado em lesões superficiais de pele e unha (Costa et al., 2002; Zahra et al., 2003). Mas apesar de ser considerado cosmopolita, o T.

possivelmente um resultado da extensa migração humana transportando tais dermatófitos (Weitzman & Summerbell, 1995). Condições geoclimáticas e sociais interferem na distribuição das espécies dermatofíticas isoladas. No Brasil, as regiões Sul e Sudeste têm apresentado alta incidência de T. rubrum, seguido de M. canis e T. mentagrophytes como as mais isoladas, enquanto na região Nordeste há maior prevalência de T. tonsurans, T.

rubrum e M. canis (Sidrim & Rocha, 2004). O fluxo populacional e alterações positivas ou

negativas das condições de saneamento podem interferir na freqüência de cada espécie em determinadas regiões com o decorrer do tempo e modificar esses padrões.

Estima-se que aproximadamente 80-93% das dermatofitoses crônicas ou recorrentes são causadas por T. rubrum, que pode ainda ter um comportamento invasivo ao causar infecções oportunistas atípicas em pacientes com o sistema imune comprometido, como ocorre em portadores do vírus HIV, pacientes com órgãos transplantados e outros que são submetidos a tratamento quimioterápico contra o câncer (Georgopapadakou & Walsh, 1994; Grossman et al., 1995; Weitzman & Summerbell, 1995; Gorani A et al., 2002; Gong et al., 2007). No Estado de São Paulo, 4.500 crianças de 0-15 anos foram avaliadas para determinar a incidência de tinea capitis entre 1996 e 2000. Em 132 crianças com suspeita de contaminação, 112 pacientes (85%) tiveram a confirmação através de microscopia direta e cultura, sendo apenas 0,9% relacionado à presença de T. rubrum (Moraes et al., 2006). Já entre as onicomicoses, T. rubrum é o mais prevalente e afeta crianças e adultos em cerca de 70% dos casos, seguido de T. mentagrophytes.

Em relação aos hospedeiros em potencial, fatores de riscos estão associados à micoses como a onicomicoses, dentre eles a idade, diabetes melittus, anomalias morfológicas na unha, fatores genéticos, imunodeficiência, tratamento e higiene inadequados, tanto para infecções primárias como em reincidências. Além disto, as taxas hormonais de cada indivíduo afetam a freqüência de infecções em homens e mulheres

(Tosti et al., 2005). Então, vários fatores climáticos, práticas sociais, migração populacional e características individuais afetam a epidemiologia das dermatofitoses.

1

1..44.. IInntteerraaççããooddeerrmmaattóóffiittoo--hhoossppeeddeeiirroo

A infecção por T. rubrum e conseqüente propagação podem ocorrer através do contato direto ou indireto entre indivíduos infectados e sadios, ou com objetos inanimados contaminados (fomites). As manifestações clínicas, conhecidas popularmente como impigem (tinha), são caracterizadas de acordo com o sítio anatômico atingido. Este dermatófito causa tinea corporis, tinea pedis e tinea unguium, e mais raramente tinea

capitis (Graser et al., 2000), sendo as lesões resultantes da reação do hospedeiro contra

enzimas específicas produzidas e liberadas pelo fungo durante o processo de infecção, que viabilizam a digestão tecidual do hospedeiro em busca de nutrientes para o desenvolvimento e manutenção do fungo (Martinez-Rossi et al., 2004).

A B C

Figura 2: Dermatofitoses causadas por T. rubrum: (A) Tinea corporis, (B) Tinea pedium e (C) Tinea

A complexidade dos eventos envolvidos no desenvolvimento de uma doença requer a combinação de características do patógeno e do hospedeiro, existindo vários fatores do hospedeiro que estão envolvidos no processo de colonização dos dermatófitos. Vários fungos e outros parasitas que se desenvolvem em tecidos queratinizados são incapazes de se manter na presença de fatores séricos e muitas vezes em temperaturas como a fisiológica humana (37 °C). Caracteres do extrato córneo favorecem essa adaptação, como a alta hidratação devido à presença de glândulas e o fato das células superficiais já se encontrarem mortas e inacessíveis a diversos mecanismos de defesa provenientes da circulação ativa, além da temperatura e do pH em torno de 5,0 a 6,7 (ácido) (Sidrim & Rocha, 2004). Ou seja, além da temperatura da pele ser menor que 37 °C, os fungos queratinolíticos não são diretamente afetados pelos componentes inflamatórios já que a extensa camada de queratina age como uma barreira que impede o contato do fungo com componentes séricos.

Entretanto, segundo Ogawa et al (1998), após o contato para a transmissão do dermatófito, a etapa inicial da patogênese envolve a capacidade infectante do fungo em superar os mecanismos de resistência do hospedeiro, p.ex., barreiras físicas como as camadas da pele em descamação e a adaptação às características físico-químicas do ambiente (incidência de luz U.V., temperatura, umidade, pH, etc). Para o estabelecimento das dermatofitoses, a aderência aos queratinócitos e a germinação conidial são cruciais (Samdani, 2005). Efetivada a aderência inicial, segue-se a competição com a flora microbiana normal e germinação dos artroconídios para subseqüente colonização da superfície celular, culminando na penetração das hifas em camadas mais profundas do extrato córneo. Sendo assim, é essencial a regulação da expressão gênica para induzir ou inibir genes de acordo com a necessidade, como em todos os seres vivos. A capacidade de adesão nas superfícies celulares vem sendo atribuída à presença de glicoproteínas na

parede celular desses microorganismos (Ferreira-Nozawa et al., 2003), como também é observado no fungo dimórfico patogênico Candida albicans (Ogawa et al., 1998).

Uma vez ultrapassadas essas etapas, os fungos devem ser capazes de obter nutrientes essenciais para sua completa instalação, desenvolvimento e permanência no hospedeiro (Martinez-Rossi et al., 2004). Mas a seletividade da membrana citoplasmática impede que macromoléculas como proteínas, amido, celulose e lipídeos sejam transportadas para o interior da célula. Para que essas moléculas sejam utilizadas, é necessário degradá-las em compostos menores aos quais as membranas são permeáveis. A quebra dessas moléculas é promovida por enzimas hidrolíticas secretadas (exoenzimas) que apresentam especificidade pelo substrato, atuando sobre proteínas, amidos ou lipídeos, e constituem um fator de virulência por hidrolisar componentes estruturais de tecidos e conferir ao microrganismo a capacidade invasora.

Um dos principais alvos desse ataque enzimático é a queratina, uma molécula protéica fibrosa de alto peso molecular (Vignardet et al., 2001), com uma matriz rica em cisteína e composta por fortes ligações peptídicas e acetamídicas que garantem estabilidade para a função de revestimento e proteção (Fraser & Parry, 2005). Esta é produzida apenas por humanos e outros animais, sendo o principal constituinte de acessórios como a pele, unhas, cascos e cornos. Outro componente importante encontrado nas paredes celulares e alvos das enzimas fúngicas são os lipídeos, que em conjunto com diversas proteínas garantem a forma e maleabilidade da parede celular (Tenchov et al., 2008). Então, frente a esses componentes, é necessário que os fungos patogênicos regulem sua expressão gênica para ativar genes durante a infecção, induzindo a síntese e liberação de várias proteases não específicas, queratinase, lipase, elastase, nuclease, fosfatase, fosfolipase e enzimas mucinolíticas, dentre outras, para degradar macromoléculas e fazer uso de elementos mais simples (carbono, nitrogênio, fósforo e enxofre) como fonte de nutrientes.

Como os principais componentes da membrana celular são proteínas e fosfolipídeos, hidrolisados na desestabilização da membrana para a devida instalação dos fungos invasores (Apodaca & McKerrow, 1989), a secreção de proteases e fosfolipases é um importante fator de virulência para os dermatófitos no processo de digestão tecidual no hospedeiro. Essa ação já foi demonstrada em fungos patogênicos, como C. albicans, C.

dubliniense, T. mentagrophytes var. erinacei Penicillium notatum, C. neoformans, A. fumigatus (Okumura et al., 1980; Ghannoum et al., 1994; Tsushima et al., 1994; Birch et al., 1996; Muhsin et al., 1997; Fotedar & Al-Hedaithy, 2005; Kadir et al., 2007), sugerindo

que de fato estas enzimas são importantes para a efetivação de determinadas doenças. Estudos de caracterização fenotípica em diferentes isolados de T. rubrum e M. canis mostraram a assimilação de diferentes fontes de carbono, sendo todas as cepas capazes de secretar queratinases, proteinases e fosfolipases (Viani et al., 2001; da Silva et al., 2002).

Atividade lipolítica também foi observada em dermatófitos (E. floccosum, M. canis,

T. mentagrophytes e T. rubrum) após a adição de diferentes fontes de lipídeos em meio

ágar, sendo quantificada a ação de lipases e fosfolipases em espécies do gênero

Trichophyton e Microsporum (Hellgren & Vincent, 1980; Muhsin & Aubaid, 2001). A

produção de lipases e esterases foi demonstrada em testes de plaqueamento em meio sólido e líquido. Um dos melhores substratos naturais para lipases secretadas é o óleo de oliva. Tween 60 e 80 também podem ser hidrolizados por dermatófitos (Muhsin & Aubaid, 2001). De acordo com a literatura disponível, ocorrem grandes diferenças na atividade lipolítica entre as várias espécies e linhagens de dermatófitos, sendo importante salientar que algumas enzimas que apresentam atividade contra lipídeos podem agir também em substratos queratinizados e em Sabouraud glucose-peptona devido às atividades mais abrangentes observadas, como é o caso da fosfolipase A (Shiba et al., 2001; Hong et al., 2005).

Já os transportadores presentes nas membranas que auxiliam na manutenção da composição citoplasmática de uma célula tanto em relação ao meio extracelular ou às organelas membranosas, também têm atividades relacionadas à patogenicidade de diversos organismos e na adaptação às alterações ambientais. Bactérias, leveduras e diversos fungos, bem como células especializadas de plantas e animais expressam proteínas de membrana para captação de aminoácidos, dipeptídeos e tripeptídeos (Fan et al., 2002; Parisot et al., 2002), sendo essenciais para regular a captação de nutrientes no meio, exclusão de metabólitos secundários ou de substâncias tóxicas.

Com uma gama de mecanismos metabólicos complexos que se interligam para a ativação da patogenicidade fúngica, é nítida a importância de conhecer mais detalhes acerca da expressão gênica dos dermatófitos. Utilizando cultivo em meio com proteínas e lipídeos para avaliar a interferência de diferentes fontes de carbono na expressão de genes ativadores de virulência e patogenicidade de fungos de interesse biomédico, é possível aprofundar o conhecimento acerca da adaptação, fisiologia e aspectos moleculares em fungos patogênicos.

1

1..55.. RReessppoossttaaddeeT.T. rruubbrruumm aaooppHHaammbbiieennttee

É bem documentado que o pH homeostático governa o crescimento, diferenciação, fisiologia e viabilidade de todos os seres vivos, e que as células mudam a resposta de acordo com os fatores abióticos presentes. Os microrganismos possuem a capacidade de adaptar-se ao pH local modulando sua expressão gênica para ajustes fisiológicos adequados a cada ambiente. A expressão gênica na célula ocorre de forma coordenada em resposta a um sinal interno ou externo e dados comprovam que certos mecanismos de patogenicidade e de resistência a inibidores dependem direta ou indiretamente dos genes responsáveis pelo monitoramento do pH extracelular (Ferreira-Nozawa et al., 2003; Li, 2004; Ferreira-Nozawa et al., 2006).

Os fungos filamentosos A. nidulans e N. crassa são capazes de crescer em várias condições, mesmo com variações extremas de pH (Rossi & Arst, 1990; Bignell et al., 2005). Para isto é necessário uma regulação do pH homeostático, a partir do monitoramento do pH extracelular. Assim, é possível direcionar a síntese de permeases e enzimas secretadas, como por exemplo, a secreção de fosfatase ácida em meio ácido e fosfatase alcalina em meio alcalino (Nahas et al., 1982; Ferreira-Nozawa et al., 2003). De Bernadis et al (1998) demonstrou a relação no controle da expressão dos genes PHR1 e PHR2 de C. albicans com as mudanças no pH ambiente, sendo estes expressos respectivamente acima e abaixo do pH 5.5. Davis et al (1999), também identificou linhagens responsivas ao pH ambiente deste mesmo patógeno (De Bernardis et al., 1998; Davis et al., 2002).

A ativação de várias enzimas proteolíticas liberadas no meio com atividade ótima em pH ácido, provavelmente porque a pele humana tem um pH levemente ácido, propicia o início da infecção. As proteinases ativas em meio ácido agem em substratos queratinizados ou não, liberando peptídeos que são hidrolisados em aminoácidos. Estes podem reprimir a síntese de proteases inespecíficas e induzir a produção de queratinases (Apodaca & McKerrow, 1989; Cutler, 1991). De acordo com o modelo proposto por Martinez-Rossi et al (2004) para a regulação de enzimas proteolíticas em função do pH, o dermatófito monitora o pH da pele ao iniciar a infecção, desreprimindo proteases não especificas e queratinases com atividade ótima em pH ácido enquanto reprimem queratinases efetivas em pH alcalino, gerando polipeptídeos pela digestão tecidual. Provavelmente, peptidases putativas clivam os polipeptídeos e geram fontes de carbono, nitrogênio e enxofre para a nutrição do fungo. A captação e metabolismo desses aminoácidos geram a alcalinização do meio, podendo levar à repressão de enzimas proteolíticas com ação em pH ácido e ativar queratinases com atividade ótima em pH alcalino, permitindo que a infecção se instale.

Dermatófito

+

+

+

+

+

-+

etc. Indução de queratinases e fosfatases alcalinas, nucleases, etc. Indução de proteases e fosfatases ácidas, nucleases, etc.

Infecção

Alcalinização

Polipeptídeos, oligonucleotídeos, etc. Peptidases, nucleases putativas de fungos

Dermatófito

+

+

+

+

+

-+

etc. Indução de queratinases e fosfatases alcalinas, nucleases, etc. Indução de proteases e fosfatases ácidas, nucleases, etc.

Infecção

Alcalinização

Polipeptídeos, oligonucleotídeos, etc.

Peptidases, nucleases putativas de fungos

Figura 3: Modelo de infecção proposto para dermatófitos, baseado na regulação de enzimas proteolíticas

Genes responsivos ao pH já foram isolados em fungos filamentosos (Delgado-Jarana et al., 2002; Brakhage et al., 2004), sendo a regulação pelo pH descrita primeiramente em N.crassa (Nahas et al., 1982), quando foi observado que a secreção de fosfatases ácidas e alcalinas eram dependentes do pH do meio. Em A. nidulans é conhecida a existência de genes alcalino-específicos e ácido-específicos. Os primeiros genes envolvidos no sensoriamente do pH ambiente foram identificados em A. nidulans (Caddick

et al., 1986), onde a resposta ao pH é mediada por uma via metabólica constituída pelo

menos por 7 genes. Um deles é o fator de transcrição PacC em fungos, homólogo ao Rim101 de leveduras (Li, 2004), que apresenta regiões zinc-fingers (Cys2His2) como domínio que interage com regiões do DNA e atua na ativação da transcrição de genes alcalino-específicos e conseqüente repressão de genes ácido-específicos (Caddick et al., 1986). Este modelo determina que a versão íntegra de pacC (PacC72_{) é ativada por}

processamento pós-traducional em pH alcalino através de dois passos proteolíticos, nos quais remove-se o domínio C-terminal. Inicialmente a clivagem forma uma proteína intermediaria (PacC53) que sofre uma proteólise gerando a forma ativa PacC27. O pH ambiente é decisivo para o primeiro passo da síntese do PacC ativo, que é resultado de uma cascata de sinalização para a correta ativação em pH específico. A interação no domínio C (entre os resíduos 529 e 678) previne o processamento sob condições inapropriadas de pH (Flaherty et al., 2003).

Tal sistema de sinalização é composto por seis genes que foram clonados e seqüenciados: pal A, B, C, F, H e I (Orejas et al., 1995; Maccheroni Jr. et al., 1997; Denison, 2000; Arst & Penalva, 2003). Arst e Peñalva (2003) propuseram algumas alterações no modelo de regulação do pH inicialmente proposto por Caddick et al (1986), sugerindo que os genes palI e palH codificam proteínas transmembranas que funcionariam como sensores do pH externo (Peñalva & Arst, 2002). Já o produto do gene palB geraria

uma calpaína (cisteína protease) responsável pelo reconhecimento do sinal que envia sinal intracelular que efetiva a clivagem do fator de transcrição pacC em sua forma ativa, removendo então a porção de 180 aminoácidos na região C-terminal (Diez et al., 2002). A ativação da transcrição de genes alcalino-específicos ocorre pelo reconhecimento de elementos cis na região promotora desses genes, enquanto que a repressão de genes ácido-específicos ocorre por inibição competitiva quando o pacC se sobrepõe ao sítio promotor e previne a ligação do fator de ativação intA (Denison et al., 1995; Tilburn et al., 2005). Essa resposta em pH alcalino é crucial mas parece ocorrer apenas após a transcrição, uma vez que não há evidências de que os genes pal sejam regulados pelo pH (Maccheroni Jr. et

al., 1997; Diez et al., 2002; Rollins, 2003).

A via de sinalização pelo pacC regula muitos eventos metabólicos envolvidos no sensoriamento do pH extracelular em diferentes níveis. Além da regulação do gene pacC, os elementos desta via também atuam na glicosilação dependente de pH de fosfatases secretadas por determinadas linhagens fúngicas, alterando o nível de carboidratos ligados as fosfatases ácidas e alcalinas, dependendo do pH ambiente (Nozawa et al., 2003). A ativação da transcrição de genes alcalinos pela proteína pacC foi demostrada experimentalmente para a síntese e secreção da Penicilina em A. nidulans, que ocorre preferencialmente em pH alcalino envolvendo um conjunto interligado de genes. Foram descritas mutações nos genes pal (A, B, etc), com alterações como o aumento dos níveis de fosfatases ácidas e a diminuição das fosfatases alcalinas quando o pH extracelular se encontrava neutro. Entretanto, mutação com remoção do gene pacC foi caracterizada por fenótipo semelhante ao crescimento em pH ácido (Tilburn et al., 1995).

T. rubrum codifica uma proteína homóloga ao regulador transcricional pacC (A. nidulans) / Rim101p (C. albicans) da conservada via de sinalização do pH, tipo zinc-finger

rubrum foi clonado, seqüenciado e nocauteado, conforme descrito por Ferreira-Nozawa et al (2006). Experimentos realizados com a linhagem mutante pacC-1 teve a sua capacidade

infectante reduzida quando cultivada em fragmentos de unha humana, correlacionando com a diminuição acentuada da atividade queratinolítica no meio de cultivo liquido suplementado com queratina. As habilidades de crescimento e capacidade queratinolítica foram comparadas com os resultados na linhagem selvagem H6, sendo evidente a diferença. Estes resultados sugerem que o desenvolvimento em queratina e a conseqüente degradação desta proteína típica de regiões infectadas pelo dermatófito T. rubrum está de alguma forma sob regulação do gene pacC, interferindo na secreção de proteases com ótima atividade em pH alcalino, necessárias para a manutenção da infecção.

1

1..66.. TTrraattaammeennttooeerreessiissttêênncciiaaaaddrrooggaass

Os fungos patogênicos são responsáveis pela maioria das doenças infecciosas em animais e plantas. Devido ao grande número de espécies fúngicas patogênicas, é crescente o interesse em abordagens para estudo de fisiologia, morfologia e análise genética, visando o aprofundamento de conhecimentos gerais e específicos que podem auxiliar na formulação de novas estratégias terapêuticas, para um ataque mais efetivo ao dermatófito. Um dos problemas no tratamento de infecções fúngicas é a ocorrência de linhagens resistentes a agentes antifúngicos encontrados no mercado, dificultando tratamentos e elevando os custos dos mesmos.

Com a emergência da AIDS (Síndrome da Imunodeficiência Adquirida; SIDA em inglês) e o advento da terapia com antibióticos de largo espectro, bem como o tratamento de pacientes com doenças metabólicas crônicas, neoplásicos e transplantados com agentes citotóxicos e imunossupressores, tornou-se pouco clara a diferença entre fungos contaminantes e patogênicos (classicamente os agentes de micoses superficiais,

subcutâneas e profundas) (Surjushe et al., 2007; Seebacher et al., 2008). Agentes como

Aspergillus, Candida e Cryptococcus, considerados antigamente como contaminantes de

laboratório e, portanto, de pouca importância clínica, são agora conhecidos como causadores de doenças disseminadas em pacientes imunodeprimidos, como endocardites e infecções pulmonares (Sidrim & Rocha, 2004). Nessa nova conjuntura, os dermatófitos também se tornaram mais agressivos.

O uso repetido de antifúngicos no tratamento ou prevenção de infecções causadas por fungos e na preservação de alimentos e sementes leva freqüentemente à ineficiência dos antimicóticos, devido ao surgimento ou seleção de linhagens fúngicas resistentes, com graves conseqüências econômicas e sociais. Esse efeito ameaça a saúde pública e dificulta tratamentos ao elevar os custos dos mesmos. Ademais, existem poucas classes químicas de antifúngicos disponíveis comercialmente e com um número de alvos limitados: o ergosterol e as enzimas de sua síntese, a síntese de ácidos nucléicos e da parede celular (DiDomenico, 1999). O ergosterol é o principal esterol da membrana plasmática do fungo, contribui para a fluidez e integridade da membrana e para o funcionamento adequado de enzimas da própria membrana celular, incluindo a quitina sintetase, uma enzima envolvida no crescimento e divisão celular (Georgopapadakou & Walsh, 1994; Sarifakioglu et al., 2007). A resistência à drogas já foi documentada para todos antifúngicos largamente empregados em terapias, havendo uma necessidade crescente por novos antifúngicos de largo espectro de ação (Sarifakioglu et al., 2007). É importante salientar que o fato da baixa diversidade em relação às classes de antimicóticos pode ser também um indício da existência de diferenças ainda não exploradas, entre o patógeno e o hospedeiro, que podem ser utilizadas no desenvolvimento de novas substâncias para interferir em funções essenciais dos fungos (Pena-Muralla, 2002).

Hashimoto & Blumenthal (1978) relataram, já na década de 70, resistência a nistatina pela espécie T. mentagropytes. No caso do T. rubrum, nos últimos anos alguns estudos foram realizados a respeito dos mecanismos de resistência a drogas e de outros processos que ocorrem durante a infecção (Hashimoto & Blumenthal, 1978; Fachin et al., 2006; Maranhão et al., 2007; Paião et al., 2007; Coelho et al., 2008; Martinez-Rossi et al., 2008; Segato et al., 2008). Entretanto, a busca de dados que auxiliem no desenvolvimento de novas drogas e na identificação e caracterização de novos alvos terapêuticos a partir de um criterioso estudo de genômica funcional ainda é constante e necessária, sendo crucial um maior entendimento da biologia dos fungos patogênicos, seja quanto à fisiologia ou aos aspectos moleculares e sistemas de adaptação a diferentes condições de estresse ambiental, assim como aprofundar o conhecimento das interações patógeno-hospedeiro.

Após o advento da Genômica Estrutural, estudos de seqüenciamento de ESTs (Expressed Sequence Tags) foram conduzidos em diversos organismos para identificar as populações de mRNA expressas em determinadas condições ou etapas do desenvolvimento (transcriptoma) (Bouzidi et al., 2007; Schumacher et al., 2008), e o desenvolvimento desses projetos propiciou o surgimento de melhores metodologias que tornaram as análises da expressão gênica mais apuradas, como por exemplo com novas técnicas de hibridização subtrativa, SAGE (Serial Analysis of Gene Expression) e microarrays (Kasuga et al., 2005; Kronstad, 2006; Poggeler et al., 2006).

Esta abordagem utilizando ESTs mostrou-se versátil, considerada rápida e econômica para identificar genes, e vem sendo cada vez mais utilizada para anotação de seqüências completas genômicas de organismos eucariotos, pois podem dar evidências biológicas para a previsão de centenas de genes (baseada em seqüências heterólogas) ou podem indicar a presença de novos genes preferencialmente expressos em certos tecidos ou células de organismos multicelulares (Franco et al., 1995). Hoje, mais de dez milhões de

ESTs estão disponíveis no banco de dados de ESTs (dbEST) do GenBank e auxiliam nessa busca por dados moleculares no estudo do metabolismo fúngico (Tugendreich et al., 1993). A nossa proposta de estudo da biologia do T. rubrum com ênfase na funcionalidade de alguns genes, como os potencialmente envolvidos na sua patogenicidade, é de interesse geral da comunidade científica, e a divulgação dos resultados representará um grande avanço nesta área.

ÉPRECISO NÃO ESQUECER NADA

É preciso não esquecer nada: nem a torneira aberta nem o fogo aceso,

nem o sorriso para os infelizes nem a oração de cada instante.

É preciso não esquecer de ver a nova borboleta nem o céu de sempre.

O que é preciso é esquecer o nosso rosto,

o nosso nome, o som da nossa voz, o ritmo do nosso pulso. O que é preciso esquecer é o dia carregado de atos,

a idéia de recompensa e de glória.

O que é preciso é ser como se já não fôssemos, vigiados pelos próprios olhos severos conosco,

pois o resto não nos pertence.

2

2.. OObbjjeettiivvoossggeerraaiisseeeessppeeccííffiiccooss

Tendo em vista a importância clínica do dematófito T. rubrum devido à necessidade de controle epidemiológico, desenvolvimento de novos antifúngicos e de um maior entendimento acerca do metabolismo do mesmo, o presente trabalho teve como objetivo geral identificar genes diferencialmente expressos em função de nutrientes específicos e do pH de cultivo, visando caracterizar genes possivelmente envolvidos na fixação e manutenção do processo infeccioso por este patógeno no hospedeiro. Sendo assim, foram delimitados os seguintes objetivos específicos:

• Cultivar o T. rubrum em meio contendo componentes celulares característicos de tecidos epidérmicos (queratina e lipídeos) para avaliar a capacidade de crescimento e possíveis alterações na expressão gênica.

• Isolar genes diferencialmente expressos das linhagens de T. rubrum tratadas nas condições descritas através de técnicas de expressão diferencial, principalmente Biblioteca Subtrativa Supressiva;

• Clonar as seqüências de cDNAs diferencialmente expressas e identificar genes cujos produtos estejam envolvidos no metabolismo, secreção enzimática e obtenção de nutrientes no tecido hospedeiro;

• Usar ferramentas bioinformáticas para análises comparativas entre os transcriptomas de T. rubrum (nas condições ensaiadas) e de outros fungos patogênicos;

• Selecionar genes diferencialmente expressos e que sejam relevantes para a virulência e/ou patogenicidade de T. rubrum e validar por northern blot.

3 3.. MMaatteerriiaaiisseeMMééttooddooss 3 3..11.. LLiinnhhaaggeennss 3 3..11..11.. LLiinnhhaaggeennssffúúnnggiiccaass

A linhagem H6 de T. rubrum (ATCC MYA – 3108), isolada de paciente do sexo feminino acometida de tinea pedis no Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto (FMRP-USP), foi a principal cepa utilizada neste estudo. A H6 foi identificada por métodos morfológicos e bioquímicos padrões (McGinnis, 1980), e cedida pela Dra. Cláudia M. Leite Maffei do Setor de Micologia do Departamento de Biologia Celular Molecular e Bioagentes Patogênicos da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto, USP. O estoque da linhagem H6 de T. rubrum foi mantido em placas de Petri contendo meio Ágar Dextrose Sabouraud, com repiques periódicos, e armazenados em estufa climatizada a 28ºC. Morfologicamente em meio Sabouraud, a linhagem apresenta colônias brancas de aspectos cotonoso e denso, com o reverso sem pigmentação devido às sucessivas repicagens, além de conídios claviformes.

Outra linhagem utilizada no nosso trabalho foi a CBS118892, de T. rubrum, cedida pelo Centraalbureau voor Schimmelcultures (CBS Holanda) e alvo de futuro seqüenciamento através de consórcio internacional, tendo sido utilizada para a obtenção de cDNAs subtraídos após crescimento em fonte lipídica. As linhagens mutantes ∆pacC-1 e ∆TruMDR2 de T. rubrum, obtidas após disrupção gênica do gene regulatório pacC e no transportador MDR, respectivamente (Fachin et al., 2006; Ferreira-Nozawa et al., 2006), também foram utilizadas para experimentos de northern blots e infecção in vitro.

3.1.2. LLiinnhhaaggeennssbbaacctteerriiaannaas s

Para a propagação de plasmídeos recombinantes (pGEM®-T) durante as etapas de clonagem, foram utilizada células competentes pMOS Blue de Escherichia coli, que apresentam a seguinte constituição genotípica: endA1, hsdR17 (rk12-mk12) supE44, thi-1,

recA1, gyrA96, relA1, lac [F’, pro A+B+, lac 1q Z∆M15, Tn10 (TcR)].

Para a manutenção, E. coli foi cultivada em meio LB líquido com tetraciclina (15 µg/mL) por 12 a 24 horas a 37 °C. Após preparar alíquotas de 1 mL e adição de glicerol estéril (70%), foram estocadas a -80 ºC para descongelamento de alíquotas apenas no momento do uso. 3 3..22..MMeeiioossddeeccuullttuurraa 3 3..22..11.. MMeeiiooMMíínniimmoo--MMMM((CCoovvee,,11996666)) Solução de sais 20 mL Água destilada (q.s.p) 1000 mL

O meio mínimo foi suplementado com glicose (55 mM) e nitrato de sódio (70 mM), com o pH ajustado em 6,8 não tamponado. O meio foi autoclavado a 1 atm de pressão e 120 °C por 20 minutos. 3 3..22..22.. MMeeiiooSSaabboouurraauuddmmooddiiffiiccaaddoo((AAttllaass,,11999933)) Glicose 20 g Peptona 10 g Água destilada (q.s.p.) 1000 mL

O pH do meio foi ajustado para 5,7. O meio foi autoclavado a 1 atm de pressão a 120 °C por 20 minutos, tendo sido adicionado agar 1,5% para o preparo do meio sólido.

3 3..22..33.. MMeeiiooLLBB((LLuurriiaaeeBBeerrttaannii))((SSaammbbrrooookk eett aall..,,11998899)) Triptona 10g Extrato de levedura 5g Cloreto de potássio 0,2g Cloreto de sódio 0,6g Água destilada (q.s.p.) 1000 mL

O pH do meio foi ajustado para 7,4. O meio foi autoclavado a 1 atm de pressão e 120 °C por 20 minutos. Para o preparo do meio sólido foi adicionado ágar para uma concentração final de 1,5% (m/v).

3

3..22..44.. MMeeiiooccoommqquueerraattiinnaa((00,,2255%%))

Queratina (Promega) 2,5g

Água destilada (q.s.p.) 1000 mL

O pH do meio foi ajustado para 5,0, não tamponado. O meio foi autoclavado a 1 atm de pressão e 120 °C por 20 minutos.

3

3..33.. SSoolluuççõõeesseettaammppõõeess 3

3..33..11.. SSoolluuççããooddeeeelleemmeennttooss--ttrraaççoo((CCoovvee,,11996666))

Borato de sódio decahidratado 40 mg

Sulfato de cobre pentahidratado 400 mg

Sulfato de ferro heptahidratado 532 mg

Sulfato de manganês monohidratado 292 mg

Molibdato de sódio bihidratado 800 mg

Sulfato de zinco heptahidratado 2 g

Água destilada esterilizada (q.s.p.) 250 mL Solução foi mantida sob clorofórmio a 4 °C.