TÍTULO: DIAGNÓSTICO GENÉTICO MOLECULAR DE PACIENTES BRASILEIROS COM DOENÇA GRANULOMATOSA CRÔNICA
TÍTULO:
CATEGORIA: CONCLUÍDO CATEGORIA:
ÁREA: CIÊNCIAS BIOLÓGICAS E SAÚDE ÁREA:
SUBÁREA: Biomedicina SUBÁREA:
INSTITUIÇÃO(ÕES): CENTRO UNIVERSITÁRIO DAS FACULDADES METROPOLITANAS UNIDAS -FMU
INSTITUIÇÃO(ÕES):
AUTOR(ES): PRISCILA MIEKO HAMAMOTO AUTOR(ES):
ORIENTADOR(ES): KAREN TIAGO DOS SANTOS, ANTONIO CONDINO NETO ORIENTADOR(ES):
COLABORADOR(ES): NURIA BENGALA ZURRO COLABORADOR(ES):
RESUMO
A doença granulomatosa crônica (DGC) é uma imunodeficiência primária causada por mutações em um dos 5 genes que codificam as proteínas do sistema nicotinamida adenina dinucleotídeo fosfato (NADPH) oxidase, presente em células fagocíticas e responsável pela produção de espécies reativas de oxigênio (EROs) para combater infecções. Devido a disfunção desse sistema, os pacientes com DGC apresentam infecções fúngicas e bacterianas recorrentes. Para o presente estudo, foram utilizadas amostras de 28 pacientes com DGC confirmada pelo exame de dihidro-rodamina (DHR). Análises genéticas realizadas através da amplificação dos éxons de interesse por PCR e posterior sequenciamento do DNA extraído de sangue total permitiram confirmar mutações em 5 pacientes, sendo 2 mutações no éxon 2 do gene NCF1 de pacientes do sexo feminino, caracterizando AR-DGC e 3 mutações em diferentes éxons do gene CYBB de pacientes do sexo masculino, caracterizando X-DGC. Todas as mutações encontradas já foram descritas na literatura.
INTRODUÇÃO
A doença granulomatosa crônica (DGC) é uma imunodeficiência primária caracterizada clinicamente por infecções bacterianas e fúngicas recorrentes e formação de granulomas decorrentes de inflamação desregulada. Os principais locais afetados são pele, trato respiratório, linfonodos, fígado e ossos. 1,2
Descrita como entidade clínica em 1957, a DGC é causada por mutações em um dos genes CYBB, CYBA, NCF1, NCF2 ou NCF4, que codificam, respectivamente, as subunidades gp91-phox, p22-phox, p47-phox, p67-phox e p40-phox do sistema nicotinamida adenina dinucleotídeo fosfato (NADPH) oxidase. 3,4
Figura 1. Proteínas do complexo NADPH oxidase presente na membrana dos fagócitos. Fonte: Gardiner G et al. (2013)3
Presente principalmente em células fagocíticas, como macrófagos e monócitos, o sistema NADPH oxidase tem como função catalisar a formação de espécies reativas de oxigênio (EROs), potentes microbicidas que geram a destruição dos microrganismos fagocitados. É composto pelas subunidades proteicas gp91-phox e p22-phox que formam o complexo flavocitocromo b558 na membrana celular, e pelas proteínas citoplasmáticas p40-phox, p47-phox e p67-phox. 5-8
O gene CYBB, que codifica a proteína gp91-phox, está localizado no braço curto (p) do cromossomo X na região Xp21.1, contém 13 éxons e ocupa aproximadamente 30 kb. Mutações no CYBB causam ausência ou defeito da proteína gp91-phox codificada por ele, gerando a DGC ligada ao cromossomo X (X-DGC) que é responsável por cerca de 70% dos casos de DGC. 9,10
O gene NCF1 codifica a p47-phox, componente citosólico do sistema NADPH oxidase. Se localiza no braço longo (q) do cromossomo 7, na região 7q11.23 e é o gene comumente alterado nos casos de DGC autossômica recessiva (AR-DGC) devido a presença de um “hot-spot” no éxon 2. As mutações nesse gene são responsáveis por 25% dos casos de DGC. 11-13
O gene CYBA, localizado no braço longo (q) do cromossomo 16 na região 16q24 possui 6 éxons. Codifica a proteína p22-phox que, junto com a proteína gp91-phox, forma o flavocitocromo b558, que durante a ativação celular da oxidase se associa às proteínas citosólicas. 14
O gene NCF2 está localizado no braço longo (q) do cromossomo 1 na região 1q25 e codifica a proteína p67-phox, subunidade citosólica que se associa com o flavocitocromo b558 e regula a transferência de elétrons. Mutações no gene NCF2 são responsáveis por menos de 6% dos casos de DGC. 15
O gene NCF4 codifica a proteína p40-phox e está localizado no braço longo (q) do cromossomo 22, na região 22q13.1. Até o momento existe registro na literatura de apenas um paciente com mutação nesse gene. 16
Asmutações no gene NCF1 são, em geral, mutações do tipo frameshift, em que a deleção de um mais nucleotídeos causa a formação de um códon de parada prematuro. Mutações no CYBB podem ser do tipo missense, quando a substituição
de um nucleotídeo por outro leva a formação de um aminoácido diferente, ou nonsense, quando a substituição da base gera um códon de parada.
Mutações em qualquer destes 5 genes podem causar DGC, que pode apresentar duas formas de herança: ligada ao cromossomo X (X-DGC) quando a mutação está presente no gene CYBB, ou autossômica recessiva quando a mutação estiver presente nos genes CYBA, NCF1, NCF2 ou NCF4, com mutações no NCF1 sendo as mais comuns. 17
O diagnóstico de DGC é feito utilizando a técnica de Dihidro-rodamina (DHR). O teste consiste na avaliação, mediante citometria de fluxo, da fluorescência emitida pela oxidação da molécula de dihidro-rodamina 123 em rhodamine 123 na presença de espécies reativas de oxigênio nas células. 18,19
Uma das perspectivas de cura da DGC é o transplante de células tronco hematopoiéticas (HSCT, hematopoietic stem cell transplantation), e tem sido uma opção bem sucedida tanto em doadores hematopoieticamente compatíveis quanto em não compatíveis. 20
OBJETIVOS
Analisar as alterações genético moleculares de pacientes brasileiros com doença granulomatosa crônica, identificando o componente alterado e a mutação subjacente que leva às manifestações clínicas da DGC, essencial para o aconselhamento genético e profilaxia adequados.
METODOLOGIAS
Foram estudados pacientes sugestivos de DGC provenientes de diferentes estados do Brasil cujas amostras foram encaminhadas pelos médicos responsáveis. Os procedimentos foram realizados após leitura e concordância com o Termo de Consentimento Livre Esclarecido (TCLE) de crianças e adultos envolvidos no estudo junto com a ficha clínica do paciente preenchida e assinada pelos médicos. O projeto foi desenvolvido sob aprovação da Comissão de Ética em Pesquisas em Seres Humanos do Instituto de Ciências Biomédicas da Universidade de São Paulo (1191/CEPSH).
DESENVOLVIMENTO EXTRAÇÃO DE DNA
um kit de extração Wizard®Genomic DNA Purification de acordo com as instruções do fabricante. Em um tubo de 15 mL contendo 3 mL de sangue, foram adicionados 10 mL de solução de lise celular. As amostras foram incubadas, à temperatura ambiente, por 10 minutos e a seguir, centrifugadas a 2000 x g por 10 minutos. Após centrifugação, o sobrenadante foi descartado e o conteúdo do tubo foi homogeneizado. Foram adicionados 1 mL de solução de lise nuclear e 330 μl de solução para precipitação de proteína e o conteúdo do tubo foi homogeneizado novamente e em seguida centrifugado a 2000 x g por 10 minutos. A seguir, o sobrenadante foi transferido para um tubo de 15 mL contendo 2 mL de isopropanol, a amostra foi homogeneizada e centrifugada a 2000 x g por 1 minuto e após a centrifugação, o sobrenadante foi descartado. Foram adicionados 2 mL de etanol 70% e a amostra foi centrifugada novamente a 2000 x g por 1 minuto. O etanol foi descartado e o tubo mantido em temperatura ambiente para evaporação do etanol remanescente. O DNA foi reidratado com 250 μl de solução de reidratação e incubado overnight a 4°C. Após essa etapa o DNA foi armazenado a -20°C até sua utilização.
AMPLIFICAÇÃO DOS ÉXONS – PCR
As reações de PCR foram realizadas em um volume de 25 μl, contendo 2 μl de DNAg, 2,5 μl de buffer de PCR X10, 2 μl de oligonucleótideos (dNTPs, 2,5 uM), 0,75 μl de MgCl2, 0,3 μl de enzima recombinante Taq DNA polimerase e 15,45 de H2O destilada. A amplificação foi executada num sistema de "multiblock thermocycler" (Applied Biosystems - GeneAmp® PCR sistema 9100).
Devido a herança da DGC, no caso de pacientes femininos a procura da mutação foi realizada, a princípio, no éxon 2 do gene NCF1 devido a presença de um hot-spot na região. No caso dos pacientes masculinos, foi realizada a amplificação dos 13 éxons do gene CYBB.
ELETROFORESE
As amostras amplificadas pela técnica de PCR foram avaliadas pela eletroforese em gel de agarose 1,5% em tampão Tris-Acetato-EDTA (TAE) e corados com SYBR® Green II RNA stain. O marcador de peso molecular de 1 Kb foi utilizado para avaliar a correta amplificação do fragmento de interesse.
Após amplificação dos diferentes éxons mediante PCR as amostras de DNAg foram purificadas GFX™ PCR DNA e Gel Band Purifiction Kit e encaminhadas para sequenciamento no Centro de Genoma Humano da Universidade de São Paulo (equipamento MegaBACE 1000 / DYEnamic ET Dye Terminator Kit Thermo Sequenase™ II DNA Polimerase).
As sequências obtidas após o sequenciamento genético do DNAg foram comparadas com as sequências depositadas no banco de dados de registros de mutações para a DGC (www.ensembl.org/index.html).
RESULTADOS
EXTRAÇÃO DE DNA
A técnica de DHR foi utilizada para o diagnóstico de DGC e foi extraído o DNA genômico dos 24 pacientes com diagnóstico confirmado, seguido da análise genética molecular. A quantidade e qualidade do DNA extraído foi avaliada pelo espectrofotômetro Nanodrop 2000 (Thermo Fisher Scientific) no comprimento de onda de 260 nm e 280 nm. A concentração, em ng/μl, da amostra de cada paciente é apresentada na tabela 1.
Tabela 1: Concentração em ng/μl de DNA genômico extraído dos pacientes DGC. Avaliação realizada por espectrofotômetro.
Paciente Concentração (ng/μl) P1. MBC 96,5 P2. MI 42,1 P3. SMM 50,0 P4. LS 1030,5 P5. VHN 290,0 P6. AJSR 2020,2 P7. ACC 341,0 P8. PAF 299,5 P9. SNC 142,2 P10. CRN 429,6 P11. JRSS 265,4 P12. RDS 540,1 P13. PHSA 95,6
P14. RAD 302,5 P15.GLS 4506,4 P16. RE 234,1 P17. GBS 606,6 P18. DC 648,0 P19. ISES 21,1 P20. LFGS 2272,2 P21. GV 149,2 P22. RR 2397,9 P23. GLSB 1076,1 P24. MM 31,1
AMPLIFICAÇÃO DOS ÉXONS POR PCR
As 24 amostras de DNA genômico extraído foram utilizadas para amplificação dos éxons de interesse por meio da técnica de PCR. Dos pacientes do sexo masculino foram amplificados os 13 éxons do gene CYBB e o éxon 2 do gene NCF1 das pacientes femininas. Os produtos de PCR foram purificados e sequenciados e a análise permitiu a identificação de mutações em 7 pacientes, descritas na tabela 2.
Tabela 2. Descrição das mutações encontradas nos pacientes DGC. Paciente Sexo Gene Éxo
n Proteína Troca de nucleotíde o Troca de aminoácid o Tipo de DGC P1. LS F NCF 1
2 P47-phox Deleção GT AR-DGC
P2. AJSR
F NCF
1
2 P47-phox Deleção GT AR-DGC
P3. ACC Em análise P4. SNC M CYB B GP91-phox G > A Trp > Ter X-DGC P5. JRSS M CYB B GP91-phox C > T Thr > Ile X-DGC P6. RDS M CYB B GP91-phox T > A X-DGC P7. RAD Em análise
ANÁLISE DAS SEQUÊNCIAS
Eletroferogramas obtidos do sequenciamento do material genético dos pacientes com DGC.
As mutações encontradas em pacientes do sexo feminino foram mutações frameshift no éxon 2 do NCF1, com deleções de nucleotídeos GT que resultaram na
formação de um códon de parada (Figura 2). Nos pacientes do sexo masculino, as mutações encontradas foram no gene CYBB, nos éxons 7, 8 e 9 do tipo missense e nonsense (Figuras 3, 4 e 5). As mutações encontradas nos genes NCF1 e CYBB causaram ausência ou defeito em suas proteínas codificadas, p47-phox e gp91-phox respectivamente, gerando o quadro clínico característico da DGC.
Figura 2: P1 e P2. Mutação no gene NCF1. A: Paciente; B. Controle. A mutação está descrita como uma deleção de nucleotídeos GT o que resultou na formação de um códon de parada no éxon 2.
Figura 3: P4. Mutação no gene CYBB. A: Paciente; B: Controle. A mutação está descrita como uma troca de nucleotídeo G por A, resultando na formação de um códon de parada no éxon 7.
A
Figura 4: P5. Mutação no gene CYBB. A: Paciente; B: Controle. A mutação está descrita como troca de nucleotídeo de C por T, resultando em uma mutação missense no éxon 9.
Figura 5: P6. A mutação está descrita como uma troca de nucleotídeo de T por A no éxon 8
CONSIDERAÇÕES FINAIS
Todas as mutações encontradas já foram descritas em outros artigos por Roos et al (2010) como responsáveis por causar ausência ou baixa expressão do sistema NADPH oxidase, levando ao quadro clínico característico de DGC. Identificar o componente alterado e a mutação subjacente que leva às variadas manifestações clínicas é muito importante na DGC, pois cada paciente e sua família têm potencialmente um defeito molecular específico, sendo essencial conhecer a mutação para o aconselhamento genético e profilaxia adequados. Os resultados desse projeto pretendem contribuir para o conhecimento sobre o sistema NADPH oxidase fagocítico humano, e para o desenvolvimento e aprimoramento de estratégias como terapia gênica, edição de genoma ou transplante de medula óssea.
A
FONTES CONSULTADAS
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