MICROENCAPSULAÇÃO DO PROBIÓTICO Bifidobacterium
longum 5
1APOR SPRAY-DRYER E APLICAÇÃO EM POLPA
DE ACEROLA EM PÓ
K. Costa
1*, L.S. Silva
1, L.F.M.
1Corrêa, C.N. Kobori
1, A.M. Silva
11-Departamento de Engenharia de Alimentos – Universidade Federal de São João del Rei - Campus Sete Lagoas, CEP: 35701-970 – Sete Lagoas – MG – Brasil, Telefone: 55 (31) 3697-2031 – e-mail: (*karen.costaa@hotmail.com)
RESUMO – A demanda por matrizes alimentícias não-lácteas vem ganhando destaque nos estudos de desenvolvimento de alimentos probióticos, em virtude do aumento no número de veganos, intolerantes à lactose e alérgicos a proteína do leite. Sucos de frutas podem ser alternativas atrativas, porém a sobrevivência do microrganismo pode ser comprometida pelo pH do produto. Uma forma de minimizar o estresse ácido à cultura probiótica é a utilização da técnica de microencapsulação por spray-dryer. O objetivo do estudo foi microencapsular a cultura Bifidobacterium
longum 51A utilizando maltodextrina e acetato ftalato celulose. Além disso, foi analisada a viabilidade
dos probióticos microencapsulados embalados a vácuo, com ou sem polpa de acerola, durante 30 dias de armazenamento a temperatura ambiente e refrigerada. As microcápsulas sem adição de polpa de acerola e refrigeradas obtiveram maior sobrevivência do probiótico durante a estocagem.
ABSTRACT – Demand for non-milky food matrix has been gaining attention in the probiotic foods development studies due to the increase in the number of vegans, lactose intolerant and people with an allergy to milk protein. Fruit juices are attractive alternatives, but the survival of the microorganism may be compromised by pH of the product. One way to minimize acid stress to probiotic culture is the use of the microencapsulation by spray-dryer technique. The study aimed to microencapsulate the probiotic culture Bifidobacterium longum 51A using maltodextrin and cellulose acetate phthalate.
Furthermore, it was analyzed the viability of probiotics microencapsulated in vacuum package, with or without acerola pulp powder, stored at refrigerated and room temperature, during 30 days. The microcapsules without adding acerola pulp and refrigerated had higher survival of probiotic during storage.
PALAVRAS-CHAVE: alimento funcional; probióticos; microencapsulação.
KEYWORDS: functional food; probiotic; microencapsulation.
1. INTRODUÇÃO
Internacionalmente, define-se probióticos como “microrganismos vivos que quando administrados em quantidades adequadas, oferecem benefícios para a saúde do hospedeiro” (FAO/OMS, 2002). A legislação brasileira considera alimento com alegação de funcionalidade aquele que contenha a quantidade mínima viável dos microrganismos reconhecidos como probióticos, compreendida entre 108 e 109 UFC por porção diária a ser fornecida pelo fabricante (Brasil, 2008).
Grande parte dos produtos probióticos comercializados são de origem láctea (Ranadheera et al., 2010). Todavia, a demanda por matrizes alimentícias não-lácteas vem crescendo de forma
acentuada, em virtude, principalmente, do número de pessoas lactase deficientes e de indivíduos alérgicos a proteína do leite. Além disso, houve intensificação dos consumidores que buscam alimentos com reduzido teor de colesterol e também dos adeptos às práticas veganas. Sendo assim, os sucos de frutas e vegetais correspondem a uma alternativa no desenvolvimento de bebidas não lácteas probióticas (Prado et al., 2008).
A viabilidade de microrganismos probióticos em sucos é mais complexa quando comparada aos produtos lácteos. Dependendo do tipo de fruto empregado como matriz pode-se inviabilizar culturas probióticas devido a baixos valores de pH e por quantidades insuficientes de aminoácidos livres e peptídeos requeridos no metabolismo celular (Antunes et al., 2013). A acerola, Malpighia
emarginata, de origem tropical, possui alto teor de vitamina C, antocianinas e carotenoides o que já
torna o fruto um potencial alimento funcional devido à presença destes compostos bioativos. A acerola depois de colhida possui alta perecibilidade e, por isso, utilizam-se técnicas que visem à conservação dos frutos e sua presença no mercado ao longo do ano (Tavares et al., 1998).
Existem inúmeros desafios no desenvolvimento de alimentos contendo probióticos como a manutenção da viabilidade dos microrganismos em concentrações adequadas durante o processamento (temperaturas elevadas, exposição ao oxigênio e pH ácido), o período de armazenamento, além das condições desfavoráveis em que são submetidos durante a passagem pelo trato gastrointestinal (acidez estomacal e sais biliares). A microencapsulação surge então como alternativa de retenção dos microrganismos benéficos em membranas poliméricas que oferecem proteção as culturas sensíveis ao estresse oxidativo, permite a liberação do conteúdo das microcápsulas no intestino, diminui problemas com contaminações, além de aumentar a retenção de microrganismos no produto final (Favaro- Trindade et al., 2008; Saad et al., 2011). Dentre os processos de microencapsulação de probióticos, a secagem por spray drying é a mais utilizada, principalmente em culturas com altas concentrações de microrganismos (Santos, 2013).
Desta forma, o objetivo do trabalho foi microencapsular o probiótico Bifidobacterium
longum, pela técnica de spray-dryer, e promover a aplicação das microcápsulas em polpa de acerola
em pó.
2. MATERIAL E MÉTODOS
A cultura de Bifidobacterium longum 51A, gentilmente cedida pelo Prof. Jacques Robert
Nicoli (ICB/UFMG), foi isolada de crianças saudáveis e identificada por técnicas de biologia molecular – PCR Multiplex (Souza et al., 2012). Foram testados como materiais encapsulantes o acetato ftalato de celulose (CAP) e a maltodextrina para determinação do material de parede que proporcionaria maior sobrevivência dos microrganismos após o processo de atomização. A sobrevivência do probiótico atomizado com a polpa de acerola também foi avaliada. Após a determinação das melhores condições para o processo de microencapsulação, determinou-se a viabilidade das microcápsulas contendo Bifidobacterium longum 5 1A ao longo da estocagem em
temperatura ambiente (25ºC ± 2) e refrigerada (5°C ± 2), aplicadas em polpa de acerola em pó ou não (controle), embaladas em filme multicamadas a vácuo. A viabilidade do microrganismo foi determinada no dia 0 e após 3, 7, 15 e 30 dias de estocagem ou até reduzir a menos de 2 log UFC/g.
2.1. Controle de qualidade
As análises de coliformes a 35ºC, pela técnica do Número Mais Provável (NMP) e contagens de bolores e leveduras (BRASIL, 2001; Silva et al., 2010) foram realizadas para verificação da qualidade dos produtos estocados nos tempos 0, 7,15 e 30 dias, à temperatura ambiente (25ºC ± 2) e sob refrigeração (5ºC ± 2).
2.2. Microencapsulação por Spray Dryer
Foram realizadas ativações do microrganismo congelado em caldo MRS (de Man, Rogosa e Sharpe, Merck KGaA) em tubos de ensaio com headspace reduzido e adição de 1% L-cisteína, com incubação posterior à 37ºC/24 horas. Em seguida, a cultura probiótica foi concentrada em Centrífuga Refrigerada (NT 825 Centrifuga Refrigerada, Nova Técnica) a 4670g (6000 RPM) por 15 minutos a temperatura de 4ºC e os precipitados foram lavados em solução salina (NaCl 0,85%) e centrifugados novamente por duas vezes (Liserre et al., 2007).
Para as formulações do material de parede, foram utilizados maltodextrina nas concentrações de 20 e 30% (m/v) (Ingredion, Brasil Ingredion LTDA) e o CAP (SM Empreendimentos Farmacêuticos LTDA) preparado com os seguintes reagentes dissolvidos em solução tampão pH 7,5: 7,5g CAP; 3,5g glicerol; 2,0g maltodextrina; 0,8g Tween 80; 3,0g leite em pó desnatado; 1,0g hi-maize e 2,0g de trealose, de acordo com Antunes et al. (2013). A atomização foi realizada em mini
Spray Dryer (modelo MSD 3.0, LM - Labmag do Brasil LTDA). As condições operacionais utilizadas
foram: temperatura de entrada do ar de secagem 110ºC; pressão no bico atomizador de 5,0 bar; vazão média de ar no atomizador de 4L/min e vazão média de alimentação de 1L/h.
A viabilidade do probiótico Bifidobacterium longum 51A foi determinada da seguinte
maneira: uma amostra do pó resultante do processo foi diluída em tampão fosfato de sódio (pH 7,5) e mantido por 5 minutos em banho maria (37ºC) para desintegração das microcápsulas. Em seguida, foram realizados plaqueamentos pour plate em ágar MRS adicionado de L-cisteína 1%, com incubação em jarras de anaerobiose (Permution), com geradores de anaerobiose (AnaeroGenTM,
Inglaterra), à 37ºC por 72 horas (Vinderola e Reinheimer, 2000).
A sobrevivência dos microrganismos foi determinada segundo equação proposta por Fritzen-Freire (2013), em que a contagem da viabilidade do probiótico microencapsulado é dividido pela contagem da solução de alimentação em base seca (%).
2.3. Análises estatísticas
Os dados foram avaliados estatisticamente pela Análise de Variância (ANOVA) e as médias comparadas pelo teste de Tukey com nível de significância de 5% (p<0,05), através do software ASSISTAT 7.7 Beta.
3. RESULTADOS E DISCUSSÃO
As amostras analisadas nos tempos 0 e 7 dias apresentaram resultados para coliformes totais (<3,0 NMP/mL) que atenderam ao padrão microbiológico estabelecido pela legislação brasileira para sucos desidratados (BRASIL, 2001). Apesar da não exigência na RDC nº12/2001, realizou-se análise de contagens de bolores e leveduras a fim de verificar a qualidade microbiológica do produto final. Os valores encontrados nas contagens de bolores e leveduras foram de aproximadamente 2,0 log UFC/mL para os tempos 0 e 7 dias de estocagem. A presença de bolores e leveduras pode estar relacionada às condições inadequadas de estocagem da embalagem utilizada para acondicionamento das amostras ou mesmo por contaminação durante os procedimentos experimentais. Tanaka (2007) também realizou análises microbiológicas de bolores e leveduras para suco de acerola microencapsulado armazenado a 25ºC durante 90 dias e encontrou resultados inferiores a 10 UFC/g.
As médias das contagens de microrganismos probióticos antes e após o processo de atomização das microcápsulas de maltodextrina e CAP estão apresentadas na Tabela 1.
Tabela 1 - Viabilidade das células de B.longum 51A na solução de alimentação e nas microcápsulas
produzidas com diferentes materiais de parede e a sobrevivência ao processo de atomização*.
*Médias ± desvios padrão das triplicatas do processo de atomização seguidas pela mesma letra minúscula na
coluna, não diferem estatisticamente entre si pelo teste de Tukey a 5% de significância.
Verificou-se que não houve diferença significativa entre as contagens de microrganismos após o processo de atomização. Assim, optou-se por utilizar as microcápsulas de maltodextrina 20% no estudo de estabilidade e aplicação, pois este material já possui ampla aplicação como agente encapsulante na indústria de alimentos processados (Santos, 2013) e em pesquisas de microencapsulação de compostos bioativos. Comparado ao CAP, a maltodextrina é mais viável financeiramente, além da maior facilidade de preparo da solução de alimentação. Em pesquisa semelhante, Santos (2013) realizou a microencapsulação por spray drying de Lactobacillus casei utilizando maltodextrina como agente microencapsulante. Como resultado, obteve a concentração de células viáveis de 1,5 x 108 UFC/g, utilizando 20% do material de parede no preparo da solução de
alimentação com temperatura de secagem de 95ºC.
A adição de polpa de acerola na solução de alimentação (antes da atomização), resultou no declínio de cerca de 3 log UFC/g nas contagens de B.longum 51A em relação aos resultados obtidos
anteriormente para as microcápsulas contendo apenas o probiótico. Tal fato pode ser explicado devido ao tempo de exposição da bactéria na solução de alimentação antes da atomização que estava com pH mais ácido (3,48), devido ao baixo pH da polpa de acerola adicionada. Resultados semelhantes foram encontrados em pesquisa desenvolvida por Almeida (2012), que utilizou maltodextrina 10% como um dos materiais de parede para microencapsular suco de abacaxi contendo Lactobacillus casei NRRL B-442 e obteve contagem de apenas 5,85 log UFC/g.
Portanto, a polpa de acerola e o probiótico B.longum 51A foram atomizados separadamente e
seus pós foram misturados antes de embalar em filme multicamadas a vácuo. A Tabela 2 mostra as contagens obtidas para as microcápsulas controle (B.longum 51A) e da mistura (B.longum 51A + polpa
de acerola) durante a estocagem em temperatura ambiente (25ºC ± 2) e refrigerada (5± 2°C).
Tabela 2 - Viabilidade das microcápsulas (log UFC/g) de Bifidobacterium longum 51A adicionadas ou
não de polpa de acerola microencapsulada durante o armazenamento em diferentes temperaturas*.
Amostra Tempo (dias)
Temperatura de armazenamento
5ºC 25ºC
0 7,86 ± 0,16Aa 7,86 ± 0,16Aa
B.longum 51A 3 5,50 ± 0,34Ba 4,00 ± 0,10Bb
7 3,86 ± 0,62Ca 2,30 ± 0,30Cb
0 4,00 ± 0,02Aa 4,00 ± 0,04Aa
B.longum 51A + polpa de acerola 3 3,09 ± 0,15Aa 2,03 ± 0,05Ba
7 1,71 ± 0,88Ba 0,58 ± 0,34Cb *Médias seguidas pela mesma letra, maiúscula na coluna e minúscula na linha, não diferem estatisticamente entre
si pelo teste de Tukey a 5% de significância.
A temperatura foi um fator que influenciou a viabilidade do microrganismo. Amostras armazenadas em temperaturas mais baixas resultaram em contagens significativamente maiores. Houve também decréscimo significativo em relação ao período de estocagem, o que limitou as
Materiais de parede Solução de alimentação
(log UFC/g) Microcápsulas (log UFC/g) Sobrevivência (%) Maltodextrina (20%) 8,42 ± 0,27b 7,42 ± 0,37a 88,01a Maltodextrina (30%) 9,76 ± 0,45a 7,72 ± 0,52a 81,16ab
Acetato Ftalato de Celulose 9,32 ± 0,11a
análises até 7 dias, em virtude da queda pronunciada nas contagens abaixo dos limites comumente estabelecidos pela legislação. Entretanto, se aumentasse a quantidade da porção microencapsulada da amostra controle com até 3 dias de estocagem (independente da temperatura) e o consumo recomendado para 100g, o produto desenvolvido atenderia a legislação para, por exemplo, leites fermentados.
Antunes et al. (2013) realizaram experimentos semelhantes, estes avaliaram a viabilidade de probióticos em amostras de néctar de acerola adicionadas de probióticos microencapsulados e adicionadas de microrganismos livres, durante o armazenamento por 30 dias sob refrigeração. Como resultado, obtiveram contagens de Bifidobacterium animalis no néctar de acerola com microrganismos microencapsulados e livres de 8,15 e 5,94 log UFC/200mL, respectivamente.
A adição da acerola foi um fator limitante na sobrevivência dos microrganismos probióticos, devido principalmente ao pH da fruta, bastante ácido. A Tabela 3 apresenta os resultados obtidos para pH e acidez titulável para o controle (B.longum 51A) e a mistura (B.longum 51A + polpa de acerola).
Tabela 3 - Medidas de pH e acidez titulável para as amostras controle e da mistura (B.longum 51A +
polpa de acerola)*.
Amostra Temperatura (ºC) pH Acidez titulável (%)
B.longum 51A 5 7,45 ± 0,16a 0,04 ± 0,0b
25 7,63 ± 0,15a 0,04 ± 0,0b
B.longum 51A + polpa de acerola 5 3,51 ± 0,03b 1,19 ± 0,08a
25 3,54 ± 0,02b 1,23 ± 0,14a *Médias seguidas pela mesma letra minúscula na coluna, não diferem estatisticamente entre si pelo teste de
Tukey a 5% de significância.
Para a amostra controle, o pH apresentou-se próximo a neutralidade com acidez titulável de 0,04%. Todavia, para a amostra com a mistura, houve decréscimo significativo no pH e aumento da acidez titulável, devido adição da polpa de acerola. Resultados equivalentes podem ser observados no estudo desenvolvido por Antunes et al. (2013) ao medir o pH do néctar de acerola elaborado e adicionado de microcápsulas de B. animalis. Os valores de pH variaram de 3,56 a 3,83.
4. CONCLUSÃO
Pode-se concluir que a polpa de acerola não correspondeu a uma matriz viável para o desenvolvimento de um novo produto probiótico, devido principalmente ao pH ácido da fruta. Mesmo empregando a técnica de microencapsulação por spray drying houve decréscimo nas contagens de
Bifidobacterium longum 51A no momento de contato do microrganismo com a polpa de acerola. Outra
alternativa seria promover o teste de viabilidade do microrganismo em polpa de acerola utilizando como agente microencapsulante o CAP.
5. AGRADECIMENTOS
Agradecimentos a Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de Minas Gerais – FAPEMIG.
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