CINÉTICA FERMENTAÇÕES

(1)

1. INTRODUÇÃO



Cinética das fermentações



descreve o crescimento do

MO e a formação do

MO e a formação do produto pelo MO

produto pelo MO

Nutriente (S) + MO (X)

CINÉTICA PROCESSO FERMENTATIVO

Produto (P) + MO (X)



Quais substâncias (consumidas e produzidas) devemos

escolher para estudo cinético?



S limitante



P de interesse

Bioquímica Industrial- professora Cristina Fantini Bioquímica Industrial- professora Cristina Fantini

1



PPar

ara

a rreeal

aliz

izar

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o eest

stud

udo

o ci

ciné

néttic

icoo



p

prroocceed

deer

r

àà

fermentação e de tempos em tempos coletar alíquotas do

caldo fermentado para determinar [S], [P] e

caldo fermentado para determinar [S], [P] e [X]

[X]



Objetivos do estudo cinético



Representação gráfica do processo fermentativo com o

tempo

CINÉTICA PROCESSO FERMENTATIVO

(2)

2. Cinética do Crescimento Microbiano



Crescimento do MO



Caracterizado por um acréscimo

em massa celular



Ocorre somente quando certas condições são satisfeitas



Condições



físicas e químicas



pH, T (°C) e [nutrientes]



Crescimento populacional



definido como o aumento do

n° celúlas ou da massa microbiana



Taxa de crescimento



é a variação do n° de células ou

massa de MO por unidade de tempo

CINÉTICA PROCESSO FERMENTATIVO

Bioquímica Industrial- professora Cristina Fantini

3

CURVA CRESCIMENTO MICROBIANO

A– B = fase de latência ou fase lag

B C = fase de transição E

(3)

CURVA CRESCIMENTO MICROBIANO

A = fase lag B = fase log

C = fase estacionária D = fase declínio

5

1) Fase de latência ou fase lag



Fase de adaptação = fase de ajuste



Período variável



Ainda não há um aumento significativo da população



tx. de crescimento ~ zero



Inicia logo após a inoculação



Célula sintetiza enzimas necessárias ao seu metabolismo



reorganização celular no

“novo”

meio



Duração depende de: Valor de X

₀

; composição do meio;

idade e viabilidade celular

(4)

2) Fase de Transição

3) Fase Log



Células já estão totalmente adaptadas, absorvendo os

nutrientes, sintetizando seus constituintes, crescendo e se

duplicando



Período de crescimento balanceado



velocidade

específica de crescimento, µ é constante



A taxa de crescimento exponencial é variável, de acordo

com o tempo de geração do organismo em questão.

7



O tempo de geração (T

_g

) é o intervalo de tempo

necessário para que uma célula se duplique.



O tempo de geração é variável para os diferentes

organismos, podendo ser de 10 a 20 minutos até dias,

sendo que em muitos dos organismos conhecidos, este

varia de 1 a 3 horas



Nesta fase são realizadas as medidas de T

_g



Fase log é representada por uma reta no gráfico

(5)

4) Fase Linear de Crescimento

5) Fase de Desaceleração



Em algum momento do cultivo r

X

começa a diminuir



desaparecimento de algum nutriente ou acúmulo de um P

inibidor

 

velocidade de crescimento



Célula passa por transição até que r

X

= zero (fase

estacionária)

9

6) Fase Estacionária



X atinge valor máximo e constante = X

m



Nesta etapa não há um crescimento líquido da

população, ou seja, o número de células que se divide é

equivalente ao número de células que morrem



Tx. de crescimento = zero



Equilíbrio entre velocidade de crescimento e velocidade

de morte



crescimento líquido da população = zero



É na fase estacionária que são sintetizados vários

metabólitos secundários

5) Fase de Morte

(6)

2.1 Velocidade Específica de Crescimento Celular



Devido ao fato de que a concentração microbiana X

aumenta

durante

um

cultivo,

aumentando

consequentemente

a

concentração

do

complexo

enzimático responsável pela transformação do S em P



Mais correto analisar os valores das velocidades

instantâneas com relação à referida concentração

microbiana



especificar o valor de X em um dado

instante analisado = Velocidade Específica de Crescimento

CINÉTICA PROCESSO FERMENTATIVO

11



Em cinética de fermentações não é usado a variável r

(veloc. instantânea de crescimento) e sim usado o valor

de µ

VELOCIDADE ESPECÍFICA DE CRESCIMENTO CELULAR

X = [celular] (g/L) t = tempo

r_X= veloc. Instantânea (g/L.h) µ = velocidade específica de crescimento celular (h-1₎

(7)



Integrando dX/dt = µ X, quando µ é constante, temos:

VELOCIDADE ESPECÍFICA DE CRESCIMENTO CELULAR

13



Quando

Δ

t = Tg, isto é, tempo requerido para X

₂

= 2X

₁

,

chamado tempo de geração, temos:

assim,



Podemos representar o crescimento exponencial (fase

log) pela seguinte reta:

VELOCIDADE ESPECÍFICA DE CRESCIMENTO CELULAR

tempo lnX



µ é a inclinação da reta

(8)



µ e Tg são parâmetros importantes em microbiologia



permitem prever a evolução da [X] ao longo da fase log



Usados para avaliar a resposta do MO às diversas

condições do ambiente

VELOCIDADE ESPECÍFICA DE CRESCIMENTO CELULAR

15

fase exponencial

µ

fase lag _{fase estacionária}

3. Cinética de Consumo de Nutrientes

 Dispondo dos dados de concentração de nutrientes no tempo

de fermentação, como mostrado, em destaque, na curva da figura abaixo, é possível obter a velocidade de consumo de nutrientes em cada ponto

CINÉTICA PROCESSO FERMENTATIVO

s

X P

[ ] _{A velocidade de consumo de S é a}

derivada em cada ponto (r_S = dS/dt)

(9)

 No estudo das cinéticas fermentativas não é usado a variável

velocidade de consumo de nutrientes (r_S) e sim a Velocidade Específica de Consumo de Nutrientes (µ_s) que é definido da seguinte maneira:

CINÉTICA DE CONSUMO DE NUTRIENTES

17 dt dS X    s  Onde: S = Concentração de nutrientes (g/L) X = Concentração celular (g/L) T = Tempo (h)

µ_s = Velocidade específica de consumo de nutrientes (h-1₎

4. Cinética de Formação de Produto

 Formação de produto metabólito pode ser relacionada a

consumo de nutriente.

 Além do mais, formação de produto não pode ocorrer sem a

presença de células.

Assim, é esperado que o crescimento de X e a formação de P

estejam intimamente relacionados à utilização de nutrientes.

 Dependendo dos controles metabólitos regulatórios, a

formação de produto será ligada a crescimento e/ou concentração celular.

(10)

 A relação cinética entre crescimento e formação de produto

depende do papel do produto no metabolismo celular.

 As duas cinéticas mais comuns são aquelas que descrevem a

síntese do produto durante o crescimento e após o crescimento ter cessado.

 Um exemplo menos comum aplica ao caso onde o crescimento

inicialmente ocorre sem formação de produto, mas após algum período de tempo o produto começa a aparecer enquanto o crescimento continua.

CINÉTICA DE FORMAÇÃO DE PRODUTO

19

CINÉTICA DE FORMAÇÃO DE PRODUTO

X P X X P P [ ] [ ] [ ] t t

(a) Formação de P associado ao crescimento (b) Formação de P parcialmente associado

(11)

 No gráfico (a)  a formação de produto é associado ao

crescimento celular.

 No gráfico (b)  temos formação de produto associado ao

crescimento, de uma forma mais ou menos confusa, chamada de formação de produto parcialmente associada ao crescimento.

 No gráfico (c)  temos formação de produto não associada ao

crescimento.

 A velocidade de formação de produto é a derivada de P em

cada ponto dP/dt. Da mesma forma dP/dt não é usado (velocidade de formação de produto) e pode ser transformada em Velocidade Específica de Formação de Produto (µ_P) que é definido da seguinte maneira:

21 dt dP X   p 

5. Fatores de Conversão

 O crescimento de X e a formação de P por X são processos de

bioconversão  S é convertido em X e metabólitos,

principalmente P

 Cada uma destas conversões pode ser quantificada por um

coeficiente de rendimento = massa de células ou produto formado por unidade de massa de S consumido

 Y_X/S  fator de conversão de S em X

 Y_P/S  fator de conversão de S em P

(12)

CINÉTICA PROCESSO FERMENTATIVO

23  Processos onde o P principal são células, ou seja, o objetivo

é a produção de X maximizar o crescimento celular e

minimizar a formação de P  Y_X/S > Y_P/S

Processos onde o P principal são metabólitos  maximizar

formação de P e minimizar o crescimento de X Y_P/S > Y_X/S

6. Influência da [S] sobre a velocidade específica de

crescimento

 A velocidade de crescimento, como uma velocidade de reação

química, é uma função da concentração de compostos químicos.

 Os compostos químicos nesse caso são os nutrientes

essenciais para o crescimento.

 A forma da relação entre velocidade de crescimento e

concentração de nutriente foi observada em 1949 por Monod, sendo similar à cinética de saturação exibida por adsorção monomolecular de Langmuir.

(13)

6.1 Equação de Monod

 A eq. de Monod(1949)  usada para explicar a relação entre

[S] e µ_X

CINÉTICA PROCESSO FERMENTATIVO

25

µ_m = Velocidade específica máxima de crescimento celular K_S = Constante de saturação

6.2 Significado de K

_S

 Se considerarmos KS = S, na equação de Monod temos:

(14)

 No inicio do cultivo, [S] é alto  o MO apresenta µ próximo à

µ_m

 Quanto menor o valor de K_S mais amplo será o patamar,

quase horizontal da curva µ X S

27

 Na teoria nunca é atingido o valor de µ_m, por mais alta que

seja a [S] inicial

 Na prática, os valores experimentais podem ser considerados

como tal  isso devido aos erros que afetam os valores

calculados de µ_X

A idéia é sempre trabalhar com S que apresente menor valor

de K_S maior rendimento do processo fermentativo

6.3 Determinação das Constantes Cinéticas

 A forma gráfica de determinar as constantes cinéticas da eq.

de Monod é chamada de linearização de Lineweaver-Burk =

(15)

CINÉTICA PROCESSO FERMENTATIVO

29

 Os valores de K_S são muito pequenos em relação a [S] nas

fermentações industriais

 µ ~ µ_m quando [S] = 10K_S

Para [S] < 10 K_S  µ é uma forte função da [S]

 Durante a fase exponencial µ é constante

 Quanto menor valor de K_S, maior rendimento da fermentação  Para determinar valores de K_S e µ_m  fazer linearização e pela

equação da reta determinar estas constantes cinéticas