Methylglyoxal effects on protein aggregation and amyloid formation

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(1)UNIVERSIDADE DE LISBOA FACULDADE DE CIÊNCIAS DEPARTAMENTO DE QUÍMICA E BIOQUÍMICA . . Methylglyoxal effects on protein aggregation and amyloid formation . Luís Miguel Araújo da Silva Oliveira . Doutoramento em Bioquímica (Especialidade: Biofísica Molecular) Tese orientada por: Prof. Doutor Alexandre Luís de Matos Botica Côrtes Quintas   Doutor Carlos Alberto Alves Cordeiro   . 2009 .

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(3) De acordo com o disposto no artigo n°. 40 do Regulamento de Estudos Pós‐Graduados da Universidade de Lisboa, Deliberação n° 961/2003, publicada no Diário da República – II Série n°. 153 – 5 de Julho de 2003, foram incluídos nesta dissertação os resultados dos seguintes artigos:   Luís M. A. Oliveira, Carlos Cordeiro, Ana Ponces Freire, Carla Ascenso, Alexandre Quintas. 2007. Unveiling heme proteins conformational stability through a UV absorbance ratio method Anal Biochem. 371: 253‐5 Alexandre Quintas, Luís M. A. Oliveira. 2008. Protein hierarchy levels of structural organization for amyloidogenesis: Biochemical and biophysical aspects underlying misfolding and disease. Protein Misfolding in Biology and Disease T. F. Outeiro, Research Signpost: 1‐34. Ricardo A. Gomes, Luís M. A. Oliveira, Mariana Silva, Carla Ascenso, Alexandre Quintas, Gonçalo Costa, Ana V. Coelho, Marta Sousa Silva, António E. N. Ferreira, Ana Ponces Freire, Carlos Cordeiro. 2008. Protein glycation in vivo: Functional and structural effects on yeast enolase. Biochem J. 416: 317‐26 . . .

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(5)                                                                                                                      Aknowledgments/Agradecimentos . Aknowledgments/Agradecimentos Chegada a conclusão desta etapa com mais de quatro anos, não a poderia deixar terminar sem agradecer a todos os que, directa ou indirectamente, contribuíram para a realização deste trabalho. Em primeiro lugar quero expressar o meu mais profundo agradecimento ao Professor Doutor Alexandre Quintas, orientador principal deste trabalho, por todo o seu apoio, amizade, compreensão e disponibilidade. Desde que começámos a trabalhar juntos que sempre manteve a nossa relação numa base de confiança, transmitindo‐me a ideia de que somos uma equipa. E uma equipa luta junta pelos seus objectivos. As suas qualidades humanas e científicas que sempre marcaram presença são uma referência. Estou certo que no futuro ainda muito mais irei aprender com ele. Por tudo, o meu mais sincero obrigado. Ao Doutor Carlos Cordeiro, segundo orientador deste trabalho, agradeço a preocupação e ensinamentos que me fizeram crescer como investigador desde o primeiro dia que integrei o grupo de enzimologia. A sua serenidade, ponderação e conhecimento contribuíram de forma extremamente positiva para o desenrolar deste trabalho e para a minha aprendizagem como investigador. À Professora Doutora Ana Ponces, uma palavra especial por tudo o que representa. Desde os tempos de licenciatura que é uma referência minha pelos ensinamentos, pela sua capacidade invulgar de gerar motivação, pelo apoio, amizade e postura perante a vida. Uma pessoa que admiro profundamente que me ensinou e preparou a ser o investigador que sou. Aos amigos e colegas do Laboratório de Patologia Molecular, onde passei a maior parte do meu doutoramento, quero agradecer a simpatia, amizade, companheirismo e boa disposição que sempre pautou a nossa investigação. O meu destaque à Professora Carla Ascenso pelo apoio, ao Carlos Família, com quem partilho o laboratório desde o início, e à Lena pela amizade. Carlos fica a frase: “Oi pessoal tudo bem? Vai um café?”. À Ana e ao Miguel pela amizade, companheirismo e espírito de grupo criado. Não esquecerei a entreajuda estabelecida convosco bem como as . .

(6) Aknowledgments/Agradecimentos                                                                                                                 aventuras por Lausanne e Copenhaga. Espero sinceramente que não fiquem por aqui. À Joana pela alegria, amizade e bom espírito. É bom ter‐te no laboratório. Ao Gonçalo pelo espírito e amizade. À Catarina que foi marcante pelo furacão de alegria que sempre trazia consigo quando entrava pelo laboratório. Uma amiga que ficou. E finalmente, aos colegas que, não fazendo parte do nosso grupo, estão tão perto: à Teresa e à Susana pela amizade e carinho e ao Henrique, à Inês e ao Paulo pelo bom espírito e profissionalismo que trazem sempre consigo. You make my day!!! Agradeço também a todas as pessoas do Grupo de Enzimologia, o grupo que inicialmente me acolheu e formou. Foi muito o que aprendi junto de vós. O meu agradecimento especial ao Professor António Ferreira pelos conhecimentos e disponibilidade que sempre mostrou. Ao Ricardo Gomes por ser um colega espectacular. Diversão, capacidade de trabalho, entreajuda, amizade, espírito empreendedor, sempre foram qualidades que estiveram presentes. Ao Nuno Lages por ser um grande amigo com quem partilhei bons e maus momentos ao longo destes anos. Ao Hugo Miranda pela longa amizade e por todos os desafios que superámos em conjunto ainda desde a licenciatura. À sempre sorridente Lídia pela amizade e boa disposição. E finalmente à Mariana, ao Gonçalo e à Marta pela amizade e apoio. Uma palavra também para o Doutor Tiago Outeiro que desde o início se revelou ser uma pessoa inspiradora que me leva sempre a tentar ser um investigador cada vez melhor. Admiro muito a sua capacidade de comunicação, trabalho e toda a ciência que produz. O meu obrigado por toda disponibilidade, serenidade e confiança que sempre esteve presente na nossa relação, bem como a ajuda fornecida para que fosse possível trabalhar no laboratório do Professor Doutor Hilal Lashuel. Ao Professor Doutor Hilal Lashuel o meu muito obrigado por me ter acolhido no seu laboratório. As suas qualidades científicas são do melhor que tive a possibilidade de presenciar. Apesar do pouco tempo que estive no seu laboratório, foram inúmeros os conhecimentos que obtive e a aprendizagem que fiz. Para isso contribuiu também sem dúvida a orientação mais estreita da Doutora Katrina Paleologou com quem foi um prazer enorme trabalhar. A todos o meu muito obrigado em especial aos colegas Abid, Asad, Margot e Mirva. Aos amigos, que estão sempre lá, para a ciência e para tudo o resto. Não há palavras para descrever a vossa importância na minha vida. Sinto‐me um privilegiado por poder chamar amigo a .

(7)                                                                                                                      Aknowledgments/Agradecimentos muita gente, mas não consigo deixar de vos destacar. Obrigado João Luís, Sónia Pais, Margarida Neves de Sousa, Ana Rita Moreira, João Lopes, Sara Gomes e a todos os Scramble por fazerem parte da minha vida. Por último o meu agradecimento a toda a família… aos avós, aos padrinhos, aos tios e primos que, embora longe, são tão importantes e sabem estar tão perto; e duas palavras de grande carinho: para com a minha mãe por tudo o que me proporcionou desde que nasci. Este meu ínfimo sucesso é sem dúvida fruto do seu amor, trabalho e dedicação… e eu não sou fácil de aturar!!! É impossível verbalizar a importância que tens na minha vida; e para com o meu pai a quem quero muito dedicar este trabalho. A tua partida a meio deste caminho deixa‐me uma mágoa inigualável. Era capaz de escrever outra tese sobre a pessoa, o exemplo e a referência que és e como te tenho presente nos meus dias, nas minhas atitudes e decisões. Sei que ninguém estaria mais orgulhoso que tu por me ver chegar aqui e por isso sei que o que fiz também é teu. . . .

(8) Aknowledgments/Agradecimentos                                                                                                                 .

(9)                                                                                                                      Aknowledgments/Agradecimentos . Table of Contents AKNOWLEDGMENTS/AGRADECIMENTOS...........................................................................................V TABLE OF CONTENTS ............................................................................................................................... IX SUMMARY.................................................................................................................................................. XIII RESUMO .......................................................................................................................................................XV ABBREVIATIONS ..................................................................................................................................... XIX CHAPTER I...................................................................................................................................................... 2 1. PROTEIN STRUCTURE .................................................................................................................................. 3 1.1 Secondary structure ............................................................................................................................. 5 1.1.1 Helical structures ........................................................................................................................................... 5 1.1.2 Beta structures ............................................................................................................................................... 6 1.1.3 Non-repetitive secondary structure ................................................................................................................ 7 . 1.2 Tertiary structure................................................................................................................................. 7 1.3 Protein dynamics and flexibility .........................................................................................................10 1.4 Natively unfolded proteins ..................................................................................................................11 2. THE PROTEIN FOLDING PROBLEM ...............................................................................................................14 2.1 The folding code .................................................................................................................................14 2.2 The folding process.............................................................................................................................15 3. PROTEIN MISFOLDING IN BIOLOGY AND DISEASE ........................................................................................18 3.1 Protein structure and amyloidosis ......................................................................................................19 3.1.1 Intrinsically unstructured proteins in conformational diseases .....................................................................21 3.1.2 Monomeric proteins in conformational diseases...........................................................................................24 3.1.3 Oligomeric proteins in conformational diseases ...........................................................................................26 3.1.4 The intrinsically unstructured, monomeric and oligomeric proteins in amyloidogenesis .............................28 . 3.2 Molecular mechanisms of amyloidosis ...............................................................................................29 3.3 Cellular aspects of protein misfolding and disease ............................................................................32 4. POST-TRANSLATIONAL PROTEIN MODIFICATIONS .......................................................................................35 4.1 Polyamine binding ..............................................................................................................................36 . .

(10) Table of Contents                                                                                                                                               4.2 Oxidation ............................................................................................................................................36 4.3 Nitration..............................................................................................................................................37 4.4 Ubiquitination.....................................................................................................................................37 4.5 Sumoylation ........................................................................................................................................38 4.6 Phosphorilation ..................................................................................................................................38 4.7 Glycation ............................................................................................................................................39 4.7.1 Methylglyoxal...............................................................................................................................................42 4.7.2 Glycation and amyloidosis............................................................................................................................46 . CHAPTER II ...................................................................................................................................................51 1. ABSTRACT .................................................................................................................................................53 2. INTRODUCTION ..........................................................................................................................................53 3. MATERIAL AND METHODS ..........................................................................................................................55 3.1 Methylglyoxal preparation .................................................................................................................55 3.2 Cytochrome c glycation ......................................................................................................................55 3.3 Cytochrome c aggregation..................................................................................................................55 3.4 Structural analysis of cytochrome c....................................................................................................56 3.5 Conformational stability measurements .............................................................................................56 4. RESULTS AND DISCUSSION .........................................................................................................................57 4.1 Glycation induces cytochrome c aggregation.....................................................................................57 4.2 Structural changes of cytochrome c upon glycation ...........................................................................59 4.3 Conformational stability of cytochrome c species ..............................................................................63 5. CONCLUSION..............................................................................................................................................66 CHAPTER III..................................................................................................................................................69 1. ABSTRACT .................................................................................................................................................71 2. INTRODUCTION ..........................................................................................................................................71 3. MATERIAL AND METHODS ..........................................................................................................................73 3.1 Methylglyoxal preparation .................................................................................................................74 3.2 Yeast strains and growth conditions ...................................................................................................74 3.3 Enolase purification............................................................................................................................74 3.4 In vitro glycation of purified enolase by methylglyoxal......................................................................75 3.5 Western blot and HPLC analysis........................................................................................................75 3.6 MS analysis.........................................................................................................................................76 3.7 Structure and stability analysis...........................................................................................................77 3.8 Enolase activity assay.........................................................................................................................78 3.9 Protein structure.................................................................................................................................78 4. RESULTS AND DISCUSSION .........................................................................................................................78 .                                                                                                                                                                                x .

(11)                                                                                                                                                    Table of Contents 4.1 Characterization of enolase glycation by MS .....................................................................................78 4.2 Glycation effects on enolase folding structure and enzyme activity ...................................................84 5. CONCLUSION..............................................................................................................................................87 6. ACKNOWLEDGEMENTS ...............................................................................................................................90 CHAPTER IV ..................................................................................................................................................93 1. ABSTRACT .................................................................................................................................................95 2. INTRODUCTION ..........................................................................................................................................95 3. EXPERIMENTAL PROCEDURES ....................................................................................................................98 3.1 Methylglyoxal preparation .................................................................................................................98 3.2 Insulin preparation .............................................................................................................................98 3.3 Expression and purification of human α-synuclein ............................................................................99 3.4 Protein glycation ..............................................................................................................................100 3.5 Fibril formation ................................................................................................................................100 3.6 Analysis of fibrillation kinetics .........................................................................................................100 3.7 Fluorescence measurements .............................................................................................................101 3.8 Circular dichroism measurements....................................................................................................101 3.9 Conformational stability measurements ...........................................................................................101 3.10 Size-exclusion and native-PAGE experiments ................................................................................102 3.11 Transmission electron microscopy .................................................................................................102 4. RESULTS AND DISCUSSION .......................................................................................................................103 4.1 Methylglyoxal reduces protein fibril formation ................................................................................103 4.2 Methylglyoxal causes protein oligomerization .................................................................................106 4.3 Effects of methylglyoxal on insulin structure and stability ...............................................................109 5. CONCLUSION............................................................................................................................................112 6. ACKNOWLEDGEMENTS .............................................................................................................................115 CHAPTER V .................................................................................................................................................117 APPENDIX ....................................................................................................................................................125 REFERENCES ..............................................................................................................................................133 . . .

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(13)                                                                                                                                                                  Summary . Summary Proteins are the core of life, providing functional support for all chemical processes in living cells. To perform this task, proteins must have a specific structure achieved by folding from its primary level to a three dimensional architecture. Disturbing this process inevitably leads to serious metabolic and physiological changes. Throughout evolution, molecular chaperones and complex protein quality control mechanisms evolved to keep protein structures functional in their lifespan. When something goes astray in this process, misfolded proteins may aggregate leading to conformational diseases such as Alzheimer, Parkinson, Huntington, Andrade and Amyotrophic Lateral Sclerosis. Several factors may contribute to protein misfolding, including point mutations, chemical stress, post‐translational modifications and impairment of protein quality control mechanisms. Post‐translational modifications play a very important role in protein misfolding, since proteins are extensively modified to achieve three dimensional structures, to regulate its activity or to target to degradation. Contrary to controlled post‐translational modifications, like phosphorylation or glycosilation, where enzymes specifically modify proteins to produce a specific cellular effect, glycation is a non‐enzymatic process where arginine and lysine side chains are irreversibly modified by carbonyl‐containing molecules. Moreover, there are several carbonyl‐ containing molecules in vivo, like glucose and methylglyoxal that irreversibly modify proteins through the Maillard reaction. Thus, it is expected that the extensive unregulated modification of particular proteins might have a deleterious effect on protein structure and function and to be associated with cell and tissue damage observed in some pathologies and aging. The observation that AGE‐modified proteins accumulate in connexion with the clinical complications of several human pathologies links protein glycation to human diseases such as diabetes mellitus, age‐related disorders, atherosclerosis and conformational diseases. Methylglyoxal is likely to be the most important glycation agent in vivo and its synthesis occurs in all living cells, in an uncontrolled way, mainly as a non‐enzymatic by‐product of glycolysis. However, in spite of all the evidences that link protein glycation with human pathological conditions, the molecular mechanisms underlying the effects of protein glycation by methylglyoxal remains unclear. The major goal of the investigations presented in this thesis is the understanding of the biochemical effects of methylglyoxal on structure, thermodynamic stability and aggregation of . .

(14) Summary                                                                                                                                                             proteins. Chapter I introduces and describes the theme. Following a brief description about protein structure and the folding problem, the importance of protein misfolding in biology and disease is presented. A review of the protein hierarchy levels of structural organization and their relation to amyloidogenesis was made. This chapter also introduces protein glycation and methylglyoxal metabolism as well as the implications of protein glycation in several human pathologies.   In chapter II, cytochrome c was chosen as a protein model to study the effects of methylglyoxal glycation. The results show a substantial decrease in conformational stability after glycation which potentiated the formation of aggregates that retained native‐like structure. This is the first evidence that methylglyoxal glycation might be associated to protein native‐like protein aggregation. In parallel a novel method for the determination of the conformational stability of heme proteins with a two state unfolding model was developed and described in the appendix. Chapter III presents a detailed comparison between the effects of in vitro and in vivo glycation on enolase, previously demonstrated to be a major glycation target in yeast. Our results demonstrate that glycation causes enolase unfolding and structural changes, leading to loss of enzyme activity. Evidences emerge for the existence of differences between in vitro and in vivo glycation effects, particularly on the nature and molecular location of specific advanced glycation end‐products. Results regarding enolase structure, thermal stability and enzyme activity show comparable in vitro and in vivo glycation effects. The experiments described in chapter IV use two amyloidogenic proteins as glycation targets. Human α‐synuclein and insulin are both related to specific human diseases. In spite of having distinct structures and different fold types, the fibrillation of both proteins was decreased in the presence of methylglyoxal. Instead of amyloid fibrils, aggregation was directed to the formation of soluble aggregates. Regarding α‐synuclein, an increase in protofibrils concentration, some of them with ring‐like structures, was observed upon glycation. Similar to cytochrome c, these aggregation pathways seem to occur with only slight changes on protein structure upon glycation. The concluding remarks in chapter V provide an integrative framework of the findings presented in this thesis. The relevance of this work and perspectives for further investigations are also highlighted in this chapter. . .                                                                                                                                                                               xiv .

(15)                                                                                                                                                                     Resumo . Resumo As proteínas desempenham um papel fundamental de suporte para todos os processos químicos que ocorrem numa célula, sendo essenciais à vida. Para executar as suas funções, as proteínas possuem uma estrutura tridimensional específica que é obtida no processo de folding. Uma perturbação deste processo leva ao aparecimento de uma estrutura diferente, levando a alterações metabólicas e fisiológicas. Ao longo da evolução, a célula desenvolveu chaperones moleculares e um complexo sistema de controlo de qualidade de proteínas com o objectivo de manter as estruturas proteicas funcionais durante o seu tempo de vida. Quando algo falha neste processo, as proteínas podem sofrer um misfold parcial e agregar levando ao aparecimento de patologias conformacionais como é o caso das doenças de Alzheimer, Parkinson, Huntington, Andrade e Esclerose Amiotrófica Lateral. Vários factores podem contribuir para o misfold parcial de proteínas, incluindo mutações pontuais, stress químico, modificações pós‐traducionais e danos no sistema de controlo de qualidade das proteínas. As modificações pós‐traducionais têm um papel muito importante no misfolding de proteínas, uma vez que as estas são extensivamente modificadas para adquirirem a sua estrutura tridimensional, regularem a sua actividade e serem marcadas para degradação. Geralmente as modificações pós‐traducionais são controladas por enzimas que modificam as proteínas em locais específicos de forma a produzirem um determinado efeito, como é o caso da fosforilação ou glicosilação, mas a glicação é um processo não‐enzimático. Neste caso as cadeias laterais dos resíduos de lisina e arginina são irreversivelmente modificados por moléculas que contenham grupos carbonilo. In vivo, existem várias moléculas com carbonilos capazes de modificar irreversivelmente proteínas através da reacção de Maillard, como é o caso da glucose ou do metilglioxal. Dada a influência que as modificações pós‐traducionais têm na estrutura nativa de uma proteína, é espectável que uma extensiva e não regulada modificação de determinadas proteínas possa culminar em alterações nocivas da estrutura e função dessas proteínas, que possam estar associadas a lesões em células e tecidos que são observadas em algumas patologias. Em doenças como a diabetes mellitus, aterosclerose e patologias conformacionais é possível observar a acumulação de proteínas modificadas por AGE, o que estabelece uma ligação entre estas doenças e a glicação de proteínas. O metilglioxal é o mais importante agente glicante in vivo e a sua síntese ocorre em todas as células vivas de forma não controlada, maioritariamente como um subproduto da via glicolítica. Ainda assim, e apesar de todas a observações que ligam a glicação de proteínas . .

(16) Resumo                                                                                                                                                                com algumas patologias humanas, os mecanismos moleculares subjacentes aos efeitos da glicação de proteínas pelo metilglioxal mantêm‐se desconhecidos. O principal objectivo da investigação apresentada nesta tese encontra‐se focado na compreensão dos efeitos da glicação na estrutura, estabilidade e agregação de proteínas. O capítulo I introduz e descreve o tema. Após uma breve apresentação da estrutura de proteínas e do seu processo de folding, a importância biológica do misfolding de proteínas em contexto de patologia é discutida através de uma revisão da relação entre os níveis hierárquicos de organização estrutural de proteínas e a formação de amilóide. Este capítulo introduz ainda a glicação de proteínas, o metabolismo do metilglioxal e as relações entre glicação e diversas patologias humanas. No capítulo II, são estudados os efeitos da glicação pelo metilglioxal no citocromo c. Os resultados mostram uma diminuição substancial da estabilidade conformacional da proteína após glicação, o que potencia a formação de agregados que mantêm uma estrutura idêntica à nativa. Este capítulo envolve pela primeira vez a glicação de proteínas pelo metilglioxal em fenómenos de agregação de proteínas que mantêm uma estrutura idêntica ao estado nativo. Paralelamente, foi desenvolvido um novo método para a determinação da estabilidade conformacional de proteínas hémicas com modelos de unfolding de dois estados, num processo que se encontra descrito em anexo. O capítulo III apresenta uma comparação entre os efeitos da glicação in vitro e in vivo no enolase, que foi previamente demonstrado ser um alvo preferencial de glicação em levedura. Os resultados mostram que a glicação causa alterações estruturais e unfolding no enolase, o que leva à perda de actividade enzimática. As diferentes metodologias usadas para a glicação do enolase revelam a existência de diferenças ao nível da natureza e localização molecular dos produtos avançados de glicação. Os resultados obtidos para as alterações estruturais, de Tm e actividade enzimática mostram um efeito comparável entre as duas metodologias de glicação utilizadas. As experiências descritas no capítulo IV usam duas proteínas amiloidogénicas como alvos de glicação. Quer a α–sinucleína quer a insulina são proteínas envolvidas em patologias humanas específicas. Apesar de possuírem estruturas distintas e tipos de fold diferentes, em ambos os casos a formação de fibras amilóides por partes destas proteínas foi reduzida na presença de metilglioxal. Em vez de fibras amilóides, a agregação foi direccionada para a formação de agregados solúveis. No caso da α–sinucleína, foi observado, após glicação, um aumento da concentração de protofibras, algumas contendo estruturas anelares. Tal como foi observado no citocromo c, estas vias de agregação parecem ocorrer apenas a partir de ligeiras alterações na estrutura. .                                                                                                                                                                               xvi .

(17)                                                                                                                                                                     Resumo O capítulo V fornece um quadro integrador dos diversos resultados apresentados nesta tese, assim como realça a importância deste trabalho. Os resultados e conclusões apresentados são relevantes não apenas porque este tipo de estudos sistemáticos aumenta o nosso conhecimento sobre os efeitos bioquímicos e estruturais da glicação em diferentes proteínas, mas também porque foi obtida informação importante que sugere que a glicação possui um papel dinâmico na estabilização de agregados oligoméricos de proteínas relevantes em contexto de patologia, com diferentes tipos de fold, o que poderá estar relacionado com um aumento da toxicidade destas proteínas. A completa compreensão dos efeitos da glicação na estrutura, estabilidade e agregação de proteínas amiloidogénicas será certamente de importância vital no desenho e criação de estratégias terapêuticas novas ou melhoradas para inibir a glicação de proteínas e combater os seus efeitos prejudiciais . . .

(18) Resumo                                                                                                                                                                .                                                                                                                                                                               xviii .

(19)                                                                                                                                                           Abbreviations . Abbreviations Aβ – Amyloid β‐peptide AD – Alzheimer’s disease AGE – Advanced glycation end‐products Ala – Alanine ALS – Amyotrophic lateral sclerosis ANS – 1‐anilino‐8‐naphthalene sulfonate Arg ‐ Arginine CD – Circular Dichroism CEL – Nε‐(carboxyethyl)lysine Cys – Cysteine DEAE – Diethylaminoethyl DHAP – Dihydroxyacetone phosphate DHB – 2,5‐Dihydroxibenzoic acid DLB – Dementia with Lewy bodies DNA – Deoxyribonucleic acid EDTA – Ethylenediamine tetraacetic acid ESI‐FTMS – Electrospray ionization – Fourier transformed mass spectrometry fALS – Familial amyotrophic lateral sclerosis FAP – Familial amyloid polyneuropathies FTICR‐MS – Fourier‐transform ion cyclotron resonance mass spectrometry GAP – Glyceraldehyde‐3‐phosphate GdnHCl – Guanidinium hydrochloride Gln – Glutamine GLO1 – Yeast glyoxalase I gene Glu – Glutamate Gly ‐ Glycine HPLC – High performance liquid chromatography HSD – Hallervorden‐Spatz disease .                                                                                                                                                                                xix .

(20) Abbreviations                                                                                                                                                      Hsp – Heat shock protein Ile – Isoleucine IR – Infrared IUP – Intrinsically unstructured protein LB – Lewy bodies Leu ‐ Leucine Lys ‐ Lysine MAGE – Methylglyoxal‐derived advanced glycation end‐products MALDI‐TOF‐MS – Matrix‐assisted laser‐desorption ionization–time‐of‐flight mass spectrometry) MAPK – Mitogen‐activated protein kinase MG–H – Hydroimidazolone MODIC – Lysine‐arginine methylglyoxal‐derived cross‐link MOLD – Methylglyoxal‐lysine dimmers MSA – Multiple system atrophy NAC – non‐Aβ component of Alzheimer’s disease NACP – non‐Aβ component of Alzheimer’s disease precursor NAD – Nicotinamide adenine dinucleotide (oxidized) NADPH – Nicotinamide adenine dinucleotide phosphate (reduced) NMR – Nuclear magnetic resonance NRMSD – Normalized root mean square deviation NSF – N‐ethylmaleimide‐sensitive factor PAGE – Polyacrilamide gel electrophoresis PD – Parkinson’s disease PDB – Protein Data Bank PGPH – Peptidyl glutamyl peptide hydrolase Phe – Phenylalanine PMSF – Phenylmethylsulfonyl fluoride Pro – Proline PTM – Post‐translational modification PVDF – Polyvinylidene difluoride RAGE – Advanced glycation end‐products receptor RNA – Ribonucleic acid .                                                                                                                                                                                xx .