RESPOSTAS DO BIVALVE ANOMALOCARDIA FLEXUOSA À EVENTOS DE TEMPERATURAS EXTREMAS:
COMPARAÇÃO SAZONAL E POPULACIONAL
Tese submetido(a) ao Programa de Pós-Graduação em Ecologia da Universidade Federal de Santa Catarina para a obtenção do título de Doutor em Ecologia.
Orientador: Prof. Dr. Paulo Roberto Pagliosa Co-Orientador: Prof. Dr. Carlos Henrique Lemos Soares
Florianópolis 2020
Carneiro, Alessandra Paula
Respostas do bivalve Anomalocardia flexuosa à eventos de temperaturas extremas : Comparação sazonal e populacional / Alessandra Paula Carneiro ; orientador, Paulo Roberto Pagliosa, coorientador, Carlos Henrique Lemos Soares, 2020. 103 p.
Tese (doutorado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Biológicas, Programa de Pós Graduação em Ecologia, Florianópolis, 2020.
Inclui referências.
1. Ecologia. 2. eventos climáticos extremos. 3. efeitos letais. 4. regiões costeiras. 5. temperatura. I. Pagliosa, Paulo Roberto. II. Soares, Carlos Henrique Lemos. III. Universidade Federal de Santa Catarina. Programa de Pós Graduação em Ecologia. IV. Título.
TEMPERATURAS EXTREMAS:
COMPARAÇÃO SAZONAL E POPULACIONAL
O presente trabalho em nível de doutorado foi avaliado e aprovado por banca examinadora composta pelos seguintes membros:
Joseane Aparecida Marques Dra. Universidade Federal do Rio Grande
Prof. Paulo Antunes Horta, Dr. Universidade Federal de Santa Catarina
Thiago César de Lima Silveira, Dr. Universidade Federal de Santa Catarina
Certificamos que esta é a versão original e final do trabalho de conclusão que foi julgado adequado para obtenção do título de doutor em Ecologia.
____________________________ Prof. Dra. Andrea Santarosa Freire
Coordenadora do Programa
____________________________ Prof. Dr. Paulo Roberto Pagliosa
Orientador
Florianópolis, 2020
Documento assinado digitalmente Andrea Santarosa Freire Data: 01/06/2020 09:41:26-0300 CPF: 844.565.237-00
Documento assinado digitalmente Paulo Roberto Pagliosa Alves Data: 01/06/2020 10:39:55-0300 CPF: 805.160.419-91
Este trabalho é dedicado a melhor mãe do mundo, Sandra Mara Carneiro, luz da minha vida (in memorian).
A minha mãe in memorian sempre ter me incentivado a aproveitar as boas oportunidade que a vida nos oferece, pelo amor imensurável e pelos ensinamentos de vida.
A minha vó Loiva pelo apoio emocional e financeiro, sempre. Obrigada pelo amor e carinho e por ser minha mãezinha desde criança.
Ao meu pai Antônio e minha irmã Flávia pelo amor incondicional, união, conforto e amizade diante de toda e qualquer dificuldade, obrigada por podermos evoluir juntos como família.
Ao meu companheiro Bruno por ter aceitado caminha ao meu lado todos os dias, nas horas boas e ruins, obrigada por ser esse amor de pessoa.
À minha nova família Sônia Lamego e Joel por terem me aceitado como parte da sua família e nunca terem negado nenhum auxílio, seja ele um ombro amigo, um colo ou um almoço.
À minha psicóloga Carolina Moser por ter me ensinado a olhar os obstáculos com outros olhos, contorna-los e seguir em frente de cabeça erguida, obrigada por ser uma mulher maravilhosa.
À minha tia Sônia que sempre estendeu a mão pra me amparar, obrigada pelo carinho, preocupação, cuidado e pelo convívio maravilhoso.
Ao meu orientador Paulo pela oportunidade e crescimento.
Ao professor Carlos Soares pela oportunidade de parceria e pelo aprendizado.
Aos colagas de laboratório Kalina, Ricardo, Flávia, Luisa, Nayara e Carla por dividirem muitos bons momentos e muitas lágrinas, obrigada pela convivência diária, pela ajuda e pelas companhias no RU.
Às amigas da Ecologia que sempre conseguiram tornar nosso fardo mais leve atraves de vinhos e risadas, Clarissa, Maristela, Aline e Lorena obrigada pela amizade e companheirismo.
Aos técnicos do NEMAR Gisela, Simão, Tião e Paulo Manso pela ajuda e pelo aprendizado.
Aos ex-colegas de trabalho da Secretaria de Saúde Roseli, Paulo, Michele e Nice que estiveram ao meu lado no momento mais difícil do doutorado, obrigada pela compreensão e pelo conforto.
Às minhas rommates Jéssica, Gabi e Michele que por hora foram como irmãs pra mim, obrigada pela amizade sincera e pelos bons momentos.
À Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) pela concessão da bolsa de estudos.
Ao Programa de Pós-Graduação em Ecologia da Universidade Federal de Santa Catarina e a todos os professores e colaboradores.
Aos membros da banca de projeto, de qualificação e de defesa bem como aos revisores dos artigos pela contribuição com a melhora do trabalho.
À filosofia espírita que me ensinou a seguir em frente e não entrar em desespero mesmo na ausência física da pessoa mais importante da minha vida.
A mudança climática global representa uma das maiores ameaças às funções ecológicas e aos interesses socioeconômicos humanos. Além do aumento gradual a longo prazo da temperatura média global, o que afeta diretamente a superfície oceânica, a frequência e a intensidade de eventos extremos de temperatura também estão aumentando. Eventos climáticos extremos conhecidos como ondas de calor marinho são eventos discretos de água com temperatura anômala quente por dias consecutivos em um local específico. As ondas de frio são definidos da mesma maneira, mas com temperatura anômala fria. As populações costeiras além de presenciarem o grande aumento na intensidade e frequências dos eventos climáticos extremos, ainda precisam conviver agudamente com a presença de substâncias poluentes de origem antropogênica. Considerando que os eventos extremos de temperatura estão associadas a um conjunto de propriedades, entender a resposta dos organismos-chave aos desafios térmicos requer conhecimento de suas respostas sob temperaturas extremas quentes e frias, sob variações de temperatura no verão e no inverno, bem como a influência das condições de contaminação ambiental em que as populações se encontram. Escolhemos como organismo teste o bivalve de relevante valor comercial e ecológico Anomalocardia flexuosa. No primeiro capítulo, testamos as respostas do bivalve a eventos simulados de ondas de calor e ondas de frio nas estações verão e inverno durante dois experimentos de 43 dias. No segundo capítulo, em um experimento de 22 dias, monitoramos as respostas de bivalves de duas populações provindas de ambientes com diferentes níveis de poluição à dois tratamentos simulando diferentes intensidades de ondas de calor. Os resultados mostram que A. flexuosa é um indicador sensitivo de ondas de calor, sentindo maiores danos durante os eventos de verão e que a poluição do estuário de origem causa influência nas respostas termais e na sobrevivência da espécie.
Palavras-chave: temperaturas extremas; mudança climática; temperatura; mortalidade; verão;
Introdução
Entendemos como mudanças climáticas o aumento gradual a longo prazo da temperatura média global, o que afeta diretamente a superfície oceânica. A contribuição antropogênica para o aumento da temperatura média global é clara e as emissões recentes de gases de efeito estufa são as mais altas da história, associados a atividades como queima de combustíveis fósseis e desmatamento e queimadas relacionadas ao uso do solo. Além disso, a frequência e a intensidade de eventos extremos de temperatura também estão aumentando. Entre esses eventos há as ondas de calor marinha, que são definidos como eventos discretos de água com temperatura anômala por dias consecutivos em um local específico, e as ondas de frio marinha, definidas da mesma maneira, mas referindo-se a eventos de água com temperatura anômala fria. Os ecossistemas bênticos costeiros e estuarinos são considerados como os mais produtivos do planeta, com alta relevância ecológica, econômica e social. Devido a sua a proximidade com as massas terrestres e sua pouca profundidade tornam-se ambientes muito vulneráveis a mudanças de temperatura bem como a pressões antropogênicas acentuadas, pois uma proporção significativa das maiores cidades do mundo está ligada, direta ou indiretamente às regiões costeiras. Os bivalves estão entre os organismos mais sensíveis e abundantes nas regiões costeiras em geral, dentre eles está o bivalve Anomalocardia flexuosa. Especialmente na região litorânea de Santa Catarina, essa espécie conhecida como berbigão está enraizada na cultura e nos hábitos alimentares da população de Florianópolis. Tendo em mente a importância e vulnerabilidade da espécie, A. flexuosa foi escolhida como organismo teste no presente trabalho.
Objetivos
Avaliar os efeitos dos eventos de temperaturas extremas sobre parâmetros fisiológicos e bioquímicos do bivalve Anomalocardia flexuosa, sob condições simuladas em laboratório, diferenciando as respostas entre as estações verão e inverno e entre populações provindas de ambiente com e sem histórico de poluição. Metodologia
A tese foi dividida em dois experimentos simulativos de eventos de temperatura extrema, sendo que o primeiro testou as distintas respostas dos bivalves às ondas de calor e ondas de frio sob condições de verão e de inverno. E o segundo experimento testou as respostas dos bivalves coletados em ambientes com distintos níveis de poluição aos efeitos das ondas de calor. Os bivalves do primeiro experimento foram coletados na Reserva Extrativista de Pirajubaé e encaminha dos ao laboratório onde foram submetidos ao sistema experimental. Previamente foi realizada uma investigação histórica (17 anos) das condições de temperatura do ambiente de origem dos bivalves tanto no inverno quanto no verão afim de calibrar as temperaturas do experimento. Em seguida, os bivalves foram acondicionados em 12 tanques de 40 L (n = 30 por tanque) e mantidos em aclimatação por um período de 10 dias. Quatro tanques tiveram sua temperatura elevada até a condição de onda de calor (+ 6°C), quatro tanques tiveram sua temperatura resfriada até a condição de ondas de frio (- 6 °C), enquanto os últimos quatro se mantiveram na temperatura da normal climatológica da região (controle). O experimento durou 43 dias no total, e foi replicado em duas estações, verão e inverno. A cada período experimental, as respostas fisiológicas e bioquímicas dos bivalves foram avaliadas. Os parâmetros analisados foram a taxa de mortalidade, taxa de filtração, taxa de respiração, níveis de proteínas, lipídeos, triglicerídeos e LDH. A taxa diária de mortalidade foi avaliada e estimada através da curva de sobrevivência de Kaplan-Meier. As diferenças nos valores dos parâmetros fisiológicos e bioquímicos entre os períodos amostrais e entre as estações do ano foram mensuradas através da análise de variância de mão única. Os bivalves do segundo experimento foram coletados na Reserva Extrativista de Pirajubaé para representar a população com nível moderado de poluição, e outro grupo foi coletado na Baía da Babitonga para representar a população com nível elevado de poluição. Ambas as populações foram encaminhadas ao laboratório e submetidos ao experimento que contava com 16 tanques de 40 L e mantidos em aclimatação por um período de 10 dias. O experimento foi dividido em quatro tratamentos, sendo duas populações (moderadamente poluída e elevada mente poluída) e duas intensidades diferentes de onda de calor (atual e futura). O tratamento de onda de calor atual teve sua temperatura experimental ajustada em 29°C e assim mantida até o final do experimento, enquanto a condição futura teve sua temperatura gradualmente elevada (1 ºC /dia) até o final do experimento. A duração total do segundo experimento foi de 23 dias e durante dois períodos amostrais, respostas fisiológicas e bioquímicas dos bivalves foram avaliadas. Os parâmetros analisados foram a taxa de mortalidade, taxa de respiração, níveis de proteínas, lipídeos, triglicerídeos, glicose, colesterol, fosfatase alcalina, GSH e LDH. A taxa diária de mortalidade foi avaliada e estimada através da curva de sobrevivência de Kaplan-Meier. As diferenças nos valores dos parâmetros fisiológicos e
Resultados e Discussão
No primeiro experimento, a taxa de mortalidade de A. flexuosa frente às ondas de calor foi diferente entre as estações do ano, sendo que as simulações de ondas de calor de verão resultaram em 97,2% de mortalidade ao final do experimento. Alta taxa de sobrevivência foi reportada no experimento de inverno tanto sob condições de ondas de calor quanto de ondas de frio. A alta vulnerabilidade dos bivalves aos experimentos de temperatura quente no verão pode explicar a mortalidade massiva das populações de A. flexuosa no verão e outono austral de 2015 nas planícies de marés da ilha de Santa Catarina, onde foram registrados eventos de ondas de calor com temperaturas análogas às intensidades utilizadas no primeiro experimento. A falta de um efeito letal significativo nas condições experimentais de período frio não foi necessariamente surpreendente. Em muitas espécies de invertebrados bentônicos, a capacidade de se adaptar ao frio está relacionada à faixa de temperatura que as espécies toleram e que define a distribuição geográfica de suas populações naturais. Alguns parâmetros foram marcadamente diferentes entre as condições de verão e inverno e sob condições de ondas de calor para ambas as estações experimentais. As taxas respiratórias e os níveis de proteínas e triglicerídeos em todos os períodos do experimento de verão foram quase duas vezes mais altos do que os do experimento de inverno. Como a síntese de componentes bioquímicos é um processo fisiológico energeticamente caro, o aumento da síntese de triglicerídeos durante o período de alta disponibilidade de alimentos no verão pode ser uma estratégia dos bivalves para armazenar energia, para posteriormente ser utilizado para manutenção metabólica durante a baixa disponibilidade de alimentos no inverno. Além disso, a taxa respiratória elevada no verão, mesmo antes do início do experimento, sugere que o verão é um período energeticamente desfavorável para A. flexuosa, com altos custos de manutenção, mesmo sem eventos extremos de temperatura. Assim, no verão, a espécie já opera muito próxima aos seus limites fisiológicos e qualquer aumento de temperatura causado por eventos de ondas de calor pode comprometer a aptidão e o desempenho dos organismos, potencialmente causando mortalidade. Uma maior capacidade de aclimatação durante as ondas de frio foi percebida nos A. flexuosa. No inverno experimental, as taxas de filtração e respiração mostraram uma relação interdependente mostrando os períodos de mudanças fisiológicas ao longo do experimento. O primeiro efeito do frio foi uma diminuição das taxas fisiológicas nos períodos inicial e primário do experimento. No período secundário, as taxas fisiológicas voltam aos valores iniciais, indicando uma condição de aclimatação. Além disso, ocorreu uma contra-resposta antagônica entre os níveis de lipídios e triglicerídeos no experimento de ondas de frio no inverno. Os níveis lipídicos aumentaram progressivamente na metade final do experimento, enquanto os níveis de triglicerídeos diminuíram. Isso pode indicar uma mobilização de triglicerídeos para lipídios, uma forma importante de armazenamento de energia relatada em bivalves marinhos. Com a necessidade do gasto energético para lidar com as baixas temperaturas, os bivalves podem aumentar a ingestão de energia e elevar o metabolismo para compensar a demanda excessiva de energia. Assim, quando A. flexuosa alcançou a aclimatação ao frio, as altas taxas fisiológicas poderiam ser mantidas, não importando quanto tempo essa condição durasse.
Com relação ao segundo experimento, a mortalidade dos bivalves foi maior no tratamento com intensidade futura (83,3%) do que no tratamento com intensidade real (7,2%). Em ambas as condições de temperatura, intensidade atual ou futura, a população severamente poluída apresentou menor sobrevivência do que a população moderadamente poluídas. O tempo de exposição ao evento de onda de calor é um fator crucial na resposta dos bivalves. As respostas encontradas no experimento e a relação esperada entre temperatura elevada e exposição à poluição age de acordo com o seguinte pressuposto: a pré-exposição da população a contaminantes interfere na tolerância térmica, resultando em limites de temperatura diminuídos nos bivalves da população severamente poluída. Os registros de episódios de mortalidade de bivalves marinhos raramente são causados por fatores únicos, mas têm maior probabilidade de serem desencadeados por efeitos sinérgicos de dois ou mais fatores. De certa forma, a população moderadamente poluída apresenta estratégias de aclimatação que os moluscos usam para lidar com a rápida variação de temperatura. Várias mudanças fisiológicas, incluindo o aumento das necessidades de oxigênio e a composição alterada de lipídios e açúcares são respostas da manutenção em ambiente de estresse térmico que leva ao acúmulo de reservas de energia molecular. Observamos nos bivalves de população moderadamente poluída uma regulação positiva da atividade da LDH no final do experimento. A atividade de curto prazo tende a ser alta quando exposta a altas temperaturas. Isso aponta para ajustes metabólicos específicos na tentativa de reduzir o gasto de energia para lidar com os desafios do calor, uma vez que a síntese de proteínas é um processo caro para a célula. A concentração de esteróis de diferentes famílias é maior no local de amostragem severamente poluído do que no local moderadamente poluído. Isso pode justificar a alta taxa de triglicerídeos e colesterol encontrados
altos de GSH, pois a exposição crônica a contaminação ambiental induz efeitos de stress oxidativos, independentemente das condições de temperatura. A partir de um certo limiar de calor, o estresse oxidativo dos bivalves é ativado, atingindo níveis muito altos. Isso foi observado para ambas as populações após 11 dias de tratamento com intensidade futura, apoiando a sugestão de que um aumento no total de GSH no tecido bivalve possa representar um mecanismo de proteção celular. Para as duas populações, o estressor da intensidade futura induziu maiores danos e foi confirmado pela alta taxa de mortalidade no referido tratamento.
Considerações finais
Com base nos resultados encontrados através de experimentos manipulativos de eventos de temperaturas extremas, podemos afirmar que eventos de ondas de calor com base nas temperaturas registradas no verão são capazes de causar efeitos letais no bivalve Anomalocardia flexuosa. Conhecendo as respostas do bivalve à eventos extremos de temperatura de calor e de frio comparativamente entre verão e inverno, percebemos que seus principais desafios são registrados nas ondas de calor no verão. Dessa forma, visando a necessidade de conhecer os efeitos sinérgicos de dois estressores, testamos experimentalmente os efeitos das ondas de calor no verão sobre populações de A. flexuosa provindas de ambientes moderadamente poluídos e severamente poluídos. Os marcadores bioquímicos avaliados em condição de campo apresentaram taxas mais elevadas para população severamente poluída em comparação à população moderadamente poluída, mostrando que o estresse toxicológico referente a poluição leva o molusco a ativação desses biomarcadores. As ondas calor de intensidade já presenciada pelos bivalves não causou grande mortalidade da espécie. Por outro lado, a exposição às ondas de calor de intensidade projetada para o futuro revelou-se altamente letal para ambas as populações. A população severamente poluída mostrou ter maior vulnerabilidade a esses eventos, confirmando o fato de que as temperaturas elevadas são capazes de aumentar os efeitos toxicológicos de certas misturas de substâncias, bem como a exposição à poluentes diminui a capacidade de tolerância termal dos bivalves. Conhecendo desafios que os efeitos combinados de ondas de calor e poluição ocasionam sobre A. flexuosa, podemos especular que a vulnerabilidade da espécie pode ser maior em campo, principalmente na escala de tempo necessária à sobrevivência da população, pois além do requerimento energético básico pra manutenção diária, é necessário considerar gastos energéticos adicionais para ativação dos mecanismos compensatórios ao efeitos calor e a poluição. Assim os registros de declínio populacional de A. flexuosa na costa de Santa Catarina nas últimas décadas pode ser resultado dos efeitos antrópicos de urbanização, associados à diminuição da qualidade da água agindo de forma sinérgica aos eventos de ondas de calor já registrados para a região. Levando em conta as médias de temperatura do oceano no verão, as métricas das ondas de calor registradas para essa estação na costa de Santa Catarina, bem como as projeções futuras de intensificação dos eventos de temperaturas extremas, podemos concluir que A. flexuosa é uma espécie fortemente vulnerável aos efeitos das futuras onda de calor. Somado ao fato do crescente aumento da ocupação humana nas regiões costeiras para diversos fins, a espécie pode ser utilizada como biondicadora nos programas de monitoramento das mudanças antropogênicas. Considerando ainda a ampla importância ecológica, social e econômica da espécie ao longo da costa brasileira, salientamos a necessidade de incluir o bivalve A. flexuosa em programas prioritários de conservação.
Palavras-chave
Global climate change represents one of the greatest threats to ecological functions and human socio-economic interests. In addition to the gradual long-term rise in global average temperature, which directly affects the ocean surface, the frequency and intensity of extreme temperature events are also increasing. Extreme temperature events known as marine heatwaves are discrete events of anomalous heat temperatures water for consecutive days in a specific location. Cold spells are defined in the same way, but with anomalously cold temperature. The coastal populations, in addition to witnessing the great increase in the intensity and frequency of extreme weather events, still need to live acutely with the presence of polluting substances of anthropogenic origin. Considering that extreme temperature events are associated with a set of properties, understanding the response of key organisms to thermal challenges requires knowledge of their responses under extreme heat and cold temperatures, under temperature variations in summer and winter, as well as the influence of environmental contamination conditions in which the populations are. We chose as test organism the bivalve of relevant commercial and ecological value Anomalocardia flexuosa. In the first chapter, we tested the bivalve's responses to simulated events of heatwaves and cold spells in the summer and winter during two experiments of 43 days long. In the second chapter, in a 22-day experiment, we monitor the responses of bivalves from two populations from environments with different levels of pollution to two treatments of different intensities of heatwaves. The results show that A.
flexuosa is a sensitive indicator of heat waves, feeling greater damage during the summer events
and that the pollution of the source estuary influences the thermal responses and the survival of the species.
Keywords: extreme climatic events; global change; temperature; lethal effects; summer;
LISTA DE FIGURAS CAPÍTULO I
Figure 1 - Experimental design to simulate heat wave and cold spell events. Each treatment has four replicates (tanks). Ti Initial temperature. Orange circles are sampling days within the
four experimental periods (initial, early, primary and secondary periods), where two bivalves were sampled from each treatment and tank. Black dashed lines indicate the experimental changes in temperature. Red dashed line indicates the threshold temperature, when the extreme temperature events start..………..34 Figure 2 - Survival curves of Anomalocardia flexuosa under simulated marine heatwaves and cold spells for summer (red dashed lines), winter (blue dashed lines) and control (green dashed lines) conditions along the four experimental periods. Vertical black dashed lines indicate the experimental day when the threshold temperature was achieved. Pairwise comparisons among survivorship curves were used to determine differences among treatments at p < 0.05……….39 Figure 3 - Response ratio (LnRR) of physiological biomarkers in Anomalocardia flexuosa under simulated marine heatwaves (MHW) for summer and winter conditions along the four experimental periods (Ini: initial period, Ear: early period, Pri: primary period, Sec: secondary period). Error bars represent 95% confidence intervals (CIs) for relative effects. Different small letters indicate significant difference between periods of the same experimental season following ANOVA and SKN post hoc test. ………..44 Figure 4 - Response ratio (LnRR) of biochemical parameter in Anomalocardia flexuosa under simulated marine heatwaves (MHW) for summer and winter conditions along the four experimental periods (Ini: initial period, Ear: early period, Pri: primary period, Sec: secondary period). Error bars represent 95% confidence intervals (CIs) for relative effects. Different small letters indicate significant difference between periods of the same experimental season. Different capital letters indicate significant difference between experimental seasons following ANOVA and SKN post hoc test...……….45 Figure 5. Response ratio (LnRR) of physiological biomarkers in Anomalocardia flexuosa under simulated marine cold spell (MCS) for summer and winter conditions along the four experimental periods (Ini: initial period, Ear: early period, Pri: primary period, Sec:
secondary period). Error bars represent 95% confidence intervals (CIs) for relative effects. Different small letters indicate significant difference between periods of the same experimental season. Different capital letters indicate significant difference between experimental seasons following ANOVA and SKN post hoc test………..46 Figure 6 - Response ratio (LnRR) of biochemical parameter in Anomalocardia flexuosa under simulated marine cold spell (MCS) for summer and winter conditions along the four experimental periods (Ini: initial period, Ear: early period, Pri: primary period, Sec: secondary period). Error bars represent 95% confidence intervals (CIs) for relative effects. Different small letters indicate significant difference between periods of the same experimental season. Different capital letters indicate significant difference between experimental seasons following ANOVA and SKN post hoc test………..47
CAPÍTULO II
Figure 1 - Maximum intensity and duration of heat wave events between 1981 and 2017 of São Francisco do Sul and Costeira do Pirajubaé, South Brazilian coast, derived from the analysis of marine heat wave according to Hobday et al. (2016)………71 Figure 2 - Experimental design to simulate heat wave events with two intensity treatments and two population treatments. Each treatment has four replicates (tanks). Orange circles are sampling days (acclimation, 5th day of heat wave and 9th day of heat wave), where three
bivalves were sampled from each treatment and tank. Blue dashed lines indicate the experimental changes in temperature. Red dashed line lines indicate the experimental day when the threshold temperature was achieved………...74 Figure 3 - Survival curves of Anomalocardia flexuosa from severely polluted population (red dashed lines) and moderately polluted population (blue dashed lines) under simulated marine heatwaves of actual intensity treatment and future intensity treatment. Vertical black dashed lines indicate the experimental day when the threshold temperature was achieved. Pairwise comparisons among survivorship curves were used to determine differences among treatments at p < 0.05………...….……….80 Figure 4 – Changes in physiological and biochemical parameters in Anomalocardia flexuosa from moderately and severely polluted populations under simulated marine heatwaves of actual and future intensity treatment along the 5th and 9th day of heat wave. Data are shown
as mean ± standard error. Different letters indicate significant difference between intensity treatments and populations of the same day of heat wave following ANCOVA test….…….83
LISTA DE TABELAS CAPÍTULO I
Table 1 - Summary of the marine heatwaves and cold spells events in the southern Brazil (from 2000 to 2017), and values adopted for seasonal experiments simulating the extreme temperature events……….31 Table 2 - Mean values (± sd) and summary of analysis of variance of the physiological and biochemical parameters in Anomalocardia flexuosa for the acclimation (initial period of the experiments) in summer and winter conditions………..42 Table 3 - Summary of analysis of variance of physiological and biochemical responses ratios in Anomalocardia flexuosa under simulated marine heatwaves (MHW) and marine cold spell (MCS) for seasonal conditions and along the experimental periods.………..43
Supplementary Material
Table 1 - Original mean values (± sd) of the physiological and biochemical responses obtained to the bivalve A. flexuosa during the summer and winter experiments of simulative Marine Heatwaves (MHW) and Cold Spell (MCS).……….. 63
CAPÍTULO II
Table 01: Concentration of different family of pollutants in the sediment for each local sample of A. flexuosa populations. <DL: below detection limit……….70 Table 02: Baseline mean ± standard deviation (sd) of biomarkers of severely and moderately polluted populations of bivalves collected and fixed in the field (field control). Summary of ANOVA performed to compare the biomarker values difference between severely and moderately polluted populations of bivalves ………79 Table 03: Median lethal temperature (LT50) ± C.I. of two A. flexuosa population submitted a
future intensity of heat wave treatment………..…………79 Table 04: Results of two-way ANCOVA testing for each biomarker between the ‘populations’ (severely and moderately polluted), ‘intensity treatments’ (actual and future) and the interaction between two factors. * indicate significance at α<0.05………...……….81
SUMÁRIO
1. INTRODUÇÃO ... 19
1.1. OBJETIVOS ... 23
1.1.1.Objetivo geral ... 23
1.1.2.Objetivos Específicos ... 23
2. ARTIGO I: IMPACT OF MARINE HEATWAVES AND COLD SPELL EVENTS ON THE BIVALVE ANOMALOCARDIA FLEXUOSA: A SEASONAL COMPARISON ... 25
3. ARTIGO II: IMPACT OF DIFFERENT INTENSITIES OF HEATWAVES ON THE BIVALVE ANOMALOCARDIA FLEXUOSA: A POPULATIONAL COMPARISON ... 64
4. CONCLUSÃO ... 98
1. INTRODUÇÃO
A mudança climática global é uma das transformações humanas mais difundidas da Terra e representa uma das maiores ameaças às funções ecológicas e aos interesses socioeconômicos humanos (Wernberg et al., 2012). Entendemos como mudanças climáticas o aumento gradual a longo prazo da temperatura média global, o que afeta diretamente a superfície oceânica. A contribuição antropogênica para o aumento da temperatura média global é clara e as emissões recentes de gases de efeito estufa são as mais altas da história, associados a atividades como queima de combustíveis fósseis e desmatamento e queimadas relacionadas ao uso do solo (Bakker et al., 2016; IPCC, 2014). É esperado que até o final do século 21 a temperatura da superfície oceânica aumente em média 2.73°C (Gattuso et al., 2015). No entanto, conjuntamente ao aquecimento a longo prazo, a frequência e a intensidade de eventos extremos de temperatura também estão aumentando como consequência das mudanças climáticas antropogênicas (Oliver et al., 2018, 2019; Perkins et al., 2012).
Eventos climáticos extremos conhecidos como ondas de calor marinha são definidos como eventos discretos de água com temperatura anômala por dias consecutivos em um local específico (Perkins e Alexander, 2012). As ondas de frio marinha são definidas da mesma maneira que as ondas de calor, mas referindo-se a eventos de água com temperatura anômala fria (Hobday et al., 2016). Enquanto as ondas de calor estão se tornando razoavelmente bem conhecidos em virtude de sua crescente contagem e intensidade, ondas de frio receberam menos reconhecimento. Considerando que os eventos extremos podem ser manifestamente prejudiciais aos organismos e aos ecossistemas, os eventos extremos de frio também têm o potencial de impactar negativamente os diversos níveis ecológicos (Lirman et al., 2011; Schlegel et al, 2017). Pesquisas recentes demonstram que flutuações extremas de temperatura
estão afetando os processos biológicos dos ectotérmicos que vivem em águas rasas, ocasionando consequências como mudanças na faixa geográfica das espécies (Burrows, et al., 2014; Lenoir e Svenning, 2015; Sunday et al., 2016; Wethey et al., 2011), oscilação na densidade populacional (Bruno et al., 2019; Hiddnik e ter Hofstede, 2008; Pansch et al., 2018), bem como mortalidade em massa (Burdon et al., 2014; Cerrano et al., 2000; Garrabou et al., 2009).
Os ecossistemas bênticos costeiros e estuarinos são considerados como os mais produtivos do planeta, com alta relevância ecológica (Jennerjahn e Mitchell, 2013; Pansch et al., 2018), econômica e social, pois suporta um amplo número de espécies que são usados por populações locais como recursos pesqueiros há milênios (Silva-Cavalcanti et al., 2018). Estes são ecossistemas de transição altamente complexos entre a terra e o mar, de modo que os sinais de perturbação humana podem ser confundidos pela variabilidade do sistema climático por meio de influências separadas sobre bacias hidrográficas e sobre as áreas oceânicas (Feyrer et al., 2015). Devido a sua a proximidade com as massas terrestres e sua pouca profundidade tornam-se ambientes muito vulneráveis a mudanças de temperatura (Cloern et al., 2016; Pansch et al., 2018), sendo que estudos recentes confirmaram que 38% das regiões costeiras do globo apresentaram aumento na frequência de temperaturas extremas quentes nos últimos 30 anos (Lima e Wethey, 2012). Além de precisar tolerar a baixa inércia térmica, esse ambiente sofre pressões antropogênicas acentuadas, pois uma proporção significativa das maiores cidades do mundo está ligada, direta ou indiretamente às regiões costeiras (Cloern et al., 2016). A intensa atividade humana decorrente do alto nível de industrialização, da atividade agrícola e do aumento da densidade populacional tem aumentado de forma significativa essas pressões. Da mesma forma que regiões estuarinas em todo o mundo são fornecedoras de alimentos como moluscos e peixes, também a utilização como como área de destino de esgotos tem sido mais
evidente (Winterbourn et al., 2016) mostrando assim o paradoxal papel da água como um recurso vital e ao mesmo tempo um veículo para a dispersão de poluentes.
A variação na frequência e intensidade dos eventos climáticos extremos afetam as populações no curto prazo (Schlegel et al, 2017). Mudanças nas médias e na variabilidade dos fatores ambientais são capazes de modificar os principais processos biológicos e alterar a estrutura e dinâmica populacional bem como alterar o funcionamento fisiológico e bioquímico individual. Assim, para sobreviver, qualquer organismo vivo deve ser adaptado ao ambiente em mudança, pois a sensibilidade de cada um depende de combinações de várias características da sua história de vida (Somero 2010). As respostas do organismo às novas condições térmicas incluem alimentação, respiração, crescimento e reprodução (Angilletta, 2009; Saucedo et al., 2004). Dessa forma, é de suma importância a investigação das relações entre a tolerância termal e a variabilidade térmica do ambiente experimentada pelos animais bentônicos, pois assim podemos determinar a existência de trade off das reações térmicas e sobrevivência bem como verificar se essas relações podem ser explicados por diferenças do habitat (Goh & Lai, 2013; Pörtner, 2002). Por exemplo a exposição a poluentes é capaz de influenciar a capacidade dos ectotérmicos marinhos de responder ao estresse térmico (Schiedek et al., 2007). Consequentemente, é esperado que os bêntos que habitam ecossistemas marinhos poluídos experimentem efeitos mais fortes do aquecimento da água do mar previstos nos futuros cenários de mudanças climáticas (Marigómez et al., 2017; Mubiana e Blust, 2007).
Os bivalves estão entre os organismos mais sensíveis e abundantes nas planícies de maré e nas proximidades da costa e muitas espécies têm seus estoques populacionais manipulados ao longo de toda a história da humanidade (Maltz e Faerman, 1958; Pezzuto e Souza, 2015). Escolhemos como organismos modelo dos efeitos das temperaturas extremas o bivalve Anomalocardia flexuosa (Linnaeus, 1767). Este molusco venerideo ocorre nas Índias
Ocidentais e na América do Sul, do Suriname ao Uruguai (Abbott e Morris, 1995; Rios, 1994; Warmke e Abbott, 1961), a espécie é consumida e comercializada pelas comunidades costeiras tradicionais, representando grande importância comercial, social e ecológica (Arruda et al, 2009; Boehs et al., 2007). Especialmente na região litorânea de Santa Catarina, essa espécie conhecida como berbigão está enraizada na cultura e nos hábitos alimentares da população de Florianópolis (Aveiro et al., 2009; Pezzuto et al, 2010). No entanto, é importante enfatizar que toda a exploração desses moluscos destinados à fonte de alimento depende exclusivamente de estoques naturais (Oliveira et al., 2016; Squella, 2014). Assim, a espécie foi a principal motivadora da criação da primeira reserva extrativista marinha do Brasil. Em 1992 em uma região localizada no lado Oeste da Ilha de santa Catarina, foi criada a Reserva Extrativista Marinha de Pirajubaé (Decreto nº 533, de 20 de maio de 1991) que possui dois extensos baixios areno-lamosos onde ocorre a captura de A. flexuosa onde inúmeras famílias faziam sua exploração.
A importância social e econômica da espécie gerou ainda uma gama de estudos focados no berbigão da área da Resex (Aveiro et al, 2009; Gandara-Martins et al., 2020; Gandara-Martins e Almeida, 2013; Pezzuto e Souza, 2015; Resgala Jr. e Piovesan, 2009; Ribas e Zuculoto, 2014; Rosso et al., 2014; Tremel, 2001). Porém os estudos experimentais de limites fisiológicos de A. flexuosa estão restringidos apenas aos organismos reproduzidos em laboratório e em fase de desenvolvimento larval (Lavander et al. al., 2014; Oliveira et al., 2016, existindo assim uma lacuna de conhecimento acerca dos limites térmicos e efeitos das mudanças climáticas em A. flexuosa silvestre realizadas em condições laboratoriais.
1.1. OBJETIVOS
1.1.1. Objetivo geral
Avaliar os efeitos dos eventos de temperaturas extremas sobre parâmetros fisiológicos e bioquímicos do bivalve Anomalocardia flexuosa, diferenciando as respostas entre as estações verão e inverno e entre populações provindas de ambiente com e sem histórico de poluição.
1.1.2. Objetivos Específicos
Capítulo I
Avaliar a sobrevivência e as respostas fisiológicas e bioquímicas do bivalve A.
flexuosa expostos a ondas de calor e ondas de frio nas condições de inverno e verão, buscando
responder as seguintes perguntas: i) os eventos extremos de temperatura tanto de calor quanto de frio afetam a sobrevivência dos bivalves? ii) as principais respostas fisiológicas e bioqúmicas dos bivalves variam de acordo com a estação do ano? e iii) as variações nas intensidades cumulativas dos eventos aumentam a capacidade de resposta dos bivalves aos eventos de temperaturas extremas?
Capítulo II
Avaliar os níveis dos marcadores bioquímicos do bivalve A. flexuosa provindos de populações de ambiente moderadamente poluídos e ambiente severamente poluído e comparar as respostas fisiológicas e bioquímicas das populações quando expostas a eventos simulados de ondas de calor de diferentes intensidades. As principais perguntas do presente trabalho são: i) existem diferenças nos níveis de biomarcadores bioquímicos entre os bivalves de população de
ambientes moderadamente e severamente poluídos coletados em campo? ii) as populações apresentam taxas de mortalidade diferentes quando expostas a eventos simulados de ondas de calor? iii) as principais respostas fisiológicas e bioqúmicas dos bivalves variam de acordo com a população? e iv) as diferentes intensidades dos eventos influenciam a capacidade de resposta dos bivalves aos eventos de temperaturas extremas?
2 ARTIGO I: IMPACT OF MARINE HEAT WAVES AND COLD SPELL events on the bivalve Anomalocardia flexuosa: a seasonal comparison
Alessandra Paula Carneiroa, Carlos Henrique Lemos Soaresb, Paulo Roberto Jardim Mansoc,
Paulo Roberto Pagliosad
a Programa de Pós-Graduação em Ecologia, Universidade Federal de Santa Catarina,
Florianópolis, Brazil
b Departamento de Bioquímica, Universidade Federal de Santa Catarina, Florianópolis, Brazil c Núcleo de Estudos do Mar, Centro de Ciências Biológicas, Universidade Federal de Santa
Catarina, Florianópolis, Brazil
d Departamento de Geociências, Universidade Federal de Santa Catarina, Florianópolis, Brazil
Artigo publicado no periódico Marine Environmental Research
Carneiro, A.P., Lemos Soares, C.H., Jardim Manso, P.R., Pagliosa, P.R., 2020. Impact of marine heat waves and cold spell events on the bivalve Anomalocardia flexuosa: A seasonal comparison. Marine Environmental Research 156, 104898.
Abstract
The effects of increasing or decreasing extreme temperatures on bivalves depend on their physiological and biochemical capacity to respond to changes in ambient temperature. We tested the response of the clam Anomalocardia flexuosa to simulated marine heat waves and cold spells, under summer and winter experimental conditions. We sought information about physiological and biochemical parameters, as well as survival rates during two bioassays of 43 days each. The winter cold spell simulations showed that extreme temperatures acted as a physiological and biochemical stimulus, linked to an increase in metabolic rates, and consequently higher maintenance costs, as acclimatory strategies. On the other hand, the summer heat wave extreme temperatures exceeded the individuals’ thermal tolerance limits, resulting in an inability to acclimate and a high mortality. These experiments suggest that A.
flexuosa can be considered as a sensitive indicator of heat wave events.
Keywords
lethal effects; biochemical effects; physiological effects; global change; temperature; shallow coastal waters; extreme climatic events
1. Introduction
Extreme climatic events, such as marine heat waves and cold spells have increased over the century, not only in intensity, but also in duration and frequency (Frölicher et al., 2018; Holbrook et al., 2019; Oliver et al., 2018a). The extreme temperature events may be caused by a combination of atmospheric and oceanographic processes. Besides happening elsewhere in the ocean, the effects of these events on marine species living at shallow waters are expected to be perceived more rapidly, and perhaps more strongly, due to the low thermal inertia conditions of this ecosystem (Madeira et al., 2012). Nevertheless, most of the currently available evidence on marine species-extreme temperature responses are geographically, seasonally and temporally limited (Compton et al., 2007; Poloczanska et al., 2016). There is a lack of studies on the southern hemisphere species and over more than one season, specifically in subtropical shallow coastal areas (Rosenzweig et al., 2008; Turra et al., 2013).
Considering that the environmental conditions generated by extreme temperature events are associated with a set of properties, including the intensity of the events and their duration, understanding the response of key organisms to thermal challenges requires knowledge on their responses under hot and cold extreme temperatures, and under summer and winter temperature variations. Bivalves living in subtropical shallow waters are naturally sensitive to the seasonal variations of temperature throughout the year. Organismal variabilities are mainly perceived in feeding, respiration and behaviour (Angilletta, 2009; Nie et al., 2018), as well as in a series of cellular reactions, including enzymatic activities (Hardewig et al., 2004), ratios of proteins (Chapple et al., 1998), biosynthesis of lipids (Pernet et al., 2007), and changes in energetic budgets (Beukema et al., 2009).
The bivalve Anomalocardia flexuosa (Linnaeus, 1767) is a typical tropical and subtropical species, occurring in the Atlantic from West Indies to Uruguay (Abbott and Morris, 1995; Rios, 1994; Warmke and Abbott, 1962). It is consumed and commercialised by traditional coastal communities and their exploitation depends exclusively on natural stocks (Arruda et al, 2009; Luz and Boehs, 2011; Oliveira et al., 2016; Pezzuto et al, 2010; Squella et al., 2015). The seasonal temperature fluctuations have a large effect on the levels of planktonic larval dispersal and on the reproductive cycle of A. flexuosa (Corte 2015; Ferreira Jr et al., 2015). However, there is a lack of knowledge on their thermal limits and effects of thermal changes on the survival, physiology and biochemistry of A. flexuosa.
Recently, an extensive decline in stocks of A. flexuosa in a sustainable use in protected area in southern Brazil have been reported, reducing the caught from 300 kilograms of live clams per fishing day (Pezzuto and Souza, 2015) to less than a dozen pounds in 2015 (Sampaio, 2018). The stock reduction coincided with a heat wave event of high intensity (Gouvêa et al., 2017), suggesting that the populations of A. flexuosa may be sensitive to extreme temperature events. In fact, the southern coast of Brazil is exposed to extreme climatic events, where the sea surface temperature has warmed at faster rates per decade (between 0.2 and 0.4 °C) than along the remaining western Atlantic coast (Lima and Wethey, 2012). Thus, the main goal of this study was to evaluate the effect of thermal stress on A. flexuosa. For this purpose, we simulated marine heat waves and cold spell events, considering both summer and winter conditions, and the clams’ responses were monitored over time. To calibrate the experimental temperature conditions (intensity, frequency and duration), historical data recorded along the subtropical coastal waters in southern Brazil were used. Our objectives were to assess survival, as well as the physiological and biochemical responses of the clam A. flexuosa exposed to varying cumulative intensities of climatic events under winter and summer conditions. Our main research questions were: i) do the extreme temperature events affect the clams’ survival, either
by heating or cooling the system; ii) do the main physiological and biochemical responses of the clams to the climatic events vary with season and iii) do the variations in the cumulative intensity of the events enhance the clams responsiveness to the events?
2. Materials and methods
2.1. Study area and sampling procedures
The clams were collected in a tidal flat in the Marine Protected Area “Reserva Extrativista Marinha de Pirajubaé”, located in the inner side of Santa Catarina Island (Southern Brazil; 27° 39' 4.9"S, 48° 31' 42.2"W). The local population of the clam is usually high (2,135 ind/m²; Pezzuto and Echternacht, 1999), but after 2015 it has experienced a massive decline, reaching the average population density of 40 ind/m² (Sampaio, 2018). The clams were handpicked in the field at the season of each experiment, in August 2017 (austral winter) and January 2018 (austral summer). Immediately after collection, the clams were placed into coolers and transported to the laboratory, where they had epibionts meticulously removed from shells before being placed into tanks until the experiment began. Only adult clams (shell length >23 mm; Corte et al., 2015) with no signs of disease were selected for the experiments. During the acclimation period, the clams were kept under a 12:12 h (light:dark) photoperiod and fed daily with the microalgae Nannochloropsis and Pavlova at 8.1 × 104 cells/mL (Oliveira et al., 2016).
The study area is under a microtidal regime and a subtropical humid climate with high seasonal temperature variability (17 – 25 ºC; Short and Klein 2016). Aiming to calibrate the experimental temperature conditions with the historical data recorded along the subtropical coastal waters in south of Brazil, we computed heat wave and cold spell events from January
2000 to December 2017. We chose these short time series because our intention was to represent the temperature which the clams were already experiencing (Lima and Wethey, 2012). We used a time series data of daily mean sea surface temperature obtained in the National Oceanic and Atmospheric Administration website (https://www.ncdc.noaa.gov/oisst) from the study area location. We calculated the number of events, duration and intensity, as well as the threshold temperature to be considered a heat wave or a cold spell (90th and 10th percentile of mean temperature, respectively; Hobday et al., 2016). The analyses were performed in the R platform, version 3.3.1 (R Core Team, 2018) using the package heatwaveR (Smit et al., 2018). We estimated the average winter temperature of 19.7°C and the summer of 25.6°C (Table 1). There were 85 events between 2000 and 2017, when the heat waves predominated in summer and cold spells in winter. The duration and intensity of the events were higher in the winters than in the summers, and they were quite similar concerning the type of the events. The calculated threshold temperature varied from 1.3 to 3°C from the recorded mean temperatures. The maximum temperature (peak) intensities varied from 3.52 to 4.50 °C.
Table 1. Summary of the marine heat waves and cold spells events in the southern Brazil (from 2000 to 2017), and values adopted for seasonal experiments simulating the extreme temperature events.
2000 – 2017 extreme temperature events Average Temperature (°C ±sd) Threshold Temperature (°C) Number of events Duration (days ±sd) Duration max (days) Intensity mean (°C ±sd) Intensity max (°C)
Marine Heat Wave
Winter 19.7 ± 1.14 21.4 19 13 ± 10.13 41 2.13 ± 0.28 1.81 – 3.83
Summer 25.6 ± 1.03 26.9 21 11.8 ± 7.52 31 1.84 ± 0.31 1.51 – 3.52
Total* 56 11.6 ± 8.12 41 1.86 ± 0.32 1.51 – 3.83
Marine Cold Spell
Winter 19.7 ± 1.14 16.7 14 11.3 ± 11.41 47 -2.09 ± 0.35 -1.67 – -4.50
Summer 25.6 ± 1.03 24.1 7 9.3 ± 4.71 23 -1.81 ± 0.22 -1.36 – -3.74
Total* 29 12.1 ± 9.97 47 -1.92 ± 0.44 -1.36 – -4.50
Values adopted for Seasonal Experiment Control Temperature (acclimation, °C) Threshold Temperature (°C) Final Temperature (°C) Duration (days)
Marine Heat Wave
Winter 20 ± 1 24 26 ± 0.3 28
Summer 26 ± 1 29 32 ± 0.3 28
Marine Cold Spell
Winter 20 ± 1 17 14 ± 0.3 28
Summer 26 ± 1 23 20 ± 0.3 28
2.2 Experimental design and setup of experiments
Two bioassays were carried out following the same experimental design during the austral winter of 2017 and summer of 2018 (Fig. 1). The experiments were set up to avoid any unchecked physiological responses of the animals related to their real condition in each season. The main differences between the experiments were: i) the average temperature of the studied season and ii) the natural physiological condition of the test organisms, which were in accordance with the studied season. The experimental setup was composed of 12 independent tanks, divided in three treatments simulating: a marine heat wave (MHW), a marine cold spell (MCS) and the marine control temperature. We used the recorded mean temperature of each season to setup the control temperature of the experiments (Table 1; Fig. 1). To define the threshold reference value for the experiments, we used the highest value considering the difference between the recorded threshold temperature and the recorded mean temperature, meaning a variation of 3°C. We considered MHW or MCS event when the temperatures transposed the threshold values for more than five days (sensu Hobday et al., 2016). The temperatures into the experimental tanks were increased (or decreased) by 3°C above (or below) the threshold values, reaching a maximum intensity value slightly higher than the one already recorded in the historical data (6°C of total variation in the experiments).
Each tank (10 L) with filtered and UV sterilised seawater was equipped with an aeration system (air compressor), an aquarium pump (3 W potency) for internal water circulation and a digital thermostat (precision of ± 0.3°C). In the marine heat wave treatment, the water temperature was controlled with a thermostat connected to a 100-W heater. In the marine cold spell treatment, the water temperature was controlled with a thermostat connected to a refrigerated system, consisting of a hydrostatic circuit with a closed loop that circulated the water with a 16 W submersible pump between the experimental tank and a cold-water container
with a cooling coil. The bottom of each tank was filled with 3 cm of sand, previously sieved and washed, in order to minimize the bivalves’ stress. The salinity was 27 (± 1), and it was monitored daily, and the water level and salinity were adjusted whenever necessary. Every 5 days, 80% of the total water of each tank was renewed by filtered seawater in the same conditions (salinity and temperature) of its respective treatment.
In each tank, 30 clams were accommodated. Along the experiment, we monitored the responses of the clams to the treatments by taking two individuals from each tank in two sampling days within four periods, named as initial period (day 1 - day 12), early period (day 13 - day 21), primary period (day 22 - day 33), and secondary period (day 34 - day 43) of the extreme temperature events (Fig. 1). The initial period corresponded to the 12 days of acclimation to the mean temperature of the respective season, 20±1°C for the winter experiment and 26±1°C for the summer experiment (Table 1). The variation of ±1°C from the acclimation temperature was to simulate a circadian variation. The early period corresponded to the following eight days when the temperatures were progressively changed (increased or decreased) by 6°C (1°C per day). This period simulated variations in temperature, which were not yet characterized as heat wave or cold spell events due to two factors: i) the temperatures did not transpose the threshold value to be considered as extreme temperatures; or ii) the temperatures transposed the threshold values, but for less than five days. The primary period and the secondary period were the times when the temperatures were beyond the thresholds for five days or more and are thus considered heat wave or cold spell events. During the primary period, to represent an event with low cumulative intensity, we took samples in days 24 and 30, meaning the 9 and 15 days of the simulated events, respectively (i.e. close to the average duration of the recorded events in the study area). In order to represent an event of high cumulative intensity (second period), we took samples at days 36 and 43, meaning the period
2.3. Analyses of physiological responses
2.3.1 Mortality
Clams mortality was monitored daily during the entire experiment. Individuals with a permanent wide valve gap, with retracted mantle borders and those that were not responsive to the touch of a glass rod or fine brush were considered dead and were removed from the experimental tanks.
2.3.2. Filtration rate
During the whole experiment, in each pre-selected period of measurements, two live clams were randomly selected. One of them was subjected to the filtration test and the other one to the respiration test. Filtration rate was measured according to the reduction of particulate concentration in the water as a function of time (Clearance Rate; Coughlan, 1969). The referred test consisted in placing the clam in a beaker containing 80 mL of seawater, under the same conditions as it was in its respective experimental treatment. At the time when the clam opened its shells and exposed the siphons (usually after 30 minutes), 10 mL of Nannochloropsis sp. Were added to a final concentration of 8.1 × 104 cells/mL. Then, a water aliquot (3 mL) was
collected every 15 min during the 90-min test. The microalgal concentration was monitored until the end of the test or until the moment when the concentration was equal to 0 (zero). To evaluate the clearance rate, we used the following equation (Cooper and Bidwell, 2006; Riisgård, 2001):
where M is the total water volume (mL), n is the number of individuals, t is the time interval (min), C0 is the algal concentration at time “0” and Ci is the algal concentration at time “I”.
2.3.3. Respiration rate
The respiration rate was measured as the difference between initial and final O2
concentration in sealed chambers (Clark et al., 2013; Díaz et al., 2017). Each clam was conditioned in a polyethylene airtight chamber, containing 200 mL of water at the same temperature as the respective treatment. The water concentration of O2 was measured by a probe
attached to a digital oximeter (YSI 5000, Ohio) at the beginning and at the end (120 min) of the incubation. Preliminary tests showed that there was enough time for the bivalves to open their shells and initiate the water inhalation through the siphons. Simultaneously, control chambers under the same experimental conditions, but without clams, were used to evaluate any eventual microorganism activity. At the end of the incubations, the wet biomass without the shells was measured. The respiration rate of each clam was calculated following the equation (Díaz et al., 2017):
Respiration Rate (mg min–1 kg–1) = (ΔO2b - ΔO2C) V / w × Δt
where ΔO2b is the variation between initial and final oxygen content in the chamber with a clam,
ΔO2c is the variation between initial and final oxygen content in the control chamber, V is the
water volume (mL), w is the weight of the clam (kg of wet biomass without the shells) and Δt is the time interval (min).
Immediately after the physiological tests, the feet and abductor muscles of each clam were removed, frozen in liquid nitrogen and subsequently kept at –80°C. The biochemical analyses were made with a pool of tissues of the two bivalves from the same experimental treatment, time and replicate. 1.5 mL of Triton x-100 solvent (0.01%) were added to each 800 μg of pooled tissue, then the tissue was homogenized, centrifuged (7000 rpm for 10 minutes at 4°C) and aliquots of the supernatant were taken as subsamples for different analyses. Total proteins were measured by the reaction with Coomassie Brilliant Blue reagent (Bradford, 1976) and the total lipids were measured using sulfo-phospho-vanillin reaction (Frings et al., 1972). The levels of triglycerides were measured by enzymatic methodology (Trinder, 1969) and the lactate dehydrogenase activity by the kinetic method with pyruvate-lactate (Schwert and Winer, 1963).
2.5. Data analysis
The effect of simulated MHW and MCS on the mortality of A. flexuosa was determined using Kaplan-Meier survival analysis (Goel et al., 2010). The survival analysis compares survivorship curves over the entire time of each simulated seasonal experiment by pairwise comparisons. Individuals used in the physiological and biochemical analysis were not included in the survival analysis.
The differences in the values of the physiological (rates of respiration and filtration) and biochemical (levels of triglycerides, lactate dehydrogenase, proteins and lipids) parameters of the clams from the initial period (acclimation) of the summer and of the winter experiments were compared using one-way analysis of variance. The physiological and biochemical responses of the clams exposed to simulated treatments were examined using the logarithm
response ratio (LnRR; Hedges et al., 1999), that consists in quantifying the proportionality of changes that result from an experimental manipulation. The value of each variable measured by each seasonal experiment, treatment, replicate, period, and sampling day was Ln transformed and standardised (subtracted) by the Ln transformed value of the variable in the corresponding control treatment. Then, the LnRR was used to assess the separate effects of each extreme temperature events (MHW or MCS) on the clams. The two-way crossed analyses of variance were used to test for differences in the respiration rate, filtration rate, levels of proteins, lipids, triglycerides and lactate dehydrogenase among seasonal experiments (fixed; 2 levels: winter and summer) and periods of each experiment (fixed; 4 levels: initial, early, primary and secondary periods). A Student-Newman-Keuls post hoc multiple comparison test was applied whenever necessary to determine the differences within seasonal experiments and periods along each experiment. All statistical and graphical analyses were performed in the R platform (R Core Team, 2017), using GAD (Sandrini-Neto and Camargo, 2012) and ggplot2 (Wickham, 2009) packages.
3. Results
3.1. Mortality
The A. flexuosa survival curves were different between event types and experimental seasons (Fig. 2). The Kaplan-Meier curve for the MHW showed a lower survival, with 97.2% mortality at the end of the summer experiment. In the summer simulation none of the clams died during the initial period, and only 12.5% during the early period died when the temperature was increasing but the anomalous events had not happened yet. There was a strong mortality of 54.5% of the organisms during the primary period, when the simulated heat wave was
3.2. Physiological and biochemical responses of A. flexuosa
The six physiological and biochemical parameters at the initial period (acclimation) differed between summer and winter experiments (Table 2). Respiration and filtration rates, as well as the values of protein, lactate dehydrogenase and triglycerides were higher in summer, while the levels of lipids were higher in winter. The physiological and biochemical responses of clams exposed to the simulated MHW showed significant variations for all analyzed parameters (Table 3). Response ratio values of respiration and filtration showed a significant interaction effect. There was an increase on respiration rates during the simulated MHW (early, primary and secondary periods) in the winter, but the same did not occur in summer (Fig. 3). In turn, the filtration rates showed an increase during the secondary period of the MHW in summer, and it did not occur in winter (Fig. 3). The response ratio of triglycerides had significant variation according to the experimental seasons (Fig. 4). In contrast, lactate dehydrogenase ratios had significant variations according to the periods, where a significant decline was perceived in the primary period for both experimental seasons (Fig. 4). The protein and lipid values showed a significant interaction effect between the factors period and season in the simulated MHW. The summer caused a significant increase in the protein levels in the early period and under high cumulative intensity events (secondary period), but no significant variation occurred in the winter (Fig. 4). The lipid levels decreased in the summer during the low cumulative intensity event (primary period), but not in the winter.
The physiological and biochemical responses of the clams exposed to the simulated MCS showed significant variations for almost all parameters, except proteins (Table 3). The respiration rates varied significantly only between periods, showing a decline during the early and primary periods in both seasonal experiments (Fig. 5). Filtration rates had the highest values in the early and secondary period in the summer and in the initial and secondary period of the
winter (Fig. 5). The biochemical parameters of the clams, when exposed to the MCS simulation under the winter condition, were more responsive than under the summer condition, at which the levels of triglycerides, lipids and lactate dehydrogenase activity did not show significant variations during the experiment (Fig. 6). Under the winter condition, triglycerides showed the lowest levels in the early and secondary period, while lactate dehydrogenase activity increased in the secondary period. On the other hand, the protein levels did not show any variations related to the simulated MCS event, while lipids increased gradually during the experiment.
Table 2. Mean values (± sd) and summary of analysis of variance of the physiological and biochemical parameters in Anomalocardia flexuosa for the acclimation (initial period of the experiments) in summer and winter conditions. Df: degrees of freedom; MS: mean squares.
Summary ANOVA one way Mean ± sd
Df MS F-value Summer Winter
Respiration (mg O² min-1 /kg-1) 0.029 ± 0.018 0.013 ± 0.008 Season 1 0.003 12.40*** Residual 46 0.002 Filtration (L/h) 0.501 ± 0.146 0.420 ± 0.171 Season 1 0.072 5.47* Residual 46 0.012 Triglycerides (mg/dL) 15.062 ± 7.252 8.388 ± 7.648 Season 1 534.521 5.35* Residual 46 99.754 Lactate Dehydrogenase (U/L) 327.760 ± 88.703 220.103 ± 91.40 Season 1 139079 7.35** Residual 46 18901 Proteins (mg/dL) 2.373 ± 0.744 0.983 ± 0.299 Season 1 23.201 32.09*** Residual 46 0.723 Lipids (mg/dL) 0.063 ± 0.062 0.135 ± 0.134 Season 1 0.066 35.196*** Residual 46 0.002
For all biomarkers, significance of planned comparisons was assessed at p ≤ 0.05 *; p < 0.01 **; p < 0.001 ***
Table 3. Summary of analysis of variance of physiological and biochemical responses ratios in Anomalocardia flexuosa under simulated marine heat waves (MHW) and marine cold spell (MCS) for seasonal conditions and along the experimental periods. Df: degrees of freedom; MS: mean squares.
Physiological responses Biochemical responses
Respiration Filtration Triglycerides Lactate
Dehydrogenase Proteins Lipids
Df MS F-value MS F-value MS F-value MS F-value MS F-value MS F-value
MHW Period (Pe) 3 16733 1.397 21559.8 5.923** 208228 0.325 10203.6 2.954* 6357.1 2.520 2516.3 1.203 Season (Se) 1 163051 13.620*** 0.5 0.001 110700 17.26*** 11717.5 3.393 6171.5 2.446 7.6 0.003 Pe X Se 3 65288 5.453** 9913.1 2.723* 121385 0.189 4987.5 1.444 7128.3 2.826* 6752.9 3.2282 Residual 56 11971 3640.1 641119 3453.5 2511.4 2091.8 MCS Period (Pe) 3 41513 4.125* 31643 5.976 ** 461498 4.176** 7026.5 2.657 4930.4 2.667 10878.9 3.414* Season (Se) 1 893 0.088 49549 9.358 ** 166939 15.108*** 731.2 0.276 1867.9 1.010 15899.9 4.990* Pe X Se 3 7945 0.789 26600 5.024** 379158 3.431* 11219.6 4.2425** 3227.9 1.746 23247.2 7.296*** Residual 56 10064 5295 110495 2644.8 1848.5 3186.2
Figure 3. Response ratio (LnRR) of physiological biomarkers in Anomalocardia
flexuosa under simulated marine heat waves (MHW) for summer and winter
conditions along the four experimental periods (Ini: initial period, Ear: early period, Pri: primary period, Sec: secondary period). Error bars represent 95% confidence intervals (CIs) for relative effects. Different small letters indicate significant difference between periods of the same experimental season following ANOVA and SKN post hoc test.
Figure 4. Response ratio (LnRR) of biochemical parameter in Anomalocardia
flexuosa under simulated marine heat waves (MHW) for summer and winter
conditions along the four experimental periods (Ini: initial period, Ear: early period, Pri: primary period, Sec: secondary period). Error bars represent 95% confidence intervals (CIs) for relative effects. Different small letters indicate significant difference between periods of the same experimental season. Different capital letters
