PRÓ-REITORIA DE PESQUISA E PÓS-GRADUAÇÃO
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIA E ENGENHARIA DE MATERIAIS MESTRADO EM CIÊNCIA E ENGENHARIA DE MATERIAIS
FRANCISCO ERNESTO DE SOUZA NETO
CARACTERIZAÇÃO E AVALIAÇÃO DO POTENCIAL DA QUITOSANA EXTRAÍDA DE Cunninghamella elegans NA FORMAÇÃO DE CRISTAIS DE OXALATO DE
CÁLCIO E ATIVIDADE ANTIOXIDANTE
MOSSORÓ
2017
CARACTERIZAÇÃO E AVALIAÇÃO DO POTENCIAL DA QUITOSANA EXTRAÍDA DE Cunninghamella elegans NA FORMAÇÃO DE CRISTAIS DE OXALATO DE
CÁLCIO E ATIVIDADE ANTIOXIDANTE
Dissertação apresentada ao Mestrado em Ciência e Engenharia de Materiais do Programa de Pós-Graduação em Ciência e Engenharia de Materiais da Universidade Federal Rural do Semi-Árido como requisito para obtenção do título de Mestre em Ciência e Engenharia de Materiais.
Linha de Pesquisa: Síntese de nanopartículas, biopolímeros e materiais nanoestruturados Orientadora: Anabelle Camarotti de Lima Batista, Prof. Dra.
Co-orientador: Hugo Alexandre de Oliveira Rocha, Prof. Dr.
MOSSORÓ
2017
Dedico este trabalho a todos os estudantes que
durante a árdua batalha de chegar à conclusão
do curso tiveram que enfrentar obstáculos que
deixaram o trajeto ainda mais difícil. E ainda
assim concluíram.
A Deus, por sempre está ao meu lado levantando-me nas quedas, e me glorificando nas alegrias. Por ter sido meu apoio sempre que precisei nos momentos de angústia e incertezas ao longo dessa etapa.
A Prof. Dra. Anabelle Camarotti de Lima Batista, que me acompanha desde o inicio da vida acadêmica, e que como sempre, foi imprescindível na construção de mais um trabalho aqui concluído. Agradeço pelo apoio, compreensão e orientação. Muito obrigado professora!
A minha mãe Eltiene. Ela que esteve ao meu lado torcendo e acreditando que um dia eu chegaria ao fim de mais uma etapa. Obrigado por não ter me deixado, de forma alguma, desistir da realização desse sonho. Eternamente obrigado!
A minha irmã Elaine, por me apoiar, e seguir paciente nessa caminhada árdua, com um fim maravilhoso, obrigado ―Ainha‖. E meu sobrinho, Davi filho, que com sua alegria e inocência de criança me fez refletir sobre um futuro prospero. Obrigado por tudo!
Ao meu querido amigo Weslley Paiva, sem seu apoio em todos os momentos, com certeza não teria conseguido chegar até aqui. Este trabalho não seria o mesmo sem teu apoio incondicional. Obrigadão por ser essa pessoa que ajuda aos amigos de olhos fechados, pensando apenas na felicidade do próximo. Sua determinação e paixão pela profissão também foram as minhas forças pra continuar na luta até aqui. Muitíssimo obrigado!
Aos meus colegas da primeira turma do Programa de Pós-graduação em Ciência e Engenharia de Materiais, em especial, a Nathalia Freire e Priscila Borges. Passar por essa etapa sem nossas conversas e nossos ―apoios de ombros‖, tantos nos piores momentos como nos melhores, não teria sido tão vibrante quanto foi.
Ao Prof. Dr. Hugo Alexandre de Oliveira Rocha, por ter me recebido em seu
laboratório para a realização de uma das etapas desse trabalho.
Principalmente a Moacir Queiroz, pela paciência e disponibilidade na realização dos testes.
A Prof. Dra. Galba Maria de Campos Takaki, e ao Núcleo de Pesquisas em Ciências Ambientais da Universidade Católica de Pernambuco, Recife-PE, pela cepa cedida para os experimentos.
Ao Prof. Dr. Rui Sales Júnior, e toda sua equipe do Laboratório de Fitopatologia, pelo o espaço e apoio na fase inicial desse trabalho.
A Prof. Dra. Fernanda Matias, pelo grande e incontestável apoio dado ao longo desse processo.
Agradeço a todos os meus amigos e familiares que diretamente ou indiretamente também estiveram transmitindo energias positivas para que eu chegasse à conclusão de mais uma etapa acadêmica. Um abraço a cada um de vocês. Obrigado!
A Universidade Federal Rural do Semi-Árido – UFERSA, pelo espaço para a concretização dessa etapa.
Ao Programa de Pós-graduação de Ciência e Engenharia de Materiais – PPgCEM, e a todo o seu corpo docente, pelo apoio em alguns momentos.
A CAPES, instituição que contribuiu financeiramente para que eu chegasse até aqui.
Obrigado.
A satisfação em poder agradecer a cada um de vocês, sem ordem de merecimento, pela
parcela que cada um teve na construção dessa etapa, é inquestionavelmente IMPORTANTE!
―Você nunca sabe que resultados virão das suas ações. Mas se você não fizer nada, não existirão resultados.‖
(Mahatma Gandhi)
tem o seu papel marcante dentro da sociedade. Isto possibilita, que outros materiais, além dos clássicos existentes, preencham algumas lacunas necessárias para atender as necessidades humana, como os biomateriais. As características dos biomateriais como biocompatibilidade e baixa toxicidade, conferem aos mesmos a capacidade de utilização em dispositivos biomédicos que possam ser utilizados em contato com sistemas biológicos. Um dos biomateriais que estão sendo utilizados em larga escala na área biomédica é a quitosana. A quitosana é um derivado do processo de desacetilação da quitina, e está denominada como um polímero de cadeia linear de
β-1,4-
D-glicosamina, ligado a resíduos de
N-acetil-
D- glicosamina, que por sua vez apresenta uma configuração tridimensional helicoidal estabilizada entre moléculas por ligações de hidrogênio. Após a solução de quitosana pronta, foram realizadas análises FT-IR, DRX e peso molecular das quitosanas fúngica e animal, como também análise das atividades antioxidante in vitro, o ensaio de formação de Oxalato de Cálcio (OxCa), incluindo o potencial zeta, e os testes de viabilidade celular da quitosana fúngica em células renais HEK. Foi possível determinar uma quitosana fúngica com grau de desacetilação de 76% e baixo peso molecular. Esta por sua vez apresentou menos compostos fenólicos que a quitosana animal, além de ambas terem apresentado baixa atividade antioxidante total, assim como baixa atividade quelante de ferro e uma atividade quelante de cobre em torno de 70%. Já no ensaio de formação de OxCa foi possível perceber uma diminuição do número, e um aumento no tamanho dos cristais, na comparação da presença de quitosana fúngica em relação a quitosana animal. Os resultados dos testes de viabilidade celular mostraram uma quitosana fúngica que permitiu uma viabilidade em torno de 70% das células renais saudáveis em três das cinco concentrações testadas. Diante do exposto a quitosana fúngica tem capacidade de continuar sendo um biomaterial de grande importância para a nova geração de materiais em uso na saúde.
Palavras-chave: Biomateriais. Quitosana fúngica. Cunninghamella elegans. Oxalato de
Cálcio. Urolitíase.
has its defining role within society. This allows other materials, in addition to the existing classics, to fill some gaps necessary to meet human needs, such as biomaterials. The characteristics of biomaterials such as biocompatibility and low toxicity give them the ability to use biomedical devices that can be used in contact with biological systems. One of the biomaterials being used in large scale in the biomedical area is chitosan. Chitosan is a derivative of the chitin deacetylation process, and is referred to as a
β-1,4-
D-glucosamine linear chain polymer, bound to
N-acetyl-
D-glucosamine residues, which in turn has a helical three-dimensional configuration stabilized between molecules by hydrogen bonds. After the solution of chitosan ready, FT-IR, XRD and molecular weight analyzes of fungi and animal chitosan were analyzed, as well as analysis of antioxidant activities in vitro, the formation of Oxalate of Calcium (OxCa), including zeta potential, and the cytotoxicity tests of fungal chitosan on HEK renal cells. It was possible to determine a fungal chitosan with degree of deacetylation of 76% and low molecular weight. This in turn presented less phenolic compounds than animal chitosan, in addition to both presented low total antioxidant activity, as well as low iron chelating activity and a chelating activity of copper around 70%. In the OxCa formation assay, it was possible to detect a decrease in number, and an increase in the size of the crystals, in the comparison of the presence of fungal chitosan in relation to animal chitosan. The results of cytotoxicity tests showed fungal chitosan that allowed viability around 70% of healthy renal cells in three of the five concentrations tested. In view of the above, fungal chitosan has the capacity to continue being a biomaterial of great importance for the new generation of materials in use in health.
Keywords: Biomaterials. Fungal chitosan. Cunninghamella elegans. Calcium Oxalate.
Urolithiasis.
Figura 1 - Estrutura química da quitina (a) e quitosana (b). ... 22 Figura 2 - Microscopia da cepa Cunninghamella elegans. ... 24 Figura 3 - Imagens de Microscopia Eletrônica de Varredura de Cristais de Oxalato de Cálcio.
(A) Mono-hidratado; (B) Di-hidratado; (C) Tri-hidratado. ... 27
Figura 4 – Fluxograma mostrando todas as etapas seguidas no Material e métodos. ... 28
Figura 5 - Imagens da formação dos diferentes tipos cristais de Oxalato de Cálcio (OxCa) em
diferentes condições: (A) Condição controle; (B) Condição com a solução de quitosana
fúngica; (C) Condição com a solução de quitosana animal. ... 46
Gráfico 1 - Espectro de infravermelho por transformada de Fourier da molécula de quitosana
fúngica obtida a partir de Cunninghamella elegans. ... 37
Gráfico 2 - Análise estrutural da molécula de quitosana fúngica pela técnica de difração de
raios-X. ... 39
Gráfico 3 - Dosagem de compostos fenólicos de quitosana animal e quitosana fúngica. ... 40
Gráfico 4 - Quantidade de cristais encontrados no campo de visão analisados através de
microscopia de campo claro. ... 47
Gráfico 5 - Tamanho de cristais encontrados no campo de visão analisados através de
microscopia de campo claro. ... 48
Gráfico 6 - Resultado da viabilidade celular da quitosana fúngica em células renais HEK. ... 49
Tabela 1 - Visualização geral dos estudos sobre o potencial de aplicação da quitosana
independente da forma de obtenção e características físico-químicas desde 1970 até
atualidade. ... 20
Tabela 2 - Condições pré-determinadas para as realizações dos testes de viabilidade celular da
quitosana fúngica... 34
Tabela 3 - Atividades antioxidantes da quitosana fúngica e quitosana animal testadas nos três
diferentes estágios da cadeia de transformação de espécies reativas: iniciação (CAT e
poder redutor); propagação (quelação de cobre e ferro); e terminação (sequestro do
radical hidroxila). ... 42
GAGs Glicoaminoglicanos OxCA Oxalato de cálcio TCP Fosfato tricálcio
COM Cristais de oxalato monohidratados COD Cristais de oxalato di-hidratados COT Cristais de oxalato tri-hidratados UCP Universidade Católica de Pernambuco YPD Yeast extract, Peptone, Dextrose
FT-IR Infravermelho por transformada de Fourier KBr Brometo de Potássio
DRX Difração de raios-X
CAT Atividade antioxidante total TCA Ácido tricloroacético
EDTA Ethylenediamine tetraacetic acid RMPI Roswell Park Memorial Institute HEK Human Embryonic Kidney
UFRN Universidade Federal do Rio Grande do Norte
MTT 3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-Diphenyltetrazolium Bromide DD Grau de desacetilação
ANOVA Análise de variância
1 INTRODUÇÃO ... 17
2 REFERENCIAL TEÓRICO ... 19
2.1 Biomateriais ... 19
2.2 Quitosana ... 20
2.2.1 Características físico-químicas e formas de obtenção da quitosana
... 222.2.2 Quitosana fúngica
... 232.2.2.1 Cunninghamella elegans
... 242.3 Quitosana x Aplicação Biomédica ... 25
2.4 Oxalato de cálcio (OxCa) ... 26
3 MATERIAL E MÉTODOS ... 28
3.1 Obtenção da cepa fúngica ... 29
3.2 Produção da biomassa e quitosana por Cunninghamella elegans ... 29
3.3 Caracterização físico-química da molécula de quitosana ... 29
3.3.1 Análise de Infravermelho por Transformada de Fourier (FT-IR)
... 293.3.2 Análise de difração de raios-X (DRX)
... 303.3.3 Peso molecular
... 303.3.4 Determinação de íons
... 303.3.5 Dosagem de compostos fenólicos totais
... 303.4 Atividade antioxidante in vitro ... 31
3.4.1 Determinação da capacidade antioxidante total (CAT)
... 313.4.2 Determinação do poder redutor
... 313.4.3 Avaliação do sequestro do radical hidroxila (OH)
... 313.4.4 Avaliação da capacidade quelante do ferro
... 323.4.5 Avaliação da capacidade quelante do cobre
... 323.5 Ensaio de formação de OxCa ... 33
3.5.1 Ensaio de cristalização do oxalato de cálcio
... 333.5.2 Análise da morfologia dos cristais de OxCa por imagem microscópica
... 333.6.1 Aplicação de quitosana fúngica nas células ... 34
3.6.2 Teste de viabilidade celular da quitosana fúngica em células renais ... 35
3.7 Análise estatística ... 35
4 RESULTADOS e DISCUSSÕES ... 36
4.1 Produção de quitosana por Cunningamella elegans ... 36
4.2 Caracterização físico-química da molécula de quitosana fúngica ... 36
4.2.1 Análise de Infravermelho por Transformada de Fourier (FT-IR)
... 364.2.2 Análise de difração de raios-X (DRX)
... 384.2.3 Determinação de íons presentes na quitosana fúngica
... 394.2.4 Determinação da quantidade de proteína e compostos fenólicos presentes na quitosana fúngica.
...404.3 Avaliação in vitro da Atividade antioxidante das quitosanas
... 414.4 Ensaio de formação de OxCa ... 45
4.4.1 Análise da morfologia dos cristais de OxCa por imagem microscópica
... 454.4.2 Medida do potencial zeta (ζ) dos cristais de OxCa
... 484.5 Teste de viabilidade celular da quitosana fúngica em células renais HEK ... 49
5 CONSIDERAÇÕES FINAIS ... 51
REFERÊNCIAS ... 52
ANEXO ... 66
1 INTRODUÇÃO
Com o passar dos anos, os materiais comumente utilizados nas mais diversas aplicações foram dando lugar a novos materiais, que surgiram através do desenvolvimento de novas tecnologias. Dentre esses materiais, se destacam os biomateriais, caracterizados por tratarem, substituírem ou aumentarem qualquer tecido, órgão ou função do corpo (HELMUS;
TWEDEN, 1995). Esses biomateriais podem ser classificados como naturais ou sintéticos, líquidos ou sólidos (RATNER; HOFFMAN, 2004).
As características dos biomateriais como biocompatibilidade e baixa toxicidade, conferem aos mesmos a capacidade de utilização em dispositivos biomédicos que possam ser utilizados em contato com sistemas biológicos (RATNER; HOFFMAN, 2004). Atualmente, um dos biomateriais que estão sendo utilizados em larga escala na área biomédica é a quitosana (MORSY; ALI; EL-SHETEHY, 2017; BANO et al., 2017; TAMER et al., 2017).
Esta é um polissacarídeo linear, produzido através da desacetilação química, quando obtida a partir da quitina da carapaça dos crustáceos; ou pela desacetilação enzimática, quando extraída da parede celular de alguns fungos (SIGNINI et al., 1998; BENTO et al., 2009; DIAS et al., 2013; BATISTA et al., 2014). É um bioproduto que detêm excelentes características biocompatíveis e biodegradáveis, determinadas em diversos experimentos (PAIVA; SOUZA NETO; BATISTA, 2017; MORSY; ALI; EL-SHETEHY, 2017; BASTAMI et al., 2017;
BANO et al., 2017).
Com as inovações nos procedimentos biomédicos, principalmente na especialidade de ortopedia, alguns estudos vêm sendo realizados com a quitosana oriunda de crustáceos, também discutida como quitosana animal (HE et al, 2017; ALIDADI et al, 2017; BASTAMI et al, 2017). Zhu e colaboradores, em 2005 apresentaram o uso da membrana de quitosana como molde extracelular para o cultivo in vitro de fibroblastos. Os autores salientam que a quitosana não é somente um polímero não tóxico, biocompatível e biodegradável, mas também uma estrutura química similar ao glicosaminoglicanos (GAGs), os quais atuam com sinergia na cicatrização das feridas.
Contudo, essas descobertas também demonstram que tal aplicação favorece a
formação de um aglomerado de cristais de cálcio nos tecidos renais. Este problema é devido a
uma falha no processo de desacetilação química, durante a etapa de desmineralização da
quitina em quitosana, essa etapa quando não realizada de forma correta, propicia um acúmulo
de resíduos de cálcio em excesso misturados ao polissacarídeo. Desta forma, quando o mesmo
é aplicado no organismo humano, tais resíduos são liberados sem controle, misturando-se ao
que já é produzido de forma natural pelo organismo e formando um aglomerado danoso à saúde (QUEIROZ et al., 2015).
São pesquisadas diversas alternativas para a produção da quitosana, tendo em vista tal problemática supracitada e a importância da continuidade dos estudos utilizando este polímero. Uma dessas possibilidades é a extração deste polímero da parede celular dos fungos, principalmente, os pertencentes à classe dos Zygomicetos. Para isso faz-se uso de um simples processo utilizando ácidos e bases fracas buscando promover a separação e obtenção dos constituintes.
Assim, a quitosana fúngica aparece como uma alternativa para a continuidade dos
testes para análise do seu potencial de aplicação como biomaterial na área biomédica. Diante
do exposto, foram realizadas várias análises que testam a capacidade da quitosana fúngica de
ser utilizada com biomaterial, dentre elas: a avaliação das propriedades físico-quimicas, a
atividade antioxidante in vitro, sua interferência na formação de cristais de Oxalato de cálcio
(OxCa), e teste de citotoxidade e atividade anticancerígena em células renais.
2 REFERENCIAL TEÓRICO
2.1 Biomateriais
Biomaterial é definido como a parte de um sistema que trata, aumenta ou substitui qualquer tecido, órgão ou função do corpo (HELMUS; TWEDEN, 1995). Outra classificação bastante utilizada define biomateriais como materiais sintéticos ou naturais, sólidos ou líquidos, utilizados em dispositivos médicos ou em contato com sistemas biológicos (RATNER; HOFFMAN, 2004). Considerando as definições, o desenvolvimento de biomateriais vem ganhando destaque nas pesquisas científicas devido a sua importância para o aumento da expectativa de vida e bem estar da população.
Os biomateriais são, geralmente, classificados em função de sua origem, da reação tecidual que geram ao organismo ou de sua natureza química. Com relação a sua origem, os biomateriais podem ser autógenos, alógenos, xenógenos e aloplásticos.
Os materiais autógenos, que são oriundos do próprio organismo, apresentam a possibilidade de realizar a manutenção da viabilidade celular. Os alógenos, provenientes de outros indivíduos da mesma espécie, podem ser obtidos a partir de cadáveres e de serem processados e armazenados em bancos. Os xenógenos tem origem de indivíduos de outras espécies. E os aloplásticos compreendem aos biomateriais exclusivamente sintéticos e biocompatíveis encontrados comercialmente, como as biocerâmicas, fosfato tricálcio (TCP), hidroxiapatita, alguns materiais poliméricos, ligas de titânio etc (ALMEIDA FILHO et al., 2007)
Os pontos determinantes para a escolha de um biomaterial, visando uma determinada aplicação, podem ser feitas de acordo com a similaridade química ou física do material em relação ao tecido a ser substituído. Assim, é importante o total conhecimento do biomaterial que será utilizado, da forma de preparação e também das respostas celulares que ele originará.
Para o biomaterial ser eficaz, o mesmo não deve causar danos locais ou sistêmicos e deve ser biocompatível (WILLIAMS, 1987; ROGERO et al., 2003).
O ponto crucial para a avaliação da biocompatibilidade é a caracterização dos
mecanismos químicos, bioquímicos, fisiológicos e físicos. Além dos que envolvem as
interações do biomaterial com os tecidos do corpo humano (PIRES, 2010).
2.2 Quitosana
Os primeiros relatos de isolamento da quitina são do ano de 1811, quando o professor francês Henri Braconnot realizou testes com vários isolados fúngicos, obtendo um extrato bruto formado pelo complexo quitina-glucano, com ausência de proteínas e pigmentos e presença de grupos acetil, o qual ele chamou de ―fungina‖. Odier, em 1823, denominou como quitina uma substância insolúvel que conseguiu isolar da carapaça de insetos. Odier também percebeu que esta mesma substância poderia ser encontrada na carapaça de caranguejos e suscitou que este poderia ser um material básico presente no exoesqueleto de insetos (DANCZUK, 2007).
Ainda no século XIX os pesquisadores Odier e Children descreveram o isolamento da quitina a partir da cutícula de insetos e da parede celular de cogumelos. Esse processo foi realizado através de tratamentos múltiplos com uma solução de hidróxido de sódio concentrado. Com tal relato, é provável que o material obtido tenha sido quitosana, pois ao submeter quitina a meio alcalino concentrado promove-se a desacetilação desse biopolímero, obtendo-se quitosana (DANCZUK, 2007). Continuando estudos, Rouget, em 1859, descreveu a presença de um grupamento amina no carbono 2 dos resíduos de quitina. Passados vários anos, em 1894, Hoppe-Seyler nomeou como ―quitosana‖ esse polissacarídeo descrito por Rouget, em 1859, e que contem grande quantidade de grupamentos amina no carbono 2 dos resíduos (ROBERTS, 1992).
Desde sua descrição e nomenclatura, a quitosana foi por muitos anos objeto apenas de pesquisa básica. Contudo, esse cenário foi mudando a partir de meados da década de 1970, quando foi percebido seu o vasto potencial de aplicação (tabela 1).
Tabela 1 - Visualização geral dos estudos sobre o potencial de aplicação da quitosana independente da forma de obtenção e características físico-químicas desde 1970 até atualidade.
Décadas Potencial de aplicação Referências 1970 – 79 Imobilização de enzimas;
Ação cicatrizante
MUZZARELI, 1973;
BALASSA, 1975;
MUZZARELLI, 1976;
LEUBA; WIDMER, 1977;
KASUMI et al., 1977;
LEUBA; WIDMER, 1978 BISSET; STERNBERG, 1978
1980 – 89 Tratamento de resíduos
industriais; Biossorção de metais pesados.
MUZZARELLI; TANFANI;
EMANUELLI, 1981;
MUZZARELLI; TANFANI, 1982; MUZZARELLI et al., 1984; MUZZARELLI, 1985;
1990 – 99 Tratamento de efluentes;
Imobilização de enzimas;
Associação química a outros compostos; Produção de filmes.
MUZZARELLI et al., 1989;
MUZZARELLI, 1990;
DOBETTI; DELBEN, 1992;
HOAGLAND; PARRIS, 1996;
2000 – 09 Degradação de corantes;
Imobilização de enzimas;
Biossorção e adsorção de metais pesados; Conservação de alimentos; Aplicação médica.
JIN; BAI, 2002; AMORIM et al., 2003; CHIOU; HO;
LI, 2004; FRANCO et al., 2004a; JEON; PARK, 2005;
RUNGSARDTHONG ET AL., 2006; ZHAO et al., 2007; CRINI; BADOT, 2008; BARONI et al., 2008;
PERIOLI et al., 2009;
CHEUNG; SZETO;
MCKAY, 2009.
2010 – atual Cosmética; Biodegradação de corantes; Antibacteriano;
Aplicação médica; Conservação
RASAD et al., 2010;
TAJIDINI et al., 2010;
GOMATHI et al., 2011;
de alimentos; Produção de biocápsulas; Tratamento de efluentes; Antifúngico; Adsorção de metais pesados.
HARRIS et al., 2011; LI et al., 2011; BATISTA., 2011;
YU et al., 2012; MOUSSA;
TAYEL; AL-TURKI , 2013;
PAIVA; SOUZA NETO;
BATISTA, 2014;
OLIVEIRA et al., 2014;
TAYEL et al., 2014;
TAILLANDIER et al., 2015;
TAMER et al, 2017;
ZHANG et al, 2017
Fonte: (Autoria própria, 2017)
2.2.1 Características físico-químicas e formas de obtenção da quitosana
A quitosana é um derivado do processo de desacetilação da quitina, e está denominada como um co-polímero de cadeia linear composta de resíduos 2-amino-2-desoxi-D- glicopiranose ligados a resíduos de 2-acetamido-2-desoxi-D-glicopiranos por ligações β 1→4 (Figura 1).
Figura 1 - Estrutura química da quitina (a) e quitosana (b).
Fonte: (Adaptado de
SPIN-NETO; PAVONE; FREITAS, 2008).
Sua estrutura espacial pode ser vista na forma hidratada, anidra, como complexos ou sais de quitosana (CHATTERJEE et al., 2005; ANTONINO, 2007; TAJIK et al., 2008).
Dependendo como seja obtida ela pode apresentar vários graus de acetilação, o que pode interferir na sua cristalinidade (ANDRADE et al., 2003; SYNOWIECKI; AL-KHATEEB, 2003)
Para a obtenção da quitosana há dois processos, um deles é a desacetilação termoquímica, que promove a retirada do grupo acetamida do carbono 2 do resíduo de quitina e adição de um grupamento amina na mesma posição. Tal processo é complementado por fases de desmineralização e desacetilação com ácidos e bases fortes que podem causar parcial desacetilação da quitina e hidrólise do polímero devido ao acesso limitado aos seus sítios reativos, levando a produtos finais com propriedades fracas, ou seja, produtos heterogêneos;
além de tais problemas, os resíduos de proteínas no produto final podem causar reações alérgicas em outros organismos (FRANCO, 2000; AMORIM et al., 2001), como também soluções alcalinas fortes que são usadas no processo são fontes eminentes de poluição para o meio ambiente (CAMPANA-FILHO et al., 2007).
O segundo deles é o processo de desacetilação enzimática da quitina, pelo qual é obtido quitosana sem aumento da temperatura e sem adição de ácidos ou bases fortes (TSIGOS, I.; BOURIOTIS, 1995; NAVQI et al., 2011). Por essa ação ser específica e pontual no carbono 2 dos resíduos de quitina é possível direcionar a produção de uma quitosana com características físico-químicas padronizadas, dependendo das condições externas que interferem diretamente na ação da enzima, como a variação de quantidade e tipos de fontes nutricionais no meio de cultura (CALVO-MENDEZ; MARTINEZ-PACHECO; RUIZ- HERRERA, 1987; DEISING; SIEGRIST, 1995; GHAOUTH et al., 1992; TOKUYASU et al, 1997; KAFETZOPOULOS; MARTINOU; BOURIOTIS, 1993; CHATTERJEE et al., 2005).
2.2.2 Quitosana fúngica
A estrutura geral desse polímero é muito semelhante à estrutura da quitina, possuindo
grupos hidroxilas (OH), mas a principal diferença entre eles é a grande presença de grupos
amino (NH
2) em mais de 70% dos resíduos da estrutura da quitosana. Essa característica
favorece a sua solubilidade em meio ácido diluído, devido à protonação do grupo amino
gerando o íon NH
3+, e lhe conferindo propriedades especiais e diferenciadas.
A produção de quitina e quitosana, a partir da biomassa micelial de fungos da classe dos Zygomicetos, vêm a ser uma alternativa sustentável devido à presença do grupamento amina, sendo considerada como o polímero do futuro por apresentar uma vasta possibilidade de aplicações (ARANAZ, 2010).
Esse biomaterial vem ganhando destaque nas mais diversas áreas, como nas indústrias alimentícias, no tratamento de efluentes (BATISTA et al., 2011), no tratamento de doenças fúngicas em plantações (MAIA et al., 2012), na nutrição do gado (ARAÚJO, 2011) e na área biomédica (PERIOLI et al., 2009).
2.2.2.1 Cunninghamella elegans
O gênero Cunninghamella pertence à Ordem Mucorales, que por sua vez foi primordialmente descrito por Matruchot em 1903 como um fungo filamentoso. Do ponto de vista taxonômico as espécies desse gênero podem ser identificadas por sua habilidade em responder as variações do meio de cultura (SHIPTON; LUNN, 1980). Esse gênero pode ser encontrado em solo, materiais de origem vegetal ou alguns outros substratos orgânicos. As espécies que mais se destacam dentro do gênero são Cunninghamela echinulata, Cunninghamella elegans e Cunninghamela bertholletiae (ALEXOPOULOS et al., 1996) (Figura 2).
Figura 2 - Microscopia da cepa Cunninghamella elegans.
Fonte: ANDRADE et al.(2015)
Em especial a C. elegans Lendner 1907, tem sido destacada por alguns autores por ser um fungo capaz de metabolizar uma variedade de compostos tóxicos recalcitrantes, utilizando as fases I e II (oxidativa e conjugativa, respectivamente) (AMBRÓSIO; CAMPOS-TAKAKI, 2004). A mesma vem sendo bastante utilizada como modelo microbiológico para o metabolismo de drogas farmacêuticas para células animais através do sistema de enzimas citocromo P-450 (WANG et al., 2000); na degradação de hidrocarbonetos aromáticos policíclicos - HAPs (SHIOSAKI et al., 2001), na biotransformação de cumarina (benzo-a- pirona) em compostos como umbeliferona (II), que apresentam atividades contra tumores animais (ATTIA; ABOU-EL-SEOUD; IBRAHIM, 2016), na biodegradação de azocorantes utilizados na indústria têxtil (AMBRÓSIO; CAMPOS- TAKAKI, 2004; FELCZAK et al., 2016), na biodegradação de produtos tóxicos advindos da combustão de óleo diesel (CERNIGLIA; GIBSON, 1977; SHIOSAKI et al., 2001), e na biorrecuperação de metais pesados (FRANCO et al., 2004a), como também no desenvolvimento de novas técnicas de obtenção de DNA em fungos (ZHANG et al., 1996). C. elegans pode ainda ser utilizada como fonte alternativa para a produção de quitina e quitosana apresentando rendimentos iguais ou superiores aos obtidos com a utilização de fontes tradicionais de obtenção, como as carapaças de crustáceos (ANDRADE et al., 2000; FRANCO et al., 2004b).
2.3 Quitosana x Aplicação Biomédica
Diferentes estudos com quitosana vêm sendo desenvolvidos para sua aplicação como biomaterial na área médica. Como exemplos têm as pesquisas para desenvolvimento de novos sistemas de liberação regulada de drogas terapêuticas, onde se faz necessário encontrar meios eficientes que possibilitem a administração das mesmas de forma segura e com o mínimo de efeitos colaterais possíveis. (STULZER et al., 2008; TORELLI-SOUZA et al., 2012).
Assim, a quitosana vem como uma dessas alternativas, pois apresenta características biofarmacêuticas que agregam valores interessantes a mesma. Tais como, a biocompatibilidade, a sensibilidade ao pH e a baixa toxicidade (BERSCH; NIES;
LIEBENDORFER, 1995). Além de ser metabolizada por enzimas presentes no organismo humano, como a lisozima, deixando-a biodegradável, como exposto no trabalho de Muzzarelli em 1997.
Para o sucesso do uso da quitosana na administração via oral de fármacos é importante que
a mesma seja hidrossolúvel e carregada positivamente, o que proporcionará que o biopolímero
se intercomunique com polímeros carregados negativamente, macromoléculas e poliânions em meio aquoso. Esta interação provocará a difusão do fármaco dentro do sistema de liberação controlada no organismo (PRABAHARAN, 2008).
Outra potencial aplicação desse biopolímero é na engenharia de tecidos, onde é buscada a formação de filmes, fibras, e ―scaffolds‖ que ajudem na regeneração tecidual (PATI et al., 2011; MIRANDA et al., 2011; ALIZADEH et al., 2013; BUSILACCHI et al., 2013;
MARTÍNEZ et al., 2015; SERRA et al., 2015; PRZEKORA; PALKA; GINALSKA, 2016).
2.4 Oxalato de cálcio (OxCa)
Danos no epitélio renal podem ser ocasionados pela formação de cálculos renais, doença conhecida como urolitíase, que possivelmente são causados em decorrência de mudanças no estilo de vida, hábitos alimentares (KNOLL, 2010; XU et al., 2013), aumento de ingestão de proteína animal, lipídeos, cálcio e sódio (RICCARDI; GIACCO; RIVELLESE, 2004; LÓPEZ; HOPPE, 2010; ROMERO; AKPINAE; ASSIMOS, 2010).
Os cálculos renais podem ser constituídos de diversos minerais, como: oxalato de cálcio (80% dos casos), fosfato de cálcio, ácido úrico (5% a 10% dos casos), cistina (1% dos casos) e cristais derivados de infecção como estruvita e carbonato de apatita, além de cristais mistos (em torno de 10% dos casos). De todos os supracitados, é importante destacar o oxalato de cálcio (OxCa), que forma uma porção significativa dos cristais encontrados em pacientes com urolitíase (BICHER et. al., 2002; MOE, 2006; LÓPEZ; HOPPE, 2010;
DAWSON; TOMSON, 2012; DAUDON; BAZIN; LETAVERNIER, 2015).
O oxalato de cálcio pode ser encontrado no organismo em três formas distintas: mono- hidratado, di-hidratado e tri-hidratado (YU et al., 2011) (Figura 3).
Em pacientes com tendência para a formação de cristais, o tipo predominante presente
na urina é o cristal de OxCa monohidratado (COM), o qual apresenta geometria monocíclica
(Figura 3A). Nos pacientes que não há tendência para formação de cálculos renais, há
abundância de cristais de OxCa di-hidratados (COD). Estes apresentam uma morfologia
característica bipiramidal tetraédrica, que pode ser facilmente visualizada por microscopia de
campo claro. Alguns pesquisadores relatam que alguns COD ao microscópio tem uma
morfologia que lembra a hélice de uma moinho de vento ou cata-vento (Figura 3B). Existe
ainda uma terceira forma, os cristais de OxCa trihidratados (COT), que possuem uma
morfologia drusiforme (Figura 3C), porém esses raramente são encontrados na urina de
paciente por sua instabilidade (YU et al., 2011).
Figura 3 - Imagens de Microscopia Eletrônica de Varredura de Cristais de Oxalato de Cálcio.
(A) Mono-hidratado; (B) Di-hidratado; (C) Tri-hidratado.
Fonte: GRASES et al. (1989)
Estudos relatam que a função dos cristais de OxCa na formação dos cálculos renais, denotam que os COM possuem uma carga positiva, o que o leva a interagir com moléculas carregadas negativamente e encontradas na superfície celular do epitélio, provocando a adesão cristal-célula. Embora tais células epiteliais do trato urinário possuam moléculas no glicocálice que impedem a interação/adesão dos cristais de OxCa com a mesma, em situações como o stress oxidativo, pode ser provocado a peroxidação lipídica da superfície celular, o que acaba permitindo que os cristais COM interajam com determinadas superfícies (LIESK;
DEGANELLO; TOBACK, 1999; YUEN, et. al., 2010).
Com a supersaturação urinária, o citoplasma das células epiteliais renais,
consequentemente, se encontra saturado de íons oxalato o que resulta em cristais formados
intracelularmente. Tais cristais junto com os cristais endocitados (COM) geram mais stress
oxidativo, que induz a formação de mais cristais e por final os cálculos renais (YUEN, et. al.,
2010).
3 MATERIAL E MÉTODOS
Inicialmente pode-se observar um fluxograma que simplifica e nos mostra todas as etapas seguidas nesse tópico da dissertação (Figura 4).
Figura 4 – Fluxograma mostrando todas as etapas seguidas no Material e métodos.
Fonte: (Autoria própria, 2017)
3.1 Obtenção da cepa fúngica
A cepa utilizada para os estudos foi a Cunninghamella elegans UCP 542, isolada do sedimento do mangue do rio Formoso, em Pernambuco. A mesma foi cedida pela Coleção de Culturas do Núcleo de Pesquisas em Ciências Ambientais da Universidade Católica de Pernambuco, Recife-PE.
3.2 Produção da biomassa e quitosana por Cunninghamella elegans
Para início dos estudos a cepa foi cultivada em meio ágar YPD (10 g extrato de levedura; 20 g peptona bacteriológica; 20 g glicose; 1000 mL) por 7 dias/28 °C. Os esporos foram coletados e armazenados em tubos de 50 mL com 15 mL de água destilada esterilizada (solução espórica). Da solução espórica 10
5esporos/mL foram adicionados em caldo YPD para crescimento da biomassa fúngica (de modo estático a 28 ºC/ 96 h). Em seguida, a biomassa foi filtrada, lavada com água destilada, secada e liofilizada. A extração da quitosana procedeu-se segundo Hu e colaboradores (1999). E a diluição da quitosana para os experimentos conseguintes foi feita em solução de ácido acético 0,5%.
3.3 Caracterização físico-química da molécula de quitosana
3.3.1 Análise de Infravermelho por Transformada de Fourier (FT-IR)
A técnica de FT-IR, foi utilizada para obter o grau de desacetilação, que foi calculado seguindo a formula 1. As amostras de quitosana foram previamente secas ―overnight‖ a 60 °C sob pressão reduzida. Posteriormente 15 mg de quitosana foram homogeneizados com 100 mg de brometo de potássio (KBr). Os discos de KBr preparados, foram colocados para secar por 24 horas a 110 °C em pressão reduzida. O espectro de infravermelho foi aferido através de espectrofotômetro Fourier Transform (FTIR) BRUKER Mod. IFS. O brometo de potássio branco foi utilizado como referência.
DD (%) = 100 − *(A1655/A3450) × 115+ (1)
3.3.2 Análise de difração de raios-X (DRX)
Medidas de difração de raios-X foram realizadas empregando difratômetro de raios-X RIGAKU (USPIFSC) com tubo de cobre (λ = 1,54 Å); a voltagem e a corrente utilizadas foram da ordem de 40 kV e 40 mA, respectivamente. Essas medidas foram realizadas no intervalo de 3-50 °C com velocidade de varredura de 1°/minuto em etapas de 0,02 °.
3.3.3 Peso molecular
A cromatografia de exclusão por tamanho foi aplicada para determinar o peso molecular da quitosana. As colunas Ultrahydrogel 500 e 250, com 7,8 x 300 mm de tamanho (Waters Corp., Milford, Massachusetts, EUA), conectados em série, foram acopladas a um HPLC Accela® com detector de índice de refração (Thermo Scientific, Waltham, Massachusetts, EUA). O eluente foi filtrado (membrana de 0,22 μm) em água ultrapura com NaNO3 0,1 M, com fluxo de 0,6 mL/ min a 30 ºC. Um conjunto de padrões de dextrano (6, 10, 40, 72.1, 147 e 270 kDa) foi usado para construir a curva padrão e permitir determinar o peso molecular do biopolímero (GALINARI et al., 2016).
3.3.4 Determinação de íons
A determinação dos íons metálicos Na
+, K
+, Ca
2+foi realizada no Laboratório de análises de solos, UFERSA, Mossoró, RN. As quantidades de Na
+, K
+foram avaliadas em fotômetro de chama (DIGIMED DM-62) e Ca
2+por espectroscopia de absorção atômica (VARIAN AA240FS).
3.3.5 Dosagem de compostos fenólicos totais
Os compostos foram quantitativamente avaliados pelo método colorimétrico de Folin-
Ciocalteau e as leituras realizadas em um comprimento de onda de 765 nm. O ácido gálico foi
utilizado como padrão de leitura (COSTA, et al., 2010). O resultado foi expresso como a
razão de mg de ácido gálico/g de amostra, a solução com quitosana não conjugado foi utilizado como branco.
3.4 Atividade antioxidante in vitro
3.4.1 Determinação da capacidade antioxidante total (CAT)
O princípio do ensaio é a redução do Mo
+6a Mo
+5pela amostra teste em diferentes concentrações, nesse processo que ocorre em pH ácido há formação de um complexo esverdeado fosfato/Mo
+5. Esse complexo colorido tem sua absorbância medida a 695 nm.
Para realizar o ensaio as amostras foram adicionadas em uma solução reagente (28 mM de fosfato de sódio, 0,6 M de ácido sulfúrico, 4 mM de molibdato de amônia). A solução foi mantida a 100 °C por 90 minutos e depois resfriada e lida em espectrofotômetro. O ácido ascórbico é utilizado como padrão e o resultado é expresso em equivalentes de ácido ascórbico/g de amostra (PRIETO; PINEDA; AGUILAR, 1999).
3.4.2 Determinação do poder redutor
Para avaliar o poder redutor, 4 mL de solução contendo as amostras em diferentes concentrações (0,1 – 1,00 mg/mL) foram misturadas ao tampão fosfato (0,2M, pH 6,6) e ferricianeto de potássio (1%) e incubados em banho maria por 20 min a 50 ºC. A reação foi interrompida pela adição de TCA (ácido tricloroacético) a 10%. Por fim adicionou-se água destilada e cloreto de ferro. A absorbância da solução é medida a 700 nm e ácido ascórbico é utilizado como padrão (ATHUKORALA; KIM; JEON, 2006; WANG et al., 2008).
3.4.3 Avaliação do sequestro do radical hidroxila (OH)
Para a realização desse teste, o radical hidroxila foi gerado utilizando-se 3 mL de
tampão de fosfato de sódio (150 mM, pH 7.4), que continha 10 mM de FeSO
4.7H2O, 10 mM
de EDTA, 2 mM de salicilato de sódio, 30% de H
2O
2e concentrações diferentes dos
polissacarídeos. O radical foi gerado devido a reação de Fenton (Fe
2++ H
2O
2→ Fe
3++ OH
-+
OH). Para o controle foi utilizado tampão fosfato em substituição ao peróxido de hidrogênio.
Após incubação a 37 ºC por 1 hora, a presença de radical hidroxila foi medida através da absorbância a 510 nm. O ácido gálico foi utilizado como controle.
3.4.4 Avaliação da capacidade quelante do ferro
A capacidade quelante das amostras foi analisada utilizando a seguinte metodologia:
as amostras em diferentes concentrações foram colocadas em uma mistura de reação constituída de cloreto de ferro II (0,05 mL, 2 mM) e ferrozina (0,2 mL, 5 mM). Após agitação por alguns segundos as soluções foram mantidas a temperatura ambiente por 10 min para que ocorressem as reações necessárias e posteriormente a absorbância da solução foi obtida a 562 nm. Controle positivo foi o EDTA e a capacidade quelante das amostras foi determinada conforme a equação abaixo.
(2)
3.4.5 Avaliação da capacidade quelante do cobre
O método se baseia na capacidade do violeta de pirocatecol em se associar a íons de cobre e formar um complexo colorido (ANTON, 1960), quando o cobre é quelado, impede a formação desse complexo e consequentemente a intensidade da coloração da solução é menor.
O teste é realizado em microplaca. Em cada poço foram adicionadas amostras em diferentes concentrações (0,1 – 2,0 mg/mL), violeta de pirocatecol (4 mM) e sulfato de cobre II pentahidratado (50 μg/mL), após a adição de cada ítem os poços são homogeneizados. A absorbância foi medida a 632 nm. Para o controle foi utilizado EDTA e a capacidade de quelação foi calculada utilizando a equação abaixo:
(3)
3.5 Ensaio de formação de OxCa
3.5.1 Ensaio de cristalização do oxalato de cálcio
Quando cristais de oxalato de cálcio se formam em solução a partir de Ca
2+e oxalato ocorre uma alteração da turbidez do meio em que se encontram, permitindo que essa formação possa ser avaliada através de espectrofotometria. Os estudos de Zhang e colaboradores (2012) descrevem um ensaio em que se mede essa formação por 30 min a 620 nm. Neste ensaio faz-se a mistura de cloreto de cálcio (8 mmol/L), oxalato de sódio (1 mmol/L), cloreto de sódio (200 mmol/L) e acetato de sódio (10 mmol/L) (solução controle), assim a cristalização é induzida pela adição de Na
2(CO
2)
2. As concentrações dessa mistura estão próximas das concentrações fisiológicas da urina. A formação dos cristais foi avaliada na presença e na ausência quitosana animal e quitosana fúngica. A partir dos valores de absorbância obtidos foi possível montar um gráfico que representa o perfil de formação de cristais de OxCa na presença da amostra de quitosana.
3.5.2 Análise da morfologia dos cristais de OxCa por imagem microscópica
Os cristais foram formados na presença e na ausência do polissacarídeo. Após formação as soluções com cristais foram centrifugadas a 5000 g e o sobrenatante foi descartado. O precipitado é composto principalmente por cristais de OxCa e foi ressuspendido em 0,5 mL de água e uma alíquota de 0,1 mL foi colocada em lâmina histológica e observada em microscópio ótico (600x) imediatamente após a ressuspensão. Foram obtidas imagens de 10 campos diferentes, selecionados aleatoriamente, de cada lâmina, que foram analisados utilizando o software NIS Elements AR 4.00.03 64 bit. Foram realizadas três réplicas distintas.
3.5.3 Medida do potencial zeta (ζ) dos cristais de OxCa
Após 30 minutos do início da formação dos cristais na presença e na ausência dos
polissacarídeos, as soluções foram centrifugadas a 5000 g. O sobrenadante foi descartado e o
precipitado rico em cristais de OxCa foi ressuspendido em 1,5 mL de água e avaliado no Zeta Plus® para obtenção do potencial zeta, ou seja, da carga superficial da camada difusa externa em comparação ao solvente em que se encontram as partículas de quitosana fúngica e animal.
3.6 Cultura de células
Foram utilizadas as células renais saudáveis HEK cedidas pelo laboratório de cultura celular da UFRN. As Culturas foram viabilizadas utilizando meio RMPI (Roswell Park Memorial Institute), em seguida elas foram incubadas a 37 ºC, em estufa com atmosfera com 3,2% de CO
2.
3.6.1 Aplicação de quitosana fúngica nas células
A quitosana foi solubilizada em ácido acético a 2%, obtendo-se uma concentração de 10 mg/mL que foi posteriormente filtrada em um filtro de 0,2 µm. Em seguida foram feitas diluições em cinco diferentes concentrações: 0,1% a 2% (Tabela 2).
Tabela 2 - Condições pré-determinadas para as realizações dos testes de viabilidade celular da quitosana fúngica.
Concentrações (%) Solução de quitosana fúngica (µL)
Meio RMPI (µL)
0,1 100 400
0,25 50 450
0,5 25 475
1 12,5 487,5
2 5 495
Fonte: (Autoria própria, 2017)
As placas de 96 poços foram incubadas por 24 horas, a 37 ºC em atmosfera de 3,2% de
CO
2. Este experimento foi realizado para ambas as linhagens de células e em triplicata.
3.6.2 Teste de viabilidade celular da quitosana fúngica em células renais
O método de MTT foi utilizado para a avaliação de citotoxicidade e tem como princípio a determinação da habilidade de células vivas em reduzirem brometo 3-(4,5-dimetil- 2-tiazolil)-2,5-difenil-2il-tetrazólico (MTT, Sigma) formando cristais insolúveis de formazan de coloração violeta. Após o tratamento, o meio de cultura foi removido e 10% de uma solução de MTT (1mg/mL) em PBS foi adicionado a cada poço. Em seguida, as culturas foram incubadas a 37 ºC, numa atmosfera de 3,2% de CO
2ao abrigo da luz, por 4 horas. Para a solubilização dos cristais e formazan, 100 µL de álcool 96 º, seguido de 15 min de mesa agitadora, a 80 rpm, e a leitura espectrofotométrica da absorbância, em comprimento de onda de 570 nm, foi realizada em leitor de placas de ELISA (Bio-Rad Microplate Reader Benchmark, Inc. USA). A porcentagem de células mortas foi calculada em relação ao controle positivo de toxicidade (CP) (Adaptado de OLIVEIRA, 2009).
3.7 Análise estatística
Foi utilizado o programa PAST. Nele foi realizado o teste da ANOVA, a qual mede a
variabilidade entre os valores, seguido do teste de Tukey para avaliar se ocorreu diferença
significativa entre as médias geradas com os experimentos.
4 RESULTADOS e DISCUSSÕES
4.1 Produção de quitosana por Cunningamella elegans
Utilizando o processo de extração descrito por Hu e colaboradores (1999) muitos autores brasileiros seguem buscando um maior rendimento de quitosana fúngica atrelado a um baixo custo de produção com vistas a competir comercialmente com a quitosana obtida a partir da quitina da carapaça de crustáceo.
Neste experimento foi possível chegar a um rendimento de 20,69 mg de quitosana por grama de Cunnigamella elegans , utilizando o meio YPD. Já na extração de quitosana fúngica através de meio composto por subprodutos da agroindústria alimentícia, Cardoso e colaboradores (2012) conseguiram obter 29,30 mg de quitosana por grama de massa seca de Rhizopus arrhizus; e Berger e colaboradores (2014), 57,82 mg de quitosana por grama de massa seca de Cunnigamella elegans UCP/WFCC 0542. Batista e colaboradores (2014), conseguiram aumentar esse rendimento trabalhando com meio composto por subproduto da indústria da carcinocultura, chegando a 89,95 mg de quitosana por grama de biomassa de Rhyzopus sp.
Tais rendimentos supracitados quando postos em comparação com a quitosana animal, obtida a partir da quitina extraída da carapaça dos crustáceos, reflete ainda um menor rendimento. Contudo, quando se leva em consideração as características físico-químicas, a facilidade de obtenção, o baixo custo de purificação e o pouco lixo químico gerado para produção de quitosana fúngica frente à produção de quitosana animal, esta diferença se torna mínima e os estudos valiosos (BESSA-JÚNIOR; GONÇALVES, 2013; NEVES et al, 2013).
4.2 Caracterização físico-química da molécula de quitosana fúngica
4.2.1 Análise de Infravermelho por Transformada de Fourier (FT-IR)
As diferentes aplicações da quitosana fúngica dependem das suas características
físico-químicas, dentre elas o grau de desacetilação. Essa característica mede a quantidade de
grupamentos químicos amina na cadeia, o que reflete em suas aplicações. Alguns estudos
demonstraram que o grau de desacetilação quanto mais próximo de 0 ou 100% favorece uma
menor degradação do biopolímero, como também uma maior adesão celular. Além de que quanto maior o grau de desacetilação, maior será a absorção de nanopartículas por fibroblastos em cultura de células. (HUANG et al., 2004; FREIER et al., 2005).
O FT-IR demonstrou um grau de desacetilação (DD) de 76% para a amostra isolada ao final do processo de extração de quitosana a partir de Cunninghamella elegans (Gráfico 1). Já nos experimentos de Berger et al., 2014a utilizando a mesma espécie fúngica chegou a um grau de desacetilação de 88,24%. Já os resultados apresentados por Paiva e colaboradores (2017) revelam uma quitosana microbiológica com grau de desacetilação de 84%. Tal diferença nos valores pode estar associada ao meio de cultura ao qual foram submetidas às produções de quitosana, como também a espécie utilizada, além das condições de crescimento fúngico.
Gráfico 1 - Espectro de infravermelho por transformada de Fourier da molécula de quitosana fúngica obtida a partir de Cunninghamella elegans.
Fonte: (Autoria própria, 2017)
O espectro infravermelho da quitosana fúngica em estudo apresentou uma banda em
1648,48 cm
-1foi assinalado como correspondendo ao estiramento N-C-CH
3da amina primária
primarias; a banda em 2293,30 cm
-1foi correlacionado com a presença dos grupos C-H sp3 e
a banda em 3414,83 cm
-1foi assinalada como decorrente da deformação axial de OH e vibrações de estiramento de pontes de hidrogênio. Tais bandas são confirmações que a amostra em questão se trata de um polissacarídeo, além disso, indica a presença de grupos funcionais presentes na molécula de quitosana. Bandas assinaladas com comprimentos de ondas semelhantes aos observados aqui nessa dissertação também foram descritas por vários autores (SANTOS et al., 2003; CHATTERJEE et al., 2005; CARDOSO et al., 2012; ARBIA et al., 2013; EBRAHIMZADEH et al., 2013) que utilizaram a técnica de FI-IR para caracterizar estruturalmente moléculas de quitosana. Isso leva a confirmação que a molécula aqui estudada trata-se de uma molécula de quitosana.
4.2.2 Análise de difração de raios-X (DRX)
Outra forma de analisarmos a molécula em estudo é utilizando o DRX. Esta técnica é aplicável a todos os sólidos cristalinos ou amorfos e a todos os líquidos. No entanto, o poder de difração dos raios X depende do número de elétrons do átomo em estudo (CANEVAROLO JÚNIOR, 2004). Quando esta técnica se aplica a um polímero, no diagrama observa-se dois conjuntos de sinais, um resultante da existência de zonas cristalinas e outro de zonas amorfas.
Diante disso, a literatura descreve uma estrutura reticular organizada com taxa de cristalinidade de aproximadamente 20-21 º para polímeros derivados da quitina com grau de desacetilação acima de 60%. (CANEVAROLO JÚNIOR, 2004). No gráfico 2 pode-se observar que a quitosana fúngica apresenta um pico em torno 20 °, que foi considerado como sendo o pico representante intensidade de difração das regiões cristalinas da estrutura dessa quitosana, corroborando com o que vem sendo descrito. Também se observa no gráfico 2 um pico de 9 ° que atribuído como sendo representante da intensidade de difração das regiões amorfas. Esses dois picos foram também descritos por outros autores que trabalharam com quitosana fúngica (BERGER et al., 2014a e WANG et al.,2008)
Já quando se verifica a análises de difração dos raios X de outros polímeros, como
celulose vegetal e poliestireno, os picos observados são descritos em outras regiões: 18 º e 13
º para a celulose (PEREIRA et al. 2012) e 20,7 º para o poliestireno, que no caso não
apresenta região amorfa (MORAIS; BOTAN; LONA; 2014). Isso mostra quão especifico é
esta técnica para certificar a identidade de várias moléculas, inclusive polímeros.
Portanto, diante dos dados de FT-IR e difração de raio X, pode-se afirmar que a molécula aqui estudada é um quitosana. Além disso, dá certeza do tipo de biomaterial que será utilizado para nos teste descritos a seguir.
Gráfico 2 - Análise estrutural da molécula de quitosana fúngica pela técnica de difração de raios-X.
Fonte: (Autoria própria, 2017)
4.2.3 Determinação de íons presentes na quitosana fúngica
Os resultados obtidos nessa análise mostraram que a quitosana fúngica, apresentou
uma concentração de Na
+a 0,10 g/kg, de K
+a 0,0 g/kg e de Ca
2+a 0,0 g/kg, tais valores
revelam que este biopolímero apresenta quantidades mínimas de Na+ e não apresenta em sua
estrutura resíduos dos metais K
+, Ca
2+. Dentre tais metais, o que deve ser evidenciado é o
Ca
2+, pois, uma vez ele inserido na molécula de quitosana de uso biomédico, favorecerá, a
longo prazo, a formação de cristais de oxalato de cálcio (OxCa) no organismo a ser tratado,
podendo causar urolitíase (cálculo renal) corroborando com os estudos de Queiroz e
colaboradores (2015).
4.2.4 Determinação da quantidade de proteína e compostos fenólicos presentes na quitosana fúngica.
Diante da confirmação da identidade do quitosana fúngica, o próximo passo foi confirmar se ela não estava contaminada com proteínas e/ou compostos fenólicos, uma vez que estas moléculas poderiam interferir nos testes descritos ulteriormente a esse tópico. E confirmou-se que mesmo quando se utilizou altas doses (1 mg/mL) não se identificou proteínas nas amostras.
No tocante ao teor de compostos fenólicos, se conseguiu identificar a presença dessas moléculas na quitosana fúngica. Contudo, a quantidade de compostos fenólicos na quitosana de origem animal foi cerca de 3,5 vezes maior do que aquela encontrada na quitosana fúngica, como pode ser observado no Gráfico 3.
Gráfico 3 - Dosagem de compostos fenólicos de quitosana animal e quitosana fúngica.
a,b
Letras diferentes indicam diferença significativa (p <0,05). Fonte: (Autoria própria, 2017)
A observação dos resultados dessa análise se torna imprescindível, uma vez que se visa a utilização da quitosana nas mais diversas áreas, principalmente, a biomédica. Pois os compostos fenólicos contaminam e poluem o meio ambiente durante a produção, transporte e/ou utilização em diversos tipos de indústrias, causando danos à fauna e à flora (DAS et al., 2014). Seus efeitos tóxicos nos seres humanos incluem permeabilidade celular e coagulação citoplasmática, irritação da pele, distúrbios gastrointestinais, mau funcionamento dos rins, falha no sistema circulatório e até edemas pulmonares (KARIM; LEE, 2013).
a
b a
b
