Embriogênese somática em soja (Glycine max (L.) Merrill)

Texto

(1)EMBRIOGÊNESE SOMÁTICA EM SOJA (Gl.ycii.n.e ma.x (L.) Merri. ÉBERSON SANCHES CALVO Engenheiro Agrônomo. ORIENTADOR. Prof. Dr.NATAL ANTONIO VELLO. Dissertação apresentada à Escola Superior de Agricultura "Luiz de Queiroz", da Universidade d.e São Paulo,para obtenção do titulo de Mestre em Agronomia. Area de Concentração : Genética e Melho ramento de Plantas.. PIRACICABA Estado de São Paulo - Brasil Agosto 1989.

(2) C169e. Calvo 1 Éberson Sanches. Embriogê.nese sonatica em soja (Glycine nax. (L.) tfer:::-ill).. Piracicaba,. 146p. ilus. Diss.(Mestre) - ESALQ Bibliografia.. 1989..

(3) UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO ESCOLA SUPERIOR DE AGRICULTURA. EMBRIOGÊNESE SOMATICA EM SOJA. "LUIZ DE QUEIROZ". (Gtycine. max (L.)Merrill). ~BERSON. SANCHES CALVO. Engenhe~ro. Aprovada em. Agrônomo. 28/08/88. Comissão julgadora: Natal Antonio Vello Paulo Roberto de Camargo e Castro Beatriz Madalena Januzzi Mendes. ESALQjUSP . ESALQ/USP CENA/USP. 1~I-q,\\r. Prof. Dr. NATAL ANTONIO VE110 Orientador.

(4) AGRADECIl'iENTOS. Sou imensament.e. ~rat.o. ao. Corpo de. Docent.es e. Funcionários do Depart.ament.o de Genét.ica /ESALQ/USP e. de. do CENA/USP. que me apoiaram em t.odos os sent.idos durant.e a. realização do curso. de. reit.erar. Mest.rado. Além. disso. gost.aria. agradeciment.os às seguint.es pessoas e. Ao. DI".. Nat.al. Ant.onio. Vello,. pela. de. os. meus. inst.i t.uições :. amizade,. orienLação. e. const.ant.e. int.eresse na minha carr'eira cient.1 fica.. Ao. DI".. Akihiko. Ando,. Dr'.. August.o. Madalena J. Mendes, da Seção apoio incondicional e. de. Tulmann. NeLo,. Radiogenét.ica do. prest.eza com que. me. e. Dra.. Beat.riz. CENA/USP,. r'eceberam nos. pelo seus. laborat.órios.. A. Sra.. Benedi t.a. de laborat.ório e. Aos. Srs,. Osmair. Inês. P.. Rodrigues. pelo. amá lio. nos. t.rabalhos. amizade.. Ant.onio. José. F.. da. Robert.o Silva,. Cogo. pelo. apoio. Claudinei no. Antonio. culti vo. das. Didoné. e. plant.as. e. amizade,. - A FAPESP e ao CNPq pela concessão da bolsa de est.udo. o de. curso de Mest.rado foi solidificar. algumas. agradeciment.os Mello, de. Maria. Souza,. Emídio. amizades. Dario. Helena. t.ambém para mim uma grande oport.unidade. f'.tinoru. Goldman R.. quais. Hiromot.o,'. Anet.e. Bonat.o ,. Piment.el, Luciano L. Naas, e. às. P.. de. Claudet.e. eu DI'.. manifest.o It.amar'. Souza,> P.. Paulo. Ruas. aos amigos da "República",. os. meus. Soares Eduardo Arnoldo. de T. t>1..

(5) Aos meus pais Sebastião e. Antonia. Ao meu irmão Edmilson Aos meus ..tios" Miguel e. Davina. que com muita garra e dignddade vão vencendo este desafio que é a vida.

(6) SUMARIO. página ABREVIATURAS . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ix. RESUMO . . . . . . . . . . . . " ......... , . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . x. SUMMARY . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . xii.. 1. INTRODUÇÃO . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 01. 2. REVISÃO DE LITERATURA . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 04 2.1. Considerações gerais . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 04 2.2. Fatores que influenciam a indução de. embriogênese. somática em soja . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 06 2.2.1. Agente solidificante e meio basal . . . . . . . . . . . . . . 06. 2.2.2. Explante . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 07. 2.2.3. Genótipo da planta doadora . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 09 2.2.4. Tipo e concentração do açúcar . . . . . . . . . . . . . . . . . . 10. 2.2.5. Tipo e concentração de auxina . . . . . . . . . . . . . . . . . . 12 2.2.6. Presença de citocininas . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 18. 2.2.7. Presença de ácido abscisico.. . ... 20. 2.2.8. Fonte de nitogênio . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 21 2.2.9. Vitaminas e aminoácidos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 21. 2.2.10. Temperatura . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 22 2.2. 11. Luz . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 23 2.2.12. pH . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 23.

(7) 2.3. Fatores. que. influenciam. a. maturação. dos. embri6ides . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 24 2.4. Fatores que. influenciam. a. germinação. dos. embri6ides . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 27 2.5. Origem dos embri6ides . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 28. 3. MATERIAIS E MÉTODOS . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 31 3.1. Procedimentos gerais . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 31 3.1.1. Cultivo das plantas . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 31 3.1.2. Coleta do material,. esterilização. e. dissecação . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 31 3.1.3. Preparo do meio de cultura . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 32 3.1.4. CondiçBes de cultura . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 34 3.1.5. Avaliação de. das. indução .. 3.1.6. Avaliação. s. culturas. na. .................. das. ,. fase ~. ........ culturas. l. ••••••••. ~ ~. •. ~ ~. 34. fase. de maturação . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 36 3.2. Procedimentos especificas . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 36 3.2.1. Experimento 1. efeito do 2,4-D.. 3.2.2. Experimento 2. efeito do 2,4,5-T.. 3.2.3. Experimento 3. efeito do NAA.. 3.2.4. Experimento 4. efeito da sacarose e da. .37. ... . .. .. . .37. filtração em meio contendo NAA. 3.2.5. Experimento. l=.. .,J. . . .37. 'J~. ••..) f. interação genótipo X meio. de cultura . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 38 3.2.6. Experimento 6. efeito da luz . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 38. 3.2.7. Experimento 7. efeito da suplementação com. ABA, BA ou IBA . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 38. 3.2.8. Experimento 8 : efeito. da. posição. de.

(8) inocu lação . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 39 3.2.9. Experimento 9. efeito da sacar os e na. presença de 2, 4-D . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 39 3.2.10. Experimento 10 : efeito da sacarose na presença de 2,4,5-T . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 40 3.2.11. Experimento 11. efeito do tipo de açúcar ...... 40. 3.2.12. Experimento 12. efeito da L-glutamina ......... 40. 3.2.13. Experimento 13. efeito da L-prolina ........... 40. 3.2.14. Experimento 14. efeito. de. substâncias. orgânicas complexas . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 41. r .......... 41. 3.2.15. Experimento 15. efeito da radiação. 3.2.16. Experimento 16. determinação do meio de. cultura para maturação dos embrióides .......... 42 3.2.17. Experimento 17 : efeito. do. genótipo. e. do meio de indução . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 42 3.2.18. Experimento 18 : efeito da luz (na maturação dos embrióides) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 43 3.2.18 Experimento 19 : efeito da radiação r (na maturação dos embrióides) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 43 3.3. Observações anat6micas . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 43. 4. RESULTADOS . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 46 4.1. Efeito de diferentes tipos e. concentrações. de. auxinas . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 46 4.1.1. Efeito do 2,4-D (Experimento 1) . . . . . . . . . . . . . . . . .46 4.1.2. Efeito do 2,4,5-T (Experimento 2) ............... 52 4.1.3. Efeito do NAA (Experimentos 3 e 4) ............... 57 4.2. Efeito do genótipo e do meio de cultura na indução de embriogênese (Experimento 5) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 60.

(9) 4.3. Efeito da. luz. na. indução. de. embriogênese. (Experimento 6) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 64 4.4. Efeito da adição de ABA, BA, ou IBA na indução de embriogênese (Experimento 7) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 65 4.5. Efeito da posição do explante no meio de cultura na indução de embriogênese (Experimento 8) ............. 65 4.6. Efeito da concentração de sacarose na. indução. de. embriogênese, em meio 20D (Experimento 9) .............. 68 4.7. Efeito da concentração de sacarose na. indução. de. embriogênese, em meio 11,5T (Experimento 10) ........... 68 4;8. Efeito do tipo de açúcar na indução de embriogênese (Experimento 11) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 72 4.9. Efeito da suplementação com aminoácidos na. indução. de embriogênese (Experimentos 12e 13) ................. 72 4.10. Efeito da adição de CH, EM, ou EL na. indução. de. embriogênese (Experimento 14) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 76 4.11. Efeito da radiação. r na indução de. embriogênese. (Exper imen to 15) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 78 4.12. Efeito de diferentes. meios. de. cultura. na. maturação dos embrióides (Experimento 16) .............. 78 4.13. Efeito do genótipo e do. meio. de. indução. na. maturação dos embrióides (Experimento 17) .............. 80 4.14. Efeito da luz. na. maturação. dos. embrióides. (Exper imen to 18) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 83 4.15. Efeito da radiação rna maturação dos embrióides (Experimento 19) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 83 4.16. Observações organográficas e anatômicas ............... 92. 5. DI SCUSSÃO . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 102.

(10) 5.1. Efeito das auxinas na indução de embriogênse .......... 102 5.2. Anormalidades organográficas dos embri6ides .... 5.3. Efeito. do. ABA. e. do. BA. embriogênese. na. indução. 0. ••••••. 105. de. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 111. 5.4. Efeito dos demais fatores. na. indução. de. embriogênese . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ' . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 113 5.5. Fatores. envolvidos. embrióides. na. maturação. dos. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 118. 5.6. Origem dos embri6ides . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 122 5.7. Estado fisiológico do explante . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 124 5.8. Consideraçôes finais e perspectivas futuras ........... 126. 6. CONCLUSOES. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 133. 7. BIBLIOGRAFIA . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 135.

(11) ix.. LISTA DE ABREVIATURAS. ABA. 2,4-D. Ácid6 absci sico Ácido 2,4 -. diclorofenóxiacét.ico. 2~4~5-T. Ácido 2,4>5 -. IBA. Ácido indolbut.irico. IAA. Ácido 3-indolacét.ico. ElA. Ácido giberélico. '". t.riclorofenoxiacét.ico. NAA. Ácido naft.alenacét.ico. MES. Ácido 2(n-morfolino) et.anosulfúrico. p-CPA. Ácido p-clorofenoxiacét.ico. MCPA. Ácido 2- met.il-4-cloroÍenoxiacét.ico. BA. Benzilaminopurina. K. Cinet.ina. CH. Caseina hidrolizada. EL. Ext.rato de levedura. EM. Ext.rato de malt.e. 2ip Z. 2-isopent.eniladenina Zeat.ina.

(12) x.. Ef'.1.BRIOQE:NESE SOMÁTICA EM SOJA (Glycine ma" (L.) MarrilD.. Au~or. : ÉBERSON SANCHES CALVO. Orient.ador : ProL DI'. NATAL ANTONIO VELLO. RESUMO. Ía~ores. Diversos det.erminar. uma. met.odologia. (Glycine. max. base. g-ermoplasma. o. imat.ur·os hormonal,. Íoram ~ipo. parâme~ros. MerrilD. (L.). e.. in. à. int... errompem. promoveram condições. os. 2A-D. morfolo~icament.e. de do. anormais. :fim. plant.as. somá~ica,. Para. et.c.).. de. soja. t.endo. como. co~ilédones. condições Foram. se. de. isso,. (regime. avaliados. calogênese,. à. os. assim. como. as. al~as. ou. por. Baixas. não. 2,4,5-T no. (11,5-17,5. es~ádio. assegurar. concen~rações. precoce. eram. que. mos~I'aram. embri6ide. desenvolviment.o embri6ides. e. a. ana~6micas.. m~/D. células.. de. diversas. açúcar,. provaveimen~e. das um. de. sob. ob~idos. on~o~ênese. desenvolvimen~o ,. merist.emá t.ico. vitro. resul~ados. <10-25 a. soja.. de. embriog-ênese. observações org-anog-ráficas e Os. reg-eneração. embrio~ênese. via. c<?ncen~ração. referent.es. concent.rações. para. brasileiro. cult.ivados. inves~ig-ados. Íoram. na puderam. globular o. dest.as. embri6ides.'. dos sua. seI'. mg/D, de. es~ado. auxinas Nessas. g-rande convert.idos. em.

(13) xi. plânt.ulas.. A. vacuolização. precoce. celular-es associados a. esse. mult.icelular-. de. a. part.ir. explant.e. A sacarose, o. açúcar. processo. que de. irradiação L-prolina,. levedura não. de. foram a. dos. com. a. Não. loi. meio de cult.ura indução inibiu. de. pelo a. As. de. induzidos mat.uração.. a. os. genót.ipo de. sob. alt.as. nesses. do. 2,0 %. foi. embriogênese. inibido. O. pela. adição. de. L-glut.amina,. rnalt.e. ou. ext.rat.o. de. e. eficiências na. de. suplement.ação. A. não de. favoI"eceu. a. embriogênese. posição. aba,,-'1al.. Tant.o. mat.uração dos embrióides foram da. plant.a. doadoI"a. int.eI"ação. ent.re. concent.rações dos. apresent.aram base. A. explant.es. mat.uração. pelo. event.os. sUb-epiderme. do. result.ados. uma. loi. maioI". auxina,. Os. o a. mas. embrióides. frequência. propost.o. e. favoreceu. de. embI"ióides.. explant.e.. gen6t.ipo. concent.:r-ação de auxina). A luz. embriogênese,. Com. dos. fort.ement.e. embriogênese.. maiores. eh'1st.ência. (t.ipo e. complet.ament.e. y.. de. indução de embI"iogênese. cult.ivando-se. evidenciada. foi. ext.rat.o. indução. embrióides.. afet.adas. e. eficiência. raios. indução de embI"iogênese quant.o a. fOI"t.ement.e. epiderme. da. maior. hidrolizada,. est.irnulou. obt.idas. células. embriogênese. explant.e. com ABA ou BA inibiu a mat.uI"ação. um. em concent.rações variando de 1,0 à. indução. casei na. foi. processo. Os embrióides t.iveraJn origem. proporcionou. do. células. das. um. de. pI"ot.ocolo. I"epx-oduzi vel paI"a regeneração de plânt.ulas assim como um modelo de oI"igem dos. embri6ides.. A. aplicação. dessa. met.odologia. na. obt.enção. de somaclones e de plant.as de soja t.ransgênicas loi discut.ida..

(14) xii.. SOMATIC EMBRYOGENESIS IN SOYBEAN (Glycine max. MerrilD. (L.). Aut.or :ÉBERSON SANCHES CALVO Adviser : ProL Dr. NATAL ANTONIO VELLO. SUMMARY. Severa! :ract.ors. a. met.odolo~y. reg-enerat.ion ~ermplasm.. severa!. t.hroug-h. lmmat.ure. sug-ars,. somat.ic. and. Paramet.ers. morpholog-ica!. and. in. max. order'. in. cult.u:red. were. concent.rat.ions. oÍ. embryo~enesis ,. oÍ. anat.omical. observat.ions. t.o. est.abilish. MerrilD. (L.). embryog-enesis,. cot.yledons. (t.ype. st.udied. (Glycine. soybean. :ror. condit.ions. were. Brazilian in. plant. soybean. vitr-o,. under. plant.. reg-ulat.ors,. callus. :rormat.i on,. were. assessed. qualit.at.ive and quant.it.at.ively. The concent.rat.ions suspended maint.ainin~. condit.ion,. t.herein. showed. analysed. t.hat.. (10. embryoid t.he. concent.rat.ions. result.s. ont.og-enesis merist.emat.ic. promot.ed. be. convert.ed. ",,'as. an. event.. int.o. associat.ed. were. ~lobulaI'. Df'. embryo. t.he. t.his. Early. st.age, cell.. Somat.ic. by. auxin. abnormal. vacuolat.ion. processo. pr'obably. development... morphologicaIy. plant.let.s. W1 t.h. t.he. st.at.e. premat.ure. most.l)· embryoids. not.. at.. oÍ. ln. t.his. and. could. t.he. cells. embryos. had.

(15) xiii.. pr'esent.ed. t.he. ernbryogenesis. hydrolysat.e,. BA. maU... enhance. t.he. The. t.he. mediurn.. was. Eit.her. lt. cult.ure induction,. by. Iound. The. and. allXÍn. not.. and. light. showed. z·esult.s,. a. proposed, applicat.ion. a. hig-h. reproducible as OI. well t.his. as. a. procedure model. met.odolog-y. Íor in. plant.let.. embryoid. t.he. t.ransg-enic soybean plant.s is discussed.. did. ABA. or. was. obt.ained. t.he. cont.act. wit.h. explant.. donor. g-enot.ype. by t.he. completely addit.ion. Re{:;arding-. The. oÍ. t.hese. reg-enerat.ion. OI. and. embryog-enesis. but.. orig-in.. ob"t.ent.ion. medium,. embryoid. favour-ed. Irequency.. :for. casein. wit.h. in. concent.rations,. maturat.ion. g-arnrna. f"avou:r'. between. supressed ernbryoid mat.ur-at.ion. Embryoids formed 2.4.5-T. of". embryoid mat.urat.ion. of". int.eract.ion. 01. cult.uz·e. suz·:face. g-enotype. process. L-proline,. t.o. did. %. explant.. ef"f"iciency. abaxial. the. any. by. suplement.at.ion. induct.ion. presence. hig-h. under. t.he. embz'yog-enesis. not.. medi um.. Medium. induct.ion. wit.h. inf"luenced. was. extract.. embryog-enesis. hig-hest.. explant.s. strong-ly. plant... induct.ion.. inhibit.ed. The. L-{:;lut.amine>. of". or yeast.. embryog-enesis. mat.ur-at.ion. cult.uz·ing. ext.ract.,. efficiency.. st.rong-ly. Addit.ion. embryoid. inhibit.ed. was. 2.0. t.o. 1.0. f"rom. ernbryog-enesis. induct.ion. irradiat.ion.. rays. not.. hig-hest.. explant.. sub-epiderrnal. and. sucrose. of". Concent.rat.ions. cells.. epidermal. f"rom. orig-in. mult.icellular. was. potent.ial. somaclones. and.

(16) 1. 1... INTRODUÇÃO. A cult.ivadas para. soja (Glycine max import.ant.es~. mais. a~ricult.ura. a. aproximadament.e. brasileira. da. 65%. ponto. Ist.o. produção. se. produção, junt.ament.e com o esmagament..o par-a a. quase. farelo. e. a. e. que. ext.ração do óleo>. insubs1At.uivel. asse~urar. fat.o. so ja. de. que. necessária. é. geram anualment.e uma receit.a. à. 1987).. (BONATO 8: BONATO,. O. da demanda ext.erna de farelo,. na. formulação. de. rações. animais,. soja est.a posição no mercado. nacional. int.ernacional por um bom t.empo. Os. cont.ribuiram desempenho exemplo juvenil as. de. pelo. t.or1..a de soja produzidos no. bilhões em export.ações. cert.ament.e irão. sócio-econórnico~. vist.a. just.ifica. brasileira. aument.o da demanda interna de óleo e produt.o. de. mercado in1..erno de óleo comest.i velo O rest.ant.e da. para abast.ecer o. média de U$ 2,5. do. uma das plant.as. (L.) MerrUD é. da. podem que. baixas. brasileiros permit.ido expansão que em. e. t.rabalhos. vêm. 1at.i t.udes,. um. (MYASAKA. cit.ados. permit.iram. (KI1HL. genét.ica. cont.ribuindo. cult.ura ser. de. et.. aument.o. os. que. a. 8::. na. para. na. Assim, nacional. se. r-egião est.as de. da. soja. est.e. bom. t.it.ulo. A. aument.o. soja. cu1t.ura da. prodUção. para. 1981).. MEDINA,. t.rabalhos. 1984).. melhorament.o. int.ensament.e. part.icularment.e alii,. e. do. periodo. difundisse dos. de. para. cerrados. pesquisas. soja,. at.ravés. t.êm da. plant.io, sem compromet.iment.o da produt.ividade, casos chega a. ser maior nas regiões de expansão do. que nas regiões mais t.radicionais (BONATO 8:: BONATO, 1987). Est.a expansão na área de cult.ivo cert.ament.e t.rará.

(17) 2. consig-o a. necessidade. de. solo,. clima,. lado,. t.em. g-enét.ica. ao. sido dos. possíveis. de. ressalt.ada. cult.ivares. da. adapt.ar. surg-iment.o. pat.amares. problema. se. de. a. a. novas. de. de. vulnerabilidade. g-enét.ica. de. a. assim. do. et.c.. se. soja. produt.ividade,. novas. doenças,. necessidade. brasileiros. às. cult.ura. condições Por. ampliar fim. de. como. out.ro. a se. base evit.ar. cont.ornar. o. (~I~ºMQ:LQ,_"."_.~.>. g-ermoplasma. VELLO, 1986). A. cult.ura de. t.écnica capaz de auxiliar o &.. KISER,. celular,. ROTH. 1985;. exploração. et.. da. t.ecidos. t.em. sido. apont.ada. como. uma. melhorament.o g-enét.ico da soja (OOODMAN alii,. variação. somaclonal. t.ecidos como et.apa básica para a. in. Seleção. 198!D.. e. o. vitro. uso. ao. da. nível. cult.ura. de. obt.enção de plant.as t.ransgênicas,. t.êm sido as aplicações mais comument.e propost.as. A. resist.ência. ent.re. a. nível. de. doenças. em. t.rabalho,. foi. à. Nest.e. (1986).. perspect.iva. de. soja. à. calos. resist.ência. veg-et.a.ção. primeiros. Mais. passos. resist.ência. aos. o. de. acúmulo. a. fazer foi. Phyalophora. ao. ~ecata. recent.ement.e,. t.ambém. no. se. sent.ido. herbicidas aminoácidos. de. plant.as. est.ão. :fazer. (glifosat.o,. e. e. in. para. et.. ali!. correlação in. vitro. ao. casa. de. em. sendo. seleção. at.razina. (met.ionina. exist.e. avaliada. de. vitro. aRA Y. por. que. nível. in. seleção. abert.a. demonst.rado. resist.ência e. se. dados vitro. os para. paraquat.),. para. (AMER. et.. alii,. soja. Ioi. prolina). 1988), e para t.olerância à salinidade (GHAZI et alii, 1988),. Variação. somaclonal. plant.as. em. recent.ement.e. relatada. para. deficiência. clorofila,. machoest.erelidade. folhas. de. enrrug-adas.. Out.ras. caracteres. alt.erações. acaso (BARWALE &. WIDHOLM, 1987).. de. qualit.ativos tot.al. fenot.ipicas. ou. como. par"cial,. ocorreram. e ao.

(18) 3. A conseguida. t.ant.o. "revolver. 1988),. quat.ro. por. de. plant.as. quant.o. últ.imo. meses,. caract.erist.ica. caso. de. int.eresse. et.. (com. alii,. possível. ao. resist.ência. t.ransgênicas o. 1988;. agronômico. e. f'oi. auxilio. do por. HINCHEE. int.roduzir,. herbicida. já. mediada. t.ransformaçã.o. CABE. foi. soja. diret.a. por. (Mc. tumefasciens. Nesse. de. t.ransformação. genes"). de. A~obacter-ium. alii,. produção. em. apenas. glifosat.o.. que. foi. et.. uma. herdada. de. maneira est.ável pela progênie, segregando na proporção esperada de 3:1 CHINCHEE et.. alii, 1988). Ent.ret.ant.o, aplicadas uma. com. t.odo. met.odologia. Exist.em. o. seu. eficient.e. dois. processos. embriogênese. somát.ica. induzida. pelo. para. est.as. pot.encial.. para. para e. t.r-at.ament.o. que. a. a. é. t.écnicas. indispensável. regeneração. de. regeneração. or-ganog-ênese. de. embriões. de. possam. ser. que. se. t.enha. plant.as. in. vitro.. de. novo. Embriogênese zigót.icos. plant.as: somát.ica,. imat.uros. com. auxinas, t.em sido a. forma mais fr-eqtient.e de regener-ação de plant.as. de. CLAZZERI. soja. GHAZI. in. et.. vitr-o. alii,. 1986;. LAZZERI. et.. alii, ali i ,. et.. 1985; 1987a. RANCH e. et.. 1987b;. alii,. 1986;. KOMATSUDA. 8::. OHYAMA, 1988; FlNER 8:: NAGASAWA, 1988).. o a. regeneração. desenvolviment.o de de. plant.as. uma met.odologia. depende. em. últ.ima. eficient.e inst.ância. para do. conheciment.o e domínio dos fat.ores que afet.am o pr-ocesso. Est.a qualit.at.iva o. e. pesquisa. t.em. quant.it.at.ivament.e,. os. por. objet.ivos. principais. faLores. processo de ernbriogênese somát.ica em soja, e. prot.ocolo para a. regeneração. de. plant.as. de base para t.rabalhos fut.uros visando a. in. (1). vitr-o. caract.erizar, que. afet.am. (2) desenvolver um que. possa servir. obt.enção de somaclones ou. de plant.as t.ransgênicas, no germoplasma brasileiro de soja..

(19) 4. 2. REVIS1\O DE LITERATURA. 2.1. Considerações gerais somát.ica. Embriog-ênese processo. at.ravés. diplóides,. do. as. qual. at.é. diferenciam. se. est.ádios embrio16g-icos. pode. &. MAHESWARAN,. formarem. denominado. de. embrião. o. 1986).. somát.ico. ou. def'inida. somát.icas,. células. dist.int.os, sem que. (WILLIAMS. ser. a. fusão. embrião. embri6ide.. hap16ides passando. plant.as, haja. de. o ou. por. g-amet.as. f'ormado. assim Em. como. alg-umas. é. espécies,. como p. ex. em Citrus sinensis , est.e processo ocorre nat.uralment.e in. vivo e. é. conhecido como poliembrionia. Em out.ras. ,. como no caso. da soja, ele é induzido, sob det.erminadas condições, in vitro.. De somát.ica. pode. mat.uração, e espécies. ser. do. e. somát.ica. dividido. g-erminação. est.udadas. semelhança,. especialment.e. at.é. pont.o. ap6s. o. t.rês. moment.o,. de. as. em. (AMMIRATO,. zig-6t.ica. a. o. maneira. fases. 1987 t.em. &. morfo16g-ico,. ent.re. (com. orig-em. f'usão. primeiras. divisões. PACE,. observado. vist.a. na. indução,. dist.int.as. ; RANCH se. embrio~ênese. de. processo. 1988). Nas. uma. ~rande. embrio~ênese. a. g-amet.as) ,. dos. celulares. do. embrião. (WILLIAMS & MAHESWARAN, 1986). A soja t.em sido considerada,. leg-uminosas, a. alg-uns. alii,. uma. espécie. insucessos. 1986).. alcançados,. difícil. iniciais. Ent.ret.ant.o, part.icularment.e. na. de. ser. nos. est.ão modificando est.a imag-em.. últ.imos. out.ras. vitro. devido. t.rabalhada. reg-eneração. prog-ressos. junt.ament.e com. de. in. plant.as. sucessivos t.rês. anos,. (HAf\1MAT vem. que. et.. sendo. cert.ament.e.

(20) 5. Os soja. t.iveram. t.rabalhos. 60,. :formulaçã.o. do. nut.rient.es , vit.arninas) denominado. de. ut.ilizado para a. e. que. o. na. levou. década. cult.ura. de. (1968). inicio. com. à. cult.ura de células. de. células. e. dest.acando-se. o. meio. basal. B5 e. que. t.ecidos de. em. GAMBORG. (macro. e. micro. ainda é. amplament.e. soja e. de dezenas. t.ecidos de. de out.ras espécies vet;et.ais.. o. primeiro. relat.o. de. indução. somát.ica em soja loi leit.o por BEVERSDORF & não. t.enha. sido. lormação de alg-uns. mal. possivel. lormaram. dilerenciados).. Seis. somát.ica.. de. Mas. et.. loi. de. soment.e. considerado. a. e. pelos. regeneração. de. t.arde. 1983). 1985. loi. loi. aut.ores. como. plant.as. por. o. ser. ,. a em. muit.o. primeiro. possível. a. embriogênese. via publicado. sendo. ou. (embrióides. publicado. vitro. que. observou-se raizes. most.rando. in. soja. em. plant.as,. embriogênicas. mais. alii,. plânt.ulas. prot.ocolo> indução. anos. de. BINGHAM (1977). Embora. que originaram. est.rut.uras. (CHRISTIANSON. regeneração. regeneração. cent.ros merist.emát.icos. casos,. t.rabalho. a. embriogênese. de. o. primeiro. reproduzivel,. embriogênese. para. somát.ica. em. processo. de. soja <LAZZERI et. alii, 1985). Diversos lat.ores embriogênese (1987a. e. (AMMIRATO,. 1987b). e. PARROT. ernbriogênese. somática. da. da. avaliação. 1983).. em. À. et.. soja. iruluência. parecem iruluenciar. dos. de. exceção ali i. são. (1988),. lalhos. diversos. no. o. LAZZERl os. et.. ali!. t.rabalhos. em. aspect.o. latores. no. quantit.ativo processo.. Em. muit.os casos est.e aspect.o loi comple't.ament.e ignorado <BEVERSDORF & BINGHAM, LI. et.. 1977; alii,. quant.ilicação a. CHRISTIANSON 1985; :foi. percent.agem de. HAMMAT leita. de. et &. alii,. 1983;. DAVEY,. maneira. LAZZERI. 1987).. grosseira,. Em. et. out.ros. alii,. 1985;. casos. avaliando-se. a. apenas. explantes que apresentaram alguma resposta,. sem.

(21) 6. se. preocupar. produzidos et.. alií,. com. o. número. (LIPPMANN. 1986;. com. LIPPMANN,. 8:. BARWALE. e/ou. et.. a. 1984;. alii,. 1986;. mOl"t"ologia RANCH. RANCH. et. et.. dos. embri6ides. alii, ali!,. 1985;. GHAZI. 1986;. GHAZI. et. alii, 1988). A seguir serão abordadas as t.rês f"ases do processo, dando-se ênfase em apresent.ar o que já se conhece sobre os f"at.ores que as imluenciam.. 2.2. Fat.ores que in:f"luenciam a. indução de embriogênese somát.ica. 2.2.1. Agente solidi:f"icant.e e. Embriogênese t.ant.o 1,. de. meio. pag.. liquido. 13).. O. cult.uras. BINGHAN, e1... ali i ,. a. grande. relat.ados usado 0,6 à. meio. GAMBORG. 1985;. KERNS. maioria os. meio. solidificado. 0,8% Cp/v). At.é. o. most.rando solidificant.e embora. est.e. o. e:feito na. e:feito. de. sólido sido. células. sido. ou. semi-sólido. empregado em. obt.ida. no. 1983;. CHRlSTIANSON. et.. ali i ,. 1986;. FlNER. t.rabalhos,. result.ados com. âgar. 8:. onde. usando-se. (veja. Tabela. est.abeleciment.o. suspensão. alii,. (BEVERSDORF e1... ali!,. NAGASAWA,. 1983. 198~D.. coincident.ement.e. na. regeneração. em. quant.idades. 8:. Jâ são. de. plant.as,. foi. que. variaram. de. presen1..e moment.o não existe nenhum estudo do. indUção. t.em. t.em. e1... dos. melhores. somát.ica. meio. liquido. embriogénicas. 1977;. LI. quant.o. meio basal. de. tenha. tipo. e. da. embriogénese sido. concent.ração somát.ica. demonstrado. em. em. do. agent.e. soja,. outras. muit.o. espécies. CZIM.MERMAN & ROBACKER, 1988). O meio basa! MS ou uma combinação do meio MS e ainda não. B5 t.em sido t.enha sido. os. mais utilizados. relatado nenhum. di:ferentes meios basais.. (Tabela 1), muito. estudo. comparativo. embora. entre. os.

(22) 7. 2.2.2. Explant.e O embrião zigÓt.ico imat..uro t..em sido o usado~. embora segment..os. est..abeleciment..o. de. cult..ura. BINGHAN.. 1977;GAMBORG. t..ecidos. embriogênicos. quando. cult..ivado. respost..a. (RANCH. NAGASA VIA. (1988). suspensão. de. de. (GHAZI. iniciaram calos. alii,. 198!:)).. uma. et... 1986). do. Mais. cult..ura. ut..illzados. no. (BEVERSDORF. &. alii.. O. 1986). eixo. embrião. células. obt..idos. e. de. embrionário. não. apresent..ou. recent..ement..e,. de. embriogênicos. foram. suspensão. KERNS. rest..ant.e. ali!,. et... em. 1983; et... do. t..ambém. célUlas. alii~. et... isolado. usando. hipoc6t..ilo. explant..e mais. FINER. &. embriogênicas. em. de. embrião. zig6t..ico. imat..uro em meio semi-sólido. LIPPMANN primeira vez que o imat..uro).. na. influencia. (1984). LIPPMANN. est..ádio de desenvolviment.o do avaliado. formação. de. pelo. compriment.o. embri6ides.. Os. pela. demonst..raram explant..e. cot..ilédones,. dos. autores. (embrião. concluíram. que. embriões com cot..ilédones com 4-5 mm de compriment..o produziram um maior número de cult.uras embriogênicas. LAZZERI zi~ót.icos. t..iveram calos. do. com 3-5 baixa. mrn. et. deram. viabilidade. t.ipo. alii. :friável.. (1985). melhores. em. result.ados.. cult.ura. Embriões. observaram. e. maiores. que. embriões. Embriões. freqüent..ement..e apresent.aram. menores íormavam. uma. maioI'. t.endência para :formação de raizes. RANCH et. alii os. e xplant..es. em. cot..ilédones ent..re de ali i. embriogênese (1986). duas 0,5-4 em. (1985). classes mrn de t..odos. encont.raram. o. a~ruparam. de. t.amanho. compriment.o os. 14. valor. e. t.inham. genÓ'tipos de. de maneira. 6. verificaram maior. avaliados. mrn. ~rosseira. como. que. :freqüência GHAZI ót..imo. et..

(23) 8. considerando-se. apenas. cult.ura.. et.. BARWALE. freQÜência. de. cot.i1édones. o. número. alii. (1986). embriog;ênese. variando. de. compriment.o. variando. promissores.. de. não. embri6ides. explant.es. com. 4-7mm.. Port.ant.o>. embriões. 3-6. com. os. produzido. encont.raram. em. ent.re. acordo. de. mm. o. diferenças. na. compriment.o. parecem. result.ados. por. dos. zig;6t.icos. serem. relat.ados. com. os. mais. acima.. As. diferenças encont.radas podem ser compreendidas considerando-se que o. parâmet.ro. f"idedig;na a f"eit..os. t..amanho. fase. com. do. cot..ilédone. de desenvolviment..o. ~en6t.ipos. dif"erent.es. do e. não. ret..rat.a. embrião; os sob. de. maneira. t.rabalhos foram. condições. dif"erent.es. de. cult..ura. Mais recent..ement.e íoi 1987). que. é. possivel. í:t>eqtiências ,. em. se. obt.er. O. de. dissecação do. íeit..o. por. embriog-ênese,. embriões. pré-cot.iledonar Cg-lobular e. demonst.rado CHAMMAT &. zigót.icos. ainda. que. ainda. seis. vezes. com. o. cort..ando-os. ao. et.. no caso. alii. a. o. <1987b).. ef"eit.o meio. cot.ilédones. aument.ou. ã. result.ado. que. freqüência. por. emb:t>ião. zig-ót.ico. Const.at.ou-se. ou. do. a. cult.ivado). eixo. que. quat.ro. eficiência quando. se. A. freqtiência. frag-ment..ou. at.enção. embr1óides. dos. o. de. aut.ores. f"oi. morfolo~icament.e. o. quase f"oi. cot.ilédones> t.rat..ament.os. com. formação. explant..e.. em. Também. os. comparado. foi. número médio. os. Ambos. °,. eficiência. aument..ou. sobre. part..es.. i mat..UZ'. a. embrionál-io.. dissecação. em. a. que. chamou de. da. int.eiros.. medida. explant..e. remOção. aument.aram ig-ualment.e de. est.ádio. "coração").. explant..e,. produzido. invest.ig-ado. baixas. único est.udo exist.ent.e sobre os efeit.os da íorma. LAZZERI. emb:t>ióides. em. no. do processo (medida pela freqüência de embriog-ênese x de. DAVEY>. ° de. cult.ivo calos. Ent.ret.ant.o, fat.o. de. normais. que. um a foi.

(24) 9 si~nificat.ivament.e su~erida. :foi. devem. ser. menor. nenhuma. :feit.os. quando. se. explicação. para. usou. para. confirmar. cot.ilédones. est.e. est.es. :fat.o. int.eiros.. e. novos. result.ados. com. Não. est.udos. um. número. maior de cult.ivares, ou mesmo em out.ros sist.emas de embrio~ênese. A. posição. do. recent.ement.e apont.ada como HARTWECK et. alii m~/D. NAA (10,0 de. no. meio. de. cult.ura. :foi. um out.ro :fat.or import.ant.e no processo.. (1988) demonst.raram que. em meio suplement.ado com. há uma t.endência de se formar uma menor quant.idade mor:folo~icament.e. embrióides. colocados com a meio. explant.e. normais,. :face int.erna em cont.at.o. suplement.ado. com. alt.as. quando com. concent.rações. o. os. cot.ilédones. meio de. de. são. cult.ura.. 2A-D. Em. ~/D. (25,.0. houve uma maior produção de embrióides quando os cot.ilédones :foram colocados. com. cont.rapart.ida,. os. apresent.aram t.ocant.e. à. :face. a. externa. em. embrióides. problemas. quant.idade. embrióides. com. meio.. o. nest.as. p:r'oduzidos. morfolo~ia.. de. dos. cont.at.o. Result.ados. produzidos,. Em. condições. semelhant.es,no. foram. encont.rados. por COLBURN et. alii (1988).. 2.2.3. Genót.ipo da plant.a doadora. o. At.é embriogênese condições. 1985;. somát.ica. diversas. RANCH. OHYAf\-"tA,. indução. et.. 1988).. bast.ant.e. mas. Ent.ret.ant.o,. cont.rast.ant.es. do na. OHYAMA, quant.o. a. em. os meio. BARWALE. 1985; a. et.. freqüência. gen6t.ipo :fase. de. 1988). freqüência. conseguiu-se. moment.o,. t.odos. cult.ura. alii,. t.ambém. &. em. de. dependent.e. K01>1ATSUDA. present.e. gen6t.ipos sólido alii, de. ut.ilizado, germinação. de. respost.a só. (RANCH. embriog-ênese. et.. alii,. KOMATSUDA. 1986;. se na et.. ident.if1cação. A. sob. t.est.ados,. (LAZZERI. não. induzir. de e. a. &. most.rou :fase. alH,. de. 1985;. g-en6t.ipos capacidade.

(25) 10 de. ~e~ene~ação. cax-á~e~,. p.. ex.. ~al. como. o. K.. Cei~o. Coi. (HODGES. mos~~ax-am. Hax-~ow'. pe~nú~i~á. uitro. já. núlho. p~elinúnaJ:"es. <A.. in. que. alii,. confere. ~ené~ica. da. Em. boa. como. ~esul~ados. soja,. ~enót.ipos. dos. des~e. ve~e~ais~. espécies. 1986).. p~esença. a. ~enealo~ia. na. ou~~as. pax-a. et.. es~udo. o. ~Manchu'. ou. emb~io~ênica. capacidade. (PARROT et. alii, 1988). encon~~ada. Não foi emb~io~ênica. do. com cax-act.e~lst.icas. t.e~ument.o. 1986).. da. Embo~a. posit.iva. sement.e. não. ent.~e. a. e. suspensão. (KERNS. na. ali i ,. et.. cl~a,. pax-ece. emb~iogênico. ali i ,. mo~folog-ia. no. suspensão. o. acent.uado,. chegando. est.abeleciment.o. efeit.o. Dos. do a. genót.ipo. haver. 2.2.4. Tipo e. do. em. em. p~ece. se. t.ambém. mas. com po~. de. células. ausência. ser. sacax-ose. acima. complet.o. a. de de. mais. complet.a. de. 8: BIN6HAM. BEVERSDORF. algum pot.encial embriog-ênico.. &. LIPPMANN. (1984). classific~am. o. processo. de embriog-ênese somát.ica em soja como sendo muit.o sens1vel a concent.rações. em. concentração do açúcar. LIPPMANN. açúcar 2,0. lormação de. nó. células. p~ece. explant.e. t.est.ados. apr·esent.~am. cult.~as. de. g-enót.ipos. ~enót.ipos. 56. (1977), soment.e dois. lo~mação. alii,. externa desses embriões somát.icos.. Já. embriog-ênese.. de. p~oduzidos. não só na quant.idade de embrióides. e~. organogênese. co~relação. Essa. 1986).. co~. ou. co~relação. uma. cult.u~a. em. capacidade. BARWALE. exis~i~. via. da. mat.u~ação,. de. 1985;. ~egeneração. de. pot.encial et.. ~rupo. como. (RANCH. capacidade. cot.iledonax-. Y·eflet.i~. o. muit.o. co~~elação. nenhuma. %. de. ~eg-iões. no ou. de. meio. de. glicose. emb~ióides,. cult.~a.. acima. apesax-. emb~iog'ênicas. at.é. de a. de. Concent.rações. de. inibiram. por. 1,5. t.e~. alt.as. %. sido. obse~vada. concent.ração. a. máxima.

(26) 11 ~es~ada. de. 5~0. % . e~. LAZZERI com. diminuia. com. e. %. Já. concen~ração. maior. e. para. a. de. 1,5. 6~0. de açúcar no meio de. a. t,e~. não. ~licose ~. Em. do. diferidos.. diferiu. para. a. ambos. embriogênese. açúcar> caso. embora da. eficiência. os. açúcares. os. sacarose. concen~rações. de aÇúcar, vindo a. %. da. No. as. maior. t,an~o. observaram que,. eficiência. concen~ração. da. %. embriogênese at,é com. de. 1,5. ocorreu. na. foi. observada. se anular com 12.0 %. cul~ura.. result,ados. Esses embriogênese. glicose>. encont,rados. eficiência foi 3,0. com. aumen~o. o. limi~es. valores a. quan~o. sacarose. ~ambém. alii<1987b). induzida. por. sugerem. 2,4-D. mais. é. que. a. aument,o. da. princípio. a. sensível. ao. concent,ração de açúcar do que quando induzida por NAA. uma vez que LIPPMANN & LIPPMANN (1984) usaram mg/D. e. LAZZERI. (10,0. rng/D.. t,ambém. et. alii. Ent,ret.ant.o.. um. efeito. conta. est.e. açúcar. em. na. LAZZERI. et.. da. somá~ico. freqüência. aspect,o , meio. meio. suplement.ado (1987b). ali i. concentração ~an~o. de. pode-se. suplement.ado. com. que NAA. com NAA. açúcar. na. com sacarose quant,o. com. embri6ides dizer. (1,0. const.at.aram. do. na concent,ração do açúcar levou a. aumen~o. sig-nificat,iva. suplement,ado com 2,4-D. usaram. import,ant,e. diferenciação do embrião glicose. um. (1987b). meio. normais.. a. uma redução. Levando-se. concent,ração. foi. de. 1.5%. de. em. 6t,ima. de. g-licose. ou. sacarose. A exercer et,. alii. sendo. um. e:lei~o. (1986) 6%. em. concent.ração int,erat.ivo. encont.raram meio. a. de com. auxina a. concent.ração. concent.ração. suplement.ado. ut.ilizada. com. 6t.ima. uma. no de. de. meio. parece. açúcar.. RANCH. sacarose. concent.ração. como. maior. de.

(27) 12 No caso de. embriogênicas em suspensão ~. cult.uras. concent.rações de sacarose ut.ilizadas. foram sempre maiores. as 2~O. que. % (veja Tabela 1). Nos t.rabalhos mais recent.es t.em se suplement.ado. o. meio. cult.ura. de. 6~O. com. %. de. sacarose. (KERNS. et.. alii,. 1986;. carbono. mais. FlNER :& NAGASAWA, 1988). Apesar ut.ilizada. nos. evidências maiores. sacarose. t.rabalhos. :foram. (RANCH. de. et.. ser. a. font.e. most.rando. que. malt.ose. embrio~ênese. que. a. alii,. 1986).. Já. ali i. LAZZERI. at.. disso,. acordo. com. não. exist.e. um. de. :fru1..ose,. glicose. os. I·esult.ados. efeit.o. aÇúcar. na. observou. se. não. (sacarose,. De. t.ipo. X. soja,. ~licose. ou. ali!. dão. mesmo. (1987b). empra~ado,. a. não. ou seja,. ~licose.. (1986). ~enót.ipo. em. ou. sacarose. observaram diferenças quant.o ao t.ipo de açúcar sacarose ou. de. somát.ica. embriogênese. de. obt.idas. :freqüências. frut.ose. da. ou. ~en6t.ipo. do. freqüência. qualquer. obt.idos. de do. efe11..o. malLose). na. por. ou. da. RANCH. ir.t.eração. embriogênese. 1..ipo. qualidade. de. ou. et.. Além açúcar. morfologia. ext.erna dos embrióides produz;idos.. 2.2.5. Tipo e. o ut.ilizadas de. são. concent.ração de auxina. t.ipo. de. cert.ament..e. auxina os. bem. fat..ores. embriogênese somát.ica em soja.. mais. Ist.o. em seguida, por se t..rat.ar de um fa1..or clara,. t.ant..o. a. freqüência de. como. respos1..a. se. as. concent..rações. import..ant.es. na. indução. jusi...ifica, como se. que alt.era, de forma quant.o. a. morfologia. verá muit.o. ext.erna. dos embrióides. Em. t..rabalho. pioneiro. com. embriogênese. somát.ica. no. gênero Glycine • BEVERSDORF & BINGHAM (1977) usaram combinações de.

(28) 13. Tabela 1. Composiijào dos diversos meios de cultura utilizados para a Referência. Meio bÃsico. BEVERSDORF & BINGHAN,1977. MILLER. GAMBQRG et alii,1983. CHRISTIANSON et alii,1983 LIPPMANN & LIPPMAN,''l J 198'1. (U. 2. + K <0,5) + 2% sacarose. 2,4-D (0,5). SL. CU. picloram {0,5} + 2% sacarose. f1S. CU. 2,4-D (5,0) + 2% sacarose. CHENG (U. IBA (0,005). L2. 2,4-D (1,1) + 1% sacarose. (5). LI et alii,1985. MS. {Si. (S). 2,4-D (5,0) ou NAA (10,0), + 3% sacarose 2,4-D (O,Sl + 2% sacarose. MS CU. IAA (0,01). + BA (0,2). + 2% sacarose. + 3% sacarose. MS. (5). 2,4-D (5,0). BARWALE et alii,1986. MS. {Si. NAA (8,0) + tiamina {l,69í. GHAZI et alii,1986 RANCH et alii,1986. LS. (5). 2,4-D. MS. (Si. 2,4-D (5,ú - 20,O) +. KERN5 et alii,1986. L2/B5. HAMMAT. t DAVEY, 1987. +. sacarose + 20 mM citrato NH.... + 2};. + BA (0,2). :3. MS/BS. ~~CH. de embriogênese somÃtica em soja.. 'i. LAZZERI et alii,1985. et alii,1985. 1. indu~o. (10,0). + ABA. +. ae.. + 2% sacarose. (0,264) 3~:. nícotinico (3,69) + 21. saco. sacarose. (U. B5. (5). lBA (0,1) + 10% água coco + 2% sacarose. LAZZERI et alii,1987a e b. MS/B5. (S). NAA (9,3 - 18,6) + 1,5% sacarose. KOMATSUDA &OHVAMA,1988. NS/B5. (5). 2,4-D (2,0) ou NAA. FlNER &NAGASAWA,1988. MS/B5 (U. 2,4-D (5,(1) + L-glutamina (2,19). PARROT et alii,1988. MS/B5. NAA 110,0) + 1,5% sacarose, por 15 dias. OBENDORF to SLAWINSKA,1988. MS. (S). (S). (10,0). :. 3. : :. !5. :. sacarose. + 6% sacarose. NAA (8,0) + 3% saco + L-glutamina (9,13) , ou 2,4-D (50,0) + 6Y,. 5(solido) e LOiquido) mg!l i tro macro e micro elementos do meio MS e vitaminas do meio B5 os dois meios foram usados em sequêncía os demais trabalhos usaram um periodo mínimo de 30 dias de. e : em 4. 3};. 5. mal tose + L-glutamina (9,13). 1. +. il1du~ào.

(29) 14 (O~O;. 2,4-D. cult..ura. 0,3;. de. obt..ido. 0,7. células. qualquer. reg'ulador. e. 1,0. em. g'rau. veg'et..al. (merist..emóides). de. IAA Na. (0,0;. a. 0,5. ausência. di1'erenciação 1'ormação. t..odas. os. e. suspensão.. ocorreu em. Esporadicament..e. mg/D. de. merist..emóides. se. rng/D. em. 2,4-D. não. 1'oi. Na. cent..ros. presença. do. merist..emát..icos. de. combinações. as. de. celular.. 1,0. e. t..est..adas.. IAA. diferenciaram. em. est..ru1..uras. embriog'ênicas, em meio suplement..ado com 1,0 rng'/l de 2,4-D. CHRISTIANSON vez. a. t..ot..ipo1..ência. da. e1... soja,. alii. via. e1... most..raram. embriog'ênese. de células em suspensão, usando 5,0 GAMBORG. (1983). ~/l. somá1..ica,. primeira. em. cul1..ura. de 2,4-D.. (1983). alii. pela. embriogênese. obt..iveram. somá 1..ica, em cult.ura de células em suspensão, suplement..ando o com. 0,2. f.lM. de. concent.rações perfeit.ament..e mesmas. plcloram. que. o. Verificou-se. variaram. picloram.. concent.rações. de. 0.11. o. 0,44. à. Ent..ret.ant.o,. que. t.ambém. NAA,. 2,4-D,não. IAA. que. o. 2,4-D. rng'/l ou. à. em. subst..i t.uia. IBA,. levaram. meio. usados. nas. formação. de. embrióides. LIPPMANN de várias auxinas a. formação. soja.. LIPPMANN. t.ecidos. adequadas.. embrióides. A. foi. embriogênicos t.ant.o. concent..ração de. (1984). 1.1. mg/l,. em o. ó1..ima muit.o. concent.ração de 0,55 rng-/l proporcionou o quant.idade foi. de. t..ecido. suplemen1..ado. IAA, t.ambém foi. com. avaliaram. concent.rações de O -. Os aut.ores concluíram que. auxinas de. de. (nas. &. 20,0 f.lM). a. em induzirem. cot.ilédones 2,4-D quant..o. de. habilidade. ima1..uros o. 2,4-D. para. embora. est.a. MCPA a. auxina. na. apareciment..o de uma maior. embriog-ênico.. Quando. out..ras. como. IBA,. observada a. eram. formação. po1..encialmen1..e auxinas. de. o. NAA,. o. meio. 2,4,.5-T. formação de t.ecidos embriogênicos. em freqüências expressivamen1..e menores. Para essas. auxinas. não. ou mas se.

(30) 15. a. observou. de. formação. a. embri6ides. dos. t.ecidos. merist.ernát.icos pot.encialment.e embriogênicos. Por out.ro lado, LAZZERI et. alii alii. (1987a) relat.aram pela. primeira. vez. a. (1985) e. indução. LAZZERI. de. et.. embriogênese. \. com o 5,0. uso. de. rng/D. NAA,. além. permit.e. do. 2,4-D.. obt.er. Segundo. esses. freqüências. alt.as. Ent.ret.ant.o, os embri6ides produzidos t.endem a. Já o. anormais. seja,. com. NAA. produz. desenvolvido. e. f:r'eqtiência de. presença. de. ernbriogênese. e. As. de. NAA.. a. 18,6. cult.u:r-as. mg/l . de. manLidas. em. com. definidos,. subst.ancialmenLe meno:r-. 9,3. ernbrióides. cot.ilédones. gema o. de. concent.rações. meio. com. da. Em. ou. cont.rapart.ida.. embrióides. Ó"Limas. se. normal,. hipocót.ilo-radicula. f"ormação. NAA. 2,4-D. ser morfologicament.e morfologia. apical.. o. embriogênese.. de. eixo. número. Além. aut.ores,. produzidos. encont.:r-adas de. a. f"oram. embrióides. diferenciavam. é. as. t.ambém. em. :r-aizes. Combinações de 5,0. rng/D. most.raram. 2,4-Dnão. exerce. enquant.o. que. NAA. que,. nenhum. nas. duas. efeit.o. combinações. de. (4,7 mg/D. na. NAA. com. 2A-D. concent.rações eficiência. com. alt.a. (0,05;. 0,.5. menores,. e o. embriogênese,. de. concenLração. de. 2,4-D. (5,0 rng/D dão result.ados iguais aos. obt.idos quando se usa soment.e. o. O. 2,4-D. nest.a. dominant.e. t.ambém. embrióides :r-eduziram relação. ao. mesma. concent.ração.. no. que. concent.rações a. freqüência. de. se. refere. t.ão. baixas. 2,4-D. embrióides. cont.role. à. parece. se:r-. morfologia. quant.o normais. 0,05. (LAZZERI. auxina. ext-erna rng/l. em. a. de. quase et.. ali!,. dos 2A-D. 40%. em. 1987a).. Esse efeit.o dominant.e do 2,4-D foi observado t.ambém em combinações com out.ros reguladores veget.ais ( RANCH et. ali i , 1986). Result.ados. semelhant.es. foram. obt.idos. com.

(31) 16. experiment.os NAA. em. as. :. foi. dias. 29. prolongadas. em. freqüência. (9)3. de. 1. em. meio. de. mg/l. expost.o por. por. ent.re. freqüências. 2A-D. sem. explant.e. t.ransferênc1a. maiores. meio. segtl1do. de. meio. rng/l. 2~4-D. cont.endo. normais. ou. 5~0. NAA.. reduziram. morfologicarnent.e. foram. dias». cont.endo. 9 ~3. com. com 2A-D. cult.ura. 30. por. NAA. dia em. embrióides. de. embrióides. de. meio. meios. e. oht.idas. quando. o. rng/l de. 2A-D. Exposições. mais. senslvelrnent.e. normais. a et.. (LAZZERI. alii, 1987a). et.. BARWALE. freqüências. de. embriogênese. viabilidade. baixa. dos. concent.rações. maiores. menor. de. vez,. a. nÚJne:r'o. alii. de. 2,4-D. com. (4,4. embrióides.. de. Os. embrióides. e. aut.ores em. meio. report.aram. mg/D. alt.as. associadas. suplement.ação. A. <10,0. 2,4-D. embrióides.. formação. t.ambém. (1986). m~/D. 14,8. com. produziu. observaram,. pela. suplement.ado. com. à. um. primeira IBA. (8,0. rng/D ou IAA {15,76 rng/D, ainda que em baixas freqéncias. et.. RANCH. diferent.es. reguladores. embriogênese.. ali!. veget.ais. encont.raram. est.udando. (1986). freqüência. na. result.ados. o de. discordant.es. efeit.o. de. indução. de. dos. expost.os. ant.eriorment.e. Os aut.ores não obt.iveram embriogênese e nem mesmo a formação (22,6. de calos em meio de cult.ura suplement.ado com IBA. ou. ,uM),. 45,2. apesar. dos. explant.es. (cot.ilédones). ou NAA t.erem. apresent.ado algum cresciment.o durant.e o período de cult.ura. Out.ro pela. primeira. superiores marcant.e sendo. 10,0. a da e. concent.ração. vez 5,0. aspect.o. avaliou-se mg/l. {5,O. concent.ração 20,0 do. int.eressant.e. rng/l 2,4-D. à. de. as. o. efeit.o 40,0. 2,4-D. melhores. t.ambém. do· 2,4-D. mg/D. na. dest.e. t.rabalho em. de. concent.rações.. possibilit.ou. uma. que. concent.rações. Observou-se. freqüência. é. um. efeit.o. embriogênese. O. aument.o melhora. na na.

(32) 17 mor:folo~ia. externa dos embri6ides. Foi. relat,ado. primeira vez, que o i~uais. :freqüências embri6ides. com. embrio~ênicos. em. eram. loram. picloram, menor. A. embri6ides. loram. A. sem. embriogênese. a. de. de. e. 2,4-D. t,ecidos. formados. nest,as. independent,ement,e. dois. para. com. auxinas. que. t.a.nt.o. a. embrióides. a. a. dois,. obt.enção. externa. morlologia. a. dos. veget.ais. elet,iva. aumeI"lt,ou. normalidade. Cult,uras. empre~ada.. reg-uladores. IBA). os. produziram. embri6ides. em. disso. superiores.. p-CPA. pela. embrio~énese. Além. anormais,. compromet.er. (NAA. quant,o. ou. da concent.ração. combinação. inefet.ivas. 2,4-D.. Os. veget,al. combinação. embrio~ênese ,. o. t,ambém. 1986),. morlolo~icament,e. lreqüência.. result,ou num abaixament.o de. com. dicamba,. re~ulador. ali i ,. obt,enção de. morfolo~icament,e. t,odos. da concent.ração de. et.. permit,e a. obt,idas. às. produzidos. suplement,adas. condições. 2,4,õ-T. (RANCH. dos. isoladament.e lreqtiêI"lcia. (RANCH. et,. de alii,. 1986).. GHAZI. et.. ali i. (1986). t.ambém. se. ut,ilizaram. concent.rações de 2,4-D (10,0 rng-/D para indução de O obt.enção. de. eleit.o. do. embrio~ênese. t.ipo. e. da. em cult.u:r:-a. células. recent.ement.e avaliado por FlNER & NAGASAWA em. baixas. concent.rações (2,4-D;. t.est.adas. embriog-ênese. mat.uração explant.e 2,4 ,õ-T dicamba. (0,5. da não. condições. embriÓides. cult.ura. houve. promoveram. 1,0. Na. sÓ. concent.ração. qualquer. de. cresciment.o. embriogênese. soment.e. o. no. das em. loi. das. auxinas promoveu. cresciment.o. t.ecido. 2õ,0. na. Observou-se que. dicamba). ocorreu. auxina. suspensão,. nenhuma. e. pré-exist.ent.es. de. em. (1988).. m~/D. picloram. Nessas. de. e. alt.as. embrio~ênese.. concent.ração. de. de. ~/l. cult.uras.. usado de. e. como. 2,4-D. ou. Picloram. e. concent.rações. muit.o.

(33) 18 alt.as. {50~O. mg/D. e. de. 5 ..0. concent.:r-ação. ainda. assim foi. rng/l. baixa. em a. eficiência.. auxina. que. 2~4-D. O. mais. na. p:r-omoveu. a. manut.enção das condições emb:r-iogênicas.. 2.2.6. Presença de cit.ocininas A p:r-ocesso. de. influência. embriogênese. invest.igada. em. dive:r-sos. de. em. suspensão. 1988). quant.o. células. NAGASAWA, (LIPPMANN. da. LIPPMANN,. &:. suplement.ação. somát.ica. t.rabalhos,. em. em. cult.u:r-a. 1984;. GHAZI. soja. t.ant.o. (SEVERSDORF. em. ci t.ocininas. t.ambém. condições. SINGHAM,. &: de. et.. com. t.ecidos. ali i ,. de. 1977; em. 1986;. t.em. no sido. cult.u:r-a FlNER. meio. LAZZERI. &:. sólido et.. alii,. 1987a; KOMATSUDA &: ORYAMA, 1988). SEVERSDORF da. cinet.ina. aument.o. t.er. na. inibido. propo:r-ção. emb:r-ióides, quando. o. BINGRAM. &:. a. (1977). :fo:r-mação. desses. meio foi. de. t.ecidos. :r-elat.a:r-am. que. houve. um. di:fe:r-enciaram. em. mer·ist.em6ides. que. se. com 0,5 rng/l. suplement.ado. apesar. de. 2,.4-D. e. 0,1 mg/l de cinet.ina. Um. &:. LIPPMANN. zeat.ina, 2A-D.. e. Os. (1984). avaliados. aut.ores. conclui:r-am. (me:r-ist.em6ides. ). observação de. embriog-ênico, embri6ides. Fo:r-am (0,5. não. :formação. mais det.alhado. cinet.ina. sensi velment.e. uma. est.udo. s6. mas mais. em a. de. em uma. adicionou. de. de. de. BA,. inibia. embriogênicos. embri6ides.. à. rng/D. adição. t.ecidos. superioridade (0.1. LIPPMANN. cit.ocininas. result.ados,. relação. BA. da. po:r-. cont.endo. adição. f'o:r-mação dos. conduzido. efeit.os. meio. :for-mação. cuidadosa. evidencia se. a. ). que. t.ambém a. embrióides. quando. 1,0 ,uM. à. os. foi. Ent.:r-et. ant. o ,. expressando-se. formação na ao. de. t.ecido. :formação meio. de. a. de. cult.ur-a,. muit.o embora est.e aspect.o não t.enha sido observado pelos aut.ores..

(34) 19. GHAZI embrióides. ern. e1... rneio. de. ali!. (1986). indução. não. obt.!veram. suplemen1..ado. corn. :formação (O~5. BA. de. ou. 5,,0. mg/l) e 2,.4-D em diversas concent.rações.. LAZZERI et. alii embriogênese soment.e a não. somát.ica. em. processo,. enquant.o. reduziu signi:ficat.ivament.e a calo. t..ipo. :friável.. avaliada,. impedindo. assirn. imat.uros. no. que. caso o. a. de. NAA.. indução. soja. mg/l. aument..ou a. conclusão. mg/D de. BA. produção de. normais. sohre. de. requer. (O~099. BA. 0~052. embrióides. qualquer. a. de. adição de. embriogênese e. :freQÜência. A. concluíram que. cot.ilédones. uma auxina.. presença de. met.ou o. (1987a). não. um. :foi. possível. efeit..o do BA na di:ferenciação dos embrióides. out..ro. Por est..udando o mg/l. de. e:feit..o. NAA,. :formação. de. embrióides.. adição. da. observaram calo. t..ipo. de. que. BA. os. ern. mg/l. 0,1. compact.o ,. Ent..ret..ant..o,. eram mor:fologicament.e. KOMATSUDA. lado,. meio de. ern. aos. suplement.ado induzia. det..riment..o. embrióides. superiores. BA. OHYAMA. &. com 10,0. uma. vigorosa. :formação. da. :formados. (1988),. nessas. de. condições. embrióides :formados. em. meio. cont.endo soment..e NAA. O. 2ip). na. avaliado. e:feit..o. proli:feração por. FlNER. da. de &. adição. cult.uras. rápido. cresciment..o. de. cit..ocininas. embriogênicas (1988).. NAGASAWA. rnost..rou algum efeit..o est..imulat..ório pelo. de. que. (BA,.. em. Sornent.e. cinet.ina,. suspensão. BA. a. rnuit..as vezes :foi. t..ecidos. não. 0,1. ou :foi. ~/l. mascarado. embriogênicos,. uma. caract..erist..ica comum aos meios de cult..ura cont..endo cit..ocinina. Embora cit.ocininas se. no. ut..ilizaram. sern. processo de. de. meios. obt..enção de embrióides e. o. obje1..ivo. de. embriogênese de. cult.ura. invest..igar somáLlca,. cont..en-. plânt..ulas de soja a. o. e:feit..o. out..ros. de. aut.ores. cit.ocininas. para. p . .pt.ir de cult..uras de.

(35) 20. células. em. suspensão. 1983; LI et. ali i. >. em soja. embrióides, e. est.udo. embriogênese. 1983;. cit.ocininas parecem assim. CHRISTIANSON. alii,. et.. que. est.e. ült.imo. efeit.o. de. maiores. est.udos.. Além. que. t.enha. invest.igado. o. induzida. afet.ar. a. embriogênese. na freqüência quant.o na diferenciação. t.ant.o. sendo. necessit.ando. nenhum. ali i ,. et.. 1985). As. somát.ica. <GAMBORG. sob. I. parece disso,. menos. não. efeit.o. de. mg/D. alt.as. est.ar. dos. claro. exist.e. ainda. cit.ocininas. em. concent.rações. de. 2,4-D.. 2.2.7. Presença de ácido abscísico (1984) most.rou em sua pesquisa que. ACKERSON. exerce ,ou. um papel. seja,. inibiu. na. embriog-ênese. quant.o. embrião. :fundament.al. est.imulou. zigót.ico,. encont.rava.. na. zig-ót.ica.. o. do. Est.e. reg-ulador e. o. est.ádio. ABA. in. veg-et.al. vivo t.ant.o. desenvolviment.o. em. est.imularam. result.ados. embriog-ênese. da. cresciment.o. dependendo. Tais. regulação. o. que. o. do. mesmo. se. invest.igação. a. de. possíveis ef'eit.os do ABA na embriogênese somát.ica. GHAZI. ali i. et.. relat.aram. (1986). que. quando. 0,264. mg'/l de ABA :foi usada em combinação com 10,0 mg/l de 2..4-D no meio de. indução,. ocorreu. embriog'ênicos cont.endo. e. a. o. apareciment.o. formação. exclusivament.e. o. de. 2,4-D,. e. desenvolviment.o. embrióides muit.o. t.a!. embora. de. como. os. calos. em. meio. aut.ores. não. apresent.aram dados quant.it.at.ivos. A cont.endo alt.erou. adição. menores. a. Ent.ret.ant.o,. ABA. concent.rações. e:ficiência 1,0. de. rng-/l. do de. <0,1 de. 2,4-D. processo ABA. mg'/D. reduziu. em. (5,0. (LAZZERI. meio mg'/D et.. de. indução. t.ambém alii,. significat.ivament.e. não. 1987a).. t.ant.o. a.

(36) 21 e:ficiéncia. quant.o. a. freQÜência (4~5. meio de indução t.inha NAA foi. suficient.e. processo.. para. Nest.e. de. caso. normais.. auxina~. mg/I) como. reduzir. últ.imo. embrióides. 0~1. a. drast.icament.e. não. foram. o. mg/l de ABA. eficiência. apresent.ados. possíveis efeit.os na morfologia ext.erna dos. Quando. dados. embri6ides. do. sobre. (LAZZERI. et.. alii, 1987a).. 2.2.8. Font.e de nit.rogênio CHRISTIANSON subst.it.uição cit.rat.o de. de. das. font.es. amônia>. cult.uras. foi. et.. de um. (1983). ali i. nit.rogênio fa1..or. embriogênicas de. do. meio. essencial. calos. e. concluiram MS. para. por. o. que. a. fiM. de. 20. es1..abeleciment.o. pos1..eriormen1..e. de. células. em. suspensão, Por ou1..ro lado, FII\TER & NAGASA WA um. efeit.o. 1..óxico. embriogênica processo. result.ados. de. Segundo. do. células os. em. de. a. seria. est.abeleciment.o. mM). inibindo. uma. adap1..ação. cult.ura. usado. gradual ao. calos. o. esses. para. sist.ema. no. das cult.uras de. em. complet.ament.e. possivel- explicação que,. (1983) houve. (20. amônio. suspensão,. aut.ores,. discordant.es. CHRISTIANSON et. ali! durant.e o. ci1..rat.o. (1988) encont.ra:r·am. por. cit.ra1..o. embriogênicos,. uma. vez que ocultA vo de calos em meio sólido 1..em um cresciment.o mais lent.o e um con1..ato menor do meio com o 1..ecido. FINER diferenças. ent.re. as. &. NAGASA VIA. font.es. de. (1988). nit.rogênio. 1..ambém do. meio. não MS. encont.z-aram e. B5. assim. como a subs1..it.uição dest.as por 10 mt-1 NH NO + 30 mM KNO. 4 3 3. 2.2.9. Vit.aminas e aminoácidos BARVlALE et. alii. (1986) est.udaram o. efeit.o da adição.

(37) 22 de quant.idades extras de vit.aminas ao meio (8~0. com NAA. ~/D. 1>4. à. (OA. ~/D.. básico MS. Os aut.ores verificaI"'am que a. aument.ou. a. freqüência. de. suplement.ado. adição de t.iamina. embrio(!;ênese. em. pelo. menos 20 %. O ácido nicot.1nico most.rou um efeit.o favorável soment.e na. concent.ração. de. ~/l.. 4,.0. Piridoxina. alt.e~ou. não. a. freqüência. de embriog-ênese. ARMSTRONG & GREEN (1985) report.aram que a adição de prolina ao meio de cult.ura aument.ou a embriog-ênicos despert.ru:'. o. em. milho. int.eresse. e. no. produção de calos friáveis e. cenoura.. uso de. Esses. prolina. e. result.ados. out.ros. sist.emas de indução de embrio{!:;énese somát.ica. No relat.ado t.ant.o. na. (BARWALE. que. a. adição. formação ali i ,. et.. de. de. embr'i6ides. 1986),.. não. prolina. quant.o. em. no. aminoácidos. em. caso da soja, foi. produziu. meio. fizeram. qualquer. cont.endo. cresciment.o. de. eí'eit.o. 4.0. mg-/l. NAA. calos. em. meio. í'izeram. pela. cont.endo 0,5 mg-/l de 2,4-D (GHAZI et. alii, 1986). Foram. FlNER. NAGASAWA. &. (1988). primeira vez um est.udo mais det.alhado sobre o aminoácidos. no. suspensão. influência (4,45 o. m'!;/D. que. embriog-ênese.. e. efeit.o da adição. de. cresciment.o de cult.uras embrio(!;ênicas de células em. Verificou-se na. quem. asparag-ina. cresciment.o. das. os. Glut.amina. (0,66. cult.uras.. aminoácidos. A. rng-/D. {0,73. exerceram e. 1,46~/D. aument.aram. suplement.ação. uma. g-rande alanina. sig-nincat.ivament.e. com. prolina. (1.73. à. 34,54m'!;/D, mais uma vez, não í'avoreceu a emb:r:-io'!;énese.. 2.2.10. Temperat.Ul"a O eí'eit.o da t.emperat.ura na. indUção de. somát.ica. em. Temperat.ura. soja de. 33. foi D. C. invest.ig-ado. inibiu. por. complet.ament.e. RANCH o. embrio{!:;ênese. et.. processo.. ali! Por. (1986). out.ro.

(38) 23. não. lado,. diferença. observou. se. t.emperat.uras de 20 e. ent.re. signi:Hcat.iva. as. 28·0.. 2.2.11..• Luz Embrlogênese somát.ica em soja t.em sido obt.ida t.ant.o em condições de ausência. alt.a. complet.a. e:Hciência alii,.1986;. do. ou. de. luz.. de. ent.re t.rat.ament.os. LAZZERI. qualidade. int..ensidade maior. (~. 10 f-lE. luminosa.. :freqüência. A. m. -1. com .S. -1. de. t.rat.ament.os. CRANCH. et... (1986). ali i. que. na. que. reduzida. que. a. não. envolviam diferent.es luminosa. que. :freqüência que em a1t.a. calos. como. verificou-se. observaram. quant..o. ). assim. int.ensidade. maior. formação. nos. e. aliiC1987b). et.. "Grolux" induziu embríogênese t.ant..o em baixa. caso,. RANCH. 1987b).. ali i ,. fot.operiodo,. lado,. últ.imo. luminosa,. sensivelment.e. foi. et.. encont.raram diferenças. out.ro. Nesse. processo. LAZZERI. condições. baixa int.ensidade. e/ou. luz luz. (::::; 85 raizes. envolviam. Por t.ipo. branca, m. -1. .s. -1. ocorreu. alt.a. ). em. int.ensidade. luminosa.. 2.2.12. pH LAZZERI est.udo. exist.ent.e. embriogênese. não. sobre. somát.ica. variação do 7,0. et... pH. alt.erou. o. soja. ant.es. eficiência. de embrióides normais. (1987b). e:feit.o. em. Cajust.ado a. ali!. do. do Os. de. conduzir-am pH. meio. aut.ores. o. de. o. meio). Ent..ret.ant..o,. aument..o. do. pH,. o. único. cult.ura. observaram. aut.oclavar. processo.. diminuiu com. do. t..ambém. que. ent.re a. na uma. 5,0. e. freqüência. sendo que. pH. ent.re 5,0 e. 5,5 deram os melhores result.ados. Foi observado t.ambém. que. de. o. cult.ura.. uso Meio. t.ampão. t.amponado. MES em. (10 pH. mM). 5,5. não. afet.ou. forneceu. os. a. viabilidade. maiores. valores. da de.

(39) 24 eficiência.. mat.uraç~o. 2.3. Fat.ores que influenciam a Também processo. de. foi. observado. embriog-ênese. em. somát.ica,. dos embri6ides soja. os. que,. embrióides. durant.e passam. o por. est.ág-ios de desenvolviment.o morfolog-icament.e muit.o semelhant.es aos encont.rados. na. alii,. RANCH. 1986;. formação et.. do. embrião. alii,. 1986;. final. um embrião. mat..uro. hipocót..ilo-radí cuia, embrião. g-lobuIar. normal. cot..ilédones em. ~ema. embrião. A. est.ádio em. conversão. denominada. é. et.. primeiro. diferenciado. apical.. maduro. O. g-lobular. No. apresent..a-se. e. (BARWALE. 1988).. GOLDBERG,. est.ág-io de desenvolviment..o reconhecível é o. vivo. in. zig-ót..ico. de. eixo. de. um. mat..uração. (RANCH et. alii, 1985; AMMIRATO, 1987). maioria. A. reg-eneração t..rat..ou. a. de. fase. Frequent.ement.e caso. ela. se. (LIPPMANN. et.. chegam. a. empregados. ela. ou. pag-.26).. iniciou. no. 1984;. ainda. mais. GHAZI. empregar. o. ali i ,. que. o. IBA. t.ermo. mais. em. ei... comument.e, 1983;. 1986),. disi..ini..a. meio. freqüent.e. no. se LI. alii,. compost.os. concent..rações, o. uso. de. BA. no. et.. meio. 1985;. de. uma. (veja. &. de. BARWALE. aut..ores. uma e. meio. (KOMATSUDA. meios. por. Nesse. LAZZERI. Normalment.e,est.es Os. não. nest..e. complet..ou et.. a. processo.. indução.. 1985;. especifico. "mat..uração". baixas. de. alii,. num meio. ali!,. somát..ica,. complet..ament..e. LAZZERI. g-eralment..e. são. sendo. ei... et.. fase. próprio. para. publicados. embriog-ênese. uma. quase. (CHRISTIANSON. preferencialment.e cit..ocininas,. se. via. como. b), ou se complet..ou. 1986;. alii,. soja,. mat..uração. LIPPMANN.. 1988),. germinação. de. de. processou. &. alii, 1987a e OHYAMA,. plant.as. proi..ocolos. dos. nem. cult.ura auxina, ou. mais. Tabela. 2..

(40) 25 Porém, separada para. da. a. CRANCH. fase. de. mat.uração et.. alii,. em. out.ros. indução,. dos. 1985;. casos sendo. embrióides. RANCH. et.. a. fase. de. propost.os. a. part.ir. alii,. 1986;. mat.uração. meios. do. especificos. est.ádio. 8:. HAMMAT. foi. g-lobular. DAVEY,. 1987;. I. BUCHHEIM et. alii, 1988; OBENDORF & SLAWINSKA, 1988). RANCH meio. exclusivo. meio. B5. para. &. para. (1985). por. IBA. est.e. Ent.ret..ant.o.. rarament.e. foi. meio, houve. acompanhada. uma do. ou. e:feit.o. com. a. adição. est.imulat.ório. de. do. acrescido. de. uma. Est.e. embriões no. est.ámo. formação. const.it.u1do mesmo. ABA,. (0,264. serem. g-lobular, de. g-ema. da. semelhança. à. foi. somát.icos. precoce. rng-/D,. meio. in vitro. ocorreu. raiz. s6. Esse. do IBA. (1,22. sug-erindo do. que. a. apical.. aument..o da concent..ração. ABA. do. zig-ót.icos. embriões. apareciment.o. mat.uração do embrião zig-ót.ico in meio. de. os. ainda. embrióides,. m~/D.. (0,122. Após. pI-oblema foi cont.ornado com o mg-/D. dos. mat.uração. 1984).. mat.uração.. empreg-aram pela primeira vez um. mat.uração. para a. RUSSELL,. t.rans:feridos. alii. a. suplement.ado. usado com sucesso (TILTON. et.. que. assim. um. ocorre. na. vivo CACKERSON, 1984). Est..e mesmo. suplement.ação. com. g-lut.amina. (9,13. rng-/D. :foi. ut.ilizado por OBENDORF 8: SLA VINSKA (1988). Post.eriorment.e. mat.uração 2A-D. de. embrióides. const.it.uido. at.ivado, 1986).. sem. Est.e. do. qualquer. mesmo. meio. foi. propost.o. produzidos. MS,. meio. sob. 10,0%. suplement.ação vem. sendo. um. alt.as. para. concent.rações. e. sacarose hormonal. empreg-ado. meio. 0,5%. de. CRANCH em. a de. carvão. et.. ali i,. t.rabalhos· mais. recent.es CBUCHHEIM et. alii, 1988). Est.a propost.a vem. sendo. induzida. adot.ada. por. t.ambém. concent.rações. de. para. suprimir casos. menores. de. a. em. suplement.ação que. 2A-D. a ou. hormonal. embriog-ênese mesmo. com. :foi NAA.

(41) 26. Tabela 2. Composiij~o dos diversos meios de cultura propostos para a matura~~o e/ou germina~o de embrioes somáticos de soja. ReféTencia. Meio básico. ---------------,. 1. Suplementa.ão. BARWALE et alii,19B6. SHAZI et alii,1986. MS (5) LS (S). RANCH et alii,19B6. MS. LIPPMANN &LIPPMANN,1984 LAZZERI et alii,19B5. LI et ali i, 1985. RANCH et alii,1985. M/ G. '8 8. M/ G M. 8 M/ 8. OU. HArU1AT &DAVEY,1987. <5. ou U. tiS ou B5 (Sl. 5. 5'5 (S) 1/2 B5 (S). LAZZERI et alií,1987a e b MS/B5. (S). IBA (1,99) + BA(1,13xl0 } + 6Aa íl,73) + 3% saco GA a (O,104) ou ZíO,llO) + 2% sacarose 0,5% carv~o + 10~ sacarose L-prolína (5,Bl + 3% sacarose IBA (0,1) + 2% sacarose 1,5% saco -$. &OHYAMA,1988. FINER &NAGA5AWA,19B8 PARROT et OBENI>ORF. alli~19B8. ~1S/B5. E. 5. 1. :. S(Sólido) e l(líquido). li!. :. ID9/l. 3. :. 5. :. (5). MS/B5. (5). MS/B5. (5). &5LAWINSKA,1988~ MS(U. BUCHHEIM et alii,19B8. ... :. B5 (5) 95 tU MS/BS (5) MS/B5 (5). 1/2MS (S) MS (S) 5H <S). M/ G M/ 6. M 8. M G. NAA (9 J3>:1O _ ) + BAl K, Z (0,1). + 3% sacarose KO~~T5UIlA. .... ---------------------------------e. IBA (0,005) + BA (0,2) + 2% sacarose + citrato de NH! Z tO,11) + 1% sacarose L2 (Si a NAA (0,15) + BA, K e Z (0,033) + MS/BS, (SI 3Y. sacarose IAA (0,01) + BA (0,2) + 2% sacarose tiS tU IBA(ü,122) + ABA (0,264) + 2% sacarose B515 ou U B5 ou MS (5) IBA (0,122) + GAa (0,10) +~!. sacarose IBA<O,041> + BAW,38) + 3% sacarose tiS (5). CHRISTIANSON et alii,1983 CHENG tU. Finalidade do meio. G. IBA (0,5) + BA <0,2) + 1% sacarose 1% sacarose NAA W,1) + BA (0,001)+ 1% sacarose 3Y. sacarose 3% sacarose 1,5% sacarose 1,5% sacarose IBA W,16) + ABA (2,64) + L-glutamina (9,13) + 3 a 21% saL, gradativam/e 3% sacarose 0,5% carv~o + 10% sacarose 1% sacarose. macro e micro elementos do meio MS e vitaminas do B5 M{matura~o), Gígermina~o), M/G (matura~~o se deu junto ci desseca~~o antes da germina~âo. germina~jo). M. M G. M G M G M G M G.