UNIVERSIDADE FEDERAL DE PELOTAS Faculdade de Odontologia
Programa de Pós-Graduação em Odontologia
Tese
Formulação de um marcador químico para identificação de restaurações dentárias em investigação forense
Mohammed Irfan
Mohammed Irfan
Formulação de um marcador químico para identificação de restaurações dentárias em investigação forense
Tese apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Odontologia da Faculdade De Odontologia da Universidade Federal de Pelotas, como requisito parcial à obtenção, Do Título de Doutor em Odontologia.
Orientadora: Profª. Dra. Adriana Fernandes da Silva Coorientador: Prof. Dr. Evandro Piva
Mohammed Irfan
Formulação de um marcador químico para identificação de restaurações dentárias em investigação forense
Tese aprovada, como requisito parcial, para obtenção do grau de Doutor em Odontologia, Programa de Pós-Graduação em Odontologia, Faculdade de Odontologia, Universidade Federal de Pelotas.
Data de Defesa: 27/09/2017
Banca Examinadora:
Profª. Dra. Adriana Fernandes da Silva (Presidente) Doutor em Odontologia, área de concentração em Dentística pela Universidade Federal de Pelotas. Prof. Dr. Rafael Guerra Lund, Doutor em Odontologia (PPGO), área de concentração em Dentística pela Universidade Federal de Pelotas.
Prof. Dr. Claudio Martin Pereira de Pereira (Externo), Doutor em Química, área de concentração em Química Orgânica pela Universidade Federal de Santa Maria.
Profª. Drª. Clarissa Marques Moreira (Externo) Doutora em Ciências área de concentração em Química Analítica pela Universidade Federal de Santa Maria. Profª. Drª. Cristina Isolan (Externo) Doutora em Odontologia área de concentração em Dentística pela Universidade Federal de Pelotas.
Profª. Drª. Lisia Lorea Valente (Suplente) Doutora em Odontologia área de concentração em Dentística pela Universidade Federal de Pelotas.
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Dedico este trabalho a todos aqueles qυе dе alguma forma estiveram е estão próximos dе mim, fazendo esta vida valer cada vеz mais а pena.
Agradecimentos
A elaboração deste trabalho não teria sido possível sem a colaboração, incentivo e o compromisso de várias pessoas. Gostaria, portanto, de expressar minha gratidão e apreço a todos aqueles que, direta ou indiretamente, contribuíram para tornar isso realidade. Antes de qualquer um, gostaria de agradecer a minha filha Melissa, a coisa mais bonita que eu mantenho dentro do meu coração. Sem o seu carinho e amor, eu não chegaria a essa etapa da minha vida.
Quero agradecer minha orientadora Professora Doutora Adriana
Fernandes da Silva. Sou grato pela liberdade de ação que ela me permitiu, e
que foi decisiva para que este trabalho contribuísse para o meu desenvolvimento pessoal. Pois foi o melhor exponente, me abriu horizontes, me ensinou principalmente a pensar, e foi fundamental na transmissão de experiências, na criação e solidificação do conhecimento em meus pequenos sucessos. A sua disponibilidade irrestrita, a sua forma exigente, crítica e criativa de arguir as ideias apresentadas, facilitaram o alcance dos objetivos propostos nesta tese.
Ao amigo e coorientador Prof. Dr. Evandro Piva, suas sugestões e idéias inovadoras durante o experimento me ajudaram a levar o experimento em direção correta, o que resultou em uma patente industrial. Sem sua ajuda e aconselhos, isso não puderia ser possível, além de ser um dos principais pesquisadores em odontologia, seu bom humor e personalidade feliz sempre se destacou durante minha pesquisa, o que deixou as coisas mais facil de entender.
Agradeço imensamente meu amigo e colega Wellington. O da Rosa quem me ajudou durante todo o experimento, seu conhecimento e experiência me ajudaram na deposição de Patentes e realização da parte experimental no laboratório do CDC-Bio da Universidade Federal de Pelotas, deste modo também agradeço ele pela sua generosidade por me receber na sua casa para discutir e esclarecer minhas dúvidas relacionadas ao experimento. Agradeço a
Tatiana Ramos por sua ajuda no CDC-Bio na preparação de soluções para
Agradeço aos bolsistas de iniciação cientifica que contribuíram fortemente para este trabalho. Em particular ao Tiago Machado da Silva, por toda a ajuda e comprometimento com o experimento que levou a essa tese. Aos colegas Carolina Sampaio, Mariana Joanol, Fernanda Srynczyk que ajudaram em tabulações de dados e auxiliaram durante o experimento.
Agradeço a todos os quatro doutorandos da odontologia Luiz Alexandre
Chisini, Tamara Ripplinger, Ivam Freira da Silva Junior e Andresa Drawanz Harting, que se disponibilizaram para participar no estudo como
examinadores. Ao Carlos Enrique Cuevas Suárez pelas fotografias.
Agradeço a todos os colegas e estudantes de PPGO por toda a parceria, pela amizade e carinho, com quem aprendi muito durante este período. Aos professores do PPGO, e em especial ao Prof. Dr. Rafael Ratto
Moraes e ao Prof.Dr. Maximiliano Cenci que acreditaram em mim, e me
deram essa oportunidade de fazer o doutorado no PPGO-UFPel. Ao Prof. Dr.
Rafael Guerra Lund, pela amizade, e por todo o suporte e apoio durante a
trajetória acadêmica. Ao Professor Alexandre Emidio Ribeiro Silva para o apoio de trabalho de estatistica. Ao Celaniro Junior por toda a sua ajuda atraves de seu trabalho na secretaria do PPGO. Ao Programa de
Pós-Graduação em Odontologia da Universidade Federal de Pelotas, pelo ensino
de qualidade. Ao Centro de Desenvolvimento de Biomateriais (CDC-Bio) da UFPel, ao Banco de Dentes de Universidade do Oeste de Santa Catarina
(UNOESC) e Comitê de Ética em pesquisa da FO-UFPel por possibilitar a
realização deste trabalho. A minha família, especialmente meus pais, pelo apoio incondicional no que foi preciso, me ensinaram sobre o bem e me deram todas as oportunidades para ter sucesso na vida. Aos meus irmãos por todo o apoio e carinho que eles demonstraram, mesmo que pela distância.
Devo meus argadecimentos a uma pessoa muito especial, minha esposa, Francine Mohammed por seu amor, apoio e compreensão contínuos e infalíveis durante o meu doutoramento que permitiu a conclusão da tese. Ela sempre estava por perto nos momentos em que pensei na impossibilidade de continuar. Pois ela me ajudou a manter a perspectiva de seguir com um bom trabalho. Eu valorizo muito o seu contributo, e aprecio profundamente sua
crença em mim. As palavras nunca dirão quão grato eu tenho com ela. Agradeço meus sogros por seu amor e apoio moral.
Agradeça a Deus por me dar força e paciência para trabalhar durante esses quatro anos.
Notas Preliminares
A presente Tese foi redigida segundo o Manual de Normas para Dissertações, Teses e Trabalhos Científicos da Universidade Federal de Pelotas de 2013, adotando o Nível de Descrição 4 - estrutura em capítulos não convencionais, descrita no Apêndice D do referido manual. http://sisbi.ufpel.edu.br/?p=documentos&i=7, Acesso em: 27/07/2017.
O projeto de pesquisa contido nesta Tese é apresentado em sua forma final após qualificação realizada em dia 30 de Maio de 2014 e aprovado pela Banca Examinadora composta pelos Profª. Drª. Adriana Fernandes da Silva (Presidente), Prof.Dr.Rodrigo Varella de Carvalho, Profª. Drª. Francine Madruga Cardoso.
Resumo
IRFAN, Mohammed. Formulação de um marcador químico para
identificação de restaurações dentárias em investigação forense. 2017.
63f. Tese (Doutorado em Dentistica) - Programa de Pós-Graduacão em Odontologia, Faculdade de Odontologia, Universidade Federal de Pelotas, Pelotas 2017.
O método de identificação dental por meio de analise das superfícies restauradas é frequentemente utilizado para a identificação de vítimas envolvidas em desastres em massa, acidentes e investigações criminais. Contudo, a utilização desse método é dificultada pela melhoria da similaridade dos materiais restauradores com as estruturas dentárias. O objetivo deste estudo foi desenvolver um produto para facilitar a identificação dental quando da obtenção do odontograma em investigações forenses, através de uma patente, bem como analisar o desempenho deste quanto a validação de um método de diagnóstico. O produto foi desenvolvido para pigmentar, irreversivelmente apenas as estruturas dentais. Assim, restaurações de resina, ionoméricas ou protéticas não são corados onde foram analisados quanto a melhor concentração, teste de envelhecimento para analise de cor e pH do produto. Após diferentes concentrações obteve-se um pulverizador contendo o produto de pronto uso em investigação forense. Quanto ao teste de validação, após obtenção de 42 dentes humanos preparados e dispostos em 3 mandíbulas artificias, três (3) avaliadores calibrados analisaram 3 possíveis métodos de diagnóstico. Grupo I: Padrão ouro empregando a luz ultravioleta (UV) para identificação e Grupos experimentais II e III, ambos contendo o produto pulverizado, sendo que no último existiu também a UV para em concomitante com o corante. Os dados foram tabulados e submetidos à análise estatística, considerando poder de 80% e nível de significância de 5%. Para comparar os desfechos no Período pós -intervenção, de acordo com os grupos de identificações, foi utilizado o teste de especificidade, sensibilidade, valor preditivo positivo (PPV) e valores preditivos negativos (NPV). A comparação das prevalências dos desfechos entre os grupos de tratamento foi realizada através do teste de qui -quadrado de heterogeneidade . As análises foram realizadas no software STATA 15. Os resultados demonstraram que o Grupo experimental III apresentou resultados positivos para a sensibilidade e sensitividade da técnica com alta confiança do examinador no uso da técnica em curto período de identificação dentaria.
Palavras-chave: Odontologia Forense, Antropologia Forense, Antraquinonas,
Abstract
IRFAN, Mohammed. Formulating a chemical marker for identification of
aesthetic dental restorations in forensic investigation: 2017. 63P.Thesis
(Doctorate in Dentistry) Post Graduate Program in Dentistry, Faculty of Dentistry, Federal University of Pelotas, Pelotas 2017.
The dental identification method by comparing the restored surfaces is often used for the identification of victims involved in mass disasters, Air accidents and in criminal investigations, especially when the remains are compromised. However, the use of this method has become difficult by the improvements in fabrication of resin restorations; they resemble similarities with dental structures. The objective of this study was to develop a product to facilitate dental identification while obtaining the dental chart during forensic investigations, apart from analyzing the performance of this product as the validated diagnostic method a patent has also been deposited demonstrating the ownership of the discovery. The product was developed to irreversibly stain the dental structures only. Thus, restorations of resin, ionomer or prosthodontic appliances are not stained when they are analyzed with best colour concentration and pH of the product. After testing different concentrations an ideal spray was obtained containing the product ready for forensic investigation. For the validation test, cavity preparations were made and restored with resin restorative materials on 42 human teeth which were arranged in 3 artificial jaws, three (3) calibrated evaluators analyzed 3 possible diagnostic methods. Group I: Gold standard using ultraviolet (UV) light for identification and Experimental groups II and III, both containing the pulverized investigative dye, but in Group III apart from investigative dye has utilized UV light. The data were tabulated and submitted to statistical analysis, considering power of 80% and level of significance of 5%. The specificity, sensitivity, positive predictive value (PPV) and negative predictive value (NPV) tests were used to compare the outcomes in the post intervention period according to the identification groups. The comparison of the prevalence’s of outcomes between the treatment groups was performed using the chi-square test of heterogeneity. The analysis were performed using STATA 15 software. The results showed that the experimental group III presented positive results for the sensitivity and sensibility for the technique used with high confidence levels of the examiners in a short period of dental identification.
Keywords: Forensic Dentistry, Forensic Anthropology, Anthraquinones,
Sumário 1 Introdução ...14 2 Capítulo 1 ...17 3 Capítulo 2...30 4 Considerações finais ...52 5 Referências ...53 6 Apêndices ...58 7 Anexos ...61
1 Introdução
Dentre vários métodos existentes para os procedimentos de identificação forense humana, o exame odontológico é considerada um dos melhores, especialmente em catástrofes de massa (PRETTY .I.A et. al 2001; LAU. G, TAN. W.F, 2005; JAMES. H, 2005) Uma vez que os tecidos dentários são as partes mais duras do nosso corpo (FEREIRA. J.L et.al, 2008; VANDRANGI. S.K et.al 2016) oferecendo resistência ao calor e a decomposição. Assim, informações dos registros odontológicos disponíveis pelos dentistas das vítimas ou com a seguradora odontológica pode auxiliar na identidade das vítimas em menor tempo. Este método de identificação é mais precisa e prática devido à particularidades únicas das características dentárias do cada indivíduo.
Dentre as técnicas usadas em identificação pós-mortem, uma das mais empregadas é a identificação das restaurações dentárias com luz ultravioleta (UV) (CLARK & MEEKS 1989; GUZY & CLAYTON 2013; BUSH et.al, 2006; HEMASATYA, BALAGOPAL, 2013; VALENZUELA et al., 2000). Restaurações dentarias podem ser consideradas como impreções digitais, uma vez que nunca são iguais em diferentes dentes, até mesmo dentro da mesma cavidade bucal, mas os avanços recentes em materiais restauradores dificultaram o trabalho de identificação, resultando em erros durante processo de identificação. Estes erros estão relacionados à natureza estética, uma vez que se assemelham muito aos dentes naturais, pois a demanda por restaurações estéticas entre os pacientes, vem aumentando especialmente envolvendo resinas compostas e cerâmicas em lugar de restaurações de amálgama (CHRISTENSEN, 1998). Apenas duas técnicas conhecidas podiam identificar os dentes naturais a partir de restaurações estéticas de resinas, são técnica radiográfica e técnica utilizando Luz Ultra Violeta (UV), entretanto ambas possuem suas próprias limitações devido a equipamentos complexos necessários para executá-las. Equipamentos como máquinas radiográficas que não podem ser transportados para locais remotos de desastres, também falta de eletricidade e água, tornam impossível o trabalho de radiografia nesses locais.
As características físicas de radiolucência ou radiopacidade e fluorescência de cada material, seja este resina composta, material ionomerico, cerâmico ou acrílico são determinados por cada fabricante de forma variada. E devido a estas diferenças de composição no mercado, o exame radiológico pós-mortem pode ser difícil quando as propriedades radiográficas das restaurações de resina são semelhantes às das propriedades de dentina ou esmalte. Também, as restaurações de resinas modernas possuem fluorescência semelhante ao do esmalte, podendo causar confusão ou de dificil detecção durante o exame clínico sob luz UV.
Assim, novos métodos forenses odontológicos com maior sensibilidade são necessários empregar, visando evitar falsos negativos e desta forma obter um correto odontograma da vitima. Levando isso em conta, este trabalho tem por objetivo desenvolver um novo marcador quimico que possa diferenciar a estrutura dos dentes naturais e as restaurações estéticas das vitimas.
Baseado na dinâmica funcional que o cálcio dos dentes forma um complexo de quelação vermelho quando entra em contato com a substancia chamada vermelho de alizarin, este composto foi o de escolha em nosso estudo baseado em sua sensibilidade, uma vez que ligasse irreversivelmente. Além disso, a coloração resultante desse composto químico pode ser evidenciada em rosa fluorescente sob a luz ultravioleta, o que faz seu uso de grande interesse para a odontologia forense, bem como pode ser transportado para os locais de desastres com muita facilidade para pronto uso. (ATUKORALA et.al 2013; ZENG.L, et.al. 2011).
1.2. Objetivo Geral
O objetivo geral desse estudo foi desenvolver um produto e patenteá-lo, bem como validar seu método de diagnóstico frente ao padrão ouro: empregando luz ultravioleta (UV) para investigação forense.
1.3. Objetivos Específicos
Parte 1-Padronizar concentração, pH, envelhecimento e apresentação do protótipo e documentar esta invenção no Brasil, através de uma patente. Parte 2-Comparar a sensibilidade, especificidade, valor preditivo positivo e valor preditivo negativo do novo produto empregando como padrão ouro a luz ultravioleta.
2. Capítulo 1
COMPOSIÇÕES PARA IDENTIFICAÇÃO DENTÁRIA EM
INVESTIGAÇÃO FORENSE1
RESUMO DA INVENÇÃO:
[0001] A invenção pertence ao campo de odontologia forense, especificamente no processo de identificação post-mortem por meio da arcada dentária. Em particular, a presente invenção abrange composições com corantes destinadas a identificação de restaurações dentárias, como o Vermelho de Alizarin, que podem corar apenas a restauração ou a estrutura dentária. Preferencialmente, o material é composto por dois componentes como um corante e um diluente na forma de pó e líquido, podendo apresentar a forma de solução, suspensão, emulsão, granulado, pasta, gel, creme, spray, aerossol, espuma.
1
A presente patente de invenção foi depositada no INPI (BR 10 2016 030615 9) em 17 de dezembro de 2016 (Anexo A)
RELATÓRIO DESCRITIVO:
[0001] A odontologia forense investiga fenômenos físicos, químicos e agentes biológicos que poderiam afetar indivíduos vivos ou mortos, resultando em lesões reversíveis ou irreversíveis no corpo humano. Em casos de desastres em massa, como acidentes aéreos em que o calor intenso ocorre durante um curto período de tempo, o corpo humano pode deteriorar-se consideravelmente dificultando a identificação. Nessas situações, os tecidos moles podem proteger os tecidos altamente mineralizados, como os ossos ou dentes.
[0002] O órgão dental é relativamente não destrutível, mas pode ser quase totalmente incinerado a 676°C. Para identificação post-mortem, a identificação dental é um importante recurso utilizado especialmente quando o corpo está desfigurado, mutilado, e/ou carbonizados, e só as arcadas dentárias permanecem em boas condições por causa de sua resistência a altas temperaturas e mau tempo.
Dos métodos de identificação em odontologia forense
[0003] Devido à resistência dos tecidos dentários mineralizados, a odontologia forense surgiu com o desenvolvimento de métodos para identificação das vítimas envolvendo um exame de seus dentes e correlacionando com registros dentários. Muitas vezes os tecidos da vítima se tornam desconfigurados e/ou amorfos. A confirmação por análises como a de DNA pode não ser rápida, sendo esse teste mais complexo e demorado para a obtenção da resultados. A patente EP1573065 (2002), WO2014028531 (2012), US20040215401 (2003) abordam métodos de identificação por meio de DNA.
[0004] Nos casos de pessoas envolvidas em desastres em massa, como catástrofes naturais, a odontologia forense facilita a identificação da vítima com alto grau de precisão por meio da comparação da arcada dentária dos registros pós-mortem com os registros odontológicos ante-mortem. Os documentos para esta identificação incluem registros de caso, fotografias, radiografias e modelos da arcada dentária. Por exemplo, no caso do tsunami que atingiu a Indonésia em 26 de dezembro de 2004, cerca de 80% das vítimas foram identificadas por meio da investigação odontológica forense (BEAUTHIER.J.P et.al, 2009). A
patente US 20020143276 A1 (2002) relata um método para obtenção de um modelo de trabalho que facilite o registro odontológico do paciente para ser utilizado na identificação de pessoas.
[0005] A identificação forense por meio de restaurações dentárias é um dos métodos mais rápidos, de baixo custo, e eficazes (VALENZUELA et al., 2000;BUSH M.A., BUSH P.J., MILLER, 2006; HEMASATYA, BALAGOPAL, 2013). Contudo, as demandas por restaurações estéticas entre os pacientes com resinas compostas ou restaurações de cerâmica vêm crescendo em detrimento ás restaurações de amálgama. O avanço tecnológico destes materiais, aliado ao aumento da demanda estética da população, impulsionou o uso de restaurações cada vez mais semelhantes as estruturas dentais. Desse modo, a identificação forense nas superfícies restauradas é dificultada, como em restaurações classe V subgengivais ou interproximais e restaurações altamente estéticas. Isso dificulta o trabalho dos peritos em desastres em função do preenchimento do odontograma, comumente utilizado para registros
post-mortem em situações atípicas. Os formulários dentários de identificação
padrão utilizados nesses casos são chamados de DVI-PM (Disaster Victim
Identification Post-mortem). A luz ultravioleta é o método mais tradicional
empregado nesse contexto para facilitar o preenchimento do formulário de maneira mais fácil e rápida. Contudo, os materiais restauradores de nova geração, como resinas compostas que tem fluorescência similar a do esmalte e dentina, dificulta a identificação dental com o auxílio de apenas luz ultravioleta. [0006] Existem outros diferentes métodos de identificação por meio da cavidade oral, como os exames de arcada dentária, das rugosites palatinas, a extração de dentes para o exame posterior do DNA da polpa dentária. A radiografia odontológica é um dos métodos não-invasivos também comumente utilizados. Ela permite avaliar dados dos tecidos duros, que podem não estar completamente visíveis no exame do perito. Ou ainda podem auxiliar na comparação da arcada dentária com registros radiográficos do dentista, caso estejam disponíveis. Apesar de ser um dos métodos de identificação mais precisos, há a desvantagem de necessitar de equipamentos de radiografia. O local para a realização dessa análise também necessita de sala com aparelho radiográfico no local do crime ou da catástrofe, o que dificulta a realização da
técnica. Além disso, o cadáver precisa ser removido para o local da tomada radiográfica, o que pode fazer com que provas vitais relacionadas com o crime sejam destruídas. A patente US 20140028010 A1 relata um sistema para identificação dentária que contem um identificador pessoal e utiliza radiografias radiográficas no método para análise forense posterior.
[0007] Apesar de esses métodos serem usualmente utilizados na cavidade oral, suas desvantagens dificultam o uso especialmente em catástrofes ou acidentes em massa, em que a obtenção do registro odontológico de modo rápido e fácil é fundamental. O uso de registros radiográficos ou de análise por DNA são métodos demorados e relativamente caros. Devido a isso, o uso de composições contendo corantes para a dentes ou restaurações pode permitir identificar mesmo restaurações altamente estéticas, facilitando a obtenção do odontograma.
[0008] Entre os corantes, o Vermelho de Alizarin cora apenas tecido altamente mineralizados, e poderia pigmentar apenas a estrutura dentária facilitando a identificação de restaurações estéticas e, consequentemente, o preenchimento do odontograma. No início do século XIX, o Vermelho de Alizarin natural foi aplicado na indústria de tecidos, sendo um dos pigmentos naturais mais estáveis extraídos de raiz de planta Madder (Rubia tinctorium). Corantes derivados do extrato da raiz da planta estavam em uso pelos antigos egípcios para colorir tecidos e fazer pinturas. Na medicina clínica, a detecção de cálcio pelo Vermelho de Alizarin foi demonstrado em estudos relacionadas à osteoartrite (SHOJI.K,1993) e possibilita a coloração de fluidos mineralizados de hidroxiapatitadas articulações. Adicionalmente, o Vermelho de Alizarin tem sido utilizado para preparações citológicas como um teste complementar para o exame de CPLM (por microscópio de luz polarizada compensado) a fim de detectar cristais de CPPD e agregados de cristais de hidroxiapatita. O cálcio formaria um complexo de quelação com o Vermelho de Alizarin, sendo a sensibilidade do ensaio de coloração dependente tanto da concentração do corante quanto do pH da solução (SUN et al., 2010).
[0009] Na odontologia, o Vermelho de Alizarin têm sido utilizado em estudos que analisam o crescimento ósseo (ATUKORALA et al.2013) e a formação de
tecidos dentários humanos por derivados de células-tronco (VILMANN. H,1971). Esse composto também foi utilizado in vivo em scaffolds de HA(Hidroxiapatita)/TCP(Fosfato de tricálcio) para evidenciar o Fosfato de Cálcio, o que indica a formação do tecido dentário (ZHENG, YANG et al., 2011).
[0010] Enquanto isso, principal componente inorgânico do esmalte e da dentina é o Fosfato de Cálcio, que está na forma de hidroxiapatita (Ca10(PO4)6(OH)2).
Os dentes humanos contêm aproximadamente 39,83% de cálcio e 19,04% de fosfato por peso, que poderiam ser corados pelo Vermelho de Alizarin. A utilização de um material contendo esse corante poderá manchar a hidroxiapatita e/ou cristais de Fosfato de Cálcio dos dentes, diferenciando-os de materiais restauradores que são mais estéticos e semelhantes ao dente. Desta forma, a utilização do Vermelho de Alizarinna identificação forense pode tornar o obtenção do odontograma muito mais conveniente e prática. Devido à sua facilidade de aplicação e uso, um produto contendo esse composto poderá ser transportado para cenas de crime muito facilmente, podendo ainda tornar a identificação dental possível sem a necessidade de mover o cadáver da cena do crime.
SUMÁRIO DA INVENÇÃO:
[0011] A invenção compreende a inédita utilização de corantes, em particular Vermelho de Alizarin, em composições para identificação dentária em odontologia forense. Ela tem o objetivo de prover composições com capacidade de corar a estrutura dental ou os materiais restauradores de diferentes maneiras de modo a facilitar a obtenção do odontograma. As composições da presente invenção são indicadas para odontologia forense, e podem estar sob a forma isolada ou combinada de pó, solução, suspensão, emulsão, granulado, pasta, gel, creme, spray, aerossol, espuma.
DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO:
[0012] A presente invenção refere-se a composições para uso em odontologia forense que compreendam pelo menos um corante, e podendo apresentar um diluente na composição. Em algumas possível formulações, pode ser
necessário o uso prévio de ácido (como gel ácido ou gel clareador) ou a necessidade de fonte de luz adequada para facilitar a obtenção do odontograma em identificação forense. A Tabela 1 exemplifica os principais componentes da presente invenção.
Da composição para identificação dentária:
[0013] Entre os corantes que podem ser utilizados na presente invenção, preferencialmente o material é composto de Vermelho de Alizarin. Como alternativa, outros corantes podem ser utilizados como grafite, purpurina, crocina, cinabre/cinábrio e sulfato de cobre, carmesin, brasilina, hematoxilina-eosina,ácido carmínico, garança,litmus, muricarmin de Mayer, índigo (anil), murexida, anilina (fenilamina, aminobenzeno), safranina, magenta, violeta de metila, azul de anilina, anilina WS, violeta de Hofmann, Bismark Brown G, fluorosceína, verde de metila, crisoidina, tionina, azul de metileno, verde malaquita, crisoidina, fucsina ácida, Bismark Brown R, Orange G, Sudan III, Auramina O, violeta cristal, Azur B, Rodamina B, Pironina G, amarelo de acridina, laranja de acridina, entre outros. De modo preferencial, o corante cora apenas a parte orgânica da estrutura dentária como a hidroxiapatita e o fosfato de cálcio, não corando materiais odontológicos restauradores como resina composta e cerâmicas, ou vice-versa, de maneira a facilitar a identificação da restauração.Dentre os possíveis diluentes, a composição pode compreender solventes orgânicos e inorgânicos como água, etanol, metanol, acetona, água oxigenada, tetrahidrofluorano (THF), soluções ácidas (como ácido acético, ácido fosfórico, ácido fluorídrico), entre outros.
Das formas de apresentação
[0014] O material pode ser composto por dois componentes na forma de pó e líquido. O pó e/ou líquido contendo o corante pode vir em compartimento separado do líquido, de modo que possa ser incorporada a solução no momento da utilização. O pó pode estar compactado na forma de comprimido solúvel, pastilha, grânulos/granulado, ou revestido por um invólucro (como cápsula, microesferas). O composto pode estar na apresentação de solução (pó + liquido miscível), suspensão (pó + liquido imiscível) ou emulsão (duas fases imiscíveis). Além disso,é possível a apresentação do produto na forma de
solução, já com o pó incorporado no líquido previamente.
[0015] Como alternativa, o material pode apresentar a forma de pasta, sendo possível a apresentação em uma única pasta já contendo o corante. Além disso, a apresentação como “pó e pasta” ou “líquido e pasta” ou “pasta e pasta” ou “líquido e líquido” pode ser utilizada.Adicionalmente, a composição pode estar sob a forma de spray, aerossol ou espuma.Outra apresentação da presente invenção é sob a forma de gel e/ou creme. O corante já pode vir incorporado no gel, creme, ou apresentar a forma de pó ou líquido para serem misturadas ao gel ou creme no momento do uso. Como alternativa, o corante pode ainda estar presente no gel contendo ácido ou solução de limpeza para aplicação prévia a aplicação do material para odontologia forense.
Outros componentes:
[0016] Outros agentes podem ser incorporados na presente invenção. Esses aditivos incluem agentes aromatizantes, conservantes (nipagin, nipasol), fluorescentes (fluorisceína), espessantes (como carbopol, carboximetilcelulose, amido), estabilizantes (como citrato de sódio, pectina), indicadores de viabilidade/qualidade, emulsionante (lauril sulfato de sódio), antioxidantes (BHT e BHI) ou neutralizantes.
TABELA 1. Possíveis componentes da presente invenção, podendo estar
isolados ou em conjunto no invento
Corante Diluente Outros componentes
Vermelho de Alizarin, grafite, purpurina, crocina, cinabre/cinábrio e sulfato de cobre, carmesin, brasilina, hematoxilina-eosina, ácido carmínico, garança, litmus, muricarmin de Mayer, índigo (anil), murexida, anilina (fenilamina, aminobenzeno), safranina,
magenta, violeta de metila, azul de anilina, anilina WS, violeta de Hofmann, Bismark Brown G, fluorosceína, verde de metila, crisoidina, tionina, azul de metileno, verde malaquita, crisoidina, fucsina
Solventes orgânicos e inorgânicos como água, etanol, metanol, acetona, água oxigenada, tetrahidrofluorano (THF), soluções ácidas (como ácido acético, ácido fosfórico, ácido fluorídrico), entre outros Agentes aromatizantes, conservantes (nipagin, nipasol), fluorescentes (fluorisceína), espessantes (como carbopol, carboximetilcelulose, amido), estabilizantes (como citrato de sódio, pectina), indicadores de viabilidade/qualidade, emulsionante (lauril sulfato de sódio), antioxidantes (BHT e
ácida, Bismark Brown R, Orange G, Sudan III, Auramina O, violeta cristal, Azur B, Rodamina B, Pironina G, amarelo de acridina, laranja de acridina, entre outros
BHI) ou neutralizantes.
EXEMPLOS
[0017] Para permitir uma melhor compreensão da presente invenção e demonstrar claramente os avanços técnicos obtidos, na sequência são apresentados exemplos de concretizações dos materiais, não sendo objetivo do presente relatório limitar a invenção apenas a estas concretizações.
EXEMPLO 1: Composição para identificação dentária contendo corantes
[0018]A Tabela 2exemplifica uma formulação para identificação em odontologia forense contendo corante na composição sob a forma de pó-líquido para aplicação como spray. Para preparo do produto, o corante deve ser misturado com os compostos nas proporções da Tabela 2. O material é composto de um corante, um diluente e aditivos na formulação.
TABELA 2. Exemplo de composição para identificação forense contendo
corantes
Componentes
Faixa em % Faixa
ampla
Faixa média Faixa
estreita Corante 0.1 - 99 1 -70 2 - 30 Diluente 0 - 99 20 - 95 60 - 95 Aromatizantes qsp qsp qsp Conservantes qsp qsp qsp Fluorescentes qsp qsp qsp Espessantes qsp qsp qsp Estabilizantes qsp qsp qsp
EXEMPLO 2: Composição para identificação dentária contendo Vermelho de Alizarin.
[0019] A Tabela 3 exemplifica uma formulação para identificação em odontologia forense contendo corante na composição sob a forma de pó-líquido. Para preparo do produto, o corante Vermelho de Alizarin deve ser misturado com os compostos nas proporções da Tabela 3 e com ajuste simultâneo do pH para cerca de 4. Os melhores resultados são obtidos com uma concentração de Vermelho de Alizarin de 1-5,0% para corar a hidroxiapatita.
Avaliação da alteração de cor
[0020] A composição contendo Vermelho de Alizarinfoi testada por meio de espectrofotometria (SP60 – EX-Rite/Grand Rapids, MI, USA)após armazenamento nos seguintes intervalos de tempo: imediatamente após a preparação, e após 7 dias, 15 dias e 30 dias de armazenamento. Vinte dentes incisivos bovinos foram restaurados com resina composta Filtek Z250 (3M
Indicadores de qualidade qsp qsp qsp
Emulsionante qsp qsp qsp
Antioxidantes qsp qsp qsp
Neutralizantes qsp qsp qsp
TABELA 3. Exemplo de composição para identificação forense contendo
Vermelho de Alizarin Componentes Faixa em % Faixa ampla Faixa média Faixa estreita Vermelho de Alizarin 0.5 - 95 1 -20 1 - 5 Água destilada 0 - 95 30 - 95 70 - 95 Hidróxido de Amônia 10% qsp qsp qsp
Espe, EUA). Após o procedimento, foi aplicado ácido fosfórico a 37% sobre a superfície da restauração e dos dentes, e a composição da presente invenção foi aplicada sobre os dentes sob a forma de spray.Desse modo, foi testada a estabilidade do produto à base de Vermelho de Alizarin, e o efeito na alteração de cor da restauração e do esmalte dentário.
[0021] Como demonstrado no Desenho 1, em todos os períodos de armazenamento do produto a alteração de cor (Delta E) no dente foi superior a da restauração. Dessa forma, a restauração é facilmente identificada contrastando com o esmalte dentário corado com o invento.
[0022] Tratou-se no presente relatório descritivo de uma invenção dotada de novidade, atividade inventiva, aplicação industrial e suficiência descritiva, preenchendo todos os requisitos determinados pela lei da propriedade industrial para obter a concessão da patente da invenção pleitada.
Desenho 1. Diferença de cor (Delta E) após aplicação do invento
contendo Vermelho de Alizarin imediatamente após o preparo, e com tempo de armazenamento (shelf-life) de 7 dias, 15 dias e 30 dias.
REIVINDICAÇÕES
1. COMPOSIÇÕES PARA IDENTIFICAÇÃO DENTÁRIA EM
INVESTIGAÇÃO FORENSE caracterizada por compreender uma ou
mais substâncias capazes de diferenciar as diferenças entre os substratos da estrutura dental e dos materiais restauradores dentários.
2. COMPOSIÇÕES PARA IDENTIFICAÇÃO DENTÁRIA EM
INVESTIGAÇÃO FORENSE como reivindicado em 1, caracterizada por
compreender um ou mais diluentes na composição.
3. COMPOSIÇÕES PARA IDENTIFICAÇÃO DENTÁRIA EM
INVESTIGAÇÃO FORENSE como reivindicado em 1 e 2, caracterizada por compreender como substância corante o Vermelho de Alizarin.
4. COMPOSIÇÕES PARA IDENTIFICAÇÃO DENTÁRIA EM
INVESTIGAÇÃO FORENSE como reivindicado em 1 a 3 caracterizado por compreender de maneira isolada ou concomitante grafite, purpurina,
crocina, cinabre/cinábrio, sulfato de cobre, carmesin, brasilina, hematoxilina-eosina, ácido carmínico, garança, litmus, muricarmin de Mayer, índigo (anil), murexida, anilina, safranina, magenta, violeta de metila, azul de anilina, anilina WS, violeta de Hofmann, Bismark Brown G, fluorosceína, verde de metila, crisoidina, tionina, azul de metileno, verde malaquita, crisoidina, fucsina ácida, Bismark Brown R, Orange G, Sudan III, Auramina O, violeta cristal, Azur B, Rodamina B, Pironina G, amarelo de acridina, laranja de acridina.
5. COMPOSIÇÕES PARA IDENTIFICAÇÃO DENTÁRIA EM
INVESTIGAÇÃO FORENSE como reivindicado em 1 e 4, caracterizada por compreender como diluentes solventes orgânicos e inorgânicos (de
forma conjunta ou isoladamente) como, por exemplo: água, etanol, metanol, acetona, água oxigenada, tetrahidrofluorano (THF) e outras soluções ácidas (como ácido acético, ácido fosfórico, ácido fluorídrico).
6. COMPOSIÇÕES PARA IDENTIFICAÇÃO DENTÁRIA EM
INVESTIGAÇÃO FORENSE como reivindicado em 1 e 5, caracterizada por compreender aditivos isolados ou em conjunto como agentes
aromatizantes, conservantes (nipagin, nipasol), fluorescentes (fluorisceína), espessantes (como carbopol, carboximetilcelulose,
amido), estabilizantes (como citrato de sódio, pectina), indicadores de viabilidade/qualidade, emulsionante (lauril sulfato de sódio), antioxidantes (BHT e BHI), neutralizantes..
3. Capítulo 2
ARTICLE
Evaluation of a chemical marker for the identification of aesthetic dental restorations in forensic investigation2
Mohammed Irfan¹, Adriana Fernandes da Silva², Wellington Luiz de Oliveira da Rosa³, Alexandre Emídio Ribeiro Silva, Evandro Piva, Tiago Machado da Silva.
Mohammed Irfan: PhD Students, Post Graduate Program in Dentistry, Federal University of Pelotas, Pelotas, RS, Brazil. E-mail: irfan_dentart@yahoo.com. phone/fax: +55 53 32226690/32256741. ORCID: 0000-0003-0683-106X
Adriana Fernandes da Silva: Associate Professors, Department of restorative dentistry, Federal University of Pelotas, Pelotas, RS, Brazil. E-mail: adrisilvapiva@gmail.com. phone/fax: +55 53 32226690/32256741. ORCID: 0000-0002-3942-7138
Wellington Luiz de Oliveira da Rosa: PhD Students, Post Graduate Program in Dentistry, Federal University of Pelotas, Pelotas, RS, Brazil. E-mail: wellington_xy@outlook.com. phone/fax: +55 53 32226690/32256741. ORCID: 0000-0001-6992-3127.
Evandro Piva: Associate Professors, Department of restorative dentistry, Federal University of Pelotas, Pelotas, RS, Brazil. E-mail: evpiva@gmail.com. phone/fax: +55 53 32226690/32256741. ORCID: 0000-0002-5970-5158.
Alexandre Emídio Ribeiro Silva: Associate Professors, Department of restorative dentistry, Federal University of Pelotas, Pelotas, RS, Brazil. E-mail: emidio3@bol.com.br. phone/fax: +55 53 32226690/32256741. ORCID: 0000-0001-6402-0789.
Tiago Machado da Silva: Undergraduate Student, School of Dentistry, Federal University of Pelotas, Pelotas, RS, Brazil. E-mail: tiagomachado91@hotmail.com. phone/fax: +55 53 32226690/32256741. ORCID: 0000-0002-2406-0628.
Corresponding Author: Dr. Adriana Fernandes da Silva Associate Professor
Federal University of Pelotas
School of Dentistry, Address: 457, Gonçalves Chavez St. 5th floor Pelotas - RS - Brazil 96015560
phone/fax: +55 53 32226690/32256741 Home-page: http://www.ppgoufpel.com/
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Este artigo será submetido para o Periódico International Journal of Legal Medicine (FI 2.382) e está formatado segundo as normas da revista.
Clinical Relevance
Scientific reasons for the study: The use of an Alizarin Red containing spray
may irreversibly stain HA crystals and / or calcium phosphate from teeth, differentiating them from other restorative materials which are aesthetically similar to the tooth but chemically different in composition.
Key Findings: Alizarin Red stains tooth structures, and resin restorations are left
behind without staining, this technique was able to distinguish between natural tooth structures and resin restorations.
Practical implications: Alizarin red can be used during forensic identifications to
prepare dental charts because of its property to differentiate between resin restorations and natural teeth.
Abstract
The ideal method of human identification in mass disasters is by comparing dental records, but often this method fails due to erroneous identification of aesthetic dental restorations. In view of the need to avoid identification errors, developing a dental chemical marker and evaluating its effectiveness in different dental forensic identification techniques in a pre-clinical study using human tooth and jaw models has been our key objective. Based on Alizarin Red (AR) staining properties, we formulated a 4% AR spray in the laboratory with pH 4.1, its effectiveness was tested clinically using 3 models of human jaws i.e. 210 teeth surfaces involving 42 human teeth. Three examiners were allocated to identify three different groups, (i) Group UV: restorations were examined using ultraviolet light (UV); (ii) Group AR: teeth stained with Alizarin Red marker were examined without UV; (iii) Group AR+UV: teeth stained with Alizarin Red marker were examined with UV. The time required for each operator to complete each identification task was recorded (in min). The data were tabulated and submitted to statistical analysis, considering power of 80% and level of significance of 5%. Participant’s perception of the ease of technique and their own confidence in conducting the procedure was evaluated from 0 to 10, specificity, sensitivity, Positive predictive value (PPV) and Negative predictive values (NPV) were calculated for all the 3 groups. The results showed that AR spray not only helped to make precise identification, but also hasten the identification process significantly compared to the conventional technique, also it was seen that the confidence level of all the participants was considerably higher while using AR spray compare to conventional UV Light technique.
Introduction
The human identification by comparing dental records is considered to be the best method of choice during mass disasters [1-4]. Teeth are the hardest parts of our body which are resistant to heat and decomposition [47-49], their morphological characters are unique in each individual which makes the dental identification more accurate and practical [42-43]. Many different techniques of dental identification are used during forensic investigations, but the most commonly cited technique is identification by dental restorations [37], which are never similar in two people this uniqueness favours during forensic identification.
The recent advances in restorative materials have made identification much difficult, resulting in errors and bias during the identification process [20-22]. These prime reasons for errors are related to the aesthetic nature of restorative materials that closely resembles natural teeth, and operator errors during radiographic interpretation [22]. There are two widely used techniques to identify aesthetic restorations i.e. by radiography and Ultra Violet Light (UV). Radiographic method have its own limitations other than time consuming method the complex radiographic equipments which cannot be transported to Remote disaster sites, and also sometimes the lack of electricity in these sites makes it impossible to work [36]. Due to these drawbacks of using radiographic identification techniques, the use of UV during mass disaster identification is considered as gold standard. However the new generation resin restorative materials show similar fluorescence nature as that of dental enamel hence the gold standard method of using UV fails to demonstrate accuracy during forensic dental identification process.
To change the future of dental identification during forensic investigations, a dental chemical marker has been formulated and tested clinically in this study; the functional idea of present dental marker is based on clinical researches related to Osteoarthritis (OA). In the early nineteenth century, Alizarin Red was used in the fabric industry. One of the most stable natural pigments extracted from the root of the Madder plant (Rubia tinctorium). The cultivation of Rubia tinctorium almost ceased after a synthetic method of production of Alizarin Red S (Figure 1), this was discovered by the German chemists Graebe and Liebermann in 1868 [53].
In clinical medicine, calcium detection by Alizarin Red Biomarkers has been demonstrated in several studies related to OA [24, 28]. In addition, this Biomarker has been used for the detection of Calcium Pyrophosphate Dehydrates (CPPD) crystals, Hydroxyapatite crystals (HA), Bone growth analysis, and the formation of human dental tissues by stem cell derivatives [25-27]. Calcium forms a red chelating complex when it comes in contact with this Biomarker and its sensitivity depends both on the dye concentration and the pH of the solution [28-30]. In addition to dental structure staining, this chemical compound can be evidenced in fluorescent pink under ultraviolet light, which makes its use of great interest for forensic dentistry, apart from all these it can be transported to the disaster sites very easily, and it makes onsite dental identification possible without moving the corpse.
The objective of this study was to formulate an Alizarin red based marker (AR) and compare the performance of three groups (i) UV, (ii) AR and (iii) AR+UV in the clinical conditions to detect aesthetic
restorations. The hypotheses evaluated were that AR would present similar performance as that of UV in detecting aesthetic restorations.
Materials and methods
Study design
This study analysed three different diagnostic methods for post-mortem identification of dental restorations. The study was approved by the Research Ethics Committee of the Federal University of Pelotas, Pelotas, RS, Brazil (CAAE: 45799915.5.0000.5318) and was adapted from STARD 2015 [52]. All the participants in this study were informed about all kinds of risks and damages related to the study or during the study and each one had signed the Consent Form (Annex C) prior to the beginning of the study. All the teeth used in this study were donated by the UNOESC tooth bio-bank (Annex B).
Study model preparation
All human teeth used in this study were examined to eliminate the presence of any carious lesions and restorations. After which, different classes of cavity preparations were made by Occlusal stamp technique to reproduce exact copy of the restorations in all the jaw models [23]. Equally distributed twenty cavities measuring 4 mm² - 8 mm² were prepared on each jaw model.
The prepared cavities were restored with resin restorative material (3M ESPE, Filtek™Z250) by a single experienced and trained operator. All the resin restorations were given occlusal finishing using, dental bur tips 4322F and 4323F (KG SORENSEN, Cotia – Sao Paulo - Brazil) and finally all the restorations underwent polishing process utilizing special polishing kit from TDV (Figure 2). The operator filled an adapted DVI form (Figure 3) indicating each tooth surface restored, which served as standard for the diagnosis.
Three artificial gypsum (Herodent, Vigodent, Rio de Janeiro, Brazil) jaw models were prepared with the help of silicone moulds made by silicone moulding material (Novo DFL - Rio de Janeiro, Brazil), and all the restored teeth were mounted on these gypsum jaw bases. Different diagnostic methods were evaluated using 3 different models of human jaws containing 42 teeth (210 surfaces) by each group. All the 3 artificial jaw models were evaluated by three different methods: (i) Gold standard - Group UV: restorations were examined with ultraviolet light (UV); (ii) Group AR: teeth stained with Alizarin Red were examined without UV; (iii) Group AR+UV: teeth stained with Alizarin Red were examined with UV (Figure 4).
Preparation of Alizarin Red based marker (AR):
The Alizarin red dye powder (Sigma Aldrich CAS: 103-22-3) 0.6 grams (Sigma Aldrich, USA) was mixed for 1 minute in 15ml of distilled water. The pH was adjusted to 4.1 according to the manufacturer's standards (Sigma-Aldrich, USA).
Teeth Staining:
Artificial jaws were stained with AR which was presented in a spray bottle, excess stain from the teeth was removed after 60 seconds using a wet cotton and left to dry for 1 minute. The stained artificial
models used for Group’s AR and AR+UV were exact replicas of the unstained jaw models used in Group UV.
Participants training and calibration:
Three trained and previously calibrated Ph.D. (students) examiners from the Dental School of the Federal University of Pelotas (UFPel), which is located in Southern Brazil were selected for the experiment. Before starting the experiment all the participants were calibrated for the study, only examiners with inter examiner Kappa values higher than 0.6 were included in the experiment. Selected participants were trained for filling the adapted Disaster Victim Identification Forms-INTERPOL (DVI-forms). The group distributions were carried out with the aid of a computer-generated randomization program (Microsoft Excel 2016, Microsoft Corporation, USA). Using a conventional slide show and demonstrative models (jaw models not involved in the study), all three participants were taught about the identification methods of resin restoration. It was also demonstrated the correct use of UV lamps (Esco-Lite, Black-Light, Model: SGAA421A) and the use of protective goggles (Kalipso- Model: Koala, impact resistance registration:ANSI Z87.1 Brazil) in examining group where UV light is used.
Examination method
After the group division all the jaw models were distributed to the individual phantom head tables of the pre-clinical department of School of Dentistry (UFPel). The models were maintained in a fixed position so that the identification procedures were performed without moving the jaws from its original position, dental diagnostic equipments like dental probes and mouth mirrors were provided on all the tables, UV Lamps and UV protective goggles were provided where there is use of UV Light for the examination. The dental reflectors were maintained at adequate position and equal distance for all the models on the table, the room temperature of 25ºC was maintained throughout the experiment.
The examiner was allocated after performing group randomization, the evaluation time required for the single operator to complete each identification task was recorded (in min). At the end of the each identification task, all the participants gave a score of 0 to 10, which is nothing but their own perception of confidence in conducting the identification procedure in each group (zero meant "I was not confident", while 10 meant "I was totally confident ").
Data analysis:
The sensitivity, specificity, positive predictive value and negative predictive value were calculated for each method. Inter-examiner reproducibility was assessed for each method, using un-weighted Kappa statistics. The classification of Kappa values was performed using criteria proposed in a previous report [21-22], Chi-squared tests were also used to compare between methods. The quantity of restorations (%) identified and the confidence levels were analyzed with ONE-WAY ANOVA followed by Tukey’s test. The evaluation time required to complete the procedures were evaluated by Kruskal-Wallis test and Participant’s perception of the ease of technique and their own confidence in conducting the procedure was evaluated from 0 to 10. The significance level was set at 0.05, and all the statistical analyses were done using STATA 15 program (STATA Corp LLC, College Station, TX, USA).
Results
Kappa value for inter examiner group reproducibility:
The inter-examiner reproducibility Kappa value showed different variable results but all the values in general showed high means, above 0.7 (Table 1).
Sensitivity, specificity, positive predictive value and negative predictive value: Sensitivity:
The technique ability of group AR+UV to correctly classify the restorations was overall higher, the test group AR+UV showed 84.9% of sensitivity rate which was higher among the test groups The Group AR with a difference of 0.3% to Group AR+UV showed sensitivity of 84.6% and the group UV sensitivity rate was 82.1% making it least sensitive among the groups (Table 2).
Specificity:
The technique specificity was higher for the groups with AR marker staining. Group AR showed almost 96% of specificity rate where as the group AR+UV almost 97%, on the other hand the group UV was almost 4-5% lesser specific compare to above two test groups (Table 2).
Positive predictive value (PPV):
The overall technique ability was higher to predict the presence of restorations as positive when
they were actually present, this positive prediction was higher for group AR+UV with 95.6 PPV followed by group AR with 94.5 PPV and in the last group UV with 89.3 PPV (Table 2), the positive predictive value’s were up to our expectations as we were expecting during the research.
Negative predictive value (NPV):
There was no significant difference between the groups AR and AR+UV. Group AR showed 88.3 NPV and group AR+UV showed 88.6 NPV on the other hand group UV showed only 86.1 NPV (Table 2).
Quantity of restorations identified & Confidence level:
When compared the quantity of correctly identified restorations among all the groups, the Group AR+UV showed higher capacity of identifying restorations when compared to other two groups as well as there was difference in the confidence level among them (Table 3).
Evaluation time:
When compared the group performance with respect to the time required to identify all the restorations among the three groups, the groups that contain the ultra violet light were more quicker in dental identification process in relation the group without UV light i.e. group AR (Table 3).
Discussion
Dentistry is advancing with striking speed and so the dental materials, the present new generation resin restorative materials are produced with high aesthetic qualities resembling natural teeth structures, which have made them very popular among people seeking aesthetic dental restorative treatments [35-36]. The demand for tooth coloured resin restoration has become a challenge for forensic dentists due to visual difficulties to detect them in routine forensic investigations and in mass disasters [36].
An Alizarin based chemical marker was formulated in the form of aerosol spray in this study, the spray method was adopted due to wide area coverage of aerosol spray while staining the teeth structures than any other dispensing method, and it is instructed to prepare the spray solution by mixing Alizarin powder and distilled water just before the application for better staining results, it was seen during the pilot study of this present experiment that pre-prepared solution of Alizarin red stain loses its effectiveness to stain tooth structure, hence immediate preparation of the solution is recommended for the identification process.
The outcome of the present study showed that our hypotheses stating AR marker would present similar performance than UV in detecting the resin restorations was accepted after the study experiment. The new dental marker developed by our research team has shown very significant statistical results demonstrating the advantages of using AR markers during forensic dental identifications compare to conventional UV technique. The Kappa values in this study gives quantitative measure of magnitude of agreement in between three examiners which has not shown great disagreement among them throughout the study, but it always remained above 0.7 which indicates that all the three examiners were well trained and calibrated, and the experiment was conducted with precision and the interpretation of each and every restoration identified was not just work of guess, apart from calibration and training for this experiment the same examiners were calibrated for previous epidemiological studies in the same institution which reduced inter-observer variation value.
In the study the Group AR+UV showed the high inter-examiner reproducibility, we believe it was the result of combination of our new AR marker with the conventional UV technique of identification which has facilitated the restoration identification, in the same test the Group AR showed the second higher inter-examiner reproducibility rate where once again we can say that the use of AR marker has increased the reproducibility rate among the examiners showing that the presence of AR marker facilitates the identification process, as we further see the statistical outcomes of the present study makes our hypotheses much more concrete regarding using AR marker during forensic dental identifications.
The Sensitivity, specificity, positive predictive values and the negative predictive values for each group shows that once again the two groups where AR marker was used showed higher values of success rate compare to the conventional UV technique, the technique sensitivity increases when two methods were used together i.e. the combination of two methods which is Group AR+UV in our study.
We believe that the sensitivity and specificity rates in Group AR+UV were higher due to the clear revelation of resin restorations by the AR marker which stained the natural tooth structure and left resin restorations unstained and this when exposed to UV light showed different tones of florescence i.e. the natural tooth structures stained with AR marker glows florescent pink and the unstained resin restorations glow florescent bright, this difference of florescence properties helped our examiners in distinguishing natural teeth from aesthetic restorations [24,25,27-29]. The high sensitivity and specificity for Group AR+UV signifies that the method can detect any resin restorations with precision, this is very important during mass disaster conditions when there are huge number of corpus to be identified and time is running out due to decomposition and high purification rate [2,3].
The PPV and the NPV values were higher for the groups where AR marker was used alone or in combination with UV, the presence of the AR marker has definitely improved the identification process in the experiment; these findings have increased the chances of positive identifications using AR markers during forensic investigations. The higher results of NPV shows that the AR marker not only helps in identifying existence of restorations but also gives information of absence of any aesthetic restoration which helps in avoiding unnecessary bias during forensic investigations. Human identification during mass disasters is very sensitive process for the investigating team which can be affected by both physical and emotional factors caused due to the chaotic situation during mass disasters; this can have direct effect on investigating teams performance causing misidentification of bodies, which may lead to huge identity problem, this can be solved by reducing the identification bias [19,20] which is only possible when correct method and techniques are used to identify. Restoration identification success in forensic dentistry is not only identifying the presence of restorations but also avoiding unnecessary false reporting, Hence the technique utilized should have both PPV and NPV values higher.
The quantity of restorations identified in the experiment were converted into percentage for the easy interpretation of the technique success, the Group AR+UV showed highest restoration identification rate followed by Group AR and Group UV with least identification rate. Almost 91% of restorations were identified by the use of AR marker which is a very crucial and important outcome of this experiment. Quantity of restoration identification is very important since it directly impacts on dental chart of the victim, and unfilled blocks in the dental chart will always arise doubts regarding the real identity of the victim. Quantity of restoration identified is nothing but once again the success rate of the used technique, here in our experiment the success rate was 91.43% in the laboratory conditions; it can definitely change when it is performed during disaster situations but we believe that constant training of investigating team with our new technique will improve this percentage.
The statistical results of the confidence level of technique used and evaluation time in this study has shown very significant results. For the first time the Group UV showed any statistical outcome almost equal when compared to Group AR+UV, this was very important for our team in terms of investigator comfort while utilizing the technique, if the investigator is not confident about the technique, he will delay to conclude the identification process. Identification delays depends on various different factors and investigator confidence is one of them [15], by improving this the problem can be overcome, and it is only possible when appropriate identification techniques are used and the investigating team feels
confidence in utilizing it during disaster situations. Our experiment gave positive values for the use of combination technique of AR marker along with UV Light in Group AR+UV. All the examiners showed their confidence to test groups where UV lights were used i.e. group AR+UV and group UV the Group AR confidence level was lowest among the three groups, we feel that the due to new experimental technique examiners were not confident about it and also the absence of UV light source which is essential to differentiate resin restorations and natural teeth structures by showing two different fluorescent glows i.e. AR stained teeth glows fluorescent pink and the restorations fluorescent bright under UV light.
Though the confidence level was high and the time required to identify the teeth was low in Group UV, but their quantity of restoration identification rate was low which was a drawback for this technique. This outcome shows that the use of combination technique is inevitable for a successful dental identification. The whole process of identification not only depends up the innovative new methods but also counts with the confidence of investigators in using the technique.
Along with all the positive outcomes there are also some drawbacks in using AR marker. Alizarin red being an antraquinone dye has identified as positive allergen if handled in inappropriate way during its manipulation, causing skin irritation and inflammation along with systemic respiratory problems if inhaled. These problems and side effects can be avoided by using individual protection equipments like protective eye wears, gloves and masks while manipulating the Alizarin spray, also the quantity of Alizarin which is used to prepare on the spot spray solution is very less to cause any serious damage to the operator.
Present biomarker irreversibly dyes the natural tooth structures in red colour, hence removal of the colouring agent from the tooth surface of the corpus is impossible, but we defend our experiment by highlighting the situations where after the mass disasters many of the bodies were remained unidentified for 6 months [2-4], which caused immense agony and emotional outbreaks among the diseased persons family members, hence we feel that correct person identification in short period of time is much important than aesthetic dental concern due to AR biomarker of the disaster victim.
Since the specificity and sensibility of Alizarin marker has shown better results than the gold standard technique, our future attempt would be further research in use of Alizarin as a sole product in dental identifications by eliminating the use of UV Light as in combination method, which will not only reduce identification time but also the costs.
Conclusion
Our findings have shown that using AR marker in the form of spray in combination with the conventional UV Light technique facilitated the identification process and increased the specificity and sensibility up to 97% and at the same time it has reduced the time necessary to conclude the identification process. Hence, we conclude that present AR marker Spray technique will not only help to make accurate dental charts but it will also accelerate the identification process in mass disaster situation.
Acknowledgement
We thank CDC laboratory (UFPel) technician Tatiana Ramos for her technical support in the laboratory.
