Peptídeo natriurético atrial em um modelo de obesidade e hipertensão induzidas por dieta em ratas ovariectomizadas

UNIVERSIDADE FEDERAL DA BAHIA – UFBA

INSTITUTO MULTIDISCIPLINAR EM SAUDE - IMS

PROGRAMA MULTICÊNTRICO DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS

FISIOLÓGICAS - SBFIS

EVERALDO NERY DE ANDRADE

PEPTÍDEO NATRIURÉTICO ATRIAL EM UM MODELO DE

OBESIDADE E HIPERTENSÃO INDUZIDAS POR DIETA EM RATAS

OVARIECTOMIZADAS

Vitória da Conquista – BA 2010

EVERALDONERYDEANDRADE

PEPTÍDEO NATRIURÉTICO ATRIAL EM UM MODELO DE

OBESIDADE E HIPERTENSÃO INDUZIDAS POR DIETA EM RATAS

OVARIECTOMIZADAS

Dissertação de Mestrado apresentada ao Programa

Multicêntrico de Pós-Graduação em Ciências

Fisiológicas da Sociedade Brasileira de Fisiologia na Universidade Federal da Bahia, como requisito parcial para a obtenção do título de Mestre em Ciências Fisiológicas.

Orientadora: Profa. Dra. Najara de Oliveira Belo Universidade Federal da Bahia - UFBA

Co-Orientadora: Profa. Dra. Adelina Martha dos Reis Universidade Federal de Minas Gerais - UFMG

Vitória da Conquista – BA 2010

Biblioteca Universitária Campus Anísio Teixeira - UFBA

Andrade, Everaldo Nery de

Peptídeo natriurético atrial em um modelo de obesidade e hipertensão induzidas por dieta em ratas ovariectomizadas / Everaldo Nery de Andrade. - 2010.

100 f. : il.

Orientadora: Profa. Dra. Najara de Oliveira Belo, Profa. Co-orientadora Dr.ª Adelina Martha dos Reis.

Dissertação (mestrado) – Universidade Federal da Bahia, Programa Multicêntrico de Pós-Graduação em Ciências Fisiológicas, 2010

1. Obesidade - Fator Natriurético Atrial. 2. Hipertensão - Fator Natriurético Atrial. 3. Estrógenos. I. Universidade Federal da Bahia. Programa Multicêntrico de Pós-Graduação em Ciências Fisiológicas. II. Título.

AGRADECIMENTOS

A Deus.

À minha mãe, irmã, irmãos, sobrinhos e cunhados pelo carinho e dedicação. A minha noiva Loreta pela compreensão, carinho e auxílio.

Aos meus cunhados Lorena e Cacau pelo apoio e compreensão no período do mestrado.

A Profa. Najara de Oliveira Belo pela amizade e por ter acreditado em mim profissionalmente, orientando e amparando-me nos momentos de dificuldades, compartilhando suas habilidades e ensinando a superar as barreiras durante este trabalho.

As Professoras Telma de Jesus Soares e Amélia Cristina Mendes de Magalhães pela simpatia de ambas e apoio neste projeto nas áreas de função renal e na dieta, respectivamente.

As colegas Liliany, Ana Carolina, Kelly e Daniela pelo convívio harmonioso, constante apoio, troca de informações e companheirismo.

À Profa. Adelina Martha dos Reis pela oportunidade de estar ao seu lado durante todo o período em que estive na UFMG, auxiliando-me nas dificuldades, nos experimentos, assim como pela sua constante preocupação sobre minha logística em Belo Horizonte.

Ao Prof. José Rodrigues Antunes pela iniciativa em propagar o conhecimento da Fisiologia por meio do Programa Multicêntrico em Ciências Fisiológicas e constantes diálogos incentivadores.

Aos Professores e colegas de turma das Universidades Nucleadoras da USP de Ribeirão Preto e UFMG pelo acolhimento.

A Janine Costa Ivo por sua assistência no experimento de radioimunoensaio do ANP.

A Luciana Firmes pelo constante apoio na realização dos experimentos de RT-PCR e radioimunoensaio na UFMG.

Aos colegas de iniciação científica Gleisy, Thiago Henrique, Thiago Moreira, Jussara, Luciano, Carol, Clarisse, Grazielle, Roberta, Alfredo, Jucimara, Welber por auxílio em algumas partes desse trabalho.

A bibliotecária, Flávia Bulhões de Sousa, pelo auxílio nas normas técnicas da ABNT. A UESB pela liberação para qualificação docente.

Ao CNPQ, CAPES e FAPESB pelo suporte financeiro.

RESUMO

Introdução e objetivos: A obesidade é uma doença complexa, multifatorial, de

proporções epidêmicas e é o principal fator de risco para o desenvolvimento da hipertensão arterial. Na pós-menopausa ocorre um aumento da incidência de obesidade central e hipertensão. Todavia, os mecanismos envolvidos nesta associação não estão esclarecidos. Os peptídeos natriuréticos podem participar da gênese desta fisiopatologia, pois permitem a redução da pressão arterial e evitam a hipertrofia cardíaca. Desta forma, indivíduos obesos apresentam baixos níveis plasmáticos de peptídeo natriurético atrial (ANP) e alta quantidade de receptores natriuréticos de clearance (NPR-C) que favorecem o desenvolvimento de hipertensão arterial e hipertrofia cardíaca. Assim, o objetivo deste projeto foi estudar o papel do sistema de peptídeos natriuréticos na patogênese da hipertensão e da obesidade induzidas por dieta hipercalórica utilizando ratas ovariectomizadas.

Metodologia: Foram utilizadas 30 ratas Wistar pesando entre 150-200g. As ratas

foram ovariectomizadas ou sham-operadas. Os animais receberam as seguintes dietas: dieta de alto teor de carboidrato ou dieta com alto teor de lipídeos ou dieta controle. Foram mensuradas a massa corporal, a pressão arterial durante 24 semanas. Em seguida, as ratas foram sacrificadas e o sangue e os tecidos foram removidos para análises posteriores. Foram realizadas: dosagem de ANP por radioimunoensaio, mensuração do diâmetro dos cardiomiócitos por análise morfológica e histológica de ventrículos e, reação em cadeia da polimerase para determinação da expressão de ANP e seus receptores em rins, tecido adiposo e coração.

Resultados: As ratas ovariectomizadas sob dieta hiperlipídica mostraram aumento

do peso corporal, da soma total de gorduras, da gordura visceral mesentérica e parametrial, pressão sanguínea sistólica e média. A pressão arterial sistólica e média foi correlacionada positivamente com o aumento do peso corporal nas ratas sob dieta hiperlipídica. Além disso, estas ratas mostraram menor expressão gênica de ANP cardíaco e plasmático e maior expressão gênica de NPR-C no tecido adiposo e renal do que o grupo controle. Observou-se ainda uma correlação inversa entre a expressão gênica de ANP ventricular e o peso cardíaco e correlação positiva entre o aumento da expressão gênica de NPR-C e a elevação da pressão arterial

nas ratas ovariectomizadas sob dieta hiperlípidica. A maior razão da massa cardíaca/corporal, a diminuição do lúmen das câmeras cardíacas, o aumento da espessura do miocárdio e do diâmetro dos cardiomiócitos ventriculares sugerem hipertrofia cardíaca concêntrica nas ratas ovariectomizadas sob dieta hiperlipídica.

Conclusão: Estes dados mostram que a combinação da ovariectomia com a dieta

hiperlipídica favorece o desenvolvimento da obesidade, aumento da pressão arterial e hipertrofia cardíaca. Estes resultados sugerem que a redução da atividade do sistema de peptídeos natriuréticos pode ser um dos mecanismos envolvidos não somente no aumento da pressão arterial, mas também na hipertrofia cardíaca associada com a obesidade em ratas ovariectomizadas.

Palavras-chaves: Hipertensão. Obesidade. Estrógenos. Fator natriurético atrial.

ABSTRACT

Introduction and aims: Obesity is a major challenge for basic science and clinical

research, since it represents an important risk for serious diet-related chronic diseases including cardiovascular disease. Among other factors, obesity is an important contributor to hypertension in humans and it is associated with salt retention, especially in postmenopausal women. The mechanisms that link obesity with high blood pressure, cardiac hypertrophy and postmenopausal status have not been fully elucidated. It has been suggested that the natriuretic peptide system may contribute to the development of hypertension in obese subjects, once they promotes blood pressure reduction. Some authors hypothesized that obese individuals may have an impaired natriuretic response. The present study was designed to study the involvement of natriuretic peptide system in the mechanisms of obesity hypertension.

Methods: We used female Wistar rats weighting 150-200g. The animals were

ovariectomized or sham-operated and they were divided into six groups: ovariectomized or operated with high-fat diet, ovariectomized or sham-operated with control diet, ovariectomized or sham-sham-operated with high-carbohydrate diet. At the end of every week in the entire study period, body weight and blood pressure were measured. After 24 weeks of diet, rats were killed and tissues were removed. Cardiac atrial natriuretic peptide (ANP), clearance receptor (NPr-C) gene expression was determined by PCR. ANP concentrations were measured in plasma. Transverse sections of the ventricles were stained with hematoxylin and eosin stain for measurement of cardiomyocyte diameter and fibrosis.

Results: Ovariectomized fat-fed rats (OF) showed increased body weight, visceral

fat depot and blood pressure compared to others groups. A direct correlation was observed between body weight and mean blood pressure in ovariectomized rats. Also, these rats showed higher heart-to-body weight and cell diameters of ventricular cardiomyocytes and lower cardiac ANP mRNA and plasma ANP than control group. The adipocyte and renal NPr-C mRNA of OF rats are higher than control. An inverse correlation was observed between ventricular ANP gene expression and heart weight in ovariectomized rats. Also, a correlation was observed between adipocyte NPr-C gene expression and blood pressure in ovariectomized rats. The cardiac

enlargement in the ovariectomized high-fat diet rats was associated with reduced chamber lumen and increased wall thickness, indicative of concentric hypertrophy.

Conclusions: Our findings show that a high-fat diet plus ovariectomy promote

decreased synthesis and increased depuration of ANP what can generated obesity, increase of the blood pressure and cardiac hypertrophy in female animals. These results suggest that the impairment of natriuretic peptide system may be one of the mechanisms involved not only in the increase of the blood pressure, but also in cardiac hypertrophy associated with obesity in ovariectomized rats.

LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS

ADH Hormônio anti-diurético

AGP Ácidos graxos poliinsaturados AGS Ácidos graxos saturados

AIN American Institute of Nutrition (Instituto de Nutrição Americano)

AMPc Adenosina monofosfato cíclico

ANP Atrial Natriuretic Peptide (peptídeo natriurético atrial)

AT Angiotensina

AT1 Receptor de angiotensina do tipo 1 AVC Acidente vascular cerebral

BNP Brain Natriuretic Peptide (peptídeo natriurético cerebral)

cDNA DNA complementar

CNP C-type natriuretic peptide (peptídeo natriurético do tipo C)

DC Dieta controle

DCO Rata ovariectomizadas alimentada com dieta controle DCS Rata sham alimentada com dieta controle

DEPC Dietilpirocarbonato

DL Dieta com alto teor de lipídios ou dieta hiperlipídica

DLO Rata ovariectomizadas alimentada com dieta hiperlipídica DLS Rata sham alimentada com dieta hiperlipídica

DNP Dendroaspis natriuretic peptide (peptídeo natriurético dendoraspis)

DNTP Desoxiribonucleotídeo trifosfatado

DS Dieta com alto teor de carboidrato refinado ou dieta hipersacarídica DSO Rata ovariectomizadas alimentada com dieta hipersacarídica

DSS Rata sham alimentada com dieta hipersacarídica EDTA ácido etilenodiamino tetra-acético

eNOS Óxido nítrico sintase endotelial EPN Endopeptidase neutra

ER Receptor de estrógeno ERα Receptor de estrógeno tipo α

ERαKO Camundongo sem receptor de estrógeno tipo α ERβ Receptor de estrógeno tipo β

ERβKO Camundongo sem receptor de estrógeno tipo β ET-1 Endotelina-1

FENA+ Fração de excreção de sódio FES Fração de excreção de sódio

FORKO Camundongos nocautes para o receptor de FSH FSH Hormônio folículo estimulante

GCA Guanilil ciclase A

GMPc Guanosina monofosfato cíclico GMT Ganho de massa total

GPCR Receptores acoplados a proteína G GTP Guanosina trifosfato

HPLC Cromatografia líquida de alta pressão HSL Lipase hormônio sensível

IMC Índice de massa corporal

IMS Instituto Multidisciplinar de Saúde

KATP Canais iônicos de potássio sensíveis a ATP

MAPK Proteína quinase ativada por mitógeno MCF Massa corporal final

MCI Massa corporal inicial

MMLV Enzima do Moloney Murine Leukemia Vírus N-ANP N-peptídeo natriurético pré-atrial terminal NFAT Fator nuclear ativado pela célula T

NO Óxido nítrico

NOS Óxido nítrico sintase

NPR Receptor de peptídeo natriurético NPR-A Receptor natriurético do tipo A NPR-B Receptor natriurético do tipo B NPR-C Receptor natriurético do tipo C OMS Organização Mundial da Saúde OVX Ovariectomizadas

PAM Pressão arterial média PAS Pressão arterial sistólica

PCR Reação em cadeia da polimerase PDE2 Fosfatidilesterase 2

PG Prostaglandinas

PGC Proteína guanilil ciclase PGF2α Prostaglandinas F2α PGH2 Prostaglandinas H2

PI3-KINASE Fosfatidilinositol-3-OH-inuase PKA Proteína quinase A

PKC Proteína quinase C PKG Proteína quinase G PKGI Proteína quinase GI PKGII Proteína quinase GII PMSF Fenilmetilsulfonilfluorido PN Peptídeos natriuréticos PREPRO Pré-hormônio

ProANP Pro-peptídeo natriurético atrial

RGS Reguladores da sinalização da proteína G RIE Radioimunoensaio

RNAm Ácido ribonucléico mensageiro RT Transcrição reversa

RT-PCR Transcrição reversa-reação em cadeia da polimerase s2 Variação do erro

SG Soma das gorduras

SRAA Sistema renina-angiotensina-aldosterona TFG Taxa de filtração glomerular

TG Triglicerídeos

UFBA Universidade Federal da Bahia

SUMARIO

01. INTRODUÇÃO

A obesidade, definida como aumento do depósito de triglicérides nas células adiposas determinado por um desequilíbrio entre consumo e gasto de energia, (MUST et al., 1999) é considerada uma doença complexa e multifatorial, de prevalência crescente, que já atingiu proporções epidêmicas na sociedade ocidental. Dados recentes da Organização Mundial de Saúde mostram que a incidência de obesidade cresce em crianças e adultos no Brasil. Foi estimado que 60,3% das mulheres brasileiras com mais de 15 anos possuem um índice de massa corporal (IMC)≥ 25 Kg/m2

(excesso de peso), 24,5% nessa mesma faixa etária possuem IMC≥ 30 kg/m² (obesas) e para as mulheres na faixa etária acima de 30 anos a prevalência de obesas aumenta para 32,1%, enquanto em 2002 apenas 20,5% das mulheres acima de 30 anos eram consideradas obesas e 58,3% estavam com excesso de peso (WORLD HEALTH ORGANIZATION, 2010).

Esse aumento também foi apontado pelo Ministério da Saúde do Brasil (2009), o qual afirma que em 2010 a obesidade aumentou entre os brasileiros, principalmente, entre mulheres (13,6%), comparado a 1975 em que apenas 2,8% dos homens e 7,8% das mulheres eram obesas e 2002 em que a obesidade atingia 8,8% dos homens e 12,7% das mulheres. É importante salientar que a obesidade entre mulheres aumenta mais de três vezes na comparação das faixas etárias de 18 e 24 anos e de 55 a 64 anos: de 6,2% para 21,3%. Já o índice de excesso de peso mais que dobra na faixa etária dos 45 aos 54 anos (52,9%) em relação a 18-24 anos (24,9%). (MINISTÉRIO DA SAÚDE DO BRASIL, 2010).

A World Health Organization (2010) relaciona o aumento da prevalência de sobrepeso e obesidade com muitas doenças crônicas relacionadas com dieta, incluindo diabetes mellitus, doença cardiovascular, acidente vascular cerebral (AVC), hipertensão e determinados tipos de câncer. Dentre estas associações, destaca-se a relação entre obesidade e pressão arterial, sendo o risco de se desenvolver hipertensão cerca de 3,8 vezes maior em obesos e de 2,4 vezes entre indivíduos com excesso de peso (JOINT NATIONAL COMMITTEE, 2004). A idade, o IMC e a circunferência abdominal aumentados são positivamente associados com uma maior prevalência de hipertensão (CIPULLO et al., 2010). Dessa forma, a obesidade é

atualmente considerada um importante e independente fator de risco para morbidade cardiovascular e mortalidade, especialmente quando do tipo visceral (KISSEBAH, KRAKOWER, 1994).

No Brasil, as doenças cardiovasculares, destacando-se a hipertensão, são responsáveis por cerca de 30% da mortalidade geral e por 1,2 milhões de hospitalizações, com um custo aproximado de 650 milhões de dólares/ano (MINISTÉRIO DA SAÚDE DO BRASIL, 2010). A hipertensão é a causa de diversos danos corporais, entre esses, a hipertrofia cardíaca concêntrica, caracterizada pelo aumento da espessura ventricular esquerda, presença ou ausência de redução da contratilidade e do tamanho da câmera cardíaca no final da diástole (JOINT NATIONAL COMMITTEE, 2004).

Em mulheres no período pós-menopausal há uma tendência de acúmulo de gordura abdominal (LOVEJOY, 2003), sendo observada em 73,8% das 157 mulheres em pós-menopausa avaliadas em ambulatórios públicos da cidade de São Paulo (FRANÇA, ALDRIGHI, MARUCCI, 2008). Apesar dos mecanismos que ligam a obesidade com a hipertensão e o estado pós-menopausal não estarem completamente elucidados, mudanças na composição corporal na menopausa pode ser causada pela diminuição dos níveis de estrógenos (LOVEJOV, 2003, FERRARA

et al., 2002), já que esse hormônio é o principal fator regulador do tecido adiposo no

desenvolvimento e fase adulta do indivíduo. O estrógeno possui efeito direto na inibição da lipogênese e na regulação do consumo e gasto energético, o que contribui para a diminuição da deposição adiposa, além de estar relacionado com o número de adipócitos (COOKE, NAAZ, 2004).

Associada à alteração dos níveis de estradiol, a hipertensão está relacionada ainda às mudanças no balanço do sódio (CIPULLO et al., 2010), resultantes de várias alterações, entre as quais da atividade do sistema nervoso simpático (GUYENET, 2006; XAVIER, VILELA, FONTES, 2008), do sistema renina-angiotensina-aldosterona (BOUSTANY, 2004) e da sensibilidade insulínica (SARZANI et al., 2008).

Mais recentemente, a participação do sistema de peptídeos natriuréticos (PN) na fisiopatologia da hipertensão e obesidade tem sido aventada (WANG et al., 2004;

DESSÌ-FULGHERI, SARZANI, RAPRELLI, 1998). Entretanto, os dados até agora apresentados são preliminares e muito estudo ainda se faz necessário para se determinar as alterações e a importância destes peptídeos e seus receptores na gênese da hipertensão e obesidade, sobretudo no período pós-menopausal.

02. REVISÃO DE LITERATURA

02.1 Peptídeos natriuréticos

A homeostase da pressão sanguínea é mantida em parte por um balanço entre as ações vasoconstrictoras/antinatriuréticas do Sistema Renina Angiotensina Aldosterona (SRAA) e as ações vasodilatadoras e natriuréticas dos peptídeos natriuréticos (SHAH et al., 2010). Entretanto, pouca atenção tem sido dada ao possível papel dos peptídeos natriuréticos e seus receptores na fisiopatologia da hipertensão arterial. A família dos peptídeos natriuréticos é composta por três peptídeos homólogos: peptídeo natriurético atrial (ANP), peptídeo natriurético tipo B (BNP) e peptídeo natriurético tipo C (CNP) (RICHARDS, 2007; POTTER, ABBEY-HOSCH, DICKEY, 2006). Além desses, há o peptídeo natriurético tipo D (DNP) e a urodilatina (GAMA, SOUZA, 2006).

Assim como os demais peptídeos natriuréticos, o ANP é sintetizado como pré-prohormônio (PREPRO) de 151 aminoácidos de comprimento, cuja clivagem da sequência terminal resulta em uma estrutura de 126 aminoácidos conhecida como proANP. O ProANP é a forma de armazenamento predominante nos grânulos atriais e é clivado durante a sua secreção pela Corina, protease serina cardíaca transmembrana, para formar a substância biologicamente ativa, o ANP com 28 aminoácidos (POTTER, ABBEY-HOSCH, DICKEY, 2006; CLERICO et al., 2006). A secreção de ANP aumenta em resposta a expansão do volume e ao aumento da pressão arterial (De BOLD et al., 2001; DIETZ, 2005; ANEJA et al., 2004). Além disso, a liberação do ANP pode ser influenciada pela endotelina-1 (SHAH, 2010), angiotensina (AT) II (AT II), agentes adrenérgicos, citocinas (IL-1, IL-6, TNF), fatores de coagulação e crescimento, insulina, hormônio do crescimento, tireoidianos, estrógenos (CLERICO et al., 2006), prostaglandinas (MELO, SONNENBERG, 1995) e pelos corticosteróides (LAUAND et al., 2007). Segundo Ruskoaho et al. (1997) os fatores endógenos liberados em resposta ao estiramento dos miócitos atriais são mais importantes na ativação da secreção do ANP do que o próprio estiramento muscular por sobrecarga de volume, apesar dos mecanismos dessa interação ainda não estarem totalmente estabelecidos.

Em um estudo realizado com 15 pacientes submetidos à circulação extracorpórea, os níveis plasmáticos de ANP se alteraram negativa e positivamente de acordo com a diminuição e aumento, respectivamente, da pressão atrial esquerda e direita, o que favorece o conceito do ANP plasmático como um fator relacionado com as pressões atriais (FRANÇOIS et al., 2002)

A obesidade é caracterizada pelo aumento da retenção de sódio devido a: ativação do SRAA por diminuição da perfusão renal em resposta à queda da pressão renal, contração no volume plasmático e diminuição da chegada de sódio para a mácula densa (KUROSKI DE BOLD, 1999); aumento da produção de aldosterona pela ativação simpática, estímulo do hormônio adreno-corticotrópico, aumento da angiotensina ou mesmo pela ausência da inibição gerada pelos níveis de ANP (PIECHOTA et al., 2007) que se encontram baixos na obesidade (RICHARDS, 2007); alteração das forças de starling (EDWARDS et al., 1986).

Os peptídeos natriuréticos antagonizam a ação de angiotensina II sobre o tônus vascular, inibem a secreção de renina e aldosterona, a reabsorção do sódio no túbulo renal e o crescimento celular vascular (SARZANI et al., 2008; WILKINS, REDONDO, BROWN, 1997; YOSHIBAYASHI, SAITO, NAKAO, 1996).

Nos rins, o ANP aumenta a taxa de filtração glomerular pela elevação da pressão nos capilares glomerulares, simultaneamente realizada por meio da dilatação da arteríola aferente e constricção da arteríola eferente (MARIN-GREZ, FLEMING, STEINHAUSEN, 1986). Além disso, o ANP inibe a reabsorção de água e sódio no túbulo proximal pela inibição do estímulo da angiotensina II e nos ductos coletores pela inibição dos canais de sódio epiteliais sensíveis a amilorida (CLERICO et al., 2006) que reduz o efluxo de sódio nessa região. No hipotálamo, o ANP suprime o apetite por sal e a liberação de hormônio anti-diurético (ADH) (SAMSON et al., 1987), a atividade simpática no tronco cerebral pela sensibilização das fibras vagais (YUSOF et al., 2009) e atenua a resposta baroreceptora (SCHULTZ et al., 1988). Assim, o aumento do ANP plasmático está correlacionado com o aumento da diurese e natriurese (FRANÇOIS et al., 2002).

O efeito inibitório do ANP sobre a renina requer a presença da proteína quinase GII (PKGII) a qual também permite a redução dos níveis de aldosterona, mas este

também é influenciado diretamente pelo ANP na zona glomerulosa da glândula adrenal por mecanismos ainda controversos (CLERICO et al., 2006). Sabe-se que estes mecanismos podem envolver a formação de guanosina monofosfato cíclico (GMPc) aumentando a expressão da fosfatidilesterase 2 (PDE2) que degrada adenosina monofosfato cíclico (AMPc), substrato para a formação da aldosterona na glomerulosa (MACFARLAND, ZELUS, BEAVO, 1991).

No coração, os peptídeos natriuréticos inibem a hipertrofia e a fibrose (RICHARDS, 2007; LI et al., 2008; MIAO et al., 2010) de maneira autócrina (KNOWLES, 2001), sendo que a diminuição da expressão gênica do ANP resulta em hipertrofia cardíaca (FRANCO et al., 2004).

O ANP modula a hipertrofia cardíaca induzida por sobrecarga de volume (MORO, BERLAN, 2006) por inibição da proliferação de células de músculo liso no vaso e de secreção de matriz extracelular pelos fibroblastos cardíacos (ROSENKRANZ et al., 2003), porém os mecanismos ainda não estão completamente esclarecidos. Uma possível explicação para o efeito anti-hipertrófico do ANP pode ser devido a sua ação depressora sobre os canais de Ca++, via ativação da proteína guanilil ciclase (pGC), produção de GMPc e ativação de PDE2 por GMPc com subsequente depressão da proteína quinase A (PKA) dependente de AMPc no desenvolvimento inicial dos cardiomiócitos (MIAO et al., 2010).

A inibição da hipertrofia cardíaca pelo ANP pode sofrer a influência da leptina, já que esta modula a atividade transcricional do gene promotor do ANP por meio da ativação da NFATc4, um tipo de fator nuclear ativado pela célula T (NFAT). Esse fator é Ca++-calmodulina dependente e está envolvido na hipertrofia patológica. Dessa forma, a diminuição da leptina reduz a NFATc4, assim como o ANP cardíaco (MASCARENO et al., 2009). O ANP ao ser acoplado na guanilil cilclase A (GCA) ativa a proteína quinase G (PKG), a qual se liga, fosforila e ativa os reguladores da sinalização da proteína G (RGS) que interage, negativamente, com a sinalização dos agonistas dos receptores acoplados a proteína G (GPCR), impedindo a ativação da calcineurina que gera hipertrofia cardíaca. Entretanto, os efeitos da interação do ANP com a GCA em modular a hipertrofia cardíaca é independente da regulação da pressão arterial (TOKUDAME et al., 2008).

Os efeitos do ANP sobre a pressão arterial se devem a combinação dos efeitos sobre o volume intravascular, natriurese, diurese e relaxamento vascular. Camundongos transgênicos com maior expressão do gene ANP têm menor pressão sanguínea, enquanto animais com o gene para ANP inativado são propensos a desenvolver hipertensão (MELO et al., 1998; MELO et al., 2000). Da mesma forma, sugere-se que o ANP pode ser importante na hipertensão relacionada com a obesidade onde os níveis de ANP são menores (DESSÌ-FULGHERI et al., 1997). A administração exógena de ANP promove uma forte resposta na redução da pressão arterial, no aumento da natriurese e na excreção urinária de GMPc em indivíduos obesos (DESSÌ-FULGHERI et al., 1999).

A manutenção dos altos níveis de pressão sanguínea pode estar relacionada a alterações da resposta do sistema de óxido nítrico ao ANP e aos seus receptores no coração e aorta de animais hipertensos. Em átrios, ventrículo e aorta, o ANP interage com receptores NPR-C ativando a óxido nítrico sintase (NOS) endotelial (eNOS) através da proteína G inibitória. Em ventrículo e aorta, a ativação da NOS também envolve NPR-A/NPR-B(COSTA et al., 2010).

O relaxamento vascular promovido pelo ANP ocorre por uma via dependente da proteína quinase GI (PKGI) que permite a diminuição dos níveis de cálcio intracelular e da sensibilidade ao cálcio pelo sistema de contração muscular (POTTER, ABBEY-HOSCH, DICKEY, 2006). Essa proteína age diretamente na fosforilação e ativação dos canais de potássio ativados pelo cálcio (ALIOUA et al., 1998) que aumenta o efluxo de potássio, causa hiperpolarização da membrana e inibição do influxo de cálcio pelos canais de cálcio voltagem dependentes.

Desta forma, os peptídeos natriuréticos defendem o organismo contra a retenção de sódio e água, inibem a produção e ação de peptídeos vasoconstrictores como a angiotensina II, promovem relaxamento vascular e ainda inibem o sistema nervoso simpático. Estas ações levam à redução da pressão arterial, principalmente em situações com elevada volemia (LEVIN, GARDINER, SAMSON, 1998). A capacidade anti-hipertensiva do ANP pode ser devido à combinação das suas ações natriuréticas, vasodilatadoras e inibitórias sobre o sistema nervoso simpático e SRAA.

Os níveis circulantes de ANP podem ser regulados ou modificados por vários fatores fisiológicos, entre eles podem-se citar a idade, hábitos alimentares, condições clínicas e particularmente, o gênero (CLERICO et al., 2006, CLERICO et al., 2009). Existem duas possíveis vias pelas quais a produção dos peptídeos natriuréticos pode ser influenciada pelo estrógeno, uma das vias está relacionada ao efeito direto dos hormônios ovarianos sobre a expressão gênica e liberação cardíaca dos peptídeos natriuréticos, enquanto a outra se deve a um ou mais mecanismos mediadores como o SRAA (KUROSKI DE BOLD, 1999; XU et al., 2008). Hong et al. (1992) demonstraram que a ovariectomia diminuiu o ácido ribonucléico mensageiro (RNAm) de ANP transcrito no átrio, e após um tratamento por 7 dias, ratas Wistar recebendo estradiol e progesterona, aumentaram a expressão gênica atrial de ANP. Os diversos efeitos biológicos dos peptídeos natriuréticos são mediados pela ligação destes hormônios a receptores específicos associados à membrana, os quais têm sido encontrados em todos os tecidos em que os peptídeos natriuréticos agem, incluindo adrenais, coração, tecido adiposo, cérebro, pulmões, rins, músculo liso vascular, útero, condrócitos (POTTER, ABBEY-HOSCH, DICKEY, 2006). Existem três subtipos diferentes de receptores de peptídeos natriuréticos (NPR). O receptor de peptídeo natriurético do tipo A (NPR-A) e o receptor de peptídeo natriurético do tipo B (NPR-B) são os únicos que contém um domínio catalítico intracelular guanilato ciclase, o qual media a ação dos peptídeos natriuréticos pela produção do segundo mensageiro GMPc (RICHARDS, 2007). O terceiro receptor, NPR-C, não está associado com qualquer mediador intracelular específico e funciona principalmente na captação, internalização e degradação intracelular (lisossomal) do hormônio (POTTER, ABBEY-HOSCH, DICKEY, 2006; LEVIN, GARDINER, SAMSON, 1998). Alguns estudos, usando técnicas de afinidade de ligação, mostraram que o NPR-B é seletivo para CNP, sendo que este tem baixa afinidade de ligação para NPR-A. O NPR-A é seletivo para ANP e BNP (SENGENÈS et al., 2002) e tem sua produção aumentada em estados hipertensivos (YOSHIMOTO et al., 1995). Em contraste, o NPR-C tem ampla especificidade, ligando-se a todos os três peptídeos natriuréticos, apesar de ter uma maior afinidade para o ANP (ESPINER et al., 1995).

Os receptores NPR-A e NPR-B possuem um domínio extracelular ligante com subdomínios aminas e íons cloreto em seu interior, uma região transmembrana

hidrofóbica, um domínio homólogo quinase intracelular, um domínio de dimerização e um domínio guanilato ciclase carboxil-terminal com duas proteínas (HSP 70 e 90). Acredita-se que o domínio catalítico forma um dímero em um arranjo que contém dois sítios ativos que transforma guanosina trifosfato (GTP) em GMPc. Além disso, há uma ligação dissulfeto no domínio extracelular. Já o NPR-C possui uma estrutura que é apenas 30% similar ao domínio extracelular do NPR-A e NPR-B (POTTER, ABBEY-HOSCH, DICKEY, 2006).

No estado basal, o receptor NPR-A é fosforilado em serinas ou treoninas com seis sítios fosfatos dentro do domínio homólogo quinase afim de que o mesmo seja sensível a ativação hormonal. Contudo, a fosforilação em alanina diminui a atividade guanilato ciclase e consequentemente a sensibilidade do receptor. A ligação do ANP no NPR-A induz uma mudança na conformação nas regiões do domínio extracelular que expõe as regiões justamembranas do domínio, sendo que esse sinal é propagado pela membrana até o domínio guanilato ciclase que permite a sua dimerização em dois sítios ativos (POTTER, ABBEY-HOSCH, DICKEY, 2006). Entretanto, em algumas situações patológicas, a exposição prolongada ao ANP estimula a diminuição da sensibilidade do receptor (CLERICO et al., 2006), pois há a desfosforilação deste que resulta em diminuição da sua atividade, processo denominado de desensibilização e inibe o processo de fosforilação necessário para o acoplamento do ANP no NPR-A. Porém, a liberação do ligante e refosforilação retorna o receptor ao seu estado basal para novos acoplamentos (POTTER, ABBEY-HOSCH, DICKEY, 2006), permitindo que o ANP promova os seus efeitos fisiológicos em um novo acoplamento.

A expressão do NPR-C está aumentada em tecido adiposo humano (SARZANI, 2004), o que aumenta o clearence de ANP e consequentemente, diminui os seus níveis plasmáticos. A expressão de ANP em tecido adiposo e pré-adipócitos sugeriu a existência de um sistema autócrino/parácrino de ANP nesse tecido, cujas implicações na lipólise e na função cardiovascular ainda não foram completamente estudadas (GARRUTI et al., 2007).

Segundo Wang et al. (2004) o índice de massa corporal foi inversamente associado com os níveis de peptídeos natriuréticos. O sobrepeso foi associado com níveis

plasmáticos de peptídeos natriuréticos de 1,4 a 3,5 vezes menores, assim como na obesidade em que os níveis foram de 1,8 a 4,8 vezes mais baixos. Os níveis plasmáticos de peptídeos natriuréticos eram 6-27% maiores em indivíduos hipertensos comparados com não hipertensos. No entanto, indivíduos com sobrepeso e obesidade e ainda hipertensão, tinham baixos níveis de BNP e N-peptídeo natriurético pré-atrial terminal (N-ANP) comparados com indivíduos não hipertensos com IMC normal. Os mesmos autores citam que a redução da atividade dos peptídeos natriuréticos é uma manifestação da síndrome metabólica que pode ter importantes implicações clinicas e fisiopatofisiológicas. Porém, os mecanismos responsáveis pela relação inversa entre os peptídeos natriuréticos e a massa corporal não foram totalmente esclarecidos (RICHARDS, 2007).

Um possível mecanismo para a redução dos peptídeos natriuréticos em obesos pode ser devida aos receptores do tipo C, NPR-C, abundantes no tecido adiposo, e que participam na remoção dos peptídeos natriuréticos da circulação (LAFONTAN et

al., 2005; MORO et al., 2004). A secreção reduzida de peptídeos natriuréticos pela

menor liberação (LICATA et al., 1994) ou pela diminuição de sua síntese (MORABITO, VALLOTTON, LANG, 2001) pode também ser uma explicação importante para os baixos níveis de peptídeos natriuréticos no plasma de indivíduos obesos. Além disso, também é hipotetizado que a endopeptidase neutra (EPN), que realiza proteólise de peptídeos natriuréticos e está presente na membrana de adipócitos e pré-adipócitos (SCHLING, SCHA¨FER, 2002), pode está elevada na obesidade e contribuir para a depuração dos peptídeos natriuréticos circulantes (MORO et al., 2007).

Foi demonstrado que a ligação de ANP ao receptor NPR-A em adipócitos, induz mobilização e oxidação lipídica em primatas (SENGENÈS et al., 2000; LAFONTAN

et al., 2005; BIRKENFELD et al., 2005). Em outras espécies como em ratos, a menor

responsividade do tecido adiposo ao ANP pode estar relacionada com a maior expressão de NPR-C. Além disso, a estimulação da pequena quantidade de NPR-A existente não é suficiente para promover o aumento do GMPc necessário para a fosforilação da lipase hormônio sensível (HSL) (LAFONTAN et al., 2005).

Dessa forma, baixos níveis de peptídeos natriuréticos podem reduzir a lipólise e consequentemente perpetuar o estado obeso (WANG et al., 2004). Nesse caso,

além da ausência ou diminuição dos efeitos cardioprotetores dos peptídeos natriuréticos, o quadro da obesidade também se agrava devido à diminuição da lipólise, constituindo um ciclo vicioso. Os peptídeos natriuréticos também regulam a proliferação de adipócitos e a expansão do tecido adiposo visceral (SARZANI et al., 2008).

O efeito lipolítico do ANP envolve uma via dependente de GMPc que não está relacionada com a PKA, com a inibição da fosfodiesterase PDE-3B ou ainda pela alteração na produção de AMPc. Esse efeito está relacionado com a ativação da PKG, a qual promove a fosforilação da perilipina e da HSL (LAFONTAN et al., 2005). Estes achados, de um novo controle da lipólise pelos peptídeos natriuréticos, levantam a questão da função fisiológica desta nova via lipolítica e seu possível envolvimento com o desenvolvimento e a patogênese da obesidade (SENGENÈS et

al., 2000).

Mais recentemente foi demonstrado que o ANP inibe a produção de adipocinas e citocinas ligadas ao desenvolvimento da resistência à insulina (MORO, BERLAN, 2006) e aumenta a produção de adiponectina, proteína anti-inflamatória nos adipócitos humanos, com possível efeito benéfico sobre o sistema cardiovascular (TSUKAMOTO et al., 2009). Também foi verificada associação entre os níveis plasmáticos de BNP com o desenvolvimento da resistência à insulina na hipertensão associada à obesidade (TEKES, CIKIM, 2007), assim como com a hipertrofia cardíaca (RITTER, NEYSES, 2003).

Em um estudo realizado com 3333 indivíduos com insuficiência cardíaca, observou-se que os níveis plasmáticos de peptídeo natriurético foram inversamente associados com todos os componentes da síndrome metabólica, exceto com a pressão sanguínea elevada, o que sugere que a redução da atividade dos peptídeos natriuréticos é uma manifestação da síndrome metabólica que pode ter importantes implicações clínicas e fisiopatológicas (WANG et al., 2007).

Sarzani et al (1999) mostraram que variações na região promotora do gene Npr3 que codifica o receptor depurador de peptídeos natriuréticos NPR-C, foi associada com baixos níveis de ANP e alta pressão sanguínea em pacientes obesos hipertensivos que tinham uma reduzida taxa de expressão NPR-A/NPR-C no tecido

adiposo. Em um de seus estudos, Sarzani et al. (2004) mostraram uma possível associação entre polimorfismo NPR-C C(55)A com índice de massa corporal, distribuição de gordura corporal e pressão sanguínea em homens. Não houve diferença significativa nos índices antropométricos, pressão sanguínea e variáveis bioquímicas relevantes entre os genótipos. Há especulações que a variação genética Npr3 poderia estar associada com uma alteração funcional no metabolismo do tecido adiposo, levando a diferenças quantitativas na deposição da gordura corporal.

Dessì-Fulgheri, Sarzani, Raprelli (1998) buscando elucidar o papel fisiopatológico dos peptídeos natriuréticos e sua relação com o tecido adiposo, compararam a expressão gênica de ANP e dos receptores NPR-A e NPR-C nos tecidos adiposos de humanos e ratos. O ANP plasmático encontrado foi menor em obesos hipertensivos do que nos normotensivos, entretanto, em sujeitos não-obesos o ANP plasmático foi maior em hipertensos do que em normotensos. A razão dos níveis de RNAm NPR-A/NPR-C foi significantemente menor em obesos hipertensos, o que sugere uma diminuição da atividade biológica e aumento da depuração de peptídeos natriuréticos no tecido adiposo. Esses dados suportam a hipótese de uma possível participação do sistema de peptídeos natriuréticos na obesidade relacionada à hipertensão.

Existem evidências de que a dieta tem um efeito regulador na pressão sanguínea, bem como na atividade renal (DESSÌ-FULGHERI, SARZANI, RAPRELLI, 1998). Em um estudo, oito pacientes obesos e hipertensos receberam uma dieta com baixo teor calórico e em seguida, injeção em bólus de ANP exógeno. A injeção de ANP depois da dieta foi acompanhada de um aumento nos níveis de ANP similares ao observado antes da dieta. Uma significante diminuição da pressão sanguínea sistólica e diastólica foi observada depois de quatro dias de dieta com baixo teor calórico e o início da fase de perda de peso foi acompanhada por um considerável aumento na diurese e natriurese. Houve uma significante redução da aldosterona plasmática observada com a administração de ANP depois da dieta com restrição de calorias (DESSÌ-FULGHERI et al., 1999). Sengenès et al. (2002) observaram que o consumo de dieta hipocalórica promoveu a melhora da lipólise. Estes achados confirmam a importância da captação calórica na modulação da atividade biológica

de ANP, sugerindo que o sistema de peptídeos natriuréticos pode ter participação nas mudanças agudas da natriurese e diurese associada com a restrição calórica. Percebe-se, portanto, a existência de evidências de que o sistema de peptídeos natriuréticos esteja envolvido no desenvolvimento tanto da hipertensão quanto da obesidade. O esclarecimento da participação do sistema de peptídeos natriuréticos na hipertensão e na obesidade, especialmente no quadro da pós-menopausa, trará contribuições para a prevenção e tratamento das mesmas.

02.2 Hipertensão, menopausa e obesidade

Além dos peptídeos natriuréticos, outras hipóteses a respeito da hipertensão associada à obesidade na pós-menopausa têm sido estudadas. O estudo da transição à menopausa e da terapia de reposição hormonal pós-menopausa tem fornecido evidências de que os esteróides sexuais desempenham função importante como reguladores da distribuição de gordura e na redução dos fatores de risco para doenças cardiovasculares. De fato, a menor incidência de doenças cardiovasculares tanto em mulheres antes da menopausa quanto em ratas e camundongas tem levantado à hipótese de que os hormônios sexuais, particularmente o estrógeno, sejam responsáveis por uma proteção cardiovascular (MENDELSOHN, KARAS, 1999; JANKOWSKI et al., 2001; TOSTES et al., 2003) contribuindo para redução tanto do peso do tecido adiposo (BELO et al., 2008; COOKE, NAAZ, 2004) quanto da pressão arterial (BELO et al., 2004; WEST et al., 2001).

Vários mecanismos têm sido propostos para tentar elucidar os efeitos diretos e indiretos do estrógeno no sistema cardiovascular, como por exemplo, redução da pressão arterial e atividade oxidante, alterações no metabolismo lipídico e de depósito do tecido adiposo (TOSTES et al., 2003). A administração de estradiol diminuiu a pressão arterial de mulheres normotensas após dois meses de tratamento (CAGNACCI et al., 1999). Estradiol administrado oralmente ou por via transdérmica diminuiu a resistência vascular periférica e consequentemente a pressão arterial de mulheres na pós-menopausa (WEST et al., 2001).

Os mecanismos pelos quais o estrógeno realiza essas alterações no sistema cardiovascular ainda são incertos, sendo alvo de inúmeros estudos. Existem

evidências sugerindo que o estrógeno pode afetar a função cardiovascular, por reduzi a pressão arterial, via ação direta nos vasos sanguíneos (MURPHY, KHALIL, 2000), ação central no sistema nervoso autônomo (SALEH, CONNELL, SALEH, 2000), formação de substâncias vasodilatadoras, como oxido nítrico (TOSTES et al., 2003), ou inibição da formação e/ou ação de substâncias vasoconstritoras, como as prostaglandinas (PG) H2 (PGH2)e F2a (PGF2a) (DANTAS et al., 1999) e angiotensina

II (TAKEDA-MATSUBARA et al., 2002).

Nas células endoteliais, o estradiol altera ou modula o fluxo de íons e de receptores da musculatura lisa. O estradiol aumenta a biodisponibilidade de óxido nítrico (NO) (TOSTES et al., 2003), diminui a expressão de receptores de angiotensina do tipo 1 (AT1), de angiotensina II pelo NO (NICKENIG et al., 2000) e diminui a endotelina-1 (ET-1) e seus receptores (TOSTES et al., 2003). Também inibi o crescimento da musculatura lisa vascular promovida pelos receptores AT1 (TAKEDA-MATSUBARA

et al., 2002). Nas células da musculatura lisa vascular, o 17-ß-estradiol pode

desempenhar uma função seletiva na regulação do tônus da musculatura lisa vascular por modular a permeabilidade dos canais iônicos de K+ sensíveis a ATP (KATP) (MARTINEZ et al., 2001), assim como dos canais de Ca++ (TOSTES et al.,

2003).

A implicação da ação benéfica e protetora do estrógeno na circulação cardiovascular necessita ser completamente elucidada para o esclarecimento das condições fisiopatofisiológicas observadas na pós-menopausa, como por exemplo, a hipertensão arterial, e para sua aplicação na prática clínica. Como a obesidade é fator de risco para o desenvolvimento de doenças cardiovasculares, em especial hipertensão arterial, a ação do estrógeno no tecido adiposo também merece destaque.

O estrógeno tem sido descrito como o principal regulador do tecido adiposo em fêmeas adultas (COOKE, NAAZ, 2004) regulando a sua deposição de maneira dependente da localização do depósito. As mulheres têm mais tecido adiposo subcutâneo do que os homens, com uma média de percentual de gordura corporal em mulheres jovens de 25% contra 15% em homens (CHUMLEA et al., 1981). O aumento da gordura abdominal nas mulheres na pré-menopausa parece ser inibido

pelo estrógeno, quando são comparadas com os homens que tendem a ter um depósito de gordura no abdômen.

Todavia, a gordura abdominal pode aumentar nas mulheres no período pós-menopausa (LEY, LESS, STEVENSON, 1992), o que está correlacionado com um aumento no risco de desenvolvimento de várias doenças. No Brasil, a prevalência de obesidade cresce nas mulheres na pós-menopausa. Na faixa etária de 18 a 24 anos é de 6,2% e, na faixa etária de 55 a 64 anos é de 21,3%. O mesmo ocorre com o excesso de peso que aumenta de 24,9% para 52,9% nas mulheres nas mesmas faixas etárias (WORLD HEALTH ORGANIZATION, 2010).

A ovariectomia em roedores ou a menopausa em mulheres resulta em aumento do depósito de tecido adiposo (COOKE, NAAZ, 2004) que está correlacionado com baixos níveis de estradiol (FERRARA et al., 2002). Já o tratamento com estradiol diminui o tecido adiposo visceral em mulheres na pós-menopausa (MUNOZ, DERSTINE, GOWER, 2002). Animais manipulados geneticamente fornecem fortes evidências que o estrógeno modula a quantidade de tecido adiposo. Tanto camundongas que não expressam o receptor para estrógeno do tipo α, (HEINE et

al., 2000), quanto as que não expressam a enzima aromatase (JONES et al., 2000),

apresentam uma grande quantidade de tecido adiposo. Este efeito do estrógeno pode acontecer através da diminuição da lipogênese (HOMMA et al., 2000), aumento da lipólise por meio da ativação da HSL (PALIN et al., 2003), aumento dos efeitos lipolíticos da epinefrina (SHERWOOD et al., 2010) e da oxidação dos ácidos graxos (MISSO et al., 2003). Assim, percebe-se que o estrógeno desempenha também importante função na regulação do tecido adiposo.

Existem dois tipos de receptores de estrógeno (ERs) intracelulares: tipo α (ERα) e tipo β (ERβ) e seus variantes (MARINO, GALLUZZO, 2008), não totalmente homólogos e consequentemente, passivos de não possuírem efeitos semelhantes na interação com o estrógeno (TOSTES et al., 2003). As diferenças fisiológicas na interação do ERβ em relação ao ERα com o estrógeno ou elementos responsivos a este se deve a falta de habilidade e capacidade da terminação amina do ERβ interagir com o domínio carboxil-terminal de ativação dependente de hormônio (LI et

A função do receptor de estrógeno tipo α (ERα) no tecido adiposo foi verificada ao comparar os tecidos adiposos de camundongos selvagens com os que não expressam ERα (ERαKO). Observou-se que a ausência de ERα causa um aumento de 100% da massa de tecido adiposo decorrente de hiperplasia e hipertrofia adipocitárias, além de resistência à insulina e intolerância à glicose (HEINE et al., 2000). Isso indica que ERα regula a deposição de tecido adiposo (DIEUDONNÉ et

al., 2004).

Para avaliar a participação da sinalização E2/ERβ no tecido adiposo, camundongos que não expressam ERβ (ERβKO) foram ovariectomizados e observou-se que nesses animais houve diminuição do tecido adiposo e da massa corporal comparados aos apenas operados (sham-operados). Isso indica que ERβKO deve ter um efeito inibitório na deposição do tecido adiposo que é o oposto ao efeito mediado pelo ERα (NAAZ et al., 2002). Dessa forma, apesar do ERα ser o modulador predominante dos efeitos do estrógeno no tecido adiposo, ERβ parece também possuir um papel nos efeitos do estrógeno sobre os adipócitos.

No metabolismo lipídico, a reposição de estrógenos em mulheres na pós-menopausa demonstrou impacto na diminuição dos níveis séricos de colesterol total (HAARBO, MARSLEW, 1991) e de lipoproteína de baixa densidade (STAMPFER et

al., 1991). Além disso, o estrógeno é o maior supressor da lipase lipoprotéica

(HOMMA et al., 2000) no tecido adiposo em mulheres, o que contribui para a prevenção de lesão cardiovascular.

Contrariamente aos seus efeitos gerais anti-lipogênicos e lipolíticos, os estrógenos em locais específicos, atenuam os efeitos dos receptores adrenérgicos α2A no tecido adiposo subcutâneo e diminui a lipólise, o que favorece o aumento da deposição desse tipo de tecido em mulheres comparadas aos homens (PEDERSEN

et al., 2004).

Os mecanismos pelos quais o estrógeno influencia esses efeitos anti-lipogênicos, lipolíticos, cardioprotetores não são totalmente conhecidos, porém podem ser devido aos efeitos tardios e de duração prolongada, denominados de efeitos “genômicos”, e os efeitos de início rápido e curta duração, chamados de efeitos “não-genômicos”. Os efeitos rápidos levam minutos para ocorrerem, como as mudanças no tônus

vasomotor, sendo mediados por sinalizações celulares rápidas, enquanto os tardios incluem, por exemplo, remodelamento e alterações lipídicas que requerem horas ou dias para ocorrerem e eventos de transcrição de RNA mensageiro e expressão protéica são necessários. Apesar desses efeitos serem facilmente diferenciados um dos outros, existem ações rápidas do estradiol que ainda não se sabe se são oriundas de mecanismos genômicos ou não-genômicos (TOSTES et al., 2003; MARINO, GALLUZZO, 2008).

Assim como os receptores de outros hormônios esteroidais e tireoidianos, os receptores de estrógenos pertencem a uma classe de receptores intracelulares que têm fatores de transcrição relacionados ao núcleo. Dessa forma, a ativação desses receptores deflagra a ação de uma sequência específica nos genes alvos que modula a transcrição do RNAm (BEATO, SANCHEZ-PACHECO, 1996). Entretanto, os efeitos do estrógeno de início rápido (não-genômicos) são mediados por receptores localizados na superfície da membrana celular que levam a ativação da proteína quinase ativada por mitógeno (MAPK), produção de GMPc e liberação de NO. Mais recentemente, observou-se que a sinalização envolve caminhos não totalmente esclarecidos tais como PKG e segundos mensageiros (RUSSEL et al., 2000) ou mesmo a mobilização Ca++, proteína quinase C (PKC) e fosfatidilinositol-3-OH inuase (PI3-kinase) (KELLY, LEVIN, 2001; SIMONCINI et al., 2000).

HODGES et al. (2000) sugerem que os efeitos do estrógeno nas células vasculares e, possivelmente no miocárdio, dependem da expressão relativa de ERα e ERβ. Contudo, as funções desses receptores nas funções cardíacas não são conhecidas. ERα e ERβ distribuem-se diferentemente no organismo. ERα tem alta expressão identificada na hipófise, rins, epidídimo e glândulas adrenais, enquanto ERβ tem alta expressão na próstata, pulmões, cérebro e bexiga. Em alguns locais há alta expressão simultânea desses dois receptores de estrógeno, incluindo ovários, testículos e útero. Na vasculatura, esses dois receptores têm sido identificados no endotélio, íntima, adventícia e terminações nervosas adrenérgicas das artérias (TOSTES et al., 2003). No tecido adiposo, ERs são expressos nos pré-adipócitos (DIEUDONNÉ et al., 2004) e o estrógeno pode potencialmente regular o desenvolvimento do pré-adipócito bem como atuar diretamente no adipócito (COOKE, NAAZ, 2004).

Os estrógenos são capazes de produzir efeitos nos outros tecidos que regulam o apetite, o gasto energético ou o metabolismo. ERs são amplamente distribuídos no hipotálamo, o local primário da regulação do balanço energético ou mesmo no fígado, onde os efeitos dos estrógenos podem produzir mudanças metabólicas que afetam a deposição adiposa (COOKE, NAAZ, 2004).

Jankowski et al. (2001) observaram que o RNAm do ERβ foi expresso em alto nível no átrio esquerdo de ratos e foi 3 a 4 vezes menor nas outras câmeras cardíacas de ratos jovens. Porém em ratos adultos, o ERβ diminuiu 20 vezes no átrio esquerdo e em menor extensão nas outras câmeras cardíacas. Com a ovariectomia, observou-se a diminuição do ERα, da razão átrio/massa corporal e expressão gênica e protéica de ANP, mas nenhuma alteração na pressão sanguínea sistólica e após a reposição hormonal, essas mudanças foram revertidas, junto com a diminuição da frequência cardíaca. Percebe-se que o aumento da expressão e secreção de ANP em resposta a ativação do ERα pode ser um mecanismo de proteção no coração por diminuição do consumo de oxigênio secundário à bradicardia.

Existem evidências que camundongos que não expressam o gene para ANP ou NPR-A apresentam hipertrofia mais evidente nos átrios do que nos ventrículos, sendo o espessamento cardíaco mais pronunciado em machos do que em fêmeas (JOHN et al., 1995; OLIVER et al., 1998), o que sugere uma interação dos estrógenos e ANP na prevenção da hipertrofia cardíaca. A co-localização dos ERs e ANP nos miócitos cardíacos (BACK, FORSSMANN, STUMPF, 1989) e a estimulação da secreção de ANP em átrio direito isolado de ratos por 17-β-estradiol (DENG, KAUFMAN, 1993) sugere que o ANP age como um mediador da ação do estrógeno. Além disso, muitos dos efeitos cardiovasculares do estrógeno são semelhantes aos do ANP.

02.3 Modelo experimental de hipertensão e obesidade na pós-menopausa

Vários modelos experimentais são utilizados para estudar a patogênese da obesidade e de condições associadas como resistência a insulina, diabetes mellitus tipo 2 e dislipidemia, chamadas em conjunto de síndrome metabólica. Existem

alguns modelos animais de obesidade, como obesidade induzida por lesão do núcleo hipotalâmico ventromedial (SHIMIZU et al., 2003), por dietas hipercalóricas e através de mutações genéticas (ROBINSON, DINULESCO, CONE, 2000). Dentre estes, o modelo mais simples e o que mais se assemelha a obesidade humana é o modelo de obesidade exógena, onde é oferecido ao animal um maior aporte calórico, através de uma sobrecarga de carboidratos ou de gordura, isoladamente ou em associação (VON DIEMEN, TRINDADE, TRINDADE, 2006). A primeira descrição de dieta com alto teor de gordura data de 1959 (MASEK, FABRY, 1959). Nestes modelos experimentais, acrescenta-se ou associa-se, à ração padrão substâncias altamente calóricas.

Como ressaltado neste estudo, atualmente, uma das doenças de maior relevância, devido aos altos índices de mortalidade na população mundial, é a hipertensão associada à obesidade. Diante disto, ressalta-se a importância do uso de modelos animais apropriados para o estudo dos mecanismos envolvidos entre obesidade e o desenvolvimento de hipertensão arterial.

Os modelos experimentais de obesidade em roedores como o ob/ob, os ratos Zucher e os ratos espontaneamente hipertensos e obesos têm sido utilizados na pesquisa cardiovascular. Entretanto, estes modelos podem não apresentar as mesmas características que os humanos obesos, como hipertensão, hiperglicemia, hiperinsulinemia e hipertrofia cardíaca (AMERICAN HEART ASSOCIATION, 2005; CONTI et al., 2004). Ao contrário, os modelos de obesidade induzidos por dieta mostram-se promissores para o estudo dos mecanismos renais (Hall et al., 1998) e cardiovasculares (CARROLL, TYAGI, 2005; CARROLL et al., 1996) envolvidos em doenças relacionadas com a obesidade.

Estudos subsequentes têm revelado que a dieta com alto teor de gordura promove hiperglicemia e resistência à insulina. Assim, é geralmente aceito que as dietas com alto teor de gordura podem ser utilizadas como modelo de hipertensão associada à obesidade (OAKES et al., 1997, AHREN et al., 1999; LINGOHR, BUETTNER, RHODES, 2002). A maioria dos modelos de hipertensão associada à obesidade utilizam ratos (LANDA et al., 2007; CARROLL et al., 1996; BARNARD et al. 1998; COATMELLEC-TAGLIONI et al., 2002; DOBRIAN et al., 2000; DOBRIAN et al., 2001). A utilização de dietas hipercalóricas com elevada concentração de lipídios,

em estudos de obesidade em animais de laboratório, baseia-se na correlação positiva previamente observada entre o consumo de gordura dietética e a incidência de obesidade e as complicações clínico-metabólicas a ela associadas (WOODS et

al., 2003) como hipertensão, hipertrofia cardíaca e distúrbios renais (DOBRIAN et al., 2000). Jakobsen et al. (2004) verificaram que o aumento de apenas 5% dos

níveis energéticos de ingestão de gordura saturada foi associado com um aumento de 36% no risco de doença cardíaca coronariana entre mulheres.

Em um estudo de revisão, Buettner et al. (2007) observaram que gorduras animais e ômega-6 e 9 contido em óleos de plantas podem ser usados para gerar fenótipos de obesidade e resistência insulínica em roedores, enquanto animais alimentados com óleos de peixe não desenvolvem essas desordens. Segundo Jakobsen et al. (2009) a diminuição de 5% na ingestão de ácidos graxos saturados (AGS) e concomitante aumento na ingestão de ácidos graxos poliinsaturados (AGP) promoveram a redução no risco de eventos e mortes por causas coronarianas, mas a mesma diminuição na ingestão de AGS e a substituição por carboidratos gerou uma modesta associação entre a introdução de carboidratos e o surgimento de eventos coronarianos. Entretanto, nesse estudo o tipo de carboidrato utilizado não foi apresentado, o que dificulta comparações em relação aos efeitos deletérios proporcionados, por exemplo, por uma dieta hipersacarídica.

Os carboidratos utilizados nas dietas de animais de laboratório consistem principalmente de açucares mais reduzidos (sacarose, frutose, glicose), amido e fibras. Dietas contendo elevados teores de sacarose ou frutose têm sido associadas a distúrbios metabólicos, como hipertrigliceridemia (KEENAN et al., 1999), aumento dos teores plasmáticos de ácidos graxos não esterificados, aumento do acúmulo de triacilgliceróis no fígado e coração e hipersinsulinemia acompanhada por resistência à insulina (LUO et al., 1995).

A ingestão de carboidratos, particularmente, de frutose, pode ter um papel importante nas doenças cardiorenais que pode ser mediado, em parte, pela habilidade da frutose aumentar o ácido úrico (JOHNSON et al., 2007). Este caminho explica também por que roedores são relativamente resistentes à frutose, pois esses animais têm menores concentrações de ácido úrico devido à presença de uma enzima (uricase) que degrada ácido úrico à alantoína. Além disso, quando uricase é

inibida no rato, a frutose causa um aumento de cinco vezes nas concentrações de ácido úrico (STAVRIC et al., 1976).

A frutose é captada nos hepatócitos e em outras células, inlcuindo células tubulares, adipócitos, células epiteliais intestinais, onde é completamente metabolizada pela frutoquinase com o consumo de ATP, ao contrário do metabolismo da glicose que possui mecanismo regulatório negativo para prevenir a depleção de ATP (PERHEENTUPA, RAIVIO, 1967). Como consequência, o ácido lático e o ácido úrico são gerados no processo de metabolização da frutose e suas concentrações se elevam, promovendo efeitos hipertensivos no organismo devido a alterações como a inibição da NOS na mácula densa, a estimulação da renina e a redução da biodisponibilidade do óxido nítrico endotelial (MAZZALI et al., 2001; NAKAGAWA et

al., 2006).

Além disso, alguns dos resíduos metabólicos de três carbonos da frutose podem ser convertidos à glicose através de gliconeogênese ou podem, eventualmente, ser usados para a síntese de glicerol e ácidos graxos que através da esterificação pode formar triglicerídeos (TG), ao contrário do metabolismo da glicose, em que há vários processos que inibem a formação dos TG a partir própria glicose (HAVEL, 2005). Portanto, alta ingestão de carboidrato refinado pode resultar em alta de síntese de TG devido à falta de regulação desse caminho.

Dessa forma, indiretamente, a dieta com alto teor de frutose (também a sacarose, constituída por aproximadamente 50% de frutose) pode constituir um fator de risco independente para doenças (JOHNSON et al., 2007), por participar do desenvolvimento da síndrome metabólica e obesidade (NAKAGAWA et al., 2006) e esta pode estar relacionada à inabilidade da frutose em estimular a insulina e leptina e inibir a grelina, fatores que são conhecidos por afetar o centro da saciedade no sistema nervoso central (MAZZALI et al., 2001).

A grande maioria dos modelos animais de dieta disponíveis utiliza ratos machos e os poucos estudos com fêmeas ou não encontraram aumento de pressão arterial relacionada com a obesidade induzida por dieta (UEMURA, MORI, 2006; COATMELLEC-TAGLIONI et al., 2002) ou não mensuraram a pressão arterial (BARTNESS et al., 1992). Em coelhas foi observado aumento da massa corporal e

da pressão arterial após 12 semanas com uma dieta contendo 15% de gordura (CARROLL et al., 1996). Uemura, Mori (2006) relatam que após 3 meses de consumo de dieta com 50% de gordura na composição, as ratas não apresentaram qualquer alteração na pressão arterial. Também Coatmellec-Taglioni et al. (2002) não observaram aumento de pressão arterial em ratas após 10 semanas com uso da dieta da cafeteria, apesar do aumento significativo da massa corporal.

Por outro lado, modelos animais que foram utilizados para o estudo da hipertensão semelhantes à pós-menopausa como, por exemplo, ratas espontaneamente hipertensas ovariectomizadas (BELO et al., 2004), ganham pouco peso e não podem ser utilizados para estudar a associação entre obesidade e hipertensão. Assim, um dos objetivos deste trabalho foi padronizar um modelo de hipertensão associada à obesidade em ratas Wistar através de castração e utilização de dietas hipercalóricas e verificar a participação do sistema de peptídeos natriuréticos na hipertensão associada à obesidade induzidas por dieta hipercalórica neste modelo.

03. OBJETIVOS

03.1 Objetivo Geral

Determinar a participação do sistema de peptídeos natriuréticos na patogênese da hipertensão associada à obesidade em ratas Wistar ovariectomizadas alimentadas com dieta hipercalórica.

03.2 Objetivos Específicos

1. Comparar os efeitos das dietas com alto teor de lipídeos (DL) ou alto teor de carboidrato refinado (DS) com a dieta controle (DC) na pressão arterial sistólica e média, massa corporal, na massa de diferentes depósitos de tecido adiposo em ratas Wistar ovariectomizadas ou sham operadas.

2. Avaliar os níveis de ANP no plasma de ratas Wistar submetidas às dietas de alto índice calórico.

3. Verificar alterações na síntese de ANP a partir da determinação da expressão gênica de ANP em átrio direito e esquerdo de ratas Wistar alimentadas com dieta hipercalórica por transcrição reversa - reação em cadeia polimerase (RT-PCR). 4. Avaliar a expressão gênica de receptores natriuréticos, NPR-A no rim e NPR-C em tecido adiposo e rim de ratas Wistar alimentadas com dieta hipercalórica por RT-PCR.

5. Determinar o diâmetro dos cardiomiócitos e verificar a presença de fibrose por análise morfológica e histológica de ventrículos de ratas Wistar alimentadas com dieta hipercalórica.

04. MATERIAL E MÉTODOS

04.1 Animais

Foram utilizadas 30 ratas Wistar provenientes do Centro de Criação de Animais do Instituto de Ciências da Saúde da Universidade Federal da Bahia (UFBA), e mantidas no biotério do Instituto Multidisciplinar em Saúde/UFBA em ambiente com controle de luz (12 horas de luz, das 7 às 19h) e temperatura (23±3°C) e livre acesso à água e ração.O transporte ocorreu de acordo com as recomendações do Instituto Nacional de Saúde para os cuidados e uso de animais de laboratório e esse estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética em Experimentação Animal da Universidade Estadual de Feira de Santana, conforme Anexo 1.

Os animais consumiram ração padronizada do Instituto de Nutrição Americana (AIN) 93 (Pragsoluções, São Paulo, SP) descrita por Reeves, Nielsen, Fahey (1993) até o dia da ovariectomia. As ratas foram ovariectomizadas ou sham-operadas com dez semanas de idade e a partir desse momento, aleatoriamente, os animais foram divididos nos seguintes grupos, conforme a dieta recebida:

· Dieta com alto teor de sacarose (52,9%) (dieta hipersacarídica – DS; Pragsoluções Biociências, SP).

· Dieta contendo 54,4% do total de calorias oriundas de gordura (dieta hiperlipídica - DL; Pragsoluções Biociências, SP).

· Dieta controle (DC) (ração padronizada AIN 93; Pragsoluções Biociências, SP).

Após a ovariectomia as ratas foram colocadas em gaiolas metabólicas durante quatro dias para determinação da ingestão alimentar. O mesmo procedimento foi realizado na sexta, décima segunda e vigésima quarta semana de dieta. Nos demais dias, os animais foram acomodados em caixas com cinco animais em cada uma delas de acordo com a dieta recebida.