Estudo de pré-formulação para desenvolvimento de fitoterápicos à base de Thuja occidentalis Linn.

(1)

rave

Universidade Federal de Pernambuco Centro de Ciências Biológicas

Programa de Pós-Graduação em Inovação Terapêutica

GRAZIELLA SILVESTRE MARQUES

ESTUDO DE PRÉ-FORMULAÇÃO PARA DESENVOLVIMENTO DE FITOTERÁPICOS A BASE DE Thuja occidentalis Linn.

Recife 2015

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Tese de Doutorado submetida ao Programa de Pós-Graduação em Inovação Terapêutica da Universidade Federal de Pernambuco, como requisito parcial para a obtenção do grau de Doutor em Inovação Terapêutica.

Orientador: Prof. Dr. Pedro José Rolim Neto Co-orientadora: Prof.ª Dr.ª Rosali Mª F. da Silva

Recife 2015

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UNIVERSIDADE FEDERAL DE PERNAMBUCO

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM INOVAÇÃO TERAPÊUTICA

REITOR

Prof. Dr. Anísio Brasileiro de Freitas Dourado

VICE-REITOR

Prof. Dr. Silvio Romero de Barros Marques

PRÓ-REITOR PARA ASSUNTOS DE PESQUISA E PÓS-GRADUAÇÃO

Prof. Dr. Francisco de Sousa Ramos

DIRETORA DO CENTRO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS

Profª. Drª. Maria Eduarda Lacerda de Larrazábal da Silva

VICE- DIRETORA DO CENTRO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS

Profª. Drª. Oliane Maria Correia Magalhães

COORDENADOR DO PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM INOVAÇÃO TERAPÊUTICA

Prof. Dr. César Augusto Souza de Andrade

VICE-COORDENADOR DO PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM INOVAÇÃO TERAPÊUTICA

(4)

Catalogação na fonte Elaine Barroso

CRB 1728

Marques, Graziella Silvestre

Estudo de pré-formulação para desenvolvimento de fitoterápicos à base de Thuja occidentalis Linn. / Graziella Silvestre Marques- Recife: O Autor, 2015.

195 folhas: il., fig., tab.

Orientador: Pedro José Rolim Neto Coorientador: Rosali M. F. da Silva

Tese (doutorado) – Universidade Federal de Pernambuco. Centro de Biociências. Inovação Terapêutica, 2015.

Inclui referências

1. Matéria médica vegetal 2. Polissacarídeos 3. Imunidade I. Rolim Neto, Pedro José (orientador) II. Silva, Rosali M. F. (coorientadora) III. Título

615.321 CDD (22.ed.) UFPE/CB-2017-254

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Tese de Doutorado de Graziella Silvestre Marques, defendida e APROVADA em 09 de março de 2015, e cuja Banca Examinadora foi constituída pelos seguintes professores:

Prof. Dr. Pedro Rolim José Neto

Instituição: Universidade Federal de Pernambuco - UFPE

Assinatura: _________________________________________________________________

Prof. Dr. Luiz Alberto Lira Soares

Assinatura: _________________________________________________________________

Prof. Dra. Teresinha Gonçalves da Silva

Assinatura: _________________________________________________________________

Prof. Dr. Geisiane Maria Alves Presmich

Assinatura: _________________________________________________________________

Prof. Dra. Magaly Andreza Marques Lyra

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À minha família, que amo incondicionalmente, e aos professores que fizeram o diferencial em minha trajetória acadêmica: Pedro Rolim,

(7)

AGRADECIMENTOS

À Deus, por guiar os meus passos, e por todas bênçãos derramadas em minha vida.

Ao Laboratório de Tecnologia de Medicamentos – LTM, na figura do Prof. Pedro Rolim, por todos os ensinamentos, incentivo, confiança, compreensão e inspiração ao longo destes anos; e a todos os seus integrantes pela aprendizagem e companheirismo diário. Só tenho a agradecer por todo crescimento pessoal e profissional que me foram proporcionados ao lado desta grande família.

À minha co-orientadora, Profª Rosali Maria, pelos ensinamentos, companheirismo, apoio, paciência e disponibilidade. Sua simplicidade e forma de conduzir a vida é admirável!!!

À toda minha família, em especial aos meus pais Nilton Marques e Lucila Marques pelo amor e apoio incondicional. Não há neste mundo nada que eu possa escrever e que traduza todo meu sentimento de amor e gratidão. Só tenho a agradecer pela linda infância e adolescência que me proporcionaram. Vocês são a minha fortaleza!!!

Ao meu esposo Igor Campos, por ter surgido em meu caminho, mostrando-me o verdadeiro sentido da vida e o amor na sua forma mais simples e pura. A força do nosso amor e companheirismo faz com que todos os nossos passos sejam conduzidos naturalmente e sem muito planejamento e dificuldade! Obrigada por ter “desorganizado” minha vida, tão planejada, e por ter me apresentado uma nova forma de enxergar o mundo!

À minha nova família, em especial aos meus sogros Valéria Campos e Clovis Barros pela confiança e carinho com que me receberam na família e permissão para que cuidasse e ficasse tão próxima de Igor no momento que ele mais precisou. Só tenho boas lembranças de todos os momentos que passamos juntos.

À equipe de trabalho “Thuja” composta por Lariza Darlene, Caio César, Williana Tôrres e

Carlos Alberto. Este trabalho não é resultado apenas de um esforço individual; mas do lindo

(8)

Ao meu ex-aluno e grande companheiro de trabalho, Caio César. É uma grande alegria e satisfação poder concluir este trabalho ao lado do meu primeiro aluno de graduação, e com quem só fiz somar conhecimento e dividir esforços. Caio, fostes meu braço direito em todo esta trajetória, e não tenho palavras para agradecer por todo sua motivação e dedicação ao nosso projeto.

Aos meus amigos do coração, Débora Barros, “Casais de meia idade”, “Quarteto

fantástico”, “Três menininhas do amor”, “Friends” e “Yes, I can, Treino!”, pela amizade

e companheirismo, sempre!

Aos professores Luiz Soares; Maíra Galdino, Rivelilson de Freitas e Lauro de Souza pela disponibilidade e conhecimentos transmitidos.

Ao Laboratório de Imunomodulação e Novas Abordagens Terapêuticas (LINAT) pela disponibilidade de equipamentos e infra-estrutura; e aos seus alunos Priscila e Thiago, pela disposição que sempre tiveram em me auxiliar.

À Fundação de Amparo à Ciência e Tecnologia do Estado de Pernambuco (FACEPE) pela concessão da bolsa de Pós-graduação.

Aos membros da Banca examinadora, Pedro Rolim, Luiz Soares, Teresinha Gonçalves,

Geisiane Presmich e Magaly Lyra pelo tempo dispendido na leitura deste trabalho e pelas

importantes sugestões apontadas.

A todos que de forma direta ou indireta contribuíram para a realização deste trabalho até então realizado.

(9)

RESUMO

Nos últimos anos, os estudos sobre plantas medicinais e extratos vegetais ricos em polissacarídeos tem despertado grande interesse científico em virtude de suas promissoras ações farmacológicas, a exemplo de Thuja occidentalis Linn. Assim, o objetivo deste trabalho foi obter o extrato seco e a fração polissacarídica de T. occidentalis para avaliação de suas propriedades imunomoduladora, antioxidante e anti-inflamatória e realização de estudo de pré-formulação. O material vegetal foi obtido e caracterizado conforme Farmacopeia Brasileira (5 ed), seguida das etapas de otimização e validação do método de doseamento dos polissacarídeos; otimização de extração por planejamento fatorial 32; obtenção e caracterização da solução extrativa, extrato seco e fração polissacarídica; avaliação da composição de monossacarídeos do extrato seco e fração; avaliação in vitro da atividade imunomoduladora pela determinação de Interleucinas (ILs) -6, -17A, -22 e -10, em esplenócitos de camundongos e de Interferon-gama (INF-γ) e ILs-2, -1β e -6 em Células Mononucleares do Sangue Periférico (PBMCs) humanas; avaliação in vitro da atividade antioxidante pelo sequestro dos radicais 2,2-difenil-1-picril-hidrazil ( ), 2,2'-azino-bis-(ácido-3-etilbenztiazoline-6-sulfonico) ( _{), hidroxila (} _{) e óxido nítrico (NO); e} determinação de substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico (TBARS); avaliação in vivo da atividade anti-inflamatória pelos testes de edema de pata induzido por carragenina, dextrana, composto 48/78, histamina, serotonina e bradicinina, e de peritonite induzida por carragenina; e por fim estudo de compatibilidade por Análise Térmica do extrato seco com excipientes empregados no desenvolvimento de formas farmacêuticas sólidas (Aerosil®, Talco, Estearato de Magnésio, Starch 1500®, Tabletose® 70, Flowlac®, Compremix®, Polivinilpirrolidona K30 e Solutab®). O método de doseamento dos polissacarídeos foi otimizado com redução do tempo da análise de ~40 h para ~4 h, sendo utilizado nos demais ensaios. Inicialmente selecionou-se a proporção de droga vegetal: água (4 g: 30 mL) e melhores condições de temperatura (85-95°C) e tempo (4,0-5,0 h) de extração. Em seguida, os efeitos e interações da temperatura e tempo sobre o teor de polissacarídeos foram estudados pelo planejamento fatorial, sendo as condições ótimas para extração 95°C e 4 h. O extrato seco obtido mostrou-se como pó fino, higroscópico e com baixa capacidade de fluxo, demonstrando a necessidade da adição de excipientes que viabilizem sua utilização farmacêutica. A análise da composição dos monossacarídeos revelou a presença predominante de glicose (extrato) e manose (fração). Nos ensaios farmacológicos foi verificado que tanto o extrato seco como a fração aumentaram a expressão das ILs-1β e -6, enquanto as demais se mantiveram em nível basal, evidenciando sua ação imunomoduladora; além de ter sido demonstrado seu potencial antioxidante e anti-inflamatório em todos os modelos analisados, com atividade superior do extrato na maioria dos testes, demonstrando a importância do fitocomplexo e do emprego terapêutico dos extratos vegetais. Por fim, foi comprovada compatibilidade do extrato seco com praticamente todos os excipientes avaliados, exceto Estearato de Magnésio e Tabletose®70, sendo necessário estudos complementares para essa confirmação. O conjunto destes resultados demonstra o potencial farmacêutico do extrato seco de T. occidentalis padronizado em polissacarídeos, podendo ser utilizado como base no desenvolvimento de fitoterápicos e na realização de estudos farmacológicos mais avançados, sobretudo no que diz respeito à avaliação imunomoduladora.

(10)

ABSTRACT

In recent years, studies about medicinal plants and plant extracts rich in polysaccharides has awakened great scientific interest because of their promising pharmacological actions, like

Thuja occidentalis Linn.The objective of this study was to obtain the dry extract and the

polysaccharide fraction of T. occidentalis to evaluate your immunomodulatory, antioxidante, and anti-inflammatory activities and to perform the pre-formulation study. The plant material was obtained and characterized as recommended by Brazilian Pharmacopoeia (5 ed), followed by optimization and validation of the assay method of polysaccharides; extraction optimization by factorial design 32; obtention and characterization of extractive solution, dry extract and polysaccharide fraction; evaluation of the monosaccharide composition of dry extract and fraction; in vitro evaluation of immunomodulatory activity by determination of the interleukins (ILs) -6, -17a, -22 and -10 in splenocytes from mice, and interferon-gamma (IFN-γ) and ILs-2, -1β e -6 in Peripheral Blood Mononuclear Cells (PBMCs) Human; in vitro evaluation of the antioxidant activity by sequestering of the radical 2,2-diphenyl-1-picryl-hydrazyl ( ), 2,2'-azino-bis (3-etilbenztiazoline acid-6-sulfonic acid) ( _), hydroxyl ( ) and nitric oxide (NO); and determination of thiobarbituric acid reactive substances (TBARS); evaluation of in vivo anti-inflammatory activity by the rat paw edema test induced by carrageenan, dextran, compound 48/78, histamine, serotonin and bradykinin, and carrageenan-induced peritonitis; and finally Thermal Analysis for compatibility study of dry extract with excipients used in the development of solid dosage forms (Aerosil®, Talc, Magnesium Stearate, Starch 1500®, Tabletose® 70, Flowlac®, Compremix®, Polivinilpirrolidona K30 e Solutab®). The polysaccharide assay method was optimized to reduce of the analysis time from ~ 40 h to ~ 4 h; being used in other tests. Initially was selected the proportion of plant drug: water (4 g; 30 ml) and the best temperature conditions (85-95°C) and time extraction (4-5 h). Then the effects and interactions of temperature and time on polysaccharide content were studied by factorial design, with the best conditions for the extraction 95°C and 4 h. The dry extract obtained showed to be fine, hygroscopic and low flowability powder, demonstrating the need for the addition of excipients to allow your pharmaceutical use. The monosaccharide composition analysis of the extract and fraction showed predominant presence, respectively, of glucose and mannose. In pharmacological testing was found that both, dry extract and the fraction, increased the expression of ILs-1β and -6, while the other remained at baseline, showing their immunomodulatory action; besides it has been shown your potential antioxidant and anti-inflammatory in all models tested, with higher activity to the extract in most tests, showing the importance of phytocomplex and the therapeutic use of plant extracts. Finally, it was demonstrated that the dry extract is compatible with practically all evaluated excipients, except magnesium stearate and Tabletose®70, requiring further studies for confirmation. This set of results demonstrates the pharmaceutical potential of dry extract of T. occidentalis standardized in polysaccharides, which can be used as a basis in the development of phytotherapeutic and performing more advanced pharmacological studies, particularly regarding the immunomodulatory evaluation.

(11)

LISTA DE FIGURAS

Figura 1 – Reação de complexação da antrona com carboidratos... 42

Figura 2 – Estrutura molecular radicalar (1) e não radicalar (2) do DPPH• ... 52

Figura 3 – Reação do método de determinação de TBARS entre o TBA e o MDA ... 54

Figura 4 – Mecanismo de reação do método de Griess ... 55

Figura 5 – Método geral para obtenção da solução-teste e doseamento dos polissacarídeos totais (Método de antrona) ... 68

Figura 6 – Histograma de distribuição granulométrica das partes aéreas de T. occidentalis .. 95

Figura 7 – Curva de retenção e passagem das partes aéreas de T. occidentalis ... 95

Figura 8 – Comportamento da precipitação etanólica dos polissacarídeos a partir de alíquotas de solução extrativa de T. occidentalis não desproteinizadas pelo método do TCA. ... 98

Figura 9 – Peso seco das proteínas removidas das amostras submetidas a diferentes condições de desproteinização... 99

Figura 10 – Comportamento da precipitação etanólica dos polissacarídeos a partir do tratamento do sobrenadante com diferentes concentrações de solução etanólica. ... 101

Figura 11 – Fluxograma do método geral e otimizado para remoção dos interferentes proteicos e precipitação dos polissacarídeos. ... 104

Figura 12 – Método otimizado para doseamento dos polissacarídeos de T. occidentalis. .... 108

Figura 13 – Espectros de varredura obtidos na análise de especificidade do método de antrona para determinação dos polissacarídeos de T. occidentalis. ... 109

Figura 14 – Efeito de diferentes temperaturas sobre a extração dos polissacarídeos de T. occidentalis. ... 112

Figura 15 – Efeito de diferentes tempos sobre a extração dos polissacarídeos de T. occidentalis. ... 113

Figura 16 – Efeito de diferentes proporções de droga vegetal sobre o a extração dos polissacarídeos de T. occidentalis. ... 114

Figura 17 – Efeito de diferentes proporções de droga vegetal sobre a extração dos polissacarídeos, considerado o peso seco de T. occidentalis. ... 114

Figura 18 – Diagrama de Pareto de efeitos padronizados obtido pelo planejamento fatorial 32, tendo como fatores a temperatura e o tempo de extração e, como variável resposta o teor de polissacarídeos de T. occidentalis. ... 116

(12)

Figura 19 – Gráfico de Superfície Resposta obtido pelo planejamento fatorial 32, tendo como

fatores a temperatura e o tempo de extração e, como variável resposta o teor de polissacarídeos de T. occidentalis. ... 117

Figura 20 – Aspecto macroscópicos do extrato seco de T. occidentalis. ... 120 Figura 21 – Fotomicrografia, por microscopia eletrônica de varredura, do extrato seco de T. occidentalis, sob aumento de 100 (A), 600 (B) e 1600 vezes (C). ... 120 Figura 22 – Distribuição do tamanho de partículas do extrato seco de T. occidentalis ... 121 Figura 23 – Espectro de infravermelho do extrato seco e fração de polissacarídeos de T. occidentalis. ... 122 Figura 24 - Curvas DSC do extrato seco e fração de polissacarídeos de T. occidentalis ... 123 Figura 25 – Curvas TG/DTG do extrato seco e fração de polissacarídeos de T. occidentalis.

... 124

Figura 26 – Perfil de higroscopicidade do extrato seco de T. occidentalis. ... 126 Figura 27 – Aspecto macroscópico da fração polissacarídica liofilizada de T. occidentalis. 128 Figura 28 – Viabilidade celular de esplenócitos de BALBs após 48 h de exposição ao extrato

seco de T. occidentalis. ... 130

Figura 29 – Vabililiade celular de esplenócitos de BALBs após 48 h de exposição à fração

polissacarídica de T. occidentalis. ... 130

Figura 30 – Viabilidade celular de PBMCs após 48 h de exposição ao extrato seco de T.

occidentalis. ... 131

Figura 31 – Vabililiade celular de PBMCs após 48 h de exposição à fração polissacarídica de

T. occidentalis. ... 131

Figura 32 – Determinação de IL-6 em cultura de esplenócitos de BALB após exposição ao

extrato seco e fração de polissacarídeos de T. occidentalis. ... 132

Figura 33 – Determinação de IL-17 e IL-22 em cultura de esplenócitos de BALB após

exposição ao extrato seco e fração de polissacarídeos de T. occidentalis. ... 133

Figura 34 – Efeito do pré-tratamento com extrato seco de T. occidentalis sobre o aumento do

sobre o edema da pata em camundongos induzido por carragenina... 145 Figura 35 – Efeito do pré-tratamento com fração de polissacarídeos de T. occidentalis sobre o edema da pata em camundongos induzido por carragenina ... 145

Figura 36 – Efeito do pré-tratamento com extrato seco de T. occidentalis sobre o edema da

pata em camundongos induzido por diferentes agentes inflamatórios ... 146

Figura 37 – Efeito do pré-tratamento com fração de polissacarídeos de T. occidentalis sobre o

(13)

Figura 38 – Efeito do pré-tratamento com extrato seco de T. occidentalis sobre a migração de

leucócitos totais e neutrófilos na peritonite induzida por carragenina em camundongos. ... 150

Figura 39 – Efeito do pré-tratamento com fração polissacarídica de T. occidentalis sobre a migração de leucócitos totais e neutrófilos na peritonite induzida por carragenina em camundongos ... 150

Figura 40 – Curvas TG do extrato seco, do Aerosil® e da mistura binária (1:1) ... 154

Figura 41 – Curvas DTG do extrato seco, do Aerosil® e da mistura binária (1:1) ... 154

Figura 42 – Curvas TG do extrato seco, do Talco e da mistura binária (1:1) ... 155

Figura 43 – Curvas DTG do extrato seco, do Talco e da mistura binária (1:1) ... 155

Figura 44 – Curvas TG do extrato seco, do Estearato de magnésio e da mistura binária (1:1) ... 156

Figura 45 – Curvas DTG do extrato seco, do Estearato de magnésio e da mistura binária (1:1) ... 156

Figura 46 – Curvas TG do extrato seco, do Starch 1500® e da mistura binária (1:1) ... 157

Figura 47 – Curvas DTG do extrato seco, do Starch 1500® e da mistura binária (1:1) ... 157

Figura 48 – Curvas TG do extrato seco, da Tabletose® e da mistura binária (1:1) ... 158

Figura 49 – Curvas DTG do extrato seco, da Tabletose® e da mistura binária (1:1) ... 158

Figura 50 – Curvas TG do extrato seco, do Flowlac® e da mistura binária (1:1) ... 159

Figura 51 – Curvas DTG do extrato seco, do Flowlac® e da mistura binária (1:1) ... 159

Figura 52 – Curvas TG do extrato seco, do Compremix® e da mistura binária (1:1) ... 160

Figura 53 – Curvas DTG do extrato seco, do Compremix® e da mistura binária (1:1) ... 160

Figura 54 – Curvas TG do extrato seco, do PVP K30 e da mistura binária (1:1) ... 161

Figura 55 – Curvas DTG do extrato seco, do PVP K30 e da mistura binária (1:1) ... 161

Figura 56 – Curvas TG do extrato seco, do Solutab® e da mistura binária (1:1) ... 162

(14)

LISTA DE TABELAS

Tabela 1 – Parâmetros de extração de polissacarídeos de plantas medicinais... 40

Tabela 2 – Obtenção da curva padrão de glucose para determinação do teor de

polissacarídeos de T. ccidentalis... 68

Tabela 3 – Avaliação e otimização da desproteinização da solução extrativa de T.

occidentalis... ₆₈ Tabela 4 – Avaliação e otimização da precipitação etanólica dos polissacarídeos da

solução extrativa de T. occidentalis... ₆₉

Tabela 5 – Parâmetros de avaliação da extração dos polissacarídeos das partes aéreas T. occidentalis... ₇₃ Tabela 6 – Níveis das variáveis do planejamento fatorial 32... 73

Tabela 7 – Relação dos excipientes avaliados no estudo de compatibilidade com o

extrato seco de T. occidentalis... 91

Tabela 8 – Teor de polissacarídeos das soluções-teste obtidas a partir de alíquotas de

solução extrativa tratadas com diferentes volumes de TCA 10% (v/v)... 98

Tabela 9 – Teor de polissacarídeos das soluções-teste obtidas a partir de alíquotas de

solução extrativa desproteinizadas a diferentes tempos de refrigeração... 99

Tabela 10 – Teor de polissacarídeos das soluções-teste obtidas a partir de amostras de

solução extrativa desproteinizadas a diferentes tempos de centrifugação... 99

sobrenadante tratadas com diferentes concentrações de solução etanólica... 101

sobrenadante tratadas com etanol absoluto e sob diferentes tempos refrigeração... 101

sobrenadante tratadas com diferentes proporções de etanol absoluto... 102

sobrenadante tratadas com etanol absoluto e diferentes tempos de centrifugação... 103

Tabela 15 – Teor de polissacarídeos determinado pelo método de antrona, variando-se

diferentes parâmetros... 104

Tabela 16 – Teor de polissacarídeos determinado pelo método de antrona, variando-se o

tempo de aquecimento no banho-maria à 100ºC... 106

Tabela 17 – Robustez do método de antrona para determinação dos polissacarídeos de T. occidentalis... 109

Tabela 18 – Precisão intermediária do método de antrona para determinação dos

(15)

Tabela 19 – Teste de recuperação do método de antrona para determinação dos

polissacarídeos de T. occidentalis... ₁₁₀

Tabela 20 – Matriz do planejamento experimental 32 para avaliação das variáveis influentes na extração de polissacarídeos de T. occidentalis... 114

Tabela 21 – Análise de variância para o modelo quadrático de superfície de resposta

obtido a partir do planejamento fatorial 32... 117

Tabela 22 – Caracterização da solução extrativa de T. occidentalis... 118

Tabela 23 – Perfil termogravimétrico do extrato seco das partes aéreas de T. occidentalis... 123

Tabela 24 – Propriedade de compactação do extrato seco de T. occidentalis... 126 Tabela 25 – Interpretação do Índice de Carr (IC) para a fluidez de pós... 126 Tabela 26 – Composição de monossacarídeos do extrato seco e fração polissacarídica

de T. occidenalis... 128

Tabela 27 – Potencial antioxidante in vitro do extrato seco e fração polissacarídica de T. occidentalis no sequestro do radical ... 137

Tabela 28 – Potencial antioxidante in vitro do extrato seco e fração polissacarídica de T. occidentalis no sequestro do radical ABTS•+... 139

Tabela 29 – Potencial antioxidante in vitro e do extrato seco e fração polissacarídica de T. occidentalis na inibição da peroxidação Lipídica pela diminuição dos

níveis de TBARS... 140

Tabela 30 – Potencial antioxidante in vitro do extrato seco e fração polissacarídica de T. occidentalis no sequestro do radical ... 141

Tabela 31 – Potencial antioxidante in vitro do extrato seco e fração polissacarídica de T. occidentalis no sequestro do NO... 142

Tabela 32 – Relação dos excipientes avaliados no estudo de compatibilidade com o

extrato seco de T. occidentalis... 151

Tabela 33 – Resultados do estudo de compatibilidade do extrato seco de T. occidentalis:

(16)

LISTA DE QUADROS

Quadro 1 – Principais mecanismos de ação relacionados a atividade imunomoduladora dos

derivados vegetais... 45

Quadro 2 – Características dos processos inflamatórios agudos e

(17)

LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS

AAPH Dihidrocloridrato de 2,2‟-azobis 2-metilpropinamida ABTS Ácido 2,2-azino-bis-3- etilbenzotiazolina-6-sulfônico _{2,2′-azinobis-3-etilbenzotiazolina-6-sulfonato}

ADCC Citotoxicidade dependente de anticorpo ANVISA Agência Nacional de Vigilância Sanitária CE50 Concentração efetiva 50%

CETENE Centro de Tecnologias Estratégicas do Nordeste

CG-MS Cromatografia gasosa acoplada a Espectrometria de Massas CV Coeficiente de variação

2,2-difenil-1-picrilhidrazil

DRX Difração de Raios-X

DNA Ácido desoxirribonucleico

EDTA Ácido etilenodiamino tetra-acético

G-CSF Fator de estimulação de colônias de granulócitos

GM-CSF Fator de estimulação de colônias de granulócitos e macrófagos HIV Vírus da Imunodeficiência Humana

HPV Papiloma Vírus Humano

IFA Insumo farmacêutico ativo

INF-γ Interferon gama

Ig Imunoglobulina

IL Interleucina

IV-TF Infravermelho por Transformada de Fourier

MDA Malonaldeído

MTT Método 3-(4,5-dimetiltiazol-2il)-2,5-difenil brometo de tetrazolina NF-κB Fator Nuclear kappa beta

NK Natural Killer

NPS Nitroprussiato de sódio

PBMC Células Mononucleares do Sangue Periférico PVP K30 Polivinilpirrolidona K30

R2 Coeficiente de determinação

(18)

RENISUS Relação Nacional de Plantas Medicinais de Intesse ao SUS

SNC Sistema Nervoso Central

SUS Sistema Único de Saúde

TBA Ácido tiobarbitúrico

TBARS Substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico TCA Ácido tricloroacético

TFA Ácido trifluoracético

TNF-α Fator de necrose tumoral alfa

TP Teor de polissacarídeos

Trolox® 6-hidroxi-2,5,7,8-tetrametil croman-2-ácido carboxílico UV/Vis Ultravioleta/visível

(19)

SUMÁRIO 1 INTRODUÇÃO ... 26 2 OBJETIVOS ... 28 2.1 OBJETIVO GERAL ... 29 2.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS ... 29 3 REVISÃO DA LITERATURA ... 31 3.1 DESENVOLVIMENTO DE FITOTERÁPICOS ... 31

3.2 Thuja occidentalis Linn. ... 32

3.2.1 Aspectos botânicos ... 33 3.2.2 Propriedades farmacológicas ... 34 3.2.3 Perfil fitoquímico ... 35 3.2.4 Aspectos toxicológicos ... 36 3.3 POLISSACARÍDEOS ... 36 3.3.1 Propriedades farmacológicas ... 37

3.3.2 Extração dos polissacarídeos ... 40

3.3.3 Doseamento dos polissacarídeos ... 41

3.4 IMUNIDADE ... 43

3.5 PLANTAS MEDICINAIS COM ATIVIDADE IMUNOMODULADORA ... 44

3.6 RADICAIS LIVRES E IMPLICAÇÕES PATOLÓGICAS ... 47

3.7 ANTIOXIDANTES ... 49

3.8 METÓDOS PARA AVALIAÇÃO DE ATIVIDADE ANTIOXIDANTE ... 51

3.8.1 Sequestro do radical ... 52

3.8.3 Inibição da peroxidação lipídica - Método de determinação de espécies reativas ao ácido tiobarbitúrico (TBARS) ... 54

(20)

3.10 ANTI-INFLAMATÓRIOS ... 58

3.11 MÉTODOS DE AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE ANTI-INFLAMATÓRIA ... 60

3.11.1 Edema de pata induzido por carragenina e diferentes agentes flogísticos ... 60

3.11.2 Peritonite induzida por carragenina ... 62

4 MATERIAL E MÉTODOS ... 64

4.1 MATÉRIA-PRIMA VEGETAL (T. occidentalis) ... 64

4.1.1 Obtenção da droga vegetal (estabilização, secagem e pulverização) ... 64

4.1.2 Caracterização físico-química da droga vegetal ... 64

4.1.3 Determinação de óleos voláteis ... 66

4.2 OTIMIZAÇÃO E VALIDAÇÃO DE MÉTODO ANALÍTICO PARA DOSEAMENTO DOS POLISSACARÍDEOS TOTAIS DAS PARTES AÉREAS DE T. occidentalis ... 66

4.2.1 Matérias-primas ... 67

4.2.2 Reagente de antrona... 67

4.2.3 Obtenção da solução extrativa ... 67

4.2.4 Método geral para obtenção da solução aquosa de polissacarídeos (solução-teste) ... 67

4.2.5 Método geral para doseamento dos polissacarídeos totais (Método de antrona) ... 68

4.2.6 Avaliação e otimização do método geral para obtenção da solução-teste ... 69

4.2.7 Avaliação e otimização do método de antrona ... 70

4.2.8 Análise estatística ... 71

4.2.9 Validação do método analítico ... 71

4.3 OTIMIZAÇÃO DA EXTRAÇÃO DE POLISSACARÍDEOS DAS PARTES AÉREAS DE T. occidentalis ... 73

4.3.1 Matérias-primas ... 73

4.3.2 Reagente de antrona... 73

4.3.3 Obtenção da solução extrativa ... 73

4.3.4 Experimento de fator-único ... 73

(21)

4.4 OBTENÇÃO E CARACTERIZAÇÃO DA SOLUÇÃO EXTRATIVA DE T. occidentalis ... 75

4.4.2 Caracterização da solução extrativa de T. occidentalis ... 75

4.5 OBTENÇÃO E CARACTERIZAÇÃO DO EXTRATO SECO DE T. occidentalis ... 76

4.5.1 Obtenção do extrato seco de T. occidentalis ... 77

4.5.2 Caracterização do extrato seco de T. occidentalis ... 77

4.6 OBTENÇÃO DA FRAÇÃO POLISSACARÍDICA DE T. occidentalis ... 81

4.7 ANÁLISE DA COMPOSIÇÃO DE MONOSSACARÍDEOS DO EXTRATO SECO E FRAÇÃO POLISSACARÍDICA DE T. occidentalis... 81

4.7.1 Preparação das amostras ... 81

4.7.2 Análise em CG-MS ... 82

4.8 AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE IMUNOMODULADORA DO EXTRATO SECO E FRAÇÃO POLISSACARÍDICA DE T. occidentalis... 82

4.8.1 Estudo experimental com camundongos BALB/c... 82

4.8.2 Estudo experimental com PBMCs ... 82

4.8.3 Processamento das amostras ... 83

4.8.4 Avaliação de citotoxicidade ... 84

4.8.5 Cultura Celular ... 84

4.8.6 Determinação de citocinas ... 84

4.9 AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE ANTIOXIDANTE DO EXTRATO SECO E FRAÇÃO POLISSACARÍDICA DE T. occidentalis ... 85

4.9.3 Inibição da peroxidação lipídica – Método de determinação de TBARS ... 87

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4.9.6 Analise estatística ... 89 4.10 AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE ANTI-INFLAMATÓRIA DO EXTRATO SECO E FRAÇÃO POLISSACARÍDICA DE T. occidentalis... 89 4.10.1 Animais ... 90 4.10.2 Teste do edema de pata induzido por carragenina em camundongos... 90 4.10.3 Teste do edema de pata induzido por diferentes agentes inflamatórios ... 90 4.10.4 Teste de migração de leucócitos para a cavidade peritoneal induzida por carragenina 91 4.10.5 Analise estatística ... 91 4.11 ESTUDO DE COMPATIBILIDADE DO EXTRATO SECO DE T. occidentalis: EXCIPIENTES ... 92 5 RESULTADOS E DISCUSSÃO ... 93 5.1 MATÉRIA-PRIMA VEGETAL (T. occidentalis) ... 94 5.1.1 Determinação da granulometria dos pós ... 94 5.1.2. Determinação da perda por dessecação – método gravimétrico... 95 5.1.3 Determinação de cinzas totais ... 96 5.1.4 Determinação de teor de extrativos ... 96 5.1.3 Determinação de óleos voláteis ... 96 5.2 OTIMIZAÇÃO E VALIDAÇÃO DE MÉTODO ANALÍTICO PARA DOSEAMENTO DOS POLISSACARÍDEOS TOTAIS DAS PARTES AÉREAS DE T. occidentalis ... 97 5.2.1 Avaliação e otimização do método geral para obtenção da solução-teste ... 97 5.2.2 Avaliação e otimização do método de antrona ... 105 5.2.3 Validação do método analítico ... 108 5.3 OTIMIZAÇÃO DA EXTRAÇÃO DE POLISSACARÍDEOS DAS PARTES AÉREAS DE T. occidentalis ... 111 5.3.1 Experimento de fator-único ... 111 5.3.2 Metodologia de Superfície Resposta - Planejamento fatorial 32 ... 115 5.4 OBTENÇÃO E CARACTERIZAÇÃO DO EXTRATO SECO DE T. occidentalis ... 119 5.4.1 Descrição macroscópica ... 119

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5.4.2 Análise em MEV ... 120 5.4.3 Determinação do tamanho de partícula por granulometria a laser ... 120 5.4.4 Espectroscopia no IV-TF ... 122 5.4.5 Caracterização térmica ... 123 5.5.6 Determinação da área superficial específica e porosidade do extrato seco ... 124 5.4.7 Determinação da higroscopicidade ... 125 5.4.8 Determinação de polissacarídeos totais ... 126 5.4.9 Propriedades de compactação, ângulo repouso e tempo de escoamento. ... 126 5.5 OBTENÇÃO DA FRAÇÃO POLISSACARÍDICA DE T. occidentalis ... 128 5.6 ANÁLISE DA COMPOSIÇÃO DE MONOSSACARÍDEOS DO EXTRATO SECO E FRAÇÃO POLISSACARÍDICA DE T. occidentalis... 128 5.7 AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE IMUNOMODULADORA DO EXTRATO SECO E FRAÇÃO POLISSACARÍDICA DE T. occidentalis... 129 5.7.1 Avaliação da citotoxicidade ... 129 5.7.2 Determinação de citocinas ... 131 5.8 AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE ANTIOXIDANTE DO EXTRATO SECO E FRAÇÃO POLISSACARÍDICA DE T. occidentalis ... 137 5.8.1 Sequestro do radical ... 137 5.8.2 Sequestro do radical ... 139 5.8.3 Inibição da peroxidação lipídica – Método de determinação de TBARS ... 140 5.8.4 Sequestro do radical ... 141 5.8.5 Sequestro do NO ... 143 5.9 AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE ANTI-INFLAMATÓRIA DO EXTRATO SECO E FRAÇÃO POLISSACARÍDICA DE T. occidentalis... 144 5.9.1 Teste do edema de pata induzido por carragenina em camundongos... 144 5.9.3 Teste de migração de leucócitos para a cavidade peritoneal induzida por carragenina 149 5.10 ESTUDO DE COMPATIBILIDADE DO EXTRATO SECO DE T. occidentalis: EXCIPIENTES ... 152

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6 CONCLUSÃO ... 163 REFERÊNCIAS ... 166

(25)

(26)

1 INTRODUÇÃO

As plantas medicinais são utilizadas desde os tempos antigos como recurso terapêutico para tratamento e prevenção de diversas doenças; e mesmo diante dos avanços da indústria química, continuam sendo utilizadas mundialmente, seja como remédio tradicional, seja em formulações fitoterápicas (ARCHANA, 2011). Somado a isto, os produtos naturais representam ainda uma fonte extremamente valiosa de novas entidades químicas, visto que são compostos por estruturas químicas, selecionadas ao longo de milhões de anos de evolução (CARVALHO, 2011).

Há, portanto, um grande interesse na investigação de novos compostos naturais para uma ampla variedade de aplicações farmacêuticas (ARAÚJO et al. 2011), uma vez que sua identificação aliada aos estudos de atividade biológica, comprovam a eficácia das plantas medicinais e representam uma etapa imprescindível para padronização dos extratos e desenvolvimento de fitoterápicos (NASCIMENTO, 2012).

Seguindo esta tendência, os polissacarídeos naturais têm atraído grande atenção científica devido às diferentes atividades biológicas que exercem, aliada a ausência de toxicidade e de efeitos colaterais significativos (YUAN et al., 2008; NGUYEN et al., 2012; XIA et al., 2012; XU et al., 2012). Apesar do grande arsenal de propriedades terapêuticas relatadas para os polissacarídeos, muitos estudos têm dado ênfase a investigação de espécies com atividade imunomoduladora (SUÁREZ et al., 2010; LEE et al., 2011; YI et al., 2012; YUE et al., 2012; KOUAKOU et al., 2013), anti-inflamatória (POPOV et al., 2005; PAIVA et al., 2011; PEREIRA, 2011) e antioxidante (LUO et al., 2010; PAIVA et al., 2011; JIN et al., 2012; CHEN et al., 2014; LI et al., 2015). De modo que diversos extratos vegetais têm sido amplamente investigados em diferentes partes do mundo (ALAMGIR; UDDIN, 2010).

Dentre as espécies vegetais de amplo interesse medicinal e cujas propriedades farmacológicas tem sido atribuídas aos polisscarídeos, destaca-se Thuja occidentalis Linn. (Cupressaceae), popularmente conhecida como árvore da vida ou cedro branco (NASER et al., 2005b; SUNILA; HAMSA; KUTTAN, 2011); Esta corresponde a uma das espécies que compõem o Esberitox® N, um fitoterápico produzido pela Aspen Pharmacare Australia® e clinicamente comprovado para fortalecimento do sistema imunológico e tratamento de sintomas do resfriado comum (ESBERITOX® N, 2014).

Em virtude da ausência de patente com o extrato de T. occidentalis padronizado em polissacarídeos e de literatura científica disponível envolvendo a avaliação e otimização dos

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processos extrativos de polissacarídeos a partir das partes áreas de T. occidentalis, este trabalho teve como objetivo inicial otimizar e validar um método analítico para doseamento dos polissacarídeos das partes aéreas de T. occidentalis (droga vegetal) para, em seguida, avaliar e otimizar suas condições de extração, visando a obtenção de um extrato seco padronizado em polissacarídeos para posterior avaliação de suas atividades imunomoduladora, antioxidante e anti-inflamatória, e realização de um estudo inicial de pré-formulação para propiciar o desenvolvimento de fitoterápicos à base de T. occidentalis.

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(29)

2 OBJETIVOS

Os objetivos que norteiam o presente trabalho estão descritos abaixo, sendo classificados em geral e específicos.

2.1 OBJETIVO GERAL

Obter extrato seco de T. occidentalis padronizado em polissacarídeos para avaliação de suas atividades imunomoduladora, antioxidante e anti-inflamatória e realização de estudo de pré-formulação, a fim de propiciar o desenvolvimento de futuros fitoterápicos.

2.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS

 Obter e caracterizar a droga vegetal;

 Otimizar e validar método de quantificação dos polissacarídeos totais na droga vegetal e extrato aquoso de T. occidentalis;

 Avaliar e otimizar o processo de extração de polissacarídeos de T. occidentalis;

 Preparar e caracterizar a solução extrativa e extrato seco de T. occidentalis;

 Obter a fração polissacarídica de T. occidentalis;

 Analisar a composição de monossacarídeos presentes do extrato seco e fração polissacarídica de T. occidentalis;

 Avaliar a citotoxicidade celular e as atividades imunomoduladora, antioxidante e anti-inflamatória do extrato seco e fração polissacarídica de T. occidentalis.

 Realizar estudo de compatibilidade do extrato seco de T. occidentalis com diferentes excipientes utilizados na formulação de formas farmacêuticas sólidas.

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3 REVISÃO DA LITERATURA

A seguir encontra-se descrito o embasamento teórico utilizado como base para realização deste trabalho.

3.1 DESENVOLVIMENTO DE FITOTERÁPICOS

As plantas medicinais, assim como suas preparações, sempre foram utilizadas pelo homem, e embora esta utilização tenha passado por um declínio após a ascensão mundial da terapêutica centrada em fármacos sintéticos, nas últimas décadas vem ocorrendo um retorno ao uso da fitoterapia, tanto nos países em desenvolvimento como nos desenvolvidos (NASCIMENTO et al., 2005; BORELLA et al., 2010). Como consequência, o uso de plantas medicinais e fitoterápicos encontra-se em expansão em todo o mundo e constitui um mercado bastante promissor (NASCIMENTO et al., 2005).

Atualmente, as plantas medicinais movem altos valores financeiros em todo o mundo e representam o tipo de tratamento mais acessível para uma parcela significativa da população, estimada em cerca de 80% (SOUZA-MOREIRA et al., 2010). Em 2010, por exemplo, o mercado mundial de fitoterápicos movimentou cerca de US$ 44 bilhões, enquanto que, no Brasil, as estimativas apontam um movimento entre US$ 350 a 550 milhões (MIOTO, 2010).

De forma geral, os fatores relacionados à esta expansão da fitoterapia deve-se à necessidade de busca por novas alternativas terapêuticas para o tratamento de enfermidades e à preferência dos consumidores por tratamentos “naturais”, somada à crescente validação científica das propriedades farmacológicas de espécies vegetais, ao desenvolvimento de novos métodos analíticos para controle de qualidade; e ao desenvolvimento de novas formas de preparações e administração dos produtos (SOUZA-MOREIRA et al., 2010).

Seguindo esta tendência atual, inúmeros estudos têm abordado a análise de espécies vegetais com potencial terapêutico, de modo a contribuir com a descoberta de novas plantas medicinais e com o desenvolvimento de fitoterápicos (MENDEZ et al., 2011), que por sua vez requer conhecimento sobre diversas etapas a serem ser seguidas com a matéria-prima vegetal, quais sejam: cultivo, coleta, secagem, moagem, extração, avaliação farmacológica e toxicológica e formulação, constituindo assim um processo interdisciplinar, multidisciplinar e interinstitucional (TOLETO et al., 2003; BORELLA et al., 2010). Caso essas etapas não

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sejam realizadas adequadamente, poderão ocorrer alterações na composição química dos compostos bioativos, com consequente interferência na qualidade do produto final (BORELLA et al., 2010). Portanto, o emprego de espécies vegetais como matéria-prima para produção de medicamentos, tem como pré-requisito a padronização das drogas e extratos vegetais, bem como de suas formulações, através de diferentes técnicas, com o objetivo estabelecer suas especificações de qualidade e garantir seus critérios de eficácia e segurança (KLEIN et al., 2009). Ademais, também é imprescindível o monitoramento e controle de todas as etapas envolvidas no processo produtivo.

No Brasil, têm sido tomadas várias providencias no sentido de normatizar o uso dos fitoterápicos, através da publicação de diferentes resoluções pela Agência Nacional de Vigilância Sanitária (ANVISA). Dentre as medidas adotadas, destacam-se a Política Nacional de Plantas Medicinais e Fitoterápicos e o Programa Nacional de Plantas Medicinais e Fitoterápicos dentro do Sistema Único de Saúde (SUS), com objetivos comuns voltados à garantia do acesso seguro e uso racional de plantas medicinais e fitoterápicos (BRASIL, 2006; BRASIL, 2008b). Como consequência, o Ministério da Saúde passou a financiar fitoterápicos na rede pública de saúde a partir de 2007 (DIÁRIO DA SAÚDE, 2012), e em 2009 publicou a Relação Nacional de Plantas Medicinais de Interesse ao SUS (RENISUS) para direcionamento de pesquisas científicas com 71 espécies vegetais de potencial farmacológico, visando ampliar o rol de fitoterápicos financiados pelo Governo Federal (BRASIL, 2009). Inicialmente, apenas dois fitoterápicos constavam na Relação Nacional de Medicamentos essenciais (RENAME) para disponibilização pelo SUS, e atualmente constam 12 produtos, após a última atualização da RENAME no ano de 2012 (DIÁRIO DA SAÚDE, 2012).

Portanto, o desenvolvimento de estudos abordando o desenvolvimento e caracterização de extratos vegetais é uma área de interesse no Brasil e de grande relevância científica e tecnológica.

3.2 Thuja occidentalis Linn.

Thuja occidentalis, comumente conhecida como árvore da vida ou cedro branco, é

uma árvore pertencente ao gênero Thuja e família Cupressaceae (CHANG et al., 2000). Originária do leste da América do Norte e cultivada no Brasil como árvore ornamental (CHANG et al., 2000), esta espécie foi identificada pela primeira vez, durante uma expedição do século 16 no Canadá, onde era utilizada como remédio por índios nativos, tendo

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demonstrado eficácia no tratamento de fraqueza e escorbuto (NASER et al., 2005b). A seguir serão discutidos alguns aspectos importantes sobre essa espécie.

3.2.1 Aspectos botânicos

As árvores de T. occidentalis têm característica conífera e monoica, medindo 12-21 m de altura (HEBER, 2007; NASER et al., 2005a), com caule ereto do tipo tronco com córtex marrom-avermelhado e galhos bastante ramificados (FARMACOPEIA HOMEOPÁTICA BRASILEIRA, 2011). Os ramos são achatados, curtos, horizontais, de extremidade ascendente e cobertos com pequenas folhas rígidas, imbricadas umas às outras. As folhas são ovais, persistentes, verdes, parecidas com escamas cruzadas de forma oposta e com extremidades acuminadas sobre uma superfície dorsal convexa (HEBER, 2007; FARMACOPEIA HOMEOPÁTICA BRASILEIRA, 2011). Na extremidade dos ramos ocorrem também cones ovoides pequenos (6-8 mm de comprimento), microesporofilados, de cor amarelo-esverdeado e cobertos de coriáceas amarelos (HEBER, 2007; FARMACOPEIA HOMEOPÁTICA BRASILEIRA, 2011). Estes cones são formados por 8 ou mais escamas, com 1-3 óvulos cada um (STANGERLIN et al., 2008). As flores apresentam-se em cones separados (monoicas), compostas por flores masculinas (cor marrom-escuro) e flores femininas (cor amarelo-esverdeada), que tem quase o formato de estrela. As sementes são marrom-amareladas, têm 3-5 mm de comprimento e aproximadamente 1 mm de largura (HEBER, 2007). O fruto é cone megasporofilado estróbilo oblongo subcônico, verde-castanho (FARMACOPEIA HOMEOPÁTICA BRASILEIRA, 2011).

Esta espécie demonstra grande tolerância à disponibilidade de água, podendo ser encontrada em habitats diversos, variando de seco a superfícies pantanosas. Há evidências de que T. occidentalis exibe ajustamento osmótico em resposta ao déficit hídrico. Esta resposta ao ajuste osmótico é comum frente ao déficit hídrico em algumas herbáceas e espécies de plantas lenhosas (EDWARDS; DIXON, 1995).

Em relação ao seu cultivo, com base em visitas técnicas realizadas em viveiros e pequenos produtores rurais de quatro municípios do Rio Grande do Sul (Brasil), foi constatada a preferência de multiplicação de T. occidentalis por estacas, com escolha de árvores sadias para o fornecimento de galhos, e cultivadas a campo, onde permanecem por 2 a 4 anos para então serem transplantadas para vasos e vendidas com custo total médio da muda propagada por estaquia de R$ 2,79 (STANGERLIN et al., 2008).

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Com relação aos fatores que afetam a regeneração de T. occidentalis, Larouche (2009) constatou que o crescimento das árvores em altura é influenciado pela região e disponibilidade de luz, enquanto o seu crescimento diametral está relacionado com o corte parcial, sendo preferível o corte parcial de baixa intensidade ou o trabalho com regeneração natural. Posteriormente, o estudo descrito por Larouche, Ruel e Lussier (2011) confirma os resultados anteriores, apontando, inclusive, que o crescimento inicial de mudas plantadas e a produção de biomassa foram proporcionais à disponibilidade de luz.

3.2.2 Propriedades farmacológicas

Diversas atividades farmacológicas da espécie T. occidentalis encontram-se descritas na literatura, dentre as quais pode-se citar as atividades antiviral (GOHLA et al., 1992; OFFERGELD et al., 1992; BODINET et al., 2002); hepatoproterora (DUBEY; BATRA, 2008b); antidiabética (DUBEY; BATRA, 2008a); antioxidante (DUBEY; BATRA, 2009b); anti-ulcerativa (DUBEY; BATRA, 2009c); anti-aterosclerótica (DUBEY; BATRA, 2009a); antimicrobiana (TSIRI et al., 2009); e imunomoduladora e antitumoral (SUNILA; HAMSA, 2006; SUNILA; HAMSA; KUTTAN, 2011).

Seu emprego na forma de tinturas-mãe hidroalcoólicas ou diluídas, vêm sendo largamente utilizado na homeopatia e fitoterapia humana e veterinária (FETROW; AVILA, 2000; NASER et al., 2005b), tendo como principais aplicações o tratamento de infecções agudas e crônicas do trato respiratório superior, e como adjuvante dos antibióticos em infecções bacterianas graves, como a bronquite, angina, faringite, otite média e sinusite. Além disso, a tintura tem sido aplicada no trato genital inferior para o tratamento de verrugas, papilomas, condilomas, excrescências de diversos tipos, principalmente aquelas relacionadas ao Papiloma Vírus Humano (HPV) (FETROW; AVILA, 2000), sendo estimado que a taxa de cura das verrugas seja de 84,2% (NEVES-JORGE et al., 2000). Estes efeitos são atribuídos principalmente as suas atividades antiviral e imunomoduladora já demonstradas em diversos experimentos in vitro e in vivo (GOHLA et al., 1992; BODINET et al., 2002; SUNILA; KUTTAN, 2006; SUNILA; HAMSA; KUTTAN, 2011).

É importante mencionar que T. occidentalis é uma das espécies vegetais que compõem o Esberitox® N, um fitoterápico produzido e comercializado na Alemanha pela Aspen

Pharmacare Australia ® e indicado para aumento da imunorresistência do organismo, sendo indicado para o tratamento dos sintomas do resfriado comum e fortalecimento do sistema

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imunológico de indivíduos com suscetibilidade aumentada para infecções, devido a fatores como estresse, falta de sono, ou tensão nervosa. Além disso, pode ser utilizado como terapia concomitante ao tratamento com antibióticos, para impedir seu efeito imunossupressor; de modo que as infecções recuem rapidamente e recidivas sejam evitadas (ESBERITOX® N, 2014). Este fitoterápico, na forma de comprimidos, contém 3,2 mg de extrato seco das raízes de Echinacea (Echinaceae pallida e Echinaceae purpureae), raízes de Baptisiae tinctoriae e partes aéreas de T. occidentalis, com eficácia clínica demonstrada em diversos estudos clínicos controlados por placebo (REITZ; HERGARTEN, 1990; BODINET; FREUDENSTEIN, 1999), sendo o de Naser et al. (2005a), o estudo mais recente.

3.2.3 Perfil fitoquímico

O perfil fitoquímico de T. occidentalis abrange diferentes classes de substâncias como saponinas, fenóis, taninos, aminas, mucilagens, princípios amargos, compostos lactônicos, carotenos, óleo essencial, triterpenos, esteroides (CASTELLÓN et al., 2000), açúcares redutores, cumarinas (ácido p-cumárico e umbelliferona), ácido tânico, polissacarídeos, proteínas e minerais (NASER et al., 2005b). Contudo, os óleos essenciais constituem um dos grupos metabólicos característicos da espécie (SVAJDLENKA et al., 1999), sendo o monoterpeno tujona seu principal constituinte (TSIRI et al., 2009). Já em termos de atividade terapêutica, destacam-se os polissacarídeos e flavonoides. Estes constituintes, juntamente com os taninos e proteínas, foram identificados por investigações fitoquímicas na fração etanólica das partes aéreas de T. occidentalis utilizada em estudos farmacológicos conduzidos por Dubey e Batra para as atividades antidiabética, hepatoprotetora, hipolipemiante, antioxidante e anti-ulcerativa (2008a, 2008b, 2009a, 2009b, 2009c).

Adicionalmente, os polissacarídeos têm sido indicados em vários estudos como os constituintes ativos responsáveis pelas suas atividades antiviral e imunomoduladora (GOHLA et al., 1992; OFFERGELD et al., 1992; BODINET et al., 2002; NASER et al., 2005b; SUNILA; HAMSA; KUTTAN, 2011). Um dos estudos mais recentes, realizado por Sunila, Hamsa e Kuttan (2011), revelou que o potencial terapêutico do extrato metanólico e fração de polissacarídeos de T. occidentalis na mediação da resposta imune celular e nos níveis de citocinas sobre as células metastáticas em modelos animais (SUNILA; HAMSA; KUTTAN, 2011). Por este motivo, nos últimos anos T. occidentalis vem sendo associada a outras plantas imunomoduladoras (NASER et al., 2005b; CORRÊA, 2006), como é o caso da associação

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com as espécies E. purpurea, E. pallida e B. tinctoria do Esberitox® N (ESBERITOX® N, 2014).

3.2.4 Aspectos toxicológicos

Um levantamento feito por Naser et al. (2005a) em torno dos efeitos adversos verificados em ensaios clínicos com T. occidentalis, constatou que as preparações obtidas a partir desta planta são consideradas seguras nas infecções do trato respiratório. Contudo, a recomendação geral é que durante a gravidez e lactação, estas preparações não sejam administradas sem o consentimento médico, pois embora não tenham exibido efeito abortivo, ainda verifica-se ausência de resultados conclusivos.

A toxicidade de T. occidentalis também foi avaliada por Valsa e Felzenszwalb (2001) utilizando amostras de três tinturas para verificação da genotoxicidade in vitro por meio do teste de Ames - Mutateste e do SOS-cromoteste-indução de β-galactosidase em Escherichia

coli. Ao fim do estudo, foi constatado que nenhum dos extratos possuiu efetiva indução de

mutagênese ou na síntese da β-galactosidase, indicador de sinal geral e precoce de lesão no ácido desoxirribonucleico (DNA), mesmo com a metabolização.

Esse resultado foi recentemente confirmado por Nikolić et al. (2011), onde foi analisado o potencial antigenotóxico dos monoterpenos cânfora, eucaliptol e tujona de T.

occidentalis sobre células procariotas e eucariotas, com elucidação do seu efeito sobre o

reparo do DNA. Os resultados obtidos indicaram que pequenas quantidades de cânfora, eucaliptol e tujona podem estimular o processo de reparo do DNA e atuar como antimutagênicos, embora maiores concentrações de monoterpenos possam induzir a rupturas dos filamentos de DNA.

3.3 POLISSACARÍDEOS

Os polissacarídeos são polímeros formados pela condensação de um grande número de monossacarídeos, mutuamente unidos por ligações O-glicosídicas (REN; PERERA; HEMAR, 2012); e encontram-se largamente distribuídos em plantas, micro-organismos (fungos e bactérias), algas e animais. Estes compotos desempenham um papel fundamental na comunicação célula-célula, na adesão celular e no reconhecimento molecular do sistema imunológico e, como tal, são biomacromoléculas essenciais aos organismos vivos (YI et al.

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2012; ZENG et al., 2015); apresentando um amplo espectro de atividades biológicas, incluindo radioproteção e as atividades antitumoral, antioxidante, antilipidêmica (ZENG et al., 2015). Vale ressaltar que a maioria dos polissacarídeos derivados de plantas medicinais são atóxicos (YUAN et al., 2008; XIA et al., 2012; XU et al., 2012) e sem efeitos colaterais significativos (NGUYEN et al., 2012; XIA et al., 2012; XU et al., 2012) quando comparado com polissacarídeos de origem bacteriana e compostos sintéticos, respaldando-os como candidatos ideais para a indústria de alimentos e medicamentos moderna (ZHANG et al., 2015).

3.3.1 Propriedades farmacológicas

3.3.1.1 Ação imunomoduladora

Os polissacarídeos modulam essencialmente a imunidade inata (ALAMGIR; UDDIN, 2010; LENZI et al., 2013), havendo uma série de mecanismos descritos na literatura, como por exemplo, a ativação de células monocíticas e indução à sua diferenciação em macrófagos, como demonstrado para os polissacarídeos da espécie Salicornia herbacea (ALAMGIR; UDDIN, 2010); a indução da produção de NO, Fator de necrose tumoral alfa (TNF-α) e Interleucina (IL)-6 em macrófagos murinos da linhagem celular RAW 264.7, conforme evidenciado para os polissacarídeos da alga vermelha Porphyridium cruentum (ABDALA-DÍAZ et al., 2010); o estímulo da proliferação de linfócitos e da fagocitose dos macrófagos, tal como demonstrado para os polissacarídeos da polpa do fruto de Dimocarpus longan (YI et al., 2012); e a proliferação de esplenócitos, reforço da fagocitose e da citotoxicidade mediada por células Natural Killer (NK), aumento da produção de NO pelos macrófagos; além de estimulação da secreção de citocinas, tanto em esplenócitos como em macrófagos, como comprovado para os polissacarídeos do tronco de Dendrobium officinale (XIA et al., 2012).

Somado aos resultados promissores demonstrados nas avaliações farmacológicas, os estudos de identificação e isolamento tem alcançado contribuições relevantes neste campo de pesquisa. De modo que alguns trabalhos tem apontado o isolamento e a identificação desses metabólitos, dentre os quais podemos citar as xiloglucanas, hetrepolissacarídeos de armazenamento das sementes de Copaifera langsdorffii e Tamarindus indica (DO ROSÁRIO et al., 2011); os componentes cíclicos e lineares β-(1→2)-D-glucanos da microalga verde comestível Chlorella pyrenoidosa (SUÁREZ et al., 2008); as frações polissacarídicas,

(38)

contendo arabinogalactano tipo II, das folhas de Alchornea cordifolia (KOUAKOU et al., 2013); e as arabinoxilanas do farelo de trigo - Triticum aestivum, que além de efeito imunomoduladora, também mostraram efeitos protetores contra a gripe aviária (AKHTAR et al., 2012).

Alguns estudos têm demonstrado, inclusive, uma correlação entre o peso molecular dos polissacarídeos e sua ação imunomoduladora (SUÁREZ et al., 2010; REN; PERERA; HEMAR; 2012; KOUAKOU et al., 2013), tal como demonstrado por Kouakou et al. (2013), que isolaram e caracterizaram 4 frações e 2 subfrações de polissacarídeos, com diferentes pesos moleculares (4,9-39,5 kDa), do extrato aquoso das folhas de A. cordifolia. O estudo confirmou que a subfração de maior peso molecular (39,5 kDa) foi a fração altamente ativa nos testes biológicos, enquanto a subfração de baixo peso molecular (5,9 kDa) foi inativa ou minimamente ativa.

Além dos polissacarídeos constantes nas espécies supracitadas, os polissacarídeos pertencentes à planta medicinal T. occidentalis tem assumido caráter de destaque na mediação da resposta imune celular. Nesse caso, o experimento apresentado por Offergeld e coladoradores (1992) demonstrou que a fração de polissacarídeos de T. occidetnalis foi indutora de celulas CD4+ em células de sangue periferico humanas, e que estimulou a expressão das citocinas ILs-1β, -2, 3 e -6; e IFN-γ, Fator de estimulação de colônias de granulócitos (G-CSF) e Fator de estimulação de colônias de granulócitos e macrófagos (GM-CSF) em culturas de linfócitos de sangue periférico humano e de ILs-1β e -6 em culturas de monócitos / macrófagos. Já o experimento mais recente apresentado por Sunila, Hamsa e Kuttan (2011) relatou que tanto a fração rica em polissacarídeos quanto o extrato metanólico oriundo das partes aéreas dessa planta promoveram uma regulação nos níveis de citocinas sobre as células metastáticas em modelos animais, sendo demonstrado um aumento da atividade das células NK, da citotoxicidade dependente de anticorpo e da citotoxicidade dependente do complemento em células metastáticas, além do aumento dos os níveis dos fatores antitumorais IL-2 e Inibidor Tecidual de Metaloproteinase; e diminuição dos elevados níveis das citocinas pró-inflamatórias IL-1β, IL-6, TNF-α e GM-CSF no soro dos animais portadores de tumor metastático, quando comparado aos animas controle.

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Nos últimos anos tem havido um crescente interesse na busca por antioxidantes naturais, eficazes e seguros, para proteção do corpo humano contra os radicais livres e assim retardar o progresso de muitas doenças crônicas (YE; HUANG, 2012). Dentre os compostos de origem natural recentemente estudados, os polissacarídeos têm demonstrado um importante papel no sequestro e eliminação de radicais livres (CHEN et al., 2012c; LUO et al., 2010; YE; HUANG, 2012), sendo apontados como novos potenciais bioativos antioxidantes para uso medicinal ou como alimento funcional (ZHAO et al., 2015).

Resultados promissores vem sendo demonstrados para as frações polissacarídicas advindas de diferentes partes das plantas, tal como demonstrado para as frações isoladas das folhas de Hibiscus rosa-sinensis (AFSHARI; SAMAVATI; SHAHIDI, 2015); assim como para as frações do rizoma Alisma orientalis (ZHAO et al., 2015) e flores de Lonicera

macranthoides (Wu et al., 2015). Experimentos in vitro indicaram ainda que os

polissacarídeos das partes aéreas de Sarcandra glabra tem efeitos significativos sobre a inibição dos radicais hidroxila ( ), superóxido ( _{), radical 2,2-difenil-1-picril-hidrazil} ( ) e 2,2′-azinobis-3-etilbenzotiazolina-6-sulfonato ( _{) de maneira} dose-dependente, indicando seu uso como potencial antioxidante natural (JIN et al., 2012).

Além disso, também tem sido evidenciado que a atividade antioxidante dos polissacarídeos é resultante de uma combinação de múltiplos fatores estruturais, incluindo a composição de monossacarídeos, o peso molecular e a proporção de ligações glicosídicas, conforme demonstrado para a fração polissacarídica FMPS3 de Fortunella margarita (ZHEN et al., 2015).

Alguns estudos demonstram ainda a importância da ação combinada dos efeitos antioxidante e imunomoduladora dos polissacarídeos no tratamento de patologias que são ocasionadas ou agravadas pela disfunção imune e estresse oxidativo. Chi et al. (2015), por exemplo, demonstraram os efeitos benéficos da atividade imunomoduladora e antioxidante dos polissacarídeos conjugados dos frutos de Ziziphus Jujube

s

obre a Síndrome da Fadiga Crônica em ratos. Seguindo esta tendência, diversos estudos têm avaliado estas duas ações para os polissacarídeos de origem vegetal, tal como demonstrado para os polissacarídeos das raízes de Actinidia Chinensis (ZHANG et al., 2015) e dos frutos de Prunella vulgaris (LI et al., 2015).

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O potencial anti-inflamatório de polissacarídeos isolados de plantas superiores é menos explorado na literatura quando comparado à ação imunomoduladora (PEREIRA, 2011). No entanto, ao longo dos anos diferentes estudos vem sendo publicados, apresentando resultados dessa atividade para o extrato aquoso rico em polissacarídeso das sementes de

Sterculia striata (YU; ZHU, 1997) e frações polissacarídicas de Orchis morio, Orchis mascula, Platanthera bifolia (BUCHALA, FRANZ; MEIER, 1974; FRANZ; MEIER, 1971), Bletilla striata (TOMODA; NAKATSUKA; SATOH, 1974; TOMODA et al., 1973) e Dendrobium officinale (HUA et al., 2004).

Essa propriedade anti-inflamatória vem sendo demonstrada por diferentes modelos experimentais. Como exemplo, os polissacarídeos pécticos extraídos da parte aérea da planta

Comarum palustre inibiram o edema de pata induzido por formalina em ratos, e a adesão de

leucócitos peritoneais in vitro (POPOV et al., 2005). Frações polissacarídicas do mesocarpo do fruto de Orbignya phalerata e das flores de Cyrtopodium cardiochilum apresentaram atividade anti-inflamatória, inibindo o aumento da permeabilidade vascular induzido por ácido acético (SILVA; PARENTE, 2001; BARRETO; PARENTE, 2006). Já os polissacarídeos ácidos de tubérculos de Apium graveolens inibiram a migração de leucócitos peritoneais in vivo (OVODOVA et al., 2009). Além disso, os polissacarídeos totais e frações isoladas das vagens de Caesalpinia ferrea Mart e dos tegumentos das sementes de

Azadirachta indica A. Juss tiveram sua ação anti-inflamatória comprovada pela inibição do

edema de pata induzido por carragenina, dextrana, histamina, serotonina, composto 48/80, bradicinina, prostaglandina E2 (PGE2) e L-arginina; além da inibição da migração de leucócitos e o extravasamento proteico induzidos por carragenina (PEREIRA, 2011). Estudo recentes tem demonstrado ainda os efeitos benéficos da ação anti-inflamarória e antioxidante sobre patologias anti-inflamatórias, como artrite (PAIVA et al., 2011).

3.3.2 Extração dos polissacarídeos

As técnicas utilizadas para extração de polissacarídeos a partir de plantas incluem extração aquosa sob aquecimento, extração por fluido supercrítico, extração assistida por micro-ondas e extração assistida por ultrassom (ZENG et al., 2015). Dentre elas, a extração aquosa sob aquecimento é a tecnologia mais comumente utilizada (HUANG; NING, 2010; JIN et al., 2011; SUN et al., 2011) devido ao baixo custo, simplicidade e facilidade para industrialização (TANG et al., 2011), quando comparado às demais técnicas que envolvem

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custos mais elevados e que não são favoráveis para a industrialização e ampliação, sendo técnicas atualmente mais limitadas para laboratório (TANG et al., 2011).

A extração aquosa sob aquecimento consiste em colocar a droga vegetal em contato com água para aquecimento em banho maria numa temperatura e intervalo de tempo previamente estabelecidos (JIANG et al., 2010; TANG et al., 2011; TIAN et al., 2011; YE; JIANG, 2011; JIN et al., 2012; LUO et al., 2012). Contudo, vale ressaltar que a duração de tempo da extração é longa e que o rendimento dos polissacarídeos pode ser afetado pelas altas temperaturas empregadas, conforme pode ser observado na Tabela 1 (HUANG; NING, 2010; TANG et al., 2011; ZENG et al., 2015). Isso ressalta a importante da avaliação do método de extração e controle dos parâmetros que podem afetar esse rendimento, quais sejam: proporção droga: solvente, temperatura e tempo de extração (SUN et al., 2011; JIN et al., 2012).

Tabela 1 – Parâmetros de extração de polissacarídeos de plantas medicinais

Espécie vegetal Proporção

Droga: solvente

Temperatura (ºC)

Tempo

(h) Referência

Ginkgo biloba 1:30 80 3.5 Jiang et al., 2010

Sarcandra glabra 1:30 85 3,0 Jin et al., 2012

Dioscorea nipponica 1:33 95 2,14 Luo et al., 2012

Morus alba 1:24 70 1,5 Tang et al., 2011

Paeonia sinjiangensis 1:8 85 1,5 Tian et al., 2011

Plantago asiatica 1:24 91 3,9 Ye; Jiang, 2011

3.3.3 Doseamento dos polissacarídeos

Em virtude do potencial terapêutico dos polissacarídeos, e das necessidades normativas para regularização de fitoterápicos, verifica-se a importância de métodos analíticos precisos, rápidos e fidedignos que possam ser usados rotineiramente no controle de qualidade de insumos vegetais cujos compostos bioativos sejam os polissacarídeos (LEYVA et al., 2008).

Segundo Martens e Frankenberger (1993) a análise para detecção de polissacarídeos possui uma complexidade inerente à sua natureza química; podendo ser determinados por cromatografia gasosa, após derivatização; por espectrofotometria (Métodos de Antrona,