Sequestro do NO

Nesta avaliação, o NO foi produzido a partir da decomposição espontânea de nitroprussiato de sódio (NPS) 20 mM em tampão fosfato (pH 7,4). Uma vez gerado, o NO interage com oxigênio para produzir íons , os quais foram medidos pela reação de Griess

conforme método de Basu e Hazra (2006). A mistura reacional (1,0 mL) contendo NPS 10 mM em tampão fosfato e várias concentrações do extrato seco ou fração polissacarídica de T.

occidentalis (0,9, 1,8, 3,6, 5,4 e 7,2 µg/mL) foi incubada a 37 °C por 1 hora. Uma alíquota de

0,5 mL foi retirada e homogeneizada com 0,5 mL do reagente de Griess (sulfanilamida 1% em ácido fosfórico a 5% e N-(1-naftil)etilenodiamina a 0,1% em água).

A absorvância das amostras foi determinada em espectrofotômetro, a 540 nm. Os resultados foram expressos em percentagem de inibição de NO, com base na inibição da formação de íons , conforme demonstrado na equação 13.

% de inibição da NO = {(Asistema – Amistura reacional) x 100}/ Asistema (Eq.13)

Legenda: Asistema – Absorvância do veículo com o NPS em tampão fosfato; Amistura reacional – Absorvância da mistura reacional contendo NPS em tampão fosfato e as concentrações do extrato seco ou fração polissacarídica de T. occidentalis.

Foi determinada a CE50 do extrato seco e da fração polissacarídica de T. occidentalis necessária para inibir a produção de íons em 50%. O mesmo procedimento experimental foi utilizado para o padrão Trolox® nas mesmas concentrações das amostras em estudo.

4.9.6 Analise estatística

Os resultados foram expressos pela média de três determinações. A análise estatística foi realizada utilizando ANOVA one way, seguido pelo teste t-Student-Newman–Keuls como

post hoc teste. Os resultados foram considerados estatisticamente significantes

quando p<0,05. Os testes estatísticos e gráficos foram realizados através do programa GraphPad Prism® versão 5.0.

4.10 AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE ANTI-INFLAMATÓRIA DO EXTRATO SECO E FRAÇÃO POLISSACARÍDICA DE T. occidentalis

A atividade anti-inflamatória do extrato seco e fração polissacarídica de T.

occidentalis foi avaliada por meio de diferentes modelos experimentais, a saber: Teste do

edema de pata induzido por carragenina em camundongos; Teste do edema de pata induzido por diferentes agentes inflamatórios em camundongos; e Teste de migração de leucócitos para a cavidade peritoneal induzida por carragenina.

Todos os ensaios foram realizados nas dependências do Laboratório de Pesquisa em Neuroquímica Experimental do Programa de Pós-graduação em Ciências Farmacêuticas da Universidade Federal do Piauí (UFPI), empregando a Indometacina como fármaco de referência (controle positivo). E o controle negativo foi realizado apenas com solução salina estéril a 0,9%, usada para solubilização do extrato seco e a fração polissacarídica de T.

occidentalis durante os experimentos in vivo.

4.10.1 Animais

Foram utilizados nos experimentos os camundongos (Mus musculus) da linhagem Swiss, machos, com 2 meses de idade, pesando 25-30 g e provenientes do Biotério Central da Universidade Federal do Piauí. Os camundongos foram mantidos em grupo de 5

camundongos em gaiolas de acrílico com livre acesso a água e a ração. Os protocolos

experimentais e procedimentos foram aprovados pelo Comitê de Ética em Experimentação com Animais da Universidade Federal do Piauí (nº 016/2011).

4.10.2 Teste do edema de pata induzido por carragenina em camundongos

Inicialmente, os camundongos foram pré-tratados com o extrato seco e fração de polissacarídeos de T. occidentalis (3, 10 e 30 mg/kg, i.p.) e com o fármaco de referência indometacina (10 mg/kg, i.p.). Após 30 minutos, o edema de pata foi induzido pela administração de 50 μl de uma suspensão de carragenina em solução salina estéril a 0,9% (500 μg/pata) na pata traseira direita. Na pata esquerda, usada como controle, foi injetado apenas 50 μl de salina estéril (0,9 %). O volume da pata, para avaliação do edema, foi medido antes (V0), e após 1, 2, 3 e 4 horas do tratamento com carragenina, usando um pletismômetro (Panlab®) como descrito por Chaves et al. (2013). Além disso, o edema foi mensurado 24, 48, 72 e 96 horas após a administração de carragenina (500 μg/pata) (POSADAS et al., 2004).

4.10.3 Teste do edema de pata induzido por diferentes agentes inflamatórios

Inicialmente, os camundongos foram pré-tratados com o extrato seco e fração de polissacarídeos de T. occidentalis (3 mg/kg, i.p.) e com o fármaco de referência indometacina (10 mg/kg, i.p.). Após 30 minutos, o edema de pata foi induzido pela administração de 50 μl

de uma suspensão em solução salina estéril a 0,9% de composto 48/80 (12 μg/pata), bradicinina (BK; 6.0 nmol/ pata), sulfato de dextrana (DEX; 500 μg/pata) e histamina (HIST; 100 μg / pata) e serotonina (5-HT; 1%) na pata traseira direita. Na pata esquerda, usada como controle, foi injetado apenas 50 μl de salina estéril (0,9 %). No experimento com bradicinina, os animais foram pré-tratados com captopril (5 mg/kg, i.p.) 1 hora antes da indução de bradicinina para evitar a degradação da bradicinina. O volume da pata, para avaliação do edema, foi medido antes (V0), e após 1 e 2 horas do tratamento com os diferentes agentes inflamatórios, usando um pletismômetro (Panlab®) como descrito por Chaves et al. (2013).

4.10.4 Teste de migração de leucócitos para a cavidade peritoneal induzida por carragenina

Inicialmente, os camundongos foram pré-tratados com o extrato seco e fração de polissacarídeos de T. occidentalis (3 mg/kg, i.p.), com salina estéril (0,9%) e com o fármaco de referência indometacina (10 mg/kg, i.p.). Após 30 minutos, a migração de leucócitos foi induzida por injeção de carragenina na cavidade peritoneal (250 µl; 500 µg/cavidade). A migração de leucócitos foi avaliada 4 horas após o estímulo, sendo os animais sacrificados e a cavidade peritoneal lavada com 1,5 ml de PBS heparinizado para a colheita peritoneal de células. Os volumes recuperados foram semelhantes em todos os grupos experimentais e equivalentes a 95% do volume injetado. As contagens de células totais foram realizadas em uma câmara de Neubauer, e as contagens de células diferenciais (100 células total) foram realizadas em lâminas preparadas em citocentrífugas coradas com hematoxilina e eosina. Os resultados foram expressos como o número de leucócitos totais e neutrófilos por mililitro de exsudato peritoneal.

4.10.5 Analise estatística

Os resultados foram expressos pela média de três determinações. A análise estatística foi realizada utilizando ANOVA one way, seguido pelo teste t-Student-Newman–Keuls como

post hoc teste. Os resultados foram considerados estatisticamente significantes

quando p<0,05. Os testes estatísticos e gráficos foram realizados através do programa GraphPad Prism® versão 5.0.

4.11 ESTUDO DE COMPATIBILIDADE DO EXTRATO SECO DE T. occidentalis: EXCIPIENTES

A seguir, encontra-se descrito o modo de avaliação da compatibilidade do extrato seco de T. occidentalis com os diferentes excipientes comumente utilizados na formulação de cápsulas e comprimidos. As misturas binárias foram preparadas, usando o extrato seco de T.

occidentalis e os excipientes farmacêuticos descritos na Tabela 7, na proporção de 1:1 (p/p).

Tabela 7 – Relação dos excipientes avaliados no estudo de compatibilidade com o extrato

seco de T. occidentalis

Excipiente Classificação Marca/Lote

Aerosil® Adsorvente Degussa® / 3158071326 Talco Lubrificante Magnesita® / N-80062-3 Estearato de Magnésio Lubrificante Fagron® / 130829408

Starch 1500® Diluente Colorcon® / IN516910 Tabletose® 70 Diluente Meggle® / 0513

Flowlac® Diluente Meggle® / 0912

Compremix® Diluente Chemyunion® / CN102-1209 Polivinilpirrolidona K30 (PVP K30) Aglutinante Viafarma® / 20111218

Solutab® Desintegrante Blanver® / 8027/05 Legenda: Aerosil® - Dióxido de silício coloidal; Starch 1500® - Amido pré-gelatinizado; Tabletose® 70 -

Lactose Monoidratada; Flowlac® - Spray dried Lactose monoidratada; Compremix® - Fosfato de cálcio, celulose microcristalina, derivado de açúcar, derivado de amido, dióxido de silício coloidal e estearato de magnésio; Solutab® - Croscarmelose sódica.

O estudo de compatibilidade foi realizado através da avaliação e comparação do perfil térmico das misturas binárias com os respectivos perfis do extrato seco de T. occidentalis e excipientes. Os perfis térmicos foram obtidos através das técnicas de DSC e TG/DTG, empregando-se os mesmos parâmetros utilizados no estudo de caracterização térmica do extrato seco e fração de polissacarídeos de T. occidentalis (4.5.2.6).

5 RESULTADOS E DISCUSSÃO

A seguir, estão descritos os resultados obtidos e a respectiva discussão realizada com base nos resultados e literatura científica.

5.1 MATÉRIA-PRIMA VEGETAL (T. occidentalis)

As partes aéreas de T. occidentalis apresentaram um rendimento de secagem de 54,4%, após estabilização, secagem e pulverização. Seu perfil fitoquímico não foi investigado neste estudo em virtude de ter sido avaliado anteriormente por Figueirêdo (2013), sendo relatada a presença constante de flavonoides, monoterpenos, sesquiterpenos, triterpenos e esteroides; além da ausência de taninos, cumarinas e alcaloides, durante um ano de avaliação sazonal (maio/2011 a abril/2012). No que diz respeito a caraterização foram obtidos os dados dispostos abaixo.

5.1.1 Determinação da granulometria dos pós

A análise granulométrica realizada para caracterização da droga vegetal das partes aéreas de T. occidentalis trata-se de um fator determinante na homogeneidade e reprodutibilidade de processos extrativos (MARQUES et al., 2012). Os resultados obtidos pelo histograma de distribuição granulométrica (Figura 6) demonstram que as partículas da droga vegetal encontraram-se predominantemente retidas entre os tamises de 850 e 425 µm, representando um percentual de material de 69%, caracterizando-a como um pó grosso (FARMACOPEIA BRASILEIRA 5ª Ed., 2010). Adicionalmente, o tamanho médio das partículas, determinado a partir do ponto de interseção das curvas de retenção e passagem, foi de 585 ± 20 µm (Figura 7).

O pó grosso constitui um importante parâmetro para conservação do material vegetal, uma vez que a granulometria reduzida com consequente aumento da superfície de contato do pó possibilita eventuais problemas de estabilidade, devido à adsorção de umidade (AMARANTE et al., 2011). Além disso, o pó grosso é o mais indicado para extração de folhas, flores e ervas, conforme determinado para T. occidentalis (LEITE, 2009). Isto porque partículas com diâmetro reduzido (< 200 µm) podem se aderir às partículas maiores,

aumentando a viscosidade do meio e criando uma barreira para penetração dos solventes (VOIGT, BORNSCHEIN, 1982).

Figura 6 – Histograma de distribuição granulométrica das partes aéreas de T. occidentalis

Figura 7 – Curva de retenção e passagem das partes aéreas de T. occidentalis

5.1.2. Determinação da perda por dessecação – método gravimétrico

A perda por dessecação é um parâmetro que permite avaliar a qualidade da droga vegetal, pois fornece, em valor mensurável, a umidade residual de compostos voláteis,

13% 35% 21% 15% 8% 6% 2% 0% 5% 10% 15% 20% 25% 30% 35% 40% > 850 850 - 600 600 - 425 425 - 250 250 - 150 150 -75 < 75 F raç õe s re tidas (% ) Classe granulométrica (µm) 0% 20% 40% 60% 80% 100% 0 100 200 300 400 500 600 700 800 900 P er ce n tual (% ) Abertura de malha (µm) Fração retida (%) Fração de passagem (%)

incluindo água. O baixo conteúdo de umidade indica que houve eficiência durante o processo de secagem e que o material é estável. Já o alto conteúdo favorece reações de hidrólise e atividade enzimática, com consequente deterioração dos constituintes químicos, além de propiciar o crescimento de fungos e bactérias (FIGUEIRÊDO, 2013; MARQUES et al, 2012).

A droga vegetal obtida apresentou perda por dessecação de 8,06 ± 0,07%, demonstrando que a mesma encontra-se dentro da especificação de 8-14% preconizada pela Farmacopeia Brasileira (2010) para diversas monografias vegetais, evitando assim o desenvolvimento de micro-organismos que possam comprometer o armazenamento e contaminar os produtos elaborados a partir dessa matéria-prima vegetal.

5.1.3 Determinação de cinzas totais

O teor de cinzas estabelece a quantidade de substâncias residuais não voláteis obtidas por incineração representando a soma de sais minerais (cinzas fisiológicas) ou impurezas (cinzas não-fisiológicas) presentes como contaminantes da droga vegetal, principalmente areia e terra silícea (FIGUEIRÊDO, 2013; MARQUES et al, 2012). Na presente análise, foi encontrado um valor de 5,22 ± 0,07%, indicando que a referida droga vegetal não possui excesso de terra e/ou areia.

5.1.4 Determinação de teor de extrativos

O teor de extrativos indica a presença de compostos hidrossolúveis presentes no material vegetal, como aminoácidos, açúcares, heterosídeos flavonoídicos e mucilagens (MARQUES et al, 2012); podendo ser empregado como ensaio auxiliar na caracterização físico-química de drogas vegetais. O valor encontrado para a droga vegetal em estudo foi de 24,45 ± 0,38 % (m/m), sugerindo que a água é um bom solvente extrator.

5.1.3 Determinação de óleos voláteis

Os resultados para determinação de óleos essenciais por Clevenger apresentaram valor de 0,7% e, portanto, em conformidade com o teor de óleos essenciais apresentados em outros trabalhos conduzidos com T. occidentalis (SVAJDLENKA et al., 1999; KHOMASURYA, 1999; TSIRI et al., 2009; FIGUEIRÊDO, 2013).

5.2 OTIMIZAÇÃO E VALIDAÇÃO DE MÉTODO ANALÍTICO PARA DOSEAMENTO DOS POLISSACARÍDEOS TOTAIS DAS PARTES AÉREAS DE T. occidentalis

A seguir, estão descritos os resultados obtidos e a respectiva discussão no que tange o método para quantificação dos polissacarídeos da droga vegetal de T. occidentalis.

5.2.1 Avaliação e otimização do método geral para obtenção da solução-teste

Foram avaliados em sequência a interferência dos interentes proteicos na análise, as melhores condições para precipitação de polissacarídeos e verificação das variáveis do método de antrona.

5.2.1.1 Remoção dos interferentes proteicos

A especificidade do método de antrona para análise de carboidratos e sua aplicação bastante útil na análise de extratos vegetais (YEMM; WILLIS, 1954; HANSEN; MOLLER, 1975; DONG et al., 2003; DONG et al., 2006; LEYVA et al., 2008; TANG et al., 2011; TIAN et al., 2011), foram os critérios de escolha para utilizá-lo como método analítico para doseamento dos polissacarídeos totais das partes aéreas de T. occidentalis.

De um modo geral, a aplicação do método de antrona em análise de amostras vegetais, requer o isolamento dos polissacarídeos devido a outros compostos comumente presentes nas matrizes vegetais, tais como monossacarídeos, oligossacarídeos e proteínas, também poderem se condensar com o reagente de antrona, de modo similar aos polissacarídeos (SOMANI; KHANADE; SINHA, 1987; CHEN et al., 2012b), formando produtos com coloração rosa (SOMANI; KHANADE; SINHA, 1987), vermelha (MORRIS, 1948) ou púrpura (JERMYN, 1963), que podem afetar sua determinação colorimétrica. Este motivo somado ao fato de que os extratos vegetais podem apresentar uma grande quantidade de proteínas com pesos moleculares similares aos polissacarídeos e que podem dificultar o seu isolamento, suscitou a necessidade de se realizar uma etapa prévia para desproteinização das amostras (CHEN et al., 2012b).

Contudo, apesar de alguns autores, como Chen et al. (2012b), considerarem a desproteinização como uma etapa fundamental para análise de polissacarídeos em plantas, em

algumas situações, a remoção de proteínas não demonstrou ser necessária (MORRIS, 1948; FAGEN; SIBBACH; HUSSONG, 1954; LEYVA et al., 2008). De modo que esta condição foi avaliada neste estudo, empregando-se como modelo o método do TCA.

Inicialmente verificou-se que a etapa de desproteinização é uma condição necessária para o isolamento dos polissacarídeos presentes na solução extrativa das partes aéreas de T.

occidentalis, pois as amostras que não foram tratadas com o TCA 10% e que não tiveram as

proteínas removidas por centrifugação, tiveram interferência na etapa posterior de precipitação etanólica dos polissacarídeos (Figura 8A).

Figura 8 – Comportamento da precipitação etanólica dos polissacarídeos a partir de alíquotas

de solução extrativa de T. occidentalis não desproteinizadas pelo método do TCA.

Legenda: A – Precipitação etanólica da alíquota da solução extrativa que não foi tratada com TCA e que não foi centrifugada. B – Precipitação etanólica da alíquota da solução extrativa que não foi tratada com TCA e que foi

centrifugada. Fonte: arquivo pessoal.

Adicionalmente foi verificado que mesmo sem adição de TCA 10%, a centrifugação da solução extrativa permitiu a remoção de alguns compostos que possivelmente interferiram na precipitação dos polissacarídeos, pois conforme pode ser visualizado na Figura 8B, a amostra que não foi tratada com TCA 10%, mas que foi centrifugada, não teve a precipitação dos polissacarídeos afetada, embora o precipitado tenha apresentado uma difícil solubilização em água e um teor de polissacarídeo superestimado quando comparado as amostras tratadas com diferentes TCA 10% (Tabela 8).

Tabela 8 – Teor de polissacarídeos das soluções-teste obtidas a partir de alíquotas de solução

extrativa tratadas com diferentes volumes de TCA 10% (v/v).

TCA 10% (v/v) (mL) Teor de polissacarídeos (µg/mL) ± dp CV (%) 0,00 3,34 ± 0,09 2,79 0,12 3,18 ± 0,06 1,93 0,24 2,82 ± 0,05 1,84 0,36 --- --- 0,48 --- ---

Legenda: dp – desvio padrão; CV – Coeficiente de variação.

A avaliação do tratamento da solução extrativa com diferentes volumes de TCA (0,0; 0,12; 0,24; 0,36; 0,48 mL) (Tabela 8), evidenciou um decréscimo estatisticamente significativo do teor de polissacarídeos, para as análises com 0,0; 0,12 e 0,24 mL do reagente, conforme demonstrado pelo teste ANOVA, com F calculado (41,64) > F tabelado (5,14). Além disso, as amostras contendo 0,36 e 0,48 mL do reagente não se mostraram adequadas para o método, tendo em vista que não possibilitaram a precipitação dos polissacarídeos nas etapas posteriores, possivelmente devido a reações de hidrólise conferidas pelo maior teor de ácido existente. Ademais, foi verificado que o decréscimo do teor de polissacarídeos constatado para a amostra de solução extrativa tratada com 0,24 mL de TCA 10% possivelmente tem como causa a desproteinização mais eficiente obtida para este volume, conforme demonstrado na Figura 9.

Figura 9 – Peso seco das proteínas removidas das amostras submetidas a diferentes condições

de desproteinização. 1 1,5 2 2,5 3 0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 P rot eín as (m g) Volume de TCA 10% (v/v) (mL)

Após o estabelecimento do volume de TCA 10% (v/v), avaliou-se a necessidade da solução extrativa tratada com TCA 10% ser refrigerada antes da centrifugação e remoção das proteínas. Os dados analisados no período de 0, 3, 6, 12 e 24 h (Tabela 9) não foram estatisticamente diferentes, conforme demonstrado pelo teste ANOVA, com F calculado (0,68) < F tabelado (3,48). Complementarmente, foi demonstrado pelo teste t-Student uma concordância para os resultados de 0 e 24 h, com t calculado (0,92) < t tabelado (2,78), sendo então selecionado o tempo de 0 h (centrifugação imediata) para as análises.

Tabela 9 – Teor de polissacarídeos das soluções-teste obtidas a partir de alíquotas de solução

extrativa desproteinizadas após diferentes tempos de refrigeração.

Tempo de refrigeração (h) Teor de polissacarídeos (µg/mL) ± dp CV (%) 0 2.77 ± 0.13 4.71 3 2.83 ± 0.14 5.08 6 2.78 ± 0.17 6.05 12 2.65 ± 0.20 7.50 24 2.68 ± 0.11 4.24

Legenda: dp – desvio padrão; CV – Coeficiente de variação.

Por fim, avaliou-se o tempo de centrifugação (5, 10 e 15 min), mantendo-se constante a força g (Tabela 10).

Tabela 10 – Teor de polissacarídeos das soluções-teste obtidas a partir de amostras de

solução extrativa desproteinizadas a diferentes tempos de centrifugação.

Tempo de centrifugação (min) Teor de polissacarídeos (µg/mL) ± dp CV (%) 5 2.74 ± 0.10 3.67 10 2.66 ± 0.09 3.41 15 2.78 ± 0.14 4.89

Os resultados não apresentaram diferenças estatisticamente significativas, conforme demonstrado pelo teste ANOVA, com F calculado (0,86) < F tabelado (5,14); resultado concordante com o teste t-Student, com t calculado (0,46) < t tabelado (2,78) para os tempos 5 e 15 min, sendo então selecionado o menor tempo para o método

5.2.1.2 Precipitação dos polissacarídeos

Após estabelecimento dos parâmetros para remoção dos interferentes proteicos da solução extrativa de T. occidentalis (0,24 mL de TCA 10% e centrifugação imediata a 3584 g, por 5 min), analisou-se os parâmetros para precipitação etanólica dos polissacarídeos a partir do sobrenadante da solução extrativa obtido na etapa de desproteinização. O primeiro parâmetro analisado foi a concentração da solução etanólica (60; 65; 70; 75; 80; 85; 90; 95 e 99,5 %-absoluto) utilizada para promover a precipitação dos polissacarídeos.

Na Figura 10 é possível observar macroscopicamente o papel determinante que a concentração etanólica exerce na precipitação dos polissacarídeos, de modo que este evento só foi verificado a partir das soluções-teste tratadas com etanol a 70%, e com maior uniformidade a partir do etanol a 85%. Estas observações macroscópicas foram então confrontadas com o teor de polissacarídeos determinado pelo método de antrona para todas as amostras (Tabela 11).

Figura 10 – Comportamento da precipitação etanólica dos polissacarídeos a partir do

tratamento do sobrenadante com diferentes concentrações de solução etanólica.

Tabela 11 – Teor de polissacarídeos das soluções-teste obtidas a partir de amostras de

sobrenadante tratadas com diferentes concentrações de solução etanólica.

Concentração da solução etanólica (%) Teor de polissacarídeos (µg/mL) ± dp CV (%) 70 2,67 ± 0,15 5,52 75 2,72 ± 0,14 5,25 80 2,75 ± 0,09 3,40 85 2,85 ± 0,09 3,04 90 2,85 ± 0,06 2,18 95 2,99 ± 0,04 1,37 99,5 - absoluto 3,07 ± 0,04 1,31

Legenda: dp – desvio padrão; CV – Coeficiente de variação.

Embora tenha sido demonstrado uma maior uniformidade da precipitação a partir das amostras de sobrenadante tratadas com etanol 85% (Figura 10), verificou-se pelo teste ANOVA que houve variação estatisticamente significativa entre os resultados obtidos a partir da concentração de 85% [F calculado (9,18) > F tabelado (4,07], reforçando sua forte influência como agente precipitante. Apenas para o intervalo de 95-99,5%, não houve variação significativa [t calculado (2,51) < t tabelado (2,78)] pelo teste t-Student. No entanto, por questão de praticidade e redução de possíveis erros experimentais, selecionou-se o etanol absoluto (99,5%) como reagente precipitante. Em seguida, avaliou-se a necessidade das amostras contendo sobrenadante: etanol absoluto permanecerem 12 h sob refrigeração (Tabela 12).

Tabela 12. Teor de polissacarídeos das soluções-teste obtidas a partir de amostras de

sobrenadante tratadas com etanol absoluto e sob diferentes tempos refrigeração.

Tempo de refrigeração (h) Teor de polissacarídeos (µg/mL) ± dp CV (%) 0 2,90 ± 0,10 3,43 3 3,03 ± 0,03 0,95 6 2,91 ± 0,12 4,15 12 2,95 ± 0,14 4,62

Os dados analisados no período de 0, 3, 6 e 12 h (Tabela 12) não foram estatisticamente diferentes, conforme demonstrado pelo teste ANOVA, com F calculado (0,95) < F tabelado (4,07). Corroborando com estes resultados, foi demonstrado pelo teste t-Student uma concordância para os resultados de 0 e 12 h, com t calculado (0,50) < t tabelado (2,78), sendo então selecionado o tempo de 0 h (centrifugação imediata) para as análises.

Em seguida, analisou-se a proporção de sobrenadante: etanol absoluto (1:2, 1:3, 1:4 e 1:5) (Tabela 13) utilizada para precipitação dos polissacarídeos. Conforme avaliação pelo teste ANOVA para todas as proporções [F calculado (0,74) < F tabelado (4,07)], e teste t-Student para as proporções 1:2 e 1:5 [(t calculado (0,90) < t tabelado (2,78)], os teores de polissacarídeos foram estatisticamente equivalentes. No entanto, por ser um ponto crítico da precipitação, e diante do maior CV da proporção 1:2, selecionou-se para o método, a proporção 1:3, uma proporção mais adequada do ponto de vista econômico, em relação a proporção 1:5 utilizada no método geral.

Tabela 13. Teor de polissacarídeos das soluções-teste obtidas a partir de amostras de

sobrenadante tratadas com diferentes proporções de etanol absoluto.

Proporção Sobrenadante: etanol Teor de polissacarídeos (µg/mL) ± dp CV (%) 1:2 2,91 ± 0,20 6,96 1:3 3,02 ± 0,11 3,58 1:4 3,08 ± 0,11 3,56 1:5 3,04 ± 0,12 4,14

Legenda: dp – desvio padrão; CV – Coeficiente de variação.

Por fim, analisou-se o tempo de centrifugação (5, 10 e 15 min) das soluções-teste (Tabela 14). Embora não tenha sido verificado uma variação significativa entre estes tempos, através do teste ANOVA [(F calculado (1,86) < F tabelado (5,14)], e do teste t-Student para os intervalos de tempos de 5-15 min [(t calculado (1,54) < t tabelado (2,78)] e 10-15 min [(t calculado (0,44) < t tabelado (2,78)], verificou-se que abaixo de 15 min os precipitados de polissacarídeos apresentaram-se mais frouxos, dificultando a remoção completa do sobrenadante. Portanto, por tratar-se de uma etapa crítica e, levando ainda em consideração o CV, manteve-se o tempo de 15 min nesta etapa, igualmente ao descrito no método geral (4.2.4).