Foram utilizados esplenócitos de camundongos e Células Mononucleares do Sangue Periférico (PBMCs) de cidadãos sadios, para avaliação de viabilidade celular e determinação dos níveis de citocinas no sobrenadante de cultura in vivo.
4.8.1 Estudo experimental com camundongos BALB/c
Foram utilizados 7 camundongos BALB/c, do sexo feminino, com uma média de 38- 40 dias de vida, e provenientes do biotério do Laboratório de imunopatologia Keizo Asami (LIKA) da UFPE. O procedimento com os animais só foi iniciado após aprovação no Comitê de Ética em Pesquisa Experimental com Animais do Centro de Ciências Biológicas (CCB) da UFPE, processo nº 23076.025207/2014-12.
4.8.2 Estudo experimental com PBMCs
As PBMCs foram obtidas de 4 voluntários clinicamente saudáveis escolhidos de forma aleatória na UFPE. Todos declararam não serem fumantes ou ter consumido qualquer tipo de
medicação nos 15 dias que antecederam a coleta das amostras. Para coleta da amostra foi necessária a punção de 12 mL de sangue venoso em tubos de heparina, com uso de materiais descartáveis e antissepsia adequada, por profissional habilitado. O procedimento com os indivíduos só foi iniciado após aprovação no Comitê de Ética em Pesquisa em Seres Humanos do Centro de Ciências da Saúde (CCS), sob o processo nº 21991713.3.0000.5208.
4.8.3 Processamento das amostras
4.8.3.1Preparação dos Esplenócitos
Após o sacrifício dos animais com gás carbônico (CO2), o baço de cada camundongo foi extraído de e transferido em uma Placa de Petri contendo Meio RPMI-1640 (Gibco®) para ser triturado e as células desagregadas. As suspensões celulares obtidas de cada baço foram filtradas em um Cell Strainer 40μm nylon (BD Bioscience®) e transferidas em seguida para Tubos de centrifuga tipo Falcon 50 ml para recuperação dos esplenócitos. Os concentrados de baço foram então centrifugados a 300 G, 10 minutos, aceleração 6, freio 4. Quando necessário, o precipitado de células foi tratado com a solução 1X RBC lysis Buffer (eBioscience®) para lisar as células vermelhas presentes. Os esplenócitos foram contatos em Câmera de Neubauer e a viabilidade celular determinada pelo método de exclusão por coloração azul de tripan, em que as células mortas aparecem em azul. Foram utilizadas apenas as células esplênicas cuja viabilidade foi superior a 98%.
4.8.3.2 Preparação dos PBMCs
As PBMCs foram isoladas a partir do sangue dos pacientes por centrifugação com Ficoll Paque (GE Healthcare Bio-Science®). Em seguida, as PBMCs foram recuperadas para tubos de centrifugação com RPMI 1640 (Gibco®) e centrifugadas 300-350 G, 20 minutos, aceleração 6, freio 4 para lavagem das mesmas, sendo este processo realizado 2 vezes. Posteriormente, as células foram contadas em Câmara de Neubauer e a viabilidade celular determinada pelo método de exclusão por coloração azul de tripan, em que as células mortas aparecem em azul. Foram utilizadas apenas as PBMCs cuja viabilidade foi superior a 98%.
4.8.4 Avaliação de citotoxicidade
O estudo citotóxico foi pelo método do 3-(4,5-dimetiltiazol-2il)-2,5-difenil brometo de tetrazolina (MTT), conforme descrito por Mosmann, 1983. Para tal estudo, foram testadas em triplicata os extratos secos de T. occidentalis nas concentrações de 10, 50, 100, 200 e 500
µg/mL, assim como suas frações de polissacarídeos nas concentrações de 5, 25, 50, 100 e 250 µg/ml. Em placas de 96 poços foram colocadas 2x106 células de esplenócitos e 5 x 105 de
PBMCs. As células receberam tratamentos com as amostras e após 48 horas em estufa a 5%
de CO2 a 37°C, foi adicionado a solução de MTT (0,5mg/mL), e incubado por 3 horas. Em seguida, foi adicionado a solução de Dodecil sulfato de sódio à 20% para dissolução do
precipitado. O controle negativo utilizado correspondeu apenas às células em meio de cultura
e a absorbância foi lida em espectrofotômetro de placa a 570 nm, após 24 horas.
4.8.5 Cultura Celular
Esplenócitos e PBMCs foram cultivados em placas de 24 poços de fundo chato (1x106 células por poço) em Meio RPMI 1640(Gibco®) suplementado com 10% de soro bovino fetal (Gibco®), 10mM de ácido 4-(2-hidroxietil)-1-piperazinoetanossulfónico (HEPES) (Gibco®) e 200 U/mL de penicilina e estreptomicina (Gibco). As células de esplenócitos foram estimuladas com o controle positivo, a lectina Concavalina A (ConA) a 5µg/mL, e com os extratos e as frações nas concentrações escolhidas após o teste de citotoxicidade. As PBMCs foram estimuladas com o controle positivo Phorbol 12 myristate 13 acetate (PMA) 100 ng/mL (Sigma) + Ionomicina 1ug/mL (Sigma®), e com os extratos e as frações nas concentrações escolhidas após o teste de citotoxicidade. As placas foram incubadas em estufa a 37°C em de 5% CO2 e após 48 horas o sobrenadante da cultura foi coletado para avaliação da atividade imunomoduladora.
4.8.6 Determinação de citocinas
A avaliação da atividade imunomoduladora foi realizada através da quantificaçãodas citocinas presentes nos sobrenadantes das culturas celulares (esplenócitos e PBMCs), após estímulo, durante 24 e 48 h, com seus respectivos controles positivos e com o extrato seco (10, 50, 100 e 200 μg/mL) e fração de polissacarídeos de T. occidentalis (5, 25, 50, 100 e 250
μg/ mL).
O método utilizado para quantificação das citocinas no sobrenadante de cultura de esplenócitos e PBMCs foi o Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) tipo sanduíche, seguindo as informações recomendadas pelos fornecedores. O espectrofotômetro utilizado foi o BioTek EL808®, e a diferença das absorbâncias nos comprimentos de 450-570 nm foi utilizada para cálculo da concentração.
As citocinas avaliadas no sobrenadante de cultura de esplenócitos foram: IL-6 (BD Biosciences®), IL-17A (eBiosciences®), IL-22 (eBiosciences®) e IL-10 (BD Biosciences®). Seus limites inferiores de detecção foram de 7,8 pg/mL; 3,9 pg/mL; 3,9 pg/mL e 15.6 pg/mL, respectivamente. Já as citocinas avaliadas no sobrenadante de cultura de PBMCs foram: IL-1β (BD Biosciences®), IL-6 (BD Biosciences®), IL-2 (eBiosciences®) e Interferon-gama (INF-γ) (BD Biosciences®).Seus limites inferiores de detecção foram de 1,9 pg/mL; 4,69 pg/mL; 1,5 pg/mL e 4.69 pg/mL, respectivamente.
4.8.7 Análise estatística
Os resultados foram expressos pela média de três determinações. A análise estatística foi realizada através do teste t-student (duas vias) Mann-Whitney. Os resultados foram considerados estatisticamente significantes quando p<0,05. Os testes estatísticos e gráficos foram realizados através do programa GraphPad Prism® versão 5.0.
4.9 AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE ANTIOXIDANTE DO EXTRATO SECO E FRAÇÃO