A mobilização de lipídeos e proteínas de reserva é simultaneamente modulada por açúcares durante o estabelecimento da plântula em girassol

Texto

(1)UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE CENTRO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS DEPARTAMENTO DE BIOQUÍMICA. PAULA SIMONE ORTIZ BARROS. A MOBILIZAÇÃO DE LIPÍDEOS E PROTEÍNAS DE RESERVA É SIMULTANEAMENTE MODULADA POR AÇÚCARES DURANTE O ESTABELECIMENTO DA PLÂNTULA EM GIRASSOL. NATAL 2015.

(2) PAULA SIMONE ORTIZ BARROS. A MOBILIZAÇÃO DE LIPÍDEOS E PROTEÍNAS DE RESERVA É SIMULTANEAMENTE MODULADA POR AÇÚCARES DURANTE O ESTABELECIMENTO DA PLÂNTULA EM GIRASSOL. Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Bioquímica da Universidade Federal do Rio Grande do Norte como requisito parcial para obtenção do título de Mestre em Bioquímica. Orientador: Prof. Eduardo Luiz Voigt.. NATAL 2015.

(3) UFRN / Biblioteca Central Zila Mamede Catalogação da Publicação na Fonte Barros, Paula Simone Ortiz. A mobilização de lipídeos e proteínas de reserva é simultaneamente modulada por açúcares durante o estabelecimento da plântula em girassol / Paula Simone Ortiz Barros. – Natal, RN, 2015. 54 f. : il. Orientador: Prof. Dr. Eduardo Luiz Voigt. Dissertação (Mestrado) – Universidade Federal do Rio Grande do Norte. Centro de Biociências. Programa de Pós-Graduação em Bioquímica. 1. Girassol (Helianthus annuus L.) – Dissertação. 2. Açúcares – Partição - Dissertação. 3. Açúcares – Sinalização - Dissertação. 4. Relação fonte-dreno – Dissertação. I. Voigt, Eduardo Luiz. II. Universidade Federal do Rio Grande do Norte. III. Título. RN/UF/BCZM. CDU 663.542.

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(5) Dedico este trabalho A Deus, aos meus pais, ao meu esposo e à minha filha..

(6) AGRADECIMENTOS. Agradecer é lembrar-se de ser humilde e que nada até aqui seria possível se não fossem as pessoas que estivessem contribuindo e ajudando a cada nova etapa, cada novo conhecimento, cada nova conquista. Agradeço primeiramente ao pai celestial que me deu a vida, o criador de tudo o que tentamos desvendar, o provedor de nossa sabedoria, a Deus agradeço. Agradeço aos meus pais por estarem sempre dispostos a me ajudar, por estarem presentes nos momentos mais importantes da minha vida, por simplesmente me amarem. Agradeço ao meu esposo por compartilhar das alegrias e angustias, ao meu lado, literalmente, a cada dia deste mestrado. Ao meu orientador, Professor Doutor Eduardo Luiz Voigt por todos os seus ensinamentos, paciência e dedicação na realização desta jornada. Ao meu co-orientador Professor Paulo Sérgio Marinho Lúcio e à professora Cristiane Elizabeth Costa de Macedo por me acolherem em seus laboratórios para a realização desta tarefa. À minha grande amiga, professora Luciana Duarte Martins da Matta por abrir as portas de seu laboratório quando precisei, pelos ensinamentos, conselhos, conversas, gargalhadas e afeto, muito obrigada por sua amizade. Aos amigos de laboratório, Ana Paula, Danilo, Lucas, Mariana e Ranieri, pela imensa ajuda dada a mim, pelos momentos de gargalhadas, conversas amigas e total apoio. Aos amigos de mestrado pelos conhecimentos compartilhados, pelos momentos de alegria de tensão durante esta jornada. À Verônica, Karenine e Mayara pela disposição em sempre me ajudarem na organização de meus experimentos. A todos os meus amigos e irmãos da igreja que sempre torceram e oraram por essa conquista. À Universidade Federal do Rio Grande do Norte, Pós-graduação em Bioquímica, CAPES e CNPq pela bolsa de mestrado..

(7) “A ciência só pode determinar o que é não o que deveria ser.” (Albert Einstein).

(8) RESUMO. Experimentos in vitro com suplementação utilizando plântulas de girassol foram realizados para investigar o efeito modulador de açúcares exógenos sobre a mobilização de diferentes reservas e alterações concomitantes sobre a partição dos metabólitos e atividades de enzimas degradadoras de reserva. Quando sacarose 100 mM foi adicionada ao meio de cultura, a mobilização de lipídeos e proteínas de reserva foi retardada nos cotilédones. Uma mistura equimolar de glicose e frutose falhou em mimetizar esta resposta, mas resultados semelhantes foram encontrados utilizando uma concentração equimolar de glicose ou análogos não metabolizáveis de glicose. A acumulação de açúcares não redutores ao longo de um gradiente decrescente das raízes para os cotilédones, acompanhou o atraso do catabolismo de lipídeos e proteínas de reserva induzido por açúcares. Além disso, a glicose e os açúcares não-metabolizáveis, manose e 3-O-metil-glicose, foram capazes de diminuir a atividade de lipases, amilases e proteases ácidas nos cotilédones. De acordo com estes resultados, açúcares exógenos modulam a mobilização das principais reservas (lipídeos e proteínas de reserva) durante o estabelecimento da plântulas em girassol. Esta resposta não é especificamente desencadeada por sacarose e não é exclusivamente devido a efeitos metabólicos dos açúcares. As atividades das diferentes enzimas degradadoras de reserva são simultaneamente moduladas pela glicose exógena. Um gradiente de açúcares não redutores (provavelmente sacarose) pode desempenhar algum papel na sinalização à longa distância, indicando alterações da relação fonte-dreno. Palavras-chave Helianthus annuus L.; partição de açúcares; relação fonte-dreno; sinalização de açúcares..

(9) ABSTRACT In vitro feeding experiments using sunflower seedlings were performed to investigate the modulatory effect of exogenous sugars on the mobilization of different reserves and the concomitant alterations on metabolite partitioning and activity of reservedegrading enzymes. When 100 mM sucrose was added to the culture medium, the mobilization of both oils and storage proteins was delayed in the cotyledons. An equimolar mixture of glucose and fructose failed to mimic this response, but similar results were found using equimolar concentration of glucose or non-metabolizable glucose analogues. The accumulation of non-reducing sugars along a decreasing gradient from the roots to the cotyledons accompanied the sugar-induced delay of oil and storage protein catabolism. In addition, glucose and the non-metabolizable sugars mannose and 3-O-methyl-glucose were able to decrease the activity of lipases, acid proteases and amylases in the cotyledons. According to these results, exogenous sugars modulated the mobilization of the main reserves (oils and storage proteins) during seedling establishment in sunflower. This response is not specifically triggered by sucrose and is not exclusively due to sugar metabolic effects. The activities of different reserve-degrading enzymes are simultaneously modulated by exogenous glucose. A gradient of non-reducing sugars (probably sucrose) may play a part in long-distance signalling, indicating alterations of the source-sink relation. Keywords Helianthus annuus L.; sugar partitioning; source-sink relation; sugar signalling..

(10) LISTA DE FIGURAS. FIGURA 1 - Aspectos morfológicos da flor e de sementes de girassol (Helianthus annuus L.).................................................................................................................. 12 FIGURA 2 - Estrutura molecular de oligossacarídeos............................................... 14 FIGURA 3 - Via degradativa dos oligossacarídeos da serie rafinósica e sacarose.................................................................................................................... 16 FIGURA 4 - Estrutura molecular dos polissacarídeos componentes do amido........ 17 FIGURA 5 - Degradação do amido........................................................................... 18 FIGURA 6 - Estrutural geral de triacilgliceróis........................................................... 19 FIGURA 7 - Mobilização dos triacilgliceróis.............................................................. 20 FIGURA 8 - Mobilização de proteínas de reserva..................................................... 22 FIGURA 9 - Modelo integrado da mobilização de reservas...................................... 24 FIGURA 10 - Modelo que representa o sistema de cultivo e a coleta do material vegetal....................................................................................................................... 30 FIGURA 11 - Proposta de modelo integrativo........................................................... 48.

(11) LISTA DE TABELAS. TABELA 1 - Massa seca de cotilédones, hipocótilo e raízes em plântulas de girassol expostas a diferentes açúcares exógenos................................................................ 36 TABELA 2 - Conteúdo de lipídeos neutros, amido e proteínas solúveis em cotilédones, hipocótilo e raízes de plântulas de girassol expostas a diferentes açúcares exógenos................................................................................................... 37 TABELA 3 - Conteúdo de açúcares solúveis totais (AST), açúcares não redutores (ANR), e aminoácidos livres totais (AALT) nos cotilédones, hipocótilos e raízes de plântulas de girassol expostas a diferentes açúcares exógenos.............................. 39 TABELA 4 - Massa seca de cotilédones, hipocótilo e raízes em plântulas de girassol expostas aos análogos de glicose............................................................................. 40 TABELA 5 - Conteúdo de lipídeos neutros, amido e proteínas solúveis nos cotilédones, hipocótilos e raízes nas plântulas de girassol expostas aos análogos de glicose....................................................................................................................... 41 TABELA 6 - Conteúdo de açúcares solúveis totais (AST), açúcares não redutores (ANR), e aminoácidos livres totais (AALT) nos cotilédones, hipocótilos e raízes de plântulas de girassol expostas aos análogos de glicose........................................... 42 TABELA 7 - Atividade de lipases, isocitrato liases, amilases e proteases ácidas nos cotilédones. de. plântulas. de. girassol. expostas. aos. análogos. de. glicose....................................................................................................................... 43.

(12) LISTA DE ABREVIATURAS / SIGLAS. AAS. Aminoácidos. AALT. Aminoácidos livres totais. AAL. Aminoácidos livres. Am. Aminopeptidases. ANR. Açúcares não redutores. ASN. Asparagina. AST. Açúcares solúveis totais. ATP. Adenosina trifosfato. CL. Corpos lipídicos. CG. Complexo de Golgi. CPVs. Compartimentos pré-vacuolares. CoA. Coenzima-A. DAE. Dias após a embebição. EDTA. Ácido etilenodiaminotetracético, do inglês ethylenediaminetetraacetic acid. GLN. Glutamina. HXK. Hexoquinase, do inglês hexokinase. ICL. Isocitrato liase, do inglês isocitrate lyase. LN. Lipídios neutros. MF. Massa fresca. MS. Massa seca. OSR. Oligossacarídeos da serie rafinósica. 3-OMG 3-O-metil-glicose PRS. Proteínas de reserva de sementes. PS. Proteínas solúveis. Ps. Peptidases. REL. Retículo endoplasmático liso. RER. Retículo endoplasmático rugoso. SAC. Sacarose. SDS. Dodecil sulfato de sódio, do inglês sodium dodecyl sulfate. TAGs. Triacilgliceróis. UDP. Uridina difosfato. VEP. Vacúolos de estocagem de proteínas.

(13) SUMÁRIO 1 1.1. INTRODUÇÃO................................................................................................. 12 CARACTERÍSTICAS. GERAIS. E. IMPORTÂNCIA. ECONÔMICA. DO. GIRASSOL (Helianthus annuus L.)........................................................................... 12 1.2. MOBILIZAÇÃO DAS RESERVAS DE SEMENTE.......................................... 13. 1.2.1 Mobilização de carboidratos........................................................................... 14 1.2.2 Mobilização de lipídeos.................................................................................. 19 1.2.3 Mobilização de proteínas................................................................................ 21 1.2.4 Produtos da mobilização e o estabelecimento da plântula............................. 23 1.3. REGULAÇÃO DE MOBILIZAÇÃO DE RESERVAS....................................... 24. 2. OBJETIVOS................................................................................................... 28. 2.1. OBJETIVO GERAL......................................................................................... 28. 2.2. OBJETIVOS ESPECÍFICO............................................................................. 28. 3. MATERIAIS E MÉTODOS.............................................................................. 29. 3.1. MATERIAL VEGETAL................................................................................... 29. 3.2. TRATAMENTOS E COLETAS........................................................................ 29. 3.3. DETERMINAÇÕES BIOQUÍMICAS............................................................... 30. 3.3.1 LIPÍDIOS NEUTROS (LN).............................................................................. 30 3.3.2 PROTEÍNAS SOLÚVEIS (PS)........................................................................ 31 3.3.3 AMINOÁCIDOS LIVRES TOTAIS (AALT), AÇÚCARES SOLÚVEIS TOTAIS (AST) E AÇÚCARES NÃO REDUTORES (ANR)..................................................... 31 3.3.4 AMIDO............................................................................................................ 33 3.4. ATIVIDADES ENZIMÁTICAS......................................................................... 34. 3.4.1 LIPASES........................................................................................................ 34 3.4.2. ISOCITRATO LIASE....................................................................................... 34 3.4.3 AMILASES... ................................................................................................... 34 3.4.4 PROTEASES.................................................................................................. 35 3.5.. DELINEAMENTO EXPERIMENTAL E ANÁLISE ESTATÍSTICA................... 35. 4. RESULTADOS.............................................................................................. 36. 4.1. Efeito osmótico versus mobilização de reservas de carbono e nitrogênio. influenciada por açúcares exógenos......................................................................... 36 4.1.1 Influência de açúcares exógenos sobre a acumulação de açúcares e aminoácidos nas fontes e nos drenos....................................................................... 37.

(14) 4.2. Açúcares metabolizáveis e não metabolizáveis versus a mobilização de. lipídeos, proteínas e carboidratos............................................................................. 39 4.2.1 Efeitos de análogos da glicose na acumulação de açúcares ao longo de um gradiente decrescente de AST e ANR dos drenos para as fontes........................... 41 4.3. Glicose e açúcares não metabolizáveis restringem a atividade das enzimas. degradadoras de reservas......................................................................................... 43 5. DISCUSSÃO................................................................................................. 44. 5.1. O efeito modulador de açúcares sobre a mobilização de lipídeos e proteínas. de reserva em plântulas de girassol pode não ser especificamente desencadeado pela sacarose............................................................................................................ 44 5.2. Efeitos metabólicos versus o papel sinalizador de açúcares sobre a. mobilização de lipídeos e PS em plântulas de girassol............................................. 45 5.3. A atividade das enzimas degradadoras de reserva é afetada por sinalização à. longa distância envolvendo açúcares........................................................................ 47 5.4. Proposta de modelo integrativo...................................................................... 47. 6. CONCLUSÃO................................................................................................ 49. REFERÊNCIAS......................................................................................................... 50.

(15) 12 1. INTRODUÇÃO. 1.1 Características gerais e importância econômica do girassol (Helianthus annuus L.) O girassol (Helianthus annuus L.) (Figura 1) é uma oleaginosa originária da América do Norte, pertencente à classe das dicotiledôneas e à família Asteraceae (ZOBIOLE, 2010). Esta planta se adapta bem às diversas condições edafoclimáticas, podendo ser cultivada em todas as regiões do Brasil, pois seu rendimento é pouco influenciado pelas latitudes e altitudes e pelo fotoperíodo facilitando a expansão de cultivo por todo o país (CASTRO e FARIAS, 2005). Além de seu cultivo gerar uma melhoria nas condições do solo para culturas seguintes, o girassol possui alta resistência à seca, insetos e doenças (ALVES, 2012).. Figura 1. Aspectos morfológicos da flor e de sementes de girassol (Helianthus annuus L.). www.orienteocidente.wordpress.com e www.mundodospassaros.com.br.. Fonte:. A importância econômica do girassol está ligada à sua grande utilização na produção de óleos e grãos. Entre os óleos vegetais comestíveis, o óleo de girassol é o que apresenta maior teor percentual de ácidos graxos poli-insaturados em sua composição, como o ácido oleico e principalmente ácido linoleico (50 a 70%) (MANDARINO, 1992), essencial ao organismo humano, tendo em vista que o uso.

(16) 13 diário de 100 mg por peso corpóreo reduz os níveis de colesterol no sangue (Ribeiro, 1996). As proteínas de sementes de girassol têm um bom perfil de aminoácidos essenciais (CARRÃO-PANIZZI E MANDARINO, 2005), o que as qualifica como excelentes grãos in natura e farelo (ração) para alimentação de aves, suínos e bovinos, forragem e silagem, apresentando teor de proteína maior que a do milho (BRIGHENTI et al., 2003). A produção nacional de girassol na safra 2010/11 foi estimada em 101,6 mil t, numa área de aproximadamente 70 mil ha (GIANCOTTI, 2012), de fato, por possuir alto teor de óleo (cerca de 40%) nas sementes, o girassol possibilita extração a frio (GAZZONI, 2005), ou seja, extração sem adição de nenhum solvente químico ou elevação de temperatura durante o processo, conservando a pureza e a manutenção das propriedades funcionais das sementes. Além disso, pode proporcionar um baixo custo de produção (UNGARO, 2006) e um maior rendimento na produção de óleo por hectare se comparado a varias outras culturas (LAZZAROTTO et al., 2005). De maneira complementar, a composição química do óleo girassol é recomendável para os processos utilizados na produção do biodiesel (DABDOUB e BRONZEL, 2009).. 1.2. Mobilização das reservas de semente. Para que haja sucesso durante o estabelecimento da plântula, é necessário que a formação do aparelho fotossintético esteja estabelecida antes que a mobilização de reservas presentes nos órgãos de armazenamento (fontes) em direção aos órgãos em crescimento (drenos) seja concluída (EASTMOND AND GRAHAM, 2001). As principais substâncias de reserva nas sementes são carboidratos, proteínas e lipídeos. Estas reservas são degradadas durante o.

(17) 14 desenvolvimento das plântulas afim de que seus produtos sejam utilizados para diferentes fins, como produção de energia e também matéria-prima para a construção de novas células e tecidos (BEWLEY et al., 2012).. 1.2.1 Mobilização de carboidratos. Os carboidratos de reserva mais comuns são a sacarose, os oligossacarídeos da série rafinósica (OSR) e o amido. A sacarose e os OSR (Figura 2) são amplamente distribuídos entre as Angiospermas (BUCKERIDGE et al., 2004a). A sacarose corresponde ao -D-glicopiranosil-12--D-frutofuranosídeo e os OSR são derivados da sacarose pela inserção de resíduos de D-galactose por meio de ligações 16. A rafinose, por exemplo, consiste no -D-galactopiranosil-16--Dglicopiranosil-12--D-frutofuranosídeo (HELDT E PIECHULLA, 2011). Desta forma, tanto a sacarose quanto os OSR são açúcares não redutores, conferindo maior estabilidade química a estes compostos durante o armazenamento (BUCKERIDGE et al., 2004a).. Figura 2. Estrutura molecular de oligossacarídeos. A – Sacarose e B – Rafinose. Adaptada de. STOREY et al., 1998. Assume-se que a sacarose e os OSR são acumulados no citosol, principalmente nas células do eixo embrionário. Assim sendo, estes compostos podem atuar na estabilização das membranas celulares durante a fase de.

(18) 15 dessecação e o processo de embebição nas sementes ortodoxas (BLACK et al., 2006). Além disso, sugere-se que a sacarose e os OSR são os principais combustíveis celulares nos momentos iniciais da germinação, possibilitando o reparo das. estruturas. e. moléculas. danificadas. durante. a. fase. de. dessecação,. especialmente as membranas celulares e os ácidos nucleicos (BUCKERIDGE et al., 2004b). A hidrólise dos OSR é catalisada por -galactosidases, produzindo Dgalactose e sacarose (BLACK et al., 2006). Em seguida, a sacarose pode ser hidrolisada por invertases, gerando D-glicose e D-frutose, ou clivada pelas sintases da sacarose, liberando UDP-glicose e D-frutose (KOCH, 2004). De forma geral, as hexoses oriundas da mobilização da sacarose e dos OSR são canalizadas para a via glicolítica (Figura 3) (BUCKERIDGE et al., 2004b)..

(19) 16. Figura 3. Via degradativa dos oligossacarídeos da serie rafinósica e sacarose. A hidrólise dos oligossacarídeos da série rafinósica é catalisada por -galactosidases, produzindo D-galactose e sacarose. Em seguida, a sacarose pode ser hidrolisada por invertases, gerando D-glicose e D-frutose, ou clivada pelas sintases da sacarose, liberando UDP-glicose e D-frutose. De forma geral, as hexoses são canalizadas para a via glicolítica. Adaptada de Nicolas Taylor & Harvey Millar, 2004.. Dentre os polissacarídeos de reserva que ocorrem em sementes, o amido se destaca como o principal estoque de carbono em cereais e algumas leguminosas, mas também pode ser encontrado em espécies oleaginosas (BLACK et al., 2006). O amido é constituído pelos polissacarídeos amilose e amilopectina (Figura 4). A amilose é um polissacarídeo essencialmente linear, formado por resíduos de Dglicose conectados por ligações 14. De modo contrastante, a amilopectina é um polissacarídeo altamente ramificado, cuja cadeia principal é constituída por resíduos.

(20) 17 de D-glicose unidos por ligações 14 e apresenta ramificações por meio de ligações 16 (HELDT E PIECHULLA, 2011).. Figura 4. Estrutura molecular dos polissacarídeos componentes do amido: A- amilose e Bamilopectina. Adaptada de Nicolas Taylor & Harvey Millar, 2004.. O amido é armazenado em corpos subcelulares denominados grânulos de amido, localizados nos amiloplastos. Estes grânulos são constituídos por aproximadamente 25% de amilose e 75% de amilopectina, as quais são depositadas de forma entrelaçada em camadas concêntricas semicristalinas, (BEWLEY E BLACK, 2012), favorecendo sua estocagem, pois esta estrutura reduz a presença de água dentro dos amiloplastos. A degradação do amido é realizada pela ação coordenada de algumas enzimas (Figura 5). As primeiras enzimas que atuam sobre os grânulos de amido são as -amilases, endoglucanases que hidrolisam aleatoriamente as ligações 14 ao longo da amilose e da amilopectina, fornecendo malto-oligossacarídeos e dextrinas. Em seguida, ocorre a ação das exoglucanases, incluindo as -amilases e as fosforilases do amido. As -amilases atacam apenas as pontas não redutoras liberando maltose, enquanto que as fosforilases agem nos mesmos locais, mas geram glicose-1-fosfato. As ligações 16 das dextrinas são os substratos das.

(21) 18 enzimas desramificadoras, ao passo que a maltose é hidrolisada pelas maltases, produzindo hexoses livres, que serão transportadas para o citoplasma onde serão canalisadas para a via glicolítica (BLACK et al., 2006; HELDT E PIECHULLA, 2011).. Figura 5. Degradação do amido. Os grânulos de amido são inicialmente degradados pelas amilases em malto-oligossacarídeos e dextrinas, estas são os substratos das enzimas desramificadoras produzindo glucanos lineares. As -amilases atacam as pontas não redutoras dos polissacarídeos, liberando maltose. Por fim, as fosforilases agem nos mesmos locais, gerando moléculas de glicose-1-fosfato, enquanto a maltose é hidrolisada pelas maltases, produzindo glicose. Adaptada de Nicolas Taylor & Harvey Millar, 2004..

(22) 19 1.2.2 Mobilização de lipídeos Em sementes oleaginosas, os lipídeos de reserva são os principais depósitos de carbono. Estes lipídeos consistem em óleos, os quais são misturas complexas de triacilgliceróis (TAGs) ricos em cadeias de ácidos graxos insaturados (Figura 6) (BLACK et al., 2006). Os óleos são depositados em organelas conhecidas como oleossomos ou corpos lipídicos (CLs), os quais são constituídos por uma monocamada de fosfolipídios associada a proteínas que circunda um cerne preenchido por TAGs (FRANDSEN et al., 2001).. Figura 6. Estrutura geral de triacilgliceróis. R, R’ e R’’ representam as diferentes cadeias de ácidos graxos insaturados ligadas à molécula de glicerol. Adaptada de http://biomodel.uah.es/model2/lip/tagprop.htm.. Durante a biogênese dos CLs, os ácidos graxos são sintetizados nos plastídeos e os TAGs são montados e modificados pela via eucariótica no retículo endoplasmático liso (REL). Presume-se que os TAGs devem ser depositados entre os folhetos da membrana do REL, ocasionando o brotamento dos CLs. Dentre as diferentes proteínas estruturais dos CLs, as oleosinas se destacam como as mais abundantes e provavelmente previnem a coalescência dos CLs durante a maturação da semente (QUETTIER E EASTMOND, 2009). A mobilização dos TAGs ocorre por meio de interações inter-organelares envolvendo os CLs, os glioxissomos e as mitocôndrias (Figura 7). Os TAGs são hidrolisados nos CLs e os ácidos graxos liberados são transportados para os glioxissomos, os quais são especializações dos peroxissomos. Nos glioxissomos, os ácidos graxos são ativados a acil-CoA graxos e degradados a acetil-CoA pela -.

(23) 20 oxidação. Os radicais acetil são metabolizados pelo ciclo do glioxilato, que consiste em uma forma modificada do ciclo do ácido cítrico. O succinato gerado pelo ciclo do glioxilato é transportado para a mitocôndria, onde é convertido em malato por reações do ciclo do acido cítrico. Finalmente, o malato é exportado para o citosol, atuando como precursor da gliconeogênese, para a síntese da sacarose (EASTMOND E GRAHAM, 2001).. Figura 7. Mobilização dos triacilgliceróis (TAGs). Os TAGs são hidrolisados em ácidos graxos e então transportados para o glioxissomo, onde ocorre degradação, pela -oxidação, em acetil-CoA. No ciclo do glioxilato acetil-CoA é metabolizado em succinato, este é transportado para a mitocôndria e convertido em malato no ciclo do ácido cítrico. A molécula de malato é exportada para o citosol, atuando como precursora da sacarose na gliconeogênese. A - Corpo lipídico, B – Glioxissomo, C – Mitocôndria..

(24) 21 1.2.3 Mobilização de proteínas Em dicotiledôneas, as proteínas de reserva de sementes (PRS) incluem as albuminas e as globulinas. Segundo a abordagem clássica de Osborne (1924), as albuminas são as PRS solúveis em água ou tampões diluídos com pH neutro, enquanto que as globulinas são aquelas solúveis em soluções salinas. As albuminas são amplamente distribuídas entre as Angiospermas, mas geralmente são menos abundantes. Em comparação, as globulinas comumente perfazem a fração majoritária das PRS em leguminosas, podendo constituir os principais estoques em algumas espécies (BEWLEY et al., 2012). As PRS das dicotiledôneas podem ser definidas com base no seu coeficiente de sedimentação, de modo que as albuminas podem ser mais precisamente denominadas albuminas 2S e as globulinas podem ser classificadas em leguminas (globulinas 11S) e vicilinas (globulinas 7S). As albuminas 2S geralmente são heterodímeros conectados por ligações dissulfeto. As leguminas, por sua vez, são constituídas por seis subunidades unidas por interações não covalentes, cada uma apresentando uma cadeia acídica e uma cadeia básica, as quais são conectadas por uma ligação dissulfeto. Por último, as vicilinas são tipicamente proteínas triméricas que não apresentam ligações dissulfeto (SHEWRY et al., 1995). As albuminas 2S, leguminas e vicilinas são produzidas pela via secretora e armazenadas em organelas chamadas vacúolos de estocagem de proteínas (VEPs). Durante a biogênese dos VEPs, estas proteínas são sintetizadas no retículo endoplasmático rugoso (RER), processadas no complexo de Golgi (CG), acumuladas em compartimentos pré-vacuolares (CPVs) e finalmente enviadas para os VEPs em formação por intermédio de vesículas (HARA-NISHIMURA et al., 1998; HERMAN e LARKINGS, 1999)..

(25) 22 A mobilização das PRS (Figura 8) depende da ação coordenada de diversas proteases, as quais são estocadas durante a maturação ou sintetizadas de novo a partir da germinação (MUNTZ et al., 2001). Dentre estas enzimas, as proteases, endopeptidases e carboxipeptidases, hidrolisam as ligações peptídicas localizadas no interior da cadeia polipeptídica, produzindo oligopeptideos e resíduos de aminoácidos que são transportados para o citoplasma, onde as aminopeptidades e carboxipeptidases clivam os resíduos de aminoácidos dispostos nas regiões Nterminal e C-terminal, respectivamente. Posteriormente os aminoácidos são convertidos em amidas de transporte, glutamina (GLN) e asparagina (ASN), e estas serão transportadas para o eixo em crescimento. (BEWLEY et al., 2012).. Figura 8. Mobilização de proteínas de reserva. No vacúolo de estocagem de proteína (VEP), presente nos cotilédones, a proteína de reserva é atacada pelas endopeptidases (A e B) e carboxipeptidases (C) produzindo oligopeptídeos e aminoácidos, que são transportados para o citoplasma, onde ocorre a clivagem por aminopeptidases (Am) e peptidases (Ps), liberando aminoácidos livres. Posteriormente os aminoácidos são convertidos em amidas de transporte, e estas são transportadas para o eixo em crescimento. (Adaptada de Bewley e Black, 2001).

(26) 23 1.2.4 Produtos da mobilização e o estabelecimento da plântula. Os produtos de mobilização das diferentes reservas podem apresentar destinos comuns (Figura 9). Nos tecidos de armazenamento, a mobilização das reservas de carbono produz hexoses que podem ser imediatamente utilizadas como substratos da respiração, mas também podem atuar como precursores da sacarose, permitindo o transporte de carbono para o eixo em crescimento. Nos tecidos do eixo, a sacarose pode ser consumida como combustível celular ou utilizada como precursora de diferentes biomoléculas, como amido transitório e principalmente polissacarídeos de parede celular, intimamente envolvido no crescimento da plântula. Em paralelo, a mobilização das reservas de nitrogênio, as proteínas de reserva de semente (PRS), libera aminoácidos que podem ser prontamente empregados como substratos da respiração, blocos de construção para a síntese de novas proteínas, como também podem ser convertidos em amidas de transporte, ANS e GLN, nos tecidos de armazenamento. Nos tecidos em crescimento, os aminoácidos recebidos também podem atuar como precursores de proteínas ou outros compostos nitrogenados. Em conjunto com a formação da parede celular, a síntese de compostos nitrogenados contribui para o crescimento do eixo embrionário e especialmente para o estabelecimento do aparato fotossintético (BEWLEY et al. 2012,; BUCKERIDGE et al., 2004b)..

(27) 24. Figura 9. Modelo integrado da mobilização de reservas. As reservas de carbono, OSR (oligossacarídeos da serie rafinósica), SAC (sacarose), amido e TAGs (triacilgliceróis) são hidrolisados à hexoses que podem ser utilizadas como substratos para respiração nos tecidos de armazenamento, fornecendo energia na forma de ATP (adenosina trifosfato) ou para formarem SAC. Esta é então transportada para o eixo em crescimento, onde poderá ser consumida como combustível celular ou agir como precursora de diferentes biomoléculas. As reservas de nitrogênio, PRS (proteínas de reserva de semente), liberam AAS (aminoácidos) que podem ser empregados como substratos para respiração ou como precursores de proteínas nos cotilédones, ou ainda serem convertidos em amidas de transporte ASN (asparagina) e GLN (glutamina), que após transportadas para o eixo em crescimento, servirão de matéria-prima para a formação de novas proteínas. Os esqueletos carbônicos de AAS e da degradação de TAGs podem sofrer interconversão. Em conjunto com a formação da parede celular, as proteínas favorecem ao crescimento do eixo embrionário.. 1.3. Regulação de mobilização de reservas. Durante o estabelecimento das plântulas, as reservas nutritivas são mobilizadas nos tecidos de armazenamento em metabólitos solúveis e transportadas para o eixo embrionário, fornecendo blocos de construção e energia metabólica para os tecidos em crescimento (GRAHAM 2008). Dessa maneira, a mobilização de.

(28) 25 reservas e crescimento de plântulas devem ser regulados coordenadamente a fim de permitir a transição bem-sucedida do metabolismo heterotrófico para o autotrófico (THEODOULOU & EASTMOND, 2012). Embora esteja bem estabelecido que a relação fonte-dreno desempenha um papel central na regulação da mobilização de reservas em dicotiledôneas (BEWLEY et al., 2012), os sinais moleculares que medeiam a comunicação entre os tecidos de armazenamento (fontes) e os tecidos em crescimento (dreno) ainda não estão claramente caracterizados. Os açúcares medeiam diferentes vias de sinalização envolvidas na regulação do crescimento e do metabolismo das plantas (SHEEN, 2014). Como açúcares são os principais assimilados transportados das fontes para os drenos, eles são bons candidatos para sinalização à longa distância da relação fonte-dreno (LJUNG et al., 2015). Assim, experimentos de suplementação in vitro têm sido usados para caracterizar os efeitos moduladores de açúcares sobre a mobilização das reservas. A sacarose exógena retarda a hidrólise de PRS nos cotilédones destacados de plântulas das leguminosas tremoço-amarelo, Lupinus albus, e Lupinus mutabilis (BOREK & RATAJCZAK 2002; BOREK et al., 2011; BOREK et al., 2012a). Em Lupinus luteus e Lupinus mutabilis, o atraso induzido por sacarose na hidrólise das PRS, está associado com a diminuição da atividade de proteases e com a enzima degradadora de aminoácidos glutamato desidrogenase, respectivamente (BOREK & RATAJCZAK, 2002; BOREK et al., 2012a). Em cotilédones destacados de plântulas de L. luteus, L. albus, e L. mutabilis, a sacarose também retarda a mobilização de lipídeos (BOREK 2006 et al.; BOREK et al., 2011;. BOREK et al., 2012b) e induz a acumulação de amido (BOREK et al. 2013a). O efeito modulador da sacarose sobre a mobilização de lipídeos nestas espécies é acompanhado pela diminuição da atividade de lipases e da enzima glioxissomal catalase, que destoxifica o peróxido de hidrogênio produzido durante o.

(29) 26 catabolismo de ácidos gráxos (BOREK et al., 2006; BOREK et al., 2013 b). Pelo menos em L. luteus, a sacarose modula a atividade de lipases em nível de expressão gênica (BOREK e NUC, 2011). O envolvimento de vias de sinalização mediadas por hexoses na regulação da mobilização de reservas tem sido avaliado por experimentos de suplementação com análogos de glicose metabolizáveis e não-metabolizáveis. Em culturas celulares de Cucumis sativus, a glicose e a frutose, mas não o açúcar não metabolizável, 3-Ometil-glicose (3-OMG), reprime a transcrição das enzimas glioxissomais isocitrato liase (ICL) e malato sintetase (MS), que estão envolvidas no catabolismo de ácidos graxos (GRAHAM et al., 1994). De maneira adicional, a glicose e a manose retardam a mobilização de lipídeos nos cotilédones das plântulas de Arabidopsis thaliana, porém 3-OMG não é capaz de reproduzir essa resposta (TO et al., 2002). Como 3OMG é fosforilado de forma ineficiente pelo sensor de glicose hexocinase da (HXK) (CORTÈS et al., 2003), estes experimentos indicam que a via de sinalização dependente de HXK pode desempenhar algum papel na regulação da mobilização de lipídeos em plântulas de A. thaliana. A despeito destes esforços, estudos integrativos considerando o efeito modulador de açúcares sobre a mobilização das diferentes reservas e as alterações concomitantes na partição de metabolitos e na atividade de hidrolases ainda são escassos. Dessa maneira, experimentos de suplementação in vitro usando plântulas de girassol (Helianthus annuus L.) foram realizados para caracterizar os efeitos da sacarose, hexoses e análogos de glicose metabolizáveis e não metabolizáveis sobre a depleção de reservas, a partição de metabólitos e atividades de enzimas degradadoras. O girassol foi escolhido como planta modelo porque estoca diferentes reservas nos cotilédones, incluindo grandes quantidades de óleos, PRS e em menor.

(30) 27 proporção, amido (BLACK et al., 2006). Com base nesta abordagem integrativa, discute-se o envolvimento da sinalização da mobilização das reservas em girassol..

(31) 28 2. OBJETIVOS. 2.1. OBJETIVO GERAL O objetivo deste trabalho foi verificar o papel dos açúcares como mediadores. de mecanismos à longa distância que regulam a mobilização das reservas, bem como o efeito destes metabólitos sobre a relação fonte-dreno e a atividade de enzimas degradativas durante o estabelecimento da plântula em girassol (Helianthus annuus L.). 2.2. OBJETIVOS ESPECÍFICOS - Investigar o efeito de diferentes açúcares sobre a mobilização das reservas. nos cotilédones; - Caracterizar o efeito de diferentes açúcares sobre a partição dos produtos de mobilização entre os cotilédones e o eixo em crescimento; - Determinar a atividade de enzimas envolvidas na degradação das diferentes reservas nos cotilédones, lipases, amilases, proteases ácidas e isocitrato liase. - Propor um modelo para o papel dos açúcares nos mecanismos a longa distância que regulam a mobilização das reservas durante o estabelecimento da plântula em girassol..

(32) 29 3. MATERIAIS E MÉTODOS. 3.1. MATERIAL VEGETAL O presente trabalho foi desenvolvido com sementes de girassol (Helianthus. annuus L.), híbrido Hélio 250, oriundas da Heliagro Agricultura e Pecuária Ltda. (Manga, MG). Para a germinação, as sementes foram lavadas com detergente comercial diluído a 2 gotas.L-1, desinfetadas em câmara de fluxo laminar com etanol 70% (v/v) por 30 s, seguido de NaClO 0,5% (m/v) por 5 min, sob agitação eventual. Em seguida, com água destilada estéril, as sementes foram lavadas três vezes e embebidas durante 3 h. O semeio foi realizado em placas de Petri (100 mm de diâmetro) entre folhas de papel Germitest® umedecidas com água destilada estéril, na proporção de duas vezes e meia a massa do papel, distribuindo-se vinte sementes por placa. As sementes foram incubadas em câmara de crescimento sob condições controladas (radiação fotossinteticamente ativa de 80 μmol m-2 s-1, fotoperíodo de 12 h e temperatura de 28±2 °C) durante 48 h. 3.2. TRATAMENTOS E COLETAS Após protrusão da radícula, as plântulas foram transferidas para frascos de. vidro com tampa de plástico contendo meio ágar-água 4 g.L-1 para o controle e ágarágua 4 g.L-1 suplementado com diferentes açúcares metabolizáveis, sacarose, glicose e frutose, e não metabolizáveis, manose e 3-O-metil-glicose, na concentração final de 100 mM, visto que esta é a concentração ideal para avaliar a influência de açúcares exógenos sobre a mobilização de reservas em girassol (GALVÃO, 2011). As plântulas foram mantidas sob as mesmas condições de crescimento durante 72 h. Durante as coletas, as plântulas foram seccionadas em três partes, cotilédones e as duas partes que compreendem o eixo, hipocótilo e raízes, a fim de diferenciar a absorção de açúcares pelas raízes de um possível acúmulo de metabolitos causados pela mobilização das reservas sob influência dos diferentes tratamentos. As amostras foram armazenadas a -20 °C até a realização das determinações bioquímicas (figura 10)..

(33) 30. Figura 10. Modelo que representa o sistema de cultivo e a coleta do material vegetal. Esquema com os principais processos e pontos de coleta dos experimentos (A). Figura ilustrativa do modo de secção da plântula em cotilédones e eixo em crescimento (B). Adaptado de GALVÃO, 2011.. Em um experimento preliminar do tipo dose-resposta (GALVÃO, 2011), sementes de girassol germinadas foram cultivadas em meio ágar-água 4 g.L-1 suplementado com concentrações crescentes de sacarose, 0 (controle), 50, 100 ou 200 mM durante 3 dias para investigar o efeito deste açúcar sobre a mobilização das reservas e a partição de seus produtos de hidrólise. A adição de 100 mM de sacarose ao meio de cultura mostrou-se eficaz em atrasar a mobilização das reservas bem como em alterar a partição de metabólitos durante o estabelecimento da plântula em girassol. Neste trabalho, plântulas de girassol foram crescidas na presença de sacarose, glicose e manitol (um poliol, utilizado largamente como agente osmótico para simular estresse hídrico) na mesma concentração e na presença de uma mistura equimolar de glicose e frutose (glicose 50 mM e frutose 50 mM) para verificar se os resultados obtidos preliminarmente foram induzidos especificamente pela sacarose ou se podem ser reproduzidos por outros açúcares e não são devido a um efeito osmótico. Em um segundo experimento, para verificar se a resposta obtida pelo primeiro experimento foi devido a um efeito metabólico de absorção do açúcar exógeno ou se foi um efeito de sinalização à longa distância mediada por açúcar, as plântulas de girassol foram tratadas com análogos de glicose metabolizáveis e não metabolizáveis, todos em uma concentração de 100 mM. 3.3. DETERMINAÇÕES BIOQUÍMICAS. 3.3.1 LIPÍDIOS NEUTROS (LN).

(34) 31. A quantificação dos LN foi realizada pelo método gravimétrico adaptado de SOXHLET, 1879. Para tanto, amostras de cotilédones com aproximadamente 100 mg de massa seca foram pulverizadas com gral e pistilo, em seguida, o pó foi transferido para tubo de ensaio de vidro (capacidade de 20 mL) com tampa rosqueável, onde 8 mL de n-hexano foram adicionados. A extração de LN ocorreu a 60°C, durante 5 h, sob agitação eventual. Em seguida, o sobrenadante foi transferido para tubos de plástico de 15 mL com fundo cônico cuja massa era conhecida. Após a evaporação do n-hexano a 80 °C, a massa de LN foi calculada a partir da diferença entre a massa inicial e a final dos tubos e expressa em mg.cotilédone-1. As massas de LN não foram determinadas para as demais partes da plântula, pois a concentração de LN presente nestes órgãos não apresenta relevância para nosso estudo, uma vez que os LN mobilizados são transportados na forma de açúcar não redutor. 3.3.2 PROTEÍNAS SOLÚVEIS (PS) Para a extração das PS a partir dos cotilédones, amostras com cerca de 200 mg de massa fresca foram maceradas durante 5 min com 1,5 mL de tampão TrisHCl 100 mM pH 7,0 contendo NaCl 500 mM e 2-mercaptoetanol 2 mM. Após centrifugação a 10.000 xg por 10 min a 4 °C, os sobrenadantes foram coletados e os precipitados foram re-extraídos com 1 mL do tampão de extração por mais duas vezes. Ao final, os sobrenadantes foram reunidos, perfazendo 3,5 mL de extrato total por amostra. As PS do hipocótilo e raíz, por sua vez, foram extraídas com tampão Tris-HCl 100 mM pH 7,0 seguindo os procedimentos supracitados. A determinação das PS foi realizada de acordo com o método de Bradford (1976), utilizando albumina sérica bovina (BSA) como padrão, e o conteúdo de PS foi expresso em mg.parte-1. 3.3.3 AMINOÁCIDOS LIVRES TOTAIS (AALT), AÇÚCARES SOLÚVEIS TOTAIS (AST) E AÇÚCARES NÃO REDUTORES (ANR) Para a extração de AALT, AST e ANR, amostras com cerca de 200 mg de massa fresca foram cortadas com bisturi em fragmentos de aproximadamente 2 x 2.

(35) 32 mm e foram transferidas para tubos de ensaio de vidro (20 mL) com tampa rosqueável contendo 5 mL de etanol 80% (v/v). Os tubos foram fechados hermeticamente e a extração foi realizada a 60 °C por 30 min. Após a coleta do sobrenadante, os resíduos foram re-extraídos com 5 mL de etanol 80% (v/v) sob as mesmas condições. Em seguida, os sobrenadantes foram reunidos, perfazendo 10 mL de extrato total por amostra, enquanto os resíduos foram utilizados para a extração e a determinação do amido. A dosagem de AALT foi realizada pelo método de Peoples (1989), com a utilização do reagente de ninidrina. Para cada determinação, foram adicionados 100 μL da amostra, 400 μL de água destilada, 250 μL de tampão citrato 200 mM pH 5,0 e 250 μL do reagente de ninidrina (1 mL de cianeto de potássio 10 mM, 59 mL de metoxietanol e 0,5 g de ninidrina). Os tubos foram fechados hermeticamente e incubados a 100 °C durante 15 min. Após resfriamento, foram adicionados 4 mL de etanol 50% (v/v) em cada amostra. As leituras foram realizadas a 570 nm e o conteúdo de AALT foi calculado de acordo com uma curva padrão de L-glutamina, sendo expresso em µmol.g-1 MS. Para a dosagem de AST, foi utilizado o método de Dubois (1956) com algumas modificações. Em cada determinação, foram adicionados 100 μL da amostra, 400 μL de água destilada, 500 μL de fenol 5% (m/v) e 2,5 mL de ácido sulfúrico 90% (v/v). A leitura foi realizada a 490 nm e o cálculo do conteúdo de AST foi baseado em uma curva padrão de D-glicose, expressando os resultados em µmol.g-1 MS. A dosagem de ANR foi realizada pelo método de Van Handel (1968) com algumas modificações, utilizando o reagente de antrona (YEMM e WILLIS, 1954). Em cada determinação, 100 μL da amostra, 800 μL de água destilada e 100 μL de KOH 30% (m/v) foram pré-incubados a 100 °C durante 10 min. Após resfriamento, 2,5 mL do reagente de antrona foram adicionados em cada amostra e foi conduzida incubação a 40 °C durante 15 min. A leitura foi realizada a 620 nm e o conteúdo de ANR foi calculado a partir de uma curva padrão de sacarose, sendo expresso em µmol.g-1 MS..

(36) 33 3.3.4 AMIDO A extração de amido foi conduzida utilizando os resíduos da extração dos compostos solúveis de baixa massa molecular (AALT, AST e ANR). Para tanto, os resíduos foram macerados durante 5 min com 1,5 mL de ácido perclórico 30% (v/v). Após centrifugação a 10.000 xg por 10 min, os sobrenadantes foram coletados e os precipitados foram re-extraídos com 1 mL de ácido perclórico 30% (v/v) por mais duas vezes. Ao final, os sobrenadantes foram reunidos, perfazendo 3,5 mL de extrato total por amostra. A dosagem de amido foi realizada com a utilização do reagente de antrona (MORRIS, 1948; YEMM e WILLIS, 1954). Para cada determinação, foram utilizados 100 μL da amostra, 900 μL de água destilada e 2,5 mL do reagente de antrona. A leitura foi realizada a 620 nm, utilizando uma curva padrão de D-glicose. Os valores obtidos foram multiplicados pelo fator 0,9 para conversão em amido, segundo McCready et al. (1950), sendo expressos em mg.parte-1. 3.4. ATIVIDADES ENZIMÁTICAS. 3.4.1 LIPASES Para obter os extratos enzimáticos, amostras de cotilédones com cerca de 200 mg de massa fresca foram extraídos por maceração com 0,8 mL de tampão fosfato de potássio 50 mM pH 7,5 suplementado com 2-mercaptoetanol 0,01%(v/v). Após centrifugação a 10.000 xg durante 10 min a 4 °C, os sobrenadantes foram coletados e utilizados como extratos enzimáticos. A atividade de lipases foi estimada pelo método de Marriott e Northcote (1975) adaptado por Borek et al. (2006), com algumas modificações. Em um volume de reação de 2 mL, foram reunidos, em uma concentração final, tampão Tris-HCl 77,5 mM pH 8,5, triton X-100 0,001% (v/v), 4-nitrofenil-palmitato 8 mM e 200 μL do extrato enzimático. Para cada amostra, foi realizado um branco sem substrato. As amostras foram incubadas a 50 °C durante 5 e 20 min e a reação foi parada em banho de gelo. Após centrifugação a 10.000 xg por 20 min a 4 °C, as amostras foram lidas a 410nm e a atividade de lípases foi calculada com base em uma curva padrão de 4-nitrofenol e expressa em nmol.4-nitrofenol.g-1 MS.min-1..

(37) 34 3.4.2 ISOCITRATO LIASE Para a obtenção dos extratos enzimáticos, amostras de cotilédones com cerca de 200 mg de massa fresca foram extraídas por maceração com 1,5 mL de tampão fosfato de potássio 100 mM pH 7,6 suplementado com MgCl 2 1 mM e 2mercaptoetanol 10 mM. As amostras foram centrifugadas a 10.000 xg durante 10 min a 4 °C e os sobrenadantes foram coletados como extratos enzimáticos. A atividade de ICL foi estimada pelo método de Chell et al. (1978). O volume final da reação foi de 2 mL, para cada determinação foram adicionados a um volume final tampão imidazol 5 mM pH 6,8, MgCl2 5 mM, EDTA 1 mM, fenilhidrazina-HCl 4 mM, DL-isocitrato 1 mM e 200 μL do extrato enzimático. A atividade enzimática foi calculada a partir da absorbância do complexo glioxilato-fenilhidrazina a 324 nm, a cada minuto, durante 10 min, e expressa em mmol de glioxilato-fenilhidrazina.g-1 MS.min-1. 3.4.3 AMILASES A atividade de amilases foi estimada pela liberação de açúcares redutores (AR) a partir de amido solúvel como substrato (ELARBI et al., 2009). As amilases foram extraídas de amostras com aproximadamente 100 mg de massa fresca por maceração com 0,6 mL de tampão acetato de potássio 100 mM pH 6,0 contendo CaCl2 5 mM. Após centrifugação a 10.000 xg por 20 min a 4 °C, os sobrenadantes foram coletados e empregados como extratos enzimáticos. A reação ocorreu em tubo de ensaio de plástico (1,5 mL) com fundo cônico, o volume final da reação foi de 600 μL contendo 200 μL de extrato enzimático mais amido solúvel 0,33 % (m/v) em tampão acetato 0,66 mM pH 6,0 contendo CaCl2 3,3 mM. As amostras foram incubadas a 55 °C por 10 min, as reações foram paradas em banho de gelo e a concentração de AR foi determinada pelo método MILLER (1959), utilizando o reagente do 3,5-dinitro-salicilato (DNS)..

(38) 35 3.4.4 PROTEASES ÁCIDAS A atividade de proteases foi estimada pela produção de aminoácidos livres (AAL) a partir de caseína como substrato (BEEVERS, 1968 – modificado). Para a extração, amostras de cerca de 100 mg de massa fresca foram maceradas com 0,6 mL de tampão Tris-HCl 50 mM pH 7,2 contendo 2-mercaptoetanol 2 mM. As amostras foram centrifugadas a 10.000 xg por 20 min a 4 °C e os sobrenadantes foram utilizados como extratos enzimáticos. A reação ocorreu em tubo de ensaio de plástico (1,5 mL) com fundo cônico e o volume final da reação foi de 750 μL. Para cada determinação, foram adicionados 250 μL de extrato, de tampão acetato de potássio 33,33 mM pH 5,5 e caseína 0,33% (m/v). As amostras foram incubadas a 40 °C por 60 min e as reações foram paradas pela adição de 250 μL de ácido tricloroacético 20% (m/v). Depois de incubação em gelo por 20 min, as amostras foram centrifugadas a 10.000 xg por 20 min a 4 °C. A concentração de AAL nos sobrenadantes foi acessada pelo método de PEOPLES (1989), com a utilização do reagente de ninidrina. 3.5. DELINEAMENTO EXPERIMENTAL E ANÁLISE ESTATÍSTICA Os experimentos foram realizados em delineamento inteiramente casualizado. com cinco repetições por tratamento. A unidade experimental consistiu em um frasco de cultura contendo cinco plântulas. Os resultados foram submetidos à análise de variância e as médias foram comparadas pelo teste de Tukey ao nível de significância de 5%..

(39) 36. 4. RESULTADOS. 4.1. EFEITO OSMÓTICO VERSUS MOBILIZAÇÃO DAS RESERVAS DE. CARBONO E NITROGÊNIO INFLUENCIADA POR AÇÚCARES EXÓGENOS Embora os tratamentos com açúcares exógenos não tenham alterado o conteúdo de MS nos cotilédones, observou-se aumento no conteúdo de MS tanto no hipocótilo como nas raízes (tabela 1). Na presença de sacarose 100 mM, o conteúdo de MS no hipocótilo acumulou em 25% e nas raízes duas vezes, em relação ao controle. Em comparação, os tratamentos com glicose 100 mM e a mistura equimolar de glicose e frutose foram menos efetivos quanto à acumulação de MS no hipocótilo e nas raízes, enquanto o manitol manteve os níveis de MS estatisticamente iguais ao do controle para todas as partes. Tabela 1. Massa seca de cotilédones, hipocótilo e raízes em plântulas de girassol expostas a diferentes açúcares exógenos. Dois dias após a embebição, as plântulas foram cultivadas em um -1 meio ágar água 4 g L sem adições (controle) ou contendo sacarose 100 mM, glicose 100 mM, glicose 50 mM mais frutose 50 mM ou manitol 100 mM em condições controladas durante 72 h. Os valores correspondem à media ± desvio padrão obtidos a partir de cinco repetições. Valores assinalados com diferentes letras apresentam diferença significativa de acordo com teste de Tukey a 5% de significância.. Tratamentos. Massa seca (mg) Cotilédones. Controle Sacarose 100 mM Glicose 100 mM Glicose 50 mM + Frutose 50 mM Manitol 100 mM. Hipocótilo. Raízes. 24,26 ± 0,92 a 27,59 ± 3,02 a 26,08 ± 2,10 a 27,16 ± 1,62 a. 9,60 ± 0,33 bc. 5,31 ± 0,56 c. 12,03 ± 0,90 a 9,83 ± 0,62 bc. 11,68 ± 0,61 a. 10,20 ± 0,78 b. 24,75 ± 1,14 a. 8,67 ± 0,53 c. 8,04 ± 0,82 b 5,44 ± 0,79 c. 7,72 ± 0,78 b. Todos os açúcares exógenos influenciaram o processo de mobilização das reservas nos cotilédones de plântulas de girassol (Tabela 2). No entanto, apenas na presença de sacarose e glicose, houve retardo simultâneo na degradação dos lipídeos e proteínas de reserva. De fato, os tratamentos com sacarose e glicose 100 mM inibiu a degradação de LN em 47 e 32%, bem como o conteúdo de PS em 92 e 54%, nesta ordem, em relação ao controle. Embora a exposição à glicose 50 mM mais frutose 50 mM tenha retardado a degradação do conteúdo de PS em 2,6 vezes e de amido em 52%, o conteúdo de LN permaneceu inalterado nos cotilédones,.

(40) 37 quando comparada ao controle. Estas respostas não podem ser atribuídas ao efeito osmótico dos açúcares exógenos, visto que o tratamento com manitol 100 mM não alterou significativamente o conteúdo de LN, PS e amido nos cotilédones, em relação às plântulas não tratadas. Tabela 2. Conteúdo de lipídeos neutros, amido e proteínas solúveis em cotilédones, hipocótilo e raízes de plântulas de girassol expostas a diferentes açúcares exógenos. Dois dias após a -1 embebição, as plântulas foram cultivadas em um meio ágar água 4 g L sem adições (controle) ou contendo sacarose 100 mM, glicose 100 mM, glicose 50 mM mais frutose 50 mM ou manitol 100 mM em condições controladas durante 72 h. Os valores correspondem à media ± desvio padrão obtidos a partir de cinco repetições. Valores assinalados com diferentes letras apresentam diferença significativa de acordo com teste de Tukey a 5% de significância.. Tratamentos. Lipídeos neutros (mg part-1). Amido (mg part-1). Proteínas solúveis (mg part-1). Cotilédones Controle Sacarose 100 mM Glicose 100 mM Glicose 50 mM + Frutose 50 mM Manitol 100 mM. 8,73 ± 0,58 c 12,86 ±1,65 a 11,53 ± 1,15 ab 9,68 ± 0,63 bc 9,18 ± 0,60 c. 0,29 ± 0,05 c 0,27 ± 0,03 c 0,36 ± 0,03 b 0,44 ± 0,03 a 0,27 ± 0,01 c. 0,87 ± 0,13 c 1,37 ± 0,13 a 1,14 ± 0,01 b 1,13 ± 0,05 b 0,80 ± 0,08 c. Hipocótilo Controle Sacarose 100 mM Glicose 100 mM Glicose 50 mM + Frutose 50 mM Manitol 100 mM. a. ND ND ND ND ND. 0,15 ± 0,01 b 0,17 ± 0,02 b 0,19 ± 0,02 b 0,30 ± 0,06 a 0,13 ± 0,02 b. 0,25 ± 0,02 b 0,28 ± 0,04 ab 0,30 ±0,04 ab 0,34 ± 0,02 a 0,27 ± 0,02 b. Raízes Controle Sacarose 100 mM Glicose 100 mM Glicose 50 mM + Frutose 50 mM Manitol 100 mM. ND ND ND ND ND. 0,09 ± 0,02 bc 0,13 ±0,01 ab 0,08 ± 0,01 bc 0,19 ± 0,06 a 0,05 ± 0,01 c. 0,06 ± 0,01 b 0,10 ± 0,01 a 0,07 ± 0,01 b 0,12 ± 0,01 a 0,12 ± 0,01 a. a. Não determinado. 4.1.1 INFLUÊNCIA DE AÇÚCARES EXÓGENOS SOBRE A ACUMULAÇÃO DE AÇÚCARES E AMINOÁCIDOS NAS FONTES E NOS DRENOS Em paralelo ao efeito de retardo na mobilização dos lipídeos e proteínas de reserva observado nos tratamentos com sacarose e glicose, houve um aumento na concentração do gradiente decrescente de açúcares dos drenos (raízes e hipocótilo) em direção às fontes (cotilédones) (Tabela 3). Como uma evidência da absorção radicular, o conteúdo de AST aumentou em 125 e 72%, enquanto que o conteúdo de.

(41) 38 ANR apresentou aumento de três e dez vezes nas raízes expostas à sacarose e à glicose, respectivamente, em relação ao controle. Consequentemente, o conteúdo de ANR aumentou em 94 e 127% no hipocótilo, assim como nos cotilédones em 34 e 50% nas plântulas tratadas com sacarose e glicose, nesta ordem, em relação às não tratadas. Assim como os tratamentos com sacarose e glicose, a mistura equimolar de glicose e frutose também causou uma acumulação de ANR nas diferentes partes da plântula, mas não aumentou o conteúdo de AST nas raízes e no hipocótilo. De forma diferente dos tratamentos com sacarose e glicose, a mistura equimolar de glicose e frutose acarretou a acumulação de PS e amido nas raízes e no hipocótilo, em comparação com o controle (Tabela 2). Nenhum dos tratamentos com açúcares exógenos foi capaz de alterar o conteúdo de AALT nas diferentes partes da plântula (Tabela 3)..

(42) 39 Tabela 3. Conteúdo de açúcares solúveis totais (AST), açúcares não redutores (ANR), e aminoácidos livres totais (AALT) nos cotilédones, hipocótilos e raízes de plântulas de girassol expostas a diferentes açúcares exógenos. Dois dias após a embebição, as plântulas foram cultivadas em um meio ágar -1 água 4 g L sem adições (controle) ou contendo sacarose 100 mM, glicose 100 mM, glicose 50 mM mais frutose 50 mM ou manitol 100 mM em condições controladas durante 72 h. Os valores correspondem à media ± desvio padrão obtidos a partir de cinco repetições. Valores assinalados com diferentes letras apresentam diferença significativa de acordo com teste de Tukey a 5% de significância.. Tratamento. AST (µmol g-1 MS). ANR (µmol g-1 MS). AALT (µmol g-1 MS). Cotilédones Controle Sacarose 100 mM Glicose 100 mM Glicose 50 mM + Frutose 50 mM Manitol 100 mM. 230,76 ± 42,13 b 198,07 ± 21,22 b 185,49 ± 25,19 b 396,21 ± 26,14 a 403,30 ± 51,58 a. 2,26 ± 0,14 c 3,03 ± 0,64 ab 3,41 ± 0,32 a 3,04 ± 0,28 ab 2,51 ± 0,18 bc. 11,31 ± 0,05 a 11,54 ± 5,88 a 10,40 ± 1,62 a 14,54 ± 1,83 a 15,25 ± 3,01 a. Hipocótilo Controle Sacarose 100 mM Glicose 100 mM Glicose 50 mM + Frutose 50 mM Manitol 100 mM. 2083,12 ± 149,32 b 2421,04 ±138,85 a 2532,57 ± 133,65 a 1730,88 ± 54,26 c 2098,37 ± 194,37 b. 6,13 ± 0,58 d 11,87 ± 1,23 c 13,90 ± 1,05 b 25,70 ± 1,19 a 12,73 ± 0,69 b. 20,93 ± 1,03 ab 19,70 ± 1,50 ab 17,29 ± 0,46 ab 22,58 ±1,15 a 16,75 ± 6,78 b. Raízes Controle Sacarose 100 mM Glicose 100 mM Glicose 50 mM + Frutose 50 mM Manitol 100 mM. 4.2. 2077,66 ± 149.32 c 4669,31 ± 138,76 a 3571,16 ± 309,41 b 1979,94 ± 186,28 c 1967,97 ± 132,76 c. 12,87 ± 0,81 c 134,60 ± 15,30 a 39,89 ± 3,15 b 30,77 ±1,33 b 12,30 ± 0,97 c. 15,58 ± 0,62 a 6,73 ± 0,05 bc 7,78 ± 1,00 b 1,97 ± 0,23 d 6,25 ± 1,17 c. AÇÚCARES METABOLIZÁVEIS E NÃO METABOLIZÁVEIS VERSUS A. MOBILIZAÇÃO DE LIPÍDEOS, PROTEÍNAS E CARBOIDRATOS A alteração no conteúdo de MS foi influenciada pelos diferentes análogos da glicose nos cotilédones e hipocótilo, entretando os açúcares não metabolizáveis provocaram redução de MS nas raízes em comparação com o controle (Tabela 4). Ambos os tratamentos análogos e não metabolizáveis, manose e 3-OMG, aumentaram em 17,5% a MS nos cotilédones, enquanto no hipocótilo, foi observado aumento de 12% apenas para manose. Nas raízes, os tratamentos com manose e 3OMG reduziram em 57 e 40%, nesta ordem, o conteúdo de MS, em relação ao controle..

(43) 40 Tabela 4. Massa seca de cotilédones, hipocótilo e raízes em plântulas de girassol expostas aos -1 análogos de glicose. Dois dias após embebição foram cultivas em um meio agar água 4 g L sem adicionais (controle) ou com glicose 100 mM, frutose 100 mM, manose 100 mM, ou 3-O-metil-glicose 100mM em condições controladas durante 72h. Valores assinalados com diferentes letras apresentam diferença significativa de acordo com teste de Tukey a 5% de significância.. Tratamento. Controle 100mM Glicose 100mM Frutose 100mM Manose 100mM 3-O-metil-glicose100mM. Massa seca (mg) Cotilédones. Hipocótilo. Raízes. 25,25 ± 1,50 b 26,20 ± 1,81 b 27,05 ± 2,33 ab 29,69 ± 1,35 a 29,77 ± 1,18 a. 10,50 ± 0,35 b 11,00 ± 0,79 ab 10,33 ± 0,41 bc 11,88 ± 0,89 a 9,30 ± 0,45 c. 6,50 ± 0,61 a 6,88 ± 1,02 a 6,67 ± 0,54 a 2,83 ± 0,20 b 3,90 ± 0,65 b. Os análogos não metabolizáveis, manose e 3-OMG, bem como os metabolizáveis, glicose e frutose provocaram um aumento significativo na concentração de lipídeos e de PS nos cotilédones das plântulas de girassol (tabela 5). Desta maneira, a presença de 100 mM de manose e de 3-OMG, provocou aumento de 32 e 26% no conteúdo de LN e 64 e 70% no conteúdo de PS, respectivamente, em relação ao controle..

(44) 41 Tabela 5. Conteúdo de lipídeos neutros, amido e proteínas solúveis nos cotilédones, hipocótilos e raízes nas plântulas de girassol expostas aos análogos de glicose. Dois dias após embebição foram -1 cultivas em um meio agar água 4 g L sem adicionais (controle) ou com glicose 100 mM, frutose 100 mM, manose 100 mM, ou 3-O-metil-glicose 100mM em condições controladas durante 72h. Valores assinalados com diferentes letras apresentam diferença significativa de acordo com teste de Tukey a 5% de significância.. Tratamento. Lipídeos neutros (mg part-1). Controle 100mM Glicose 100mM Frutose 100mM Manose 100mM 3-O-metil-glicose100mM. 8,75 ± 0,73 b 11,00± 0,31 a 10,40 ±1,04 a 11,50 ± 0,47 a 11,02 ± 0,25 a. Amido (mg part-1) Cotilédones. Proteínas solúveis (mg part-1). 0,36 ± 0,03 c 0,40 ± 0,01 bc 0,45 ± 0,04 ab 0,49 ± 0,04 a 0,40 ± 0,02 bc Hipocótilo. 1,12 ± 0,13 c 1,49 ± 0,09 b 1,73 ± 0,10 ab 1,84 ± 0,12 a 1,90 ± 0,08 a. Controle 100mM Glicose 100mM Frutose 100mM Manose 100mM 3-O-metil-glicose100mM. NDa ND ND ND ND. 0,29 ± 0,02 c 0,37 ± 0,03 b 0,46 ± 0,04 a 0,44 ± 0,03 a 0,36 ± 0,03 b Raízes. 0,38 ± 0,01 a 0,39 ± 0,01 a 0,40 ± 0,02 a 0,37 ± 0,03 a 0,30 ± 0,03 b. Controle 100mM Glicose 100mM Frutose 100mM Manose 100mM 3-O-metil-glicose100mM. ND ND ND ND ND. 0,19 ± 0,02 b 0,23 ± 0,01 a 0,23 ± 0,03 a 0,10 ± 0,01 c 0,12 ± 0,02 c. 0,14 ± 0,01 bc 0,15 ± 0,02 b 0,21 ± 0,01 a 0,13 ± 0,02 bc 0,11 ± 0,02 c. a. Não determinado. 4.2.1 EFEITOS. DE. ANÁLOGOS. DA. GLICOSE. NA. ACUMULAÇÃO. DE. AÇÚCARES AO LONGO DE UM GRADIENTE DECRESCENTE DE AST E ANR DOS DRENOS PARA AS FONTES Os tratamentos com os diferentes açúcares exógenos levaram ao aumento na concentração do gradiente decrescente de açúcares dos drenos para as fontes nas plântulas de girassol (Tabela 6). Levando em conta a acumulação de AST nas raízes e hipocótilo, o efeito da glicose e da frutose foi mais acentuado quando comparados aos tratamentos com manose e 3-OMG. Quando as plântulas foram expostas a 100 mM de glicose e frutose, o teor de AST aumentou 2,5 vezes nas raízes e cerca de 35% no hipocótilo, no que diz respeito ao controle. Nas raízes, as plântulas tratadas com manose e 3-OMG, aumentou em 65% o conteúdo de AST enquanto no.