Avaliação da imunopatologia de tecido renal em casos fatais de dengue em crianças

1

UNIVERSIDADE FEDERAL FLUMINENSE – UFF

CURSO DE GRADUAÇÃO EM BIOMEDICINA

AVALIAÇÃO DA IMUNOPATOLOGIA DE TECIDO RENAL

EM CASOS FATAIS DE DENGUE EM CRIANÇAS

Bacharelado em pesquisa científica: Microbiologia e

Parasitologia

Autor: Lucca de Lima Siqueira Oliveira

Orientador: Marciano Viana Paes

Co-orientadora: Natália Gedeão Salomão

Niterói, RJ

2020

2 Lucca de Lima Siqueira Oliveira

AVALIAÇÃO DA IMUNOPATOLOGIA DE TECIDO RENAL EM CASOS FATAIS DE DENGUE EM CRIANÇAS

Orientador: Dr. Marciano Viana Paes

Co-orientadora: MSc. Natália Gedeão Salomão

Niterói, RJ

2020

3 Lucca de Lima Siqueira Oliveira

AVALIAÇÃO DA IMUNOPATOLOGIA DE TECIDO RENAL EM CASOS FATAIS DE DENGUE EM CRIANÇAS

BANCA EXAMINADORA

______________________________________________________

Fundação Oswaldo Cruz

______________________________________________________

Universidade Federal Fluminense

______________________________________________________

Universidade do Estado do Rio de Janeiro

______________________________________________________

Universidade Federal Fluminense

Niterói, RJ

2020

4 Trabalho desenvolvido no Laboratório Interdisciplinar de Pesquisas Médicas - Instituto Oswaldo Cruz, na Fundação Oswaldo Cruz sob a orientação do Dr Marciano Viana Paes e co-orientação da MSc. Natália Gedeão Salomão.

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A todos que acreditaram em mim e me impulsionaram durante essa trajetória. O sonho de menino se tornou realidade e ainda há de vir muito mais.

6

“Para sempre É sempre por um triz.”

7 AGRADECIMENTOS

Ao chegar ao fim dessa trajetória, posso dizer que certamente sou privilegiado por ter a companhia de pessoas incríveis nesse período; sejam elas as que já conhecia antes ingressar na universidade ou as que tive o prazer de conhecer durante a minha graduação. A imersão em conhecimento, vivências e aprendizados que tive ao longo desse percurso me tornou uma pessoa melhor, mais madura e ciente de muitas conjunturas que compõem esse mundo que vivemos. Cada um de vocês é parte disso e fico feliz de poder homenageá-los, mesmo que minimamente, com essa escrita.

Primeiramente agradeço à minha mãe, Luciene, a minha maior incentivadora nesse meio acadêmico. Sou extremamente grato por ter uma mãe tão correta, responsável e amiga como a senhora e não tenho como mensurar em tão poucas palavras o que faz por mim. Ao meu pai, Milton, que é um verdadeiro guerreiro e me faz sentir especial como mais ninguém na vida. Sei que posso contar a todo o tempo contigo e quero poder te orgulhar cada dia mais.

Agradeço à minha avó, Lucila, por ser tão solícita e carinhosa comigo. O amor que tenho por você é infinito e cada abraço que posso dar na senhora é um momento mágico para mim. Ao meu tio, Marcelo, que me mostra diversas vezes que a felicidade pode ser encontrada em momentos simples e por onde passa é garantia de sorrisos e alegria.

Ao meu avô, Alédio, um anjo na minha existência, que infelizmente se foi antes de me ver realizar esse sonho. Aonde quer que esteja, levarei a sua memória e legado a diante eternamente.

À minha madrinha, Mônica, sempre presente em minha vida como uma mãe e que fica extremamente feliz com as minhas conquistas, assim como fico por ter você em minha vida. À minha avó, Dilce, uma pessoa mais que importante para mim com seus conselhos e todo amor que me transmite. Não poderia me esquecer do meu tio, Marcus, que prezo muito e adoro conversar. É uma das inspirações que tenho para a minha paixão por música.

8 Agradeço à minha avó, Lurdes, por todo o carinho e por ser um exemplo enorme para mim de matriarca, com toda a sua bravura. À minha prima Wanessa, que tenho como confidente e irmã de consideração; que recentemente me deu a alegria de ser tio da minha querida sobrinha Isabella. Agradeço também à minha tia, Andrea, constantemente disposta a ajudar e que atualmente se encontra na linha de frente de combate à pandemia que estamos vivendo.

Acima de tudo, o meu ciclo de faculdade me permitiu ter iniciado amizades sensacionais, com pessoas das quais tenho um orgulho enorme de poder chamar de irmãos. Felipe, Carlos, Nathan e Pablo, o elo que temos é uma das coisas mais bonitas que posso testemunhar. Obrigado por estarem presentes em momentos fundamentais desse trajeto e não somente dele, com conselhos, oportunidades e a leveza imprescindível para a sinergia do nosso ambiente de benevolência. Se eu pude evoluir pessoalmente nesses quatro anos vocês podem se considerar partes essenciais desse processo.

Sofia, Sophia, Felippe, Manu e Douglas, obrigado por estarem ao meu lado em tantos momentos, sejam eles bons ou ruins. Amo estar com vocês e tenho certeza que sabem disso. Que essa nossa conexão nunca se perca.

Agradeço aos meus amigos de infância, Mateus, Samuel, João, Matheus, Luann e Eduardo, por terem me dado todo o suporte necessário ao longo desses anos. Mesmo com tantas mudanças em nossas vidas, quando nos encontramos a diversão é a mesma dos tempos mais simples de Colégio Santa Mônica e que isso se perpetue.

Ao meu estimado orientador Dr. Marciano Paes, por ter me dado a oportunidade de participar do projeto em um dos locais que sempre tive como objetivo estar, além dos muitos aprendizados que transcendem a área acadêmica. À minha prezada co-orientadora MSc. Natália Gedeão, que me proporciona diversos ensinamentos da carreira científica, além de ter a paciência para corrigir os meus deslizes com toda a sua singularidade.

Gostaria de agradecer também a todo o Laboratório Interdisciplinar de Pesquisas Médicas, principalmente os que estiveram mais presentes no meu

9 dia a dia. Kíssila, Leandro e Laiza, obrigado pelo convívio sempre agradável e por todo o companheirismo na rotina do laboratório.

A todo plantel docente do curso de biomedicina, deixo meu agradecimento e respeito registrados. Essa jornada não seria a mesma sem vocês, literalmente. O exemplo de profissionais que são me inspira a seguir uma carreira na área científica e nada disso seria possível sem todo a clareza e cuidado com que transmitem o conteúdo desejado.

A toda equipe da coordenação do curso de biomedicina. Nathália, Renata, Christina, Ronald que desde o momento do meu ingresso na faculdade fizeram questão de me dar todo o aparato essencial para o meu progresso e atenderam com toda atenção aos meus pedidos e questionamentos nessa reta final de curso.

Por fim, agradeço a todos que me apoiaram nesse percurso. O apoio de vocês me impulsiona a chegar cada vez mais longe. Fica aqui registrada a minha gratidão. Vamos por mais. Haja o que houver.

10 RESUMO

A dengue é uma doença viral com alta incidência no Brasil, que possui quatro sorotipos e que pode evoluir para um caso fatal. Assim como outros órgãos alvos já relatados, o rim também pode estar comprometido, levando o paciente a apresentar proteinúria, sinal clássico de glomerulite. Desta forma, este trabalho tem como objetivo investigar alterações histopatológicas causadas pela infecção do vírus dengue (DENV) no tecido renal de três casos fatais de crianças com anticorpos IgM+ _{anti-DENV (Caso 1: Sexo masculino, 7} anos; Caso 2: Sexo feminino, 9 anos; Caso 3: Sexo masculino, 10 anos). Para isso, foram obtidos cortes de 5 µm do tecido renal a partir de blocos de parafina do Hospital Municipal Jesus (Rio de Janeiro, Brasil). Para análise das principais alterações histopatológicas, foram realizadas as colorações de Hematoxilina & Eosina (H.E.), Tricrômico de Masson e Picro-sirius (para a observação e análise das fibras colágenas e da degradação da matriz extracelular), sendo adotados graus de 0 a 4 para avaliação dos danos causados pela infecção. Nos casos estudados foram observadas alterações histopatológicas, como áreas difusas de congestão vascular, edema e presença de infiltrado glomerular, além de espessamento da área de matriz ao redor dos capilares glomerulares; assim como infiltrado mononuclear associado à congestão vascular na região medular. Os infiltrados observados no tecido renal foram caracterizados pela expressão de células CD68+_{, T CD8}+ _{e CD56}+ _e, evidenciando a presença de macrófagos com morfologia característica de células hiperplásicas, linfócitos e células NK. Esse perfil de citocinas pró-inflamatórias se caracterizou principalmente pela expressão de TNF-α e RANTES e de mediadores como VEGF-R2. Além disso, foi feita a detecção da Caspase-3, importante componente do processo de apoptose e da Metaloproteinase-9, que participa da degradação da matriz extracelular. A replicação do vírus da dengue foi evidenciada pela detecção da proteína NS3, por imunohistoquímica. Esses resultados buscam ajudar no esclarecimento dos principais fatores que possam estar envolvidos nas alterações do tecido renal em casos fatais de dengue em crianças.

Palavras-chave: dengue; crianças; rim; histopatologia; citocinas; mediadores inflamatórios

11 ABSTRACT

Dengue is a viral disease with high incidence in Brazil, which has four serotypes and can evolve into a fatal case. Like other target organs already reported, the kidney may also be compromised, leading the patient to present proteinuria, a classic sign of glomerulitis. Thus, this work aims to investigate histopathological changes caused by dengue virus (DENV) infection in the renal tissue of three fatal cases of children with IgM+ _{anti-DENV antibodies (Case 1: Male, 7 years} old; Case 2: Female, 9 years old; Case 3: Male, 10 years old). For this purpose, 5 µm sections of renal tissue were obtained from paraffin blocks at Hospital Municipal Jesus (Rio de Janeiro, Brazil). For the analysis of the main histopathological changes, Hematoxylin & Eosin (HE), Masson's Trichrome and Picro-sirius, for the observation and analysis of collagen fibers and extracellular matrix degradation staining, with grades 0 to 4 being adopted for evaluation of the damage caused by the infection. In the studied cases, diffuse areas of vascular congestion, edema and glomerular infiltrate were observed, in addition to thickening of the matrix area around the glomerular capillaries and mononuclear infiltrate associated with vascular congestion in the medullary region. The infiltrates observed in the renal tissue were characterized by the expression of CD68+_{, T CD8}+ _{and CD56}+ _{cells and, evidencing the presence of} macrophages with characteristic morphology of hyperplastic cells, lymphocytes and NK cells. This profile of pro-inflammatory cytokines was mainly characterized by the expression of TNF-α and RANTES and mediators such as VEGF-R2. In addition, Caspase-3, an important component of the apoptosis process and Metalloproteinase-9, which participates in the degradation of the extracellular matrix, were detected. The replication of the dengue virus was evidenced by the detection of NS3 protein, by immunohistochemistry. These results seek to help clarify the main factors that may be involved in changes in renal tissue in fatal cases of dengue in children.

Key-words: dengue; children; kidney; histopathology; cytokine; inflammatory mediators

12 ÍNDICE DE ILUSTRAÇÕES

INTRODUÇÃO

Página

Figura 1.1 Presença de dengue no mundo 19

Figura 1.2 Representação esquemática da partícula viral 21 Figura 1.3 Ciclo replicativo do vírus da dengue 23 Figura 1.4 Classificação para os casos de dengue 24 Figura 1.5 Esquema da visão anatômica anterior do rim 29 Figura 1.6 Esquema representativo do túbulo urinífero a partir do néfron,

passando por túbulos proximais e distais, alça de Henle, túbulos e ductos coletores medulares

30

Figura 1.7 Fotomicrografia da região cortical do rim 31 Figura 1.8 Fotomicrografia da região medular do rim 31 Figura 1.9 Esquema e fotomicrografia de corpúsculo renal 34

RESULTADOS

Figura 4.1 Média dos níveis séricos de creatinina e ureia dos três casos fatais de dengue em crianças

42 Figura 4.2.1 Análise histopatológica do rim de casos fatais de dengue em

crianças

43 Figura 4.2.2 Quantificação dos danos observados 45

Figura 4.3.1 Análise de colágeno tecidual no rim 46 Figura 4.3.2 Quantificação de colágeno por área nos casos estudados 47 Figura 4.4 Detecção de antígeno viral (proteína NS3) no tecido renal de

caso fatal de dengue

48 Figura 4.5

Figura 4.6

Caracterização de subpopulações celulares no tecido renal Quantificação da expressão de células CD68+

49 50 Figura 4.7

Figura 4.8.1

Figura 4.8.2

Quantificação da expressão de células TCD8+

Detecção de citocinas, quimiocinas e mediadores inflamatórios no rim dos casos fatais

Detecção de MMP-9 e Caspase-3 no rim dos casos fatais

51 53 54

13 ÍNDICE DE TABELAS

Página Tabela 1 Anticorpos primários, marcas e diluições 41

14 LISTA DE ABREVIATURAS

ADE Aumento da replicação viral dependente de anticorpo (do inglês, Antibody-dependent enhancement)

CHGM Concentração de hemoglobina globular média

DC-SIGN Molécula de adesão intercelular não-integrina específica de célula dendrítica (do inglês, Dendritic Cell--specific

ICAM-grabbing nonintegrin)

DENV Vírus da dengue

DENV-1 Vírus da dengue sorotipo 1

DENV-2 Vírus da dengue sorotipo 2

DENV-3 Vírus da dengue sorotipo 3

DENV-4 Vírus da dengue sorotipo 4

FcγR Receptores de Fc gama

(do inglês, Fc gamma receptors)

HE Hematoxilina-Eosina

HGM Hemoglobina globular média

HS Heparan sulfato

IFN Interferon

IFN-γ Interferon-gama

IL-10 Interleucina-10

IRA Injúria renal aguda

L-SIGN Integrina molécula de adesão intercelular específica para fígado/linfonodo (do inglês, liver/lymph node-specific intracellular adhesion molecules grabbing non-integrin) MCP1/CCL

2

Proteína quimioatraente de monócitos 1

MHC Complexo principal de histocompatibilidade (do inglês major

15 MMP-2 Metaloproteinase de matriz 2 (do inglês, Matrix

Metallopeptidase 2)

MMP-9 Metaloproteinase de matriz -9 (do inglês, Matrix Metallopeptidase 9)

NK Natural Killer

NS (1-7) Proteína não-estrutural (1 a 7)

NS3 Proteína não-estrutural 3

OMS/WHO Organização Mundial de Saúde/ World Health Organization

pC Proteína de capsídeo pE Proteína de envelope pM Proteína de membrana prM Pré-membrana RANTES/C CL5

Regulado após a ativação, célula T normal expressa e presumivelmente secretada

RNA Ácido ribonucleico (do inglês, ribonucleic acid).

TCD8 Linfócito T citotóxico

TDC4 Linfócito T auxiliar

TGF-β Fator de transformação do crescimento beta TIM Família de receptores para célula T / transmembrana,

imunoglobulina e mucina

TAM Família de receptores para tirosina quinases TIMP Inibidor tecidual de metaloproteinase TNF-A Fator de necrose tumoral-alfa

VEGF Fator de crescimento endotelial vascular

VEGFR-1 Receptor 1 de fator de crescimento endotelial vascular VEGFR-2 Receptor 2 de fator de crescimento endotelial vascular

16 SUMÁRIO I - INTRODUÇÃO ... 18 1.1. Epidemiologia da dengue ... 18 1.1.1. No mundo ... 18 1.1.2. No Brasil ... 19 1.2. O vírus ... 20 1.3. A infecção ... 22 1.4. Manifestações clínicas ... 23 1.5. Patogênese ... 25

1.6. Patogênese no tecido renal ... 27

1.7. Morfologia renal ... 29

II - OBJETIVOS ... 35

2.1. Objetivo geral ... 35

2.2. Objetivos específicos... 35

III - MATERIAIS E MÉTODOS ... 36

3.1. Considerações éticas... 36

3.2. Casos fatais de dengue em crianças ... 36

3.3. Descrição da história clínica dos controles e casos fatais ... 36

3.4. Processamento de material e obtenção dos cortes ... 38

3.5. Colorações ... 38

3.6. Quantificações no tecido renal ... 39

3.7. Imunohistoquímica... 40

IV- RESULTADOS ... 42

4.1. Avaliação dos níveis séricos de creatinina e ureia de três casos fatais de dengue em crianças ... 42

4.2. Avaliação histopatológica e quantificação de danos do tecido renal de três casos fatais de dengue em crianças ... 43

4.3. Coloração e quantificação do colágeno no tecido renal de três casos fatais de dengue em crianças ... 46

4.4. Investigação da replicação viral através da detecção da proteína NS3 ... 47

4.5. Caracterização do perfil de células em tecido renal de casos fatais de crianças infectadas por dengue ... 48

17

4.6. Quantificação das células T CD68+ ... 50

4.7. Quantificação das células T CD8+ ... 51

4.8. Detecção de citocinas, quimiocinas e mediadores inflamatórios em tecido renal de crianças ... 51

V - DISCUSSÃO ... 55

VI - CONCLUSÃO ... 63

VII - PERSPECTIVAS ... 64

18 1. INTRODUÇÃO

1.1 Epidemiologia da dengue 1.1.1 No mundo

A dengue é considerada um desafio global de saúde pública nos países tropicais e subtropicais pela Organização Mundial de Saúde (OMS), dada as condições ambientais favoráveis para o ciclo da vida dos mosquitos do gênero Aedes nesses locais (Fig. 1.1). A doença registrou um aumento de 30 vezes no mundo entre os anos de 1960 e 2010, o que pode ser explicado por diversos fatores, como aumento da taxa de crescimento populacional, planejamento urbano inadequado, crescimento exponencial da frequência de viagens aéreas e precarização dos serviços de saúde, além de dificuldade de acesso ao mesmo (Gubler et al., 1998; WHO, 2009; Guzman et al., 2010; Revisado por Hasan et.al., 2016).

O vírus da dengue (DENV) é tido como um patógeno razoavelmente recente, havendo relatos que a transmissão do vírus para os seres humanos iniciou-se aproximadamente três séculos atrás (Pollett et al., 2018). O estabelecimento do ciclo urbano do vírus e seus quatro sorotipos demandou diversos eventos de emergência. Dentre eles, a evolução ancestral do mosquito Aedes aegypti na África, uma continuidade consistente na existência do ciclo de vida desses mosquitos e o transporte dos mesmos para a parte tropical do continente americano, para Europa e Ásia, através do comércio de escravos, em franca ascensão devido ao período das grandes navegações (Powell et al., 2018; Halstead et al., 2019).

No ano de 2019, a dengue foi capaz de provocar epidemias em diferentes locais do globo (Figura 1.1), se apresentando de maneira mais expressiva em países do Sudeste Asiático e da América Latina, em comparação aos continentes europeu e africano, que apresentaram números comparativamente baixos de infecção (ECDC, 2020). Dentre os países mais afetados, se destacam o Brasil, que notificou 1.544.987 casos prováveis da doença no último ano; as Filipinas, que foi acometida por 420.453 casos prováveis nesse período; o Vietnã e o México, que apresentaram 320.702 e

19 268.458 casos prováveis de dengue, respectivamente (SVS, 2020; WPR/OMS, 2019; OPS/OMS, 2019)

Figura 1.1 – Presença de dengue no mundo (ECDC, 2020).

1.1.2 No Brasil

Apesar de terem sido relatadas doenças com sintomas e sinais semelhantes com a infecção causada pelo DENV desde 1846 (Mariano et al., 1917), os primeiros surtos de dengue no Brasil, causado por 1 e DENV-4, foram confirmados no final de 1981 e 1982, respectivamente, na região norte do país, mais especificamente na cidade de Boa Vista, Roraima (RR) (Osanai et al., 1983). Quatro anos depois, o sorotipo 1 causou surto no estado do Rio de Janeiro (RJ), com 5 óbitos (Schatzmayr et al., 1986). No estado fluminense, houve a identificação do sorotipo DENV-2 em 1990, acarretando nos primeiros casos reconhecidos de febre hemorrágica do dengue no país (Nogueira et al., 1990; Revisado por Nunes et.al., 2019).

Em dezembro de 2000, o DENV-3 foi detectado no Rio de Janeiro (Nogueira et al., 2002), e se espalhou rapidamente para outros estados do país, sendo o principal responsável pela epidemia de dengue no Brasil em 2002, com 150 mortes, se configurando como a epidemia com resultados mais alarmantes causado pelo vírus até então (de Araujo et al, 2009). Em 2007,

20 quase duas décadas após sua introdução no Brasil, o sorotipo 2 ressurgiu e causou uma grave epidemia, que inclui um aumento de mais de 100% de casos severos de febre hemorrágica do dengue em relação aos anos anteriores (Teixeira et al., 2008). Durante esse surto, foi observado que o sorotipo 2 que emergiu em 2007/08 era geneticamente distinto da cepa inicialmente descoberta em 1990 (Oliveira et al., 2010). Essa “nova” cepa foi classificada como “Linhagem II” e possuía uma capacidade de virulência mais agressiva do que o seu antecessor (Nunes et al., 2016; Revisado por Nunes et al., 2019).

O sorotipo 4 foi reintroduzido no país em 2010. Acredita-se que foi pela circulação que já ocorria em países da América do Sul que fazem fronteira com estados brasileiros, como Colômbia e Venezuela (Gúzman et al., 2002). Os primeiros casos identificados eram provenientes dos estados de Roraima (RR) e Amazonas (AM) (Nogueira et al., 2011; Revisado por Nunes et al., 2019).

Os anos de 2015 e 2016 apresentaram a maior incidência de casos no país desde 1990, com uma nova recorrência do sorotipo 2. A epidemia registrou 972 mortes em 2015 e 609 em 2016. Embora o número de óbitos tenha sido menor em 2016, proporcionalmente ele se mostrou mais expressivo do que no ano anterior (4,3% em 2015 e 6,8% em 2016) (SVS, 2016) (SBMT, 2016) (Revisado por Salles et al., 2018)

No boletim de 2019, foram notificados 1.544.987 casos prováveis de dengue no país, com destaque para os estados de Minas Gerais (MG), São Paulo (SP) e Goiás (GO), que concentraram 67,9% dos casos prováveis do país. Nesse período, foram confirmados 1.419 casos de dengue grave e 18.740 de dengue com sinais de alarme, com 782 óbitos (SVS, 2020).

1.2 O vírus

O agente etiológico da dengue é o vírus dengue, pertencente à família Flaviviridae e gênero Flavivirus, apresentando quatro sorotipos antigenicamente distintos (DENV-1, DENV-2, DENV-3 e DENV-4), diferindo entre si de 25 a 40% em nível de aminoácidos e cerca de 3% em genótipos.

21 Esses quatro sorotipos de DENV circulam principalmente nas regiões tropicais e subtropicais do mundo (Diamond et al., 2015).

Sua partícula viral possui formato esférico com cerca de 50 nm de diâmetro e apresenta uma bicamada lipídica onde se encontram as proteínas de pré-membrana/membrana (prM/M) e envelope (E), tendo essas duas proteínas conformações diferentes nas formas madura e imatura do vírus. O peptídeo “pr” é clivado da prM durante a maturação e o peptídeo M permanece na partícula madura como uma proteína transmembrana (Perera et al., 2008). No seu interior está localizado o nucleocapsídeo, de formato icosaédrico, formado pela proteína do capsídeo (C), que abriga o genoma viral (Figura 1.2a).

Seu genoma consiste em um RNA de fita simples com polaridade positiva, de aproximadamente 11 kb, que codifica uma poliproteína, clivada por proteases da célula hospedeira e do vírus, dando origem a três proteínas estruturais (C - capsídeo, M - membrana e E - envelope) e a sete proteínas não-estruturais (NS1, NS2A, NS2B, NS3, NS4A, NS4B e NS5) (Fig. 1.2b) (Murrel et al., 2011; Pollett et al., 2018).

Figura 1.2 – a) Representação esquemática da partícula viral; b) Genoma do DENV. Modificado de (Kuhn et al., 2002; Mackenzie et al., 2004; Costa, K.D, 2018)

22 1.3 A infecção

A ligação às células-alvo e a internalização do DENV ocorre por um grupo diverso de receptores, como o DC-SIGN, que facilita a disseminação do vírus em células dendríticas; o seu homólogo, receptor L-SIGN, produzido no tecido hepático; heparan sulfato (HS); receptor de manose (CD206); e proteínas imunomoduladoras transmembranas (receptores TIM/TAM) (Diamond et al., 2015)

O tropismo do DENV é bastante diverso. Sabe-se que os alvos para a infecção do vírus da dengue in vivo incluem uma gama extensa de tipos celulares, como: monócitos, macrófagos, células dendríticas e mastócitos, além da probabilidade alta de hepatócitos e células endoteliais também estarem envolvidos. Esses vírus sofrem endocitose, mediada majoritariamente pela proteína clatrina. Forma-se um endossoma, que se acidifica, induzindo mudanças conformacionais na proteína E, permitindo a fusão do envelope do endossoma com o envelope viral. A partir daí, ocorre a liberação do nucleocapsídeo no citoplasma, em seguida, RNA viral, que será encaminhado para o retículo endoplasmático rugoso, onde será traduzido em uma poliproteína que ao ser clivada por proteases hospedeiras e virais, dando origem a três proteínas estruturais e sete não-estruturais do DENV (Diamond et al., 2015).

Já a transcrição ocorre com a síntese da fita negativa do RNA, seguida na amplificação do RNA viral, e da formação de um nucleocapsídeo, formando vírions imaturos, que brotam no retículo endoplasmático. A fase de maturação ocorre no complexo de Golgi, através da ação desempenhada pela enzima furina, o que muda expressivamente a conformação da proteína E, e torna obsoleta a existência da proteína de pré-membrana (Lindenbach et al., 2013; Diamond et al., 2015) (Figura. 1.3).

23

Figura 1.3 – Ciclo replicativo do vírus da dengue. (Pereira, A.S, 2018; Neufeldt et al., 2018)

1.4 Manifestações clínicas

A dengue possui uma vasta gama de manifestações clínicas e eventualmente tem uma evolução e desfecho clínico imprevisível, praticamente particular para cada paciente. A maioria dos casos se recupera após um quadro não grave da doença, enquanto uma pequena parcela tende a progredir para o quadro grave da doença, que no geral inclui extravasamento de plasma com ou sem hemorragia (WHO, 2009)

Atualmente, a OMS classifica as manifestações clínicas da dengue em três espectros: dengue sem sinais de alerta, dengue com sinais de alerta e dengue grave podendo levar ao óbito se não tratada corretamente (Kalayanarooj et al., 2011) (Figura 1.4).

24 Figura 1.4 – Classificação para os casos de dengue (WHO, 2009).

Durante muitas décadas, a dengue foi classificada basicamente em quatro categorias: Febre indiferenciada, Febre do Dengue, Febre Hemorrágica do Dengue e Síndrome do Choque por Dengue. Todavia, alguns estudos pleiteavam que esses critérios nem sempre eram condizentes com a severidade da doença (Deen et al., 2006; Phuong et al., 2004; Revisado por Ajlan et al., 2019). Como os critérios anteriores se mostraram obsoletos no diagnóstico específico da doença, foi necessária uma revisão dessa metodologia. Para isso, ocorreu um encontro promovido pela Organização Mundial de Saúde entre especialistas sobre o tema ao redor do globo, que chegaram a um consenso quanto a nova classificação dos tipos de dengue. Desde então a classificação engloba duas categorias: Dengue não-grave e Dengue Grave. A Dengue não-grave inclui duas sub-categorias, correspondentes aos casos com sinais de alerta e sem sinais de alerta. O uso dessa nomenclatura foi adotado para facilitar a triagem e tornar possível assim a detecção de casos que possam vir a evoluir para Dengue Grave (Ajlan et al., 2019). Esses sinais de alerta incluem: Dor abdominal, vômito persistente, derrame cavitário, sangramento de mucosa, letargia, inquietação entre outros, como indicado na Figura 1.4, enquanto as manifestações características de Dengue Grave incluem: Extravasamento grave de plasma, Hemorragia grave e um severo envolvimento/acometimento de órgãos (Figura 1.4) (WHO, 2009).

25 1.5 Patogênese

Os casos de dengue nos seres humanos apresentam extensa variedade de manifestações clínicas, que vão desde uma infecção com ausência de sintomas até um estado febril auto-limitante, podendo provocar também sintomas mais graves como extravasamento de plasma e choque, havendo a possibilidade de apresentar desfecho incompatível com a vida (WHO, 2009)

A infecção primária por um determinado sorotipo do DENV confere proteção imunológica contra esse sorotipo para toda a vida, enquanto que para sorotipos heterólogos, a proteção é temporária, podendo ter duração de meses (Reich et al., 2013; Revisado por Pollett et al., 2018). Já a infecção secundária por outro sorotipo está associada às manifestações mais severas da doença (Halstead et al., 2007; Revisado por Diamond et al., 2015). É importante ressaltar que mesmo na infecção secundária, a prevalência da dengue em sua forma grave é relativamente baixa, com cerca de 0,8% dos casos progredindo para febre hemorrágica do dengue e síndrome do choque por dengue (Diamond et al., 2015).

Até o momento, o mecanismo de ação da resposta imune ao DENV permanece controverso. Uma das teorias mais difundidas a respeito define o a capacidade de virulência do DENV, como sendo possível através de uma reação exacerbada do sistema imunológico, que ocorreria através da liberação de diversas citocinas. Essa resposta inicial provavelmente não seria responsável pelas manifestações clínicas, mas seria fundamental na disseminação do vírus a partir do momento que facilitaria a inoculação desse patógeno através do recrutamento de células com maior afinidade pelo vírus. Um exemplo claro disso ocorre na infecção das células dendríticas pelo DENV, o que induz a produção de metaloproteinases 2 e 9 (MMP-2 e MMP-9), enzimas relacionadas com a degradação de matriz extracelular. Esses mediadores podem ser capazes de facilitar a migração dessas células infectadas para os linfonodos locais onde o vírus se replicaria (Luplertlop et al., 2006; Revisado por Srikiatkhachorn et al., 2017).

Outra teoria bastante comentada envolve o fato de os anticorpos do sistema imune resultantes de uma infecção primária por dengue serem

26 capazes de viabilizar o prosseguimento da infecção secundária por um sorotipo heterólogo do DENV por não conseguirem neutralizar o vírus quando se liga ao mesmo, formando assim imunocomplexos, assim possibilitando a entrada do DENV nas células que expressam os receptores Fcγ (FcγR), num processo denominado “Aumento da replicação viral dependente de anticorpos” (ADE, do inglês “Antibody-dependent enhancement”) (Halstead, 2007; Revisado por Diamond et al., 2015), o que significa que a baixa afinidade ou a reação cruzada de anticorpos de neutralização fraca que teriam emergido na primeira infecção podem atuar como facilitadores de uma infecção secundária (causada por outro sorotipo do vírus da dengue) ao terem como foco de sua ação as proteínas estruturais do vírus, acarretando em uma viremia mais intensa e consequentemente, em manifestações clínicas mais perigosas (Halstead et al., 2007; Revisado por Diamond et al., 2015). Essa tese vem sendo discutida por várias décadas, sendo inclusive já comprovada que a administração de anticorpos mono ou policlonais reativos ao vírus da dengue é capaz de gerar aumento da carga viral em camundongos deficientes de receptores da citocina pró-inflamatória via interferon (IFN) (Zellweger et al., 2010; Revisado por Diamond et al., 2015).

Estudos recentes apontam que a entrada do DENV nos macrófagos humanos através do fenômeno ADE, auxilia no aumento da taxa de infecção viral, sendo observado também que esse mecanismo não necessariamente causa um aumento da carga viral na resposta à infecção. Tendo isso em mente, há a possibilidade de o aumento do potencial de fusão de membrana do vírus seja o passo inicial para a formação de uma cascata nociva ao portador, aumentando assim a intensidade de diversos fatores que influenciam da dengue grave, incluindo a própria infecção e a resposta anti-inflamatória exacerbada. Sendo assim, é possível que o mecanismo de aumento da replicação viral dependente de anticorpos, não seja um causador direto do aumento de severidade da doença e sim um fator indireto a isso (Flipse et al., 2016). Além disso, é possível que a ligação do DENV a receptores específicos nos mielóides ou mastócitos pode influenciar a imunidade do hospedeiro a partir do momento que promove um aumento na produção da citocina anti-inflamatória IL-10, alterando as respostas das células TCD4+ _{ou estimulando a}

27 função de fatores vasoativos que implicam no extravasamento do plasma sanguíneo capilar (Halstead et al., 2010; Syenina et al., 2015).

1.6 Patogênese no tecido renal

A dengue, assim como outras arboviroses, está associada com disfunções em diferentes órgãos (Halstead et al., 2007). Em se tratando do tecido renal, a infecção causada pelo vírus da dengue pode causar glomerulonefrite (inflamação do glomérulo renal), e levar o paciente a apresentar sinais de insuficiência renal aguda (IRA) e consequentemente proteinúria (presença anormal de proteínas na urina) e hematúria (presença anormal de eritrócitos na urina), que geralmente ocorrem durante ou pouco após a fase aguda da infecção (Lizarraga et al., 2014).

Essas manifestações nem sempre ocorrem de maneira linear, podendo variar de uma leve a média lesão tubular até uma lesão renal aguda tão severa que pode ser necessário o tratamento de diálise. Outra manifestação comum é a podocitopatia, condição que contribui expressivamente para o desequilíbrio eletrolítico observado na infecção, a partir do momento que os podócitos são componentes essenciais da barreira de filtração glomerular. Um estudo recente avaliou 2416 pacientes infectados pelo vírus da dengue, e constatou que uma porcentagem expressiva dos casos desenvolveu algum tipo de acometimento renal (218 pacientes, cerca de 9% do total). Desses 218, em todos foi observado proteinúria e 5 deles desenvolveram síndrome nefrótica, o que mostra a importância de analisar o funcionamento do tecido renal nestas infecções (Eswarappa et al., 2019). Além disso, é importante ressaltar que os pacientes que apresentam IRA possuem no geral, uma taxa de mortalidade e permanência hospitalar maior do que os pacientes sem esse tipo de lesão. Essa situação gera condições debilitantes, de diferentes graus de intensidade, que se permanecem pelo resto da vida dos pacientes (Eswarappa et al., 2019).

A patogênese da insuficiência aguda renal na dengue é complexa e continua sendo bastante discutida. Há indícios que essa condição possa ser resultado de ação direta provocada pelo vírus (Karakus et al., 2007) ou de uma ação resposta exacerbada do sistema imunológico (Garcia et al., 2006),

28 resultando em um extravasamento de plasma causado por DENV, podendo levar a uma diminuição da perfusão renal e necrose tubular aguda (Gunasekera et al., 2000, Povóa et al., 2014) (Revisado por Eswarappa et al., 2019).

Um estudo recente de Diptyanusa et al, realizado em 2019 demonstrou que a maioria dos pacientes internados com IRA eram homens com idade avançada, podendo apresentar comorbidades como diabetes, obesidade, dengue severa e até mesmo infecções bacterianas severas. Isso confirma a necessidade de investigação quanto à ocorrência ou não de IRA nos pacientes internados, já que estes apresentam uma chance maior de sofrerem com desfechos mais graves da doença. A avaliação da condição clínica e laboratorial desses pacientes contribui para a adoção de uma terapia adequada para combater os casos.

Em estudos anteriores, utilizando-se de casos fatais de DENV em adultos, foi detectada a presença de células CD68+ _{no tecido renal,} principalmente nas células mesangiais (região cortical) e células TCD4+ _no glomérulo renal, ambas em quantidades aumentadas, enquanto o número de células CD68+ _{estava mais aumentada na região medular (Póvoa et al., 2016).} Já o perfil de citocinas pró-inflamatórias foi caracterizado pela produção de TNF-α (Fator de Necrose Tumoral) e IFN-γ (Interferon gama) por macrófagos/monócitos da região medular e o de anti-inflamatórias pela produção de IL-10 (Interleucina 10) e TGF- β (Fator de crescimento de transformação) por parte de linfócitos e macrófagos nos glomérulos da região cortical. Além da expressão da quimiocina RANTES, detectada majoritariamente em macrófagos (Póvoa et al., 2016).

Estudos recentes de Nunes et al, feitos em 2019, utilizando também de casos fatais de dengue em adultos (dessa vez somente para o sorotipo DENV-4) corroboraram com o aumento de expressão de células CD68 e T CD8+ encontrado em estudos anteriores, além da expressão da citocina TNF-α. Adicionando a isso a detecção da proteína viral NS3 (não-estrutural 3) e da expressão do receptor VEGF-R2 (Fator de crescimento endotelial vascular) em macrófagos peritubulares na região medular.

29 1.7 Morfologia Renal

O rim é um órgão par, abdominal e retroperitoneal (localizado posteriormente ao peritônio). São recobertas por uma cápsula fibrosa e estão situados à direita e à esquerda da coluna vertebral, com direito ocupando uma posição inferior em relação ao esquerdo devido à presença do fígado. Possui formato de grão de feijão e apresenta duas bordas, anterior e posterior e duas bordas, medial e lateral, além das extremidades inferior e superior, que assenta a glândula suprarrenal (adrenal) (Dangelo e Fattini, 2015) (Figura1.5).

Figura 1.5 – Esquema da visão anatômica anterior do rim (Netter, 2000). A borda medial do rim apresenta uma fissura denominada hilo e através do mesmo passam artéria e veia renais, ureter, vasos linfáticos e nervos. Além disso, o hilo renal contém cálices que se unem para formar a pelve renal (parte superior do ureter) (Dangelo e Fattini, 2015). O órgão é constituído pela cápsula, de tecido conjuntivo denso, a zona cortical e a zona medular e possui o néfron como unidade funcional (Junqueira e Carneiro, 2013) (Figura 1.6). Em cada rim há cerca de 600 a 800 mil néfrons. O néfron é formado pelo corpúsculo renal ou de Malpighi (Figura 1.9), pelo túbulo contorcido distal, pelas partes delgada e espessa da alça de Henle e pelo túbulo contorcido proximal. Além disso, há o túbulo coletor, que é a porção mais extensa do

30 néfron e tem como papel modificar a composição do filtrado renal a partir de diversos processos (Junqueira e Carneiro, 2013).

Figura 1.6 - Esquema representando túbulo urinífero a partir do corpúsculo renal, passando por túbulos proximais e distais, alça de Henle, túbulos e ductos coletores medulares (Junqueira e Carneiro, 2013).

Na histologia do rim, ao analisar a região cortical é possível observar estruturas como: Glomérulo Renal, alça de Henle, túbulo contorcido distal, túbulo contorcido proximal e cápsula de Bowman (Figura 1.7). Enquanto que na região medular, estão evidenciados os ductos coletores e vasos sanguíneos, que se fazem presentes em ambas as regiões histológicas renais (Figura 1.8).

31 Figura 1.7 - Fotomicrografia da região cortical do rim. Na imagem estão representadas secções transversais dos glomérulos (G), cápsula de Bowman (CB), túbulos contorcidos distais (TCD), túbulos contorcidos proximais (TCP) e túbulos coletores (TC); corados por (Hematoxilina e Eosina; (H.E.). (Arquivo pessoal)

Figura 1.8 - Fotomicrografia da região medular renal. Na imagem estão representadas secções transversais dos ductos coletores (DC) e de vasos sanguíneos peritubulares (Vs); corados por Hematoxilina e Eosina (H.E.),. (Arquivo pessoal)

32 O processo de filtração renal tem seu início em uma estrutura conhecida como corpúsculo renal, que é formada por um tufo de capilares envoltos pela cápsula de Bowman, o glomérulo renal. A cápsula contém dois folhetos: 1) um externo ou parietal, que forma os limites do corpúsculo renal, constituído por um epitélio simples pavimentoso e em uma camada delgada de fibras reticulares, se localizando acima da lâmina basal (tecido conjuntivo cujo todo epitélio se assenta), formando uma membrana basal; 2) Um interno, ou visceral, junto aos capilares glomerulares, que sofre uma alteração morfológica em suas células epiteliais durante a embriogênese, passando a possuir características únicas e específicas. Essas células são chamadas de podócitos e contém actina, as conferindo mobilidade, o que é fundamental na sua adesão à membrana basal através de proteínas denominadas integrinas. Os podócitos possuem também fendas de filtração, que são espaços que promovem a retenção de moléculas de médio a grande porte, enquanto permitem a passagem de pequenas moléculas do plasma sanguíneo recém-chegado no glomérulo, assim iniciando o processo de filtração. Os capilares glomerulares são do tipo fenestrado, sem diafragmas nos poros das células endoteliais (Junqueira e Carneiro, 2013). Entre as células endoteliais e os podócitos, há uma membrana basal que funciona como barreira da filtração realizada pelos glomérulos. Glomérulos esses que são constituídos por capilares arteriais, células endoteliais e podócitos. Além disso, é importante ressaltar a presença de células mesangiais mergulhadas em uma matriz mesangial. Essas células mesangiais são contráteis e têm receptores para angiotensina II (diminui fluxo sanguíneo no glomérulo) e receptores para o fator natriurético produzido no átrio do coração, atuando como um vasodilatador, que por fim aumenta o volume sanguíneo local e consequentemente a área disponível para filtração (Junqueira e Carneiro, 2013).

No polo urinário do corpúsculo renal, o folheto externo da cápsula de Bowman é contínuo com o epitélio cuboide do túbulo contorcido proximal, que possui o citoplasma basal expressivamente acidófilo, enquanto que o citoplasma apical possui microvilosidades, que compõem a borda em escova. A alça de Henle é uma estrutura em forma de U que consiste em um segmento delgado e dois espessos, participando da retenção de água e assim possibilita

33 a formação de gradiente de hipertonicidade no interstício medular que influencia a concentração da urina (Junqueira e Carneiro, 2013).

Histologicamente, a distinção entre os túbulos contorcidos distais e os proximais, localizados na região cortical e formados por epitélio cúbico, baseia-se principalmente na prebaseia-sença de citoplasma mais acidófilo e com orla em escova dos túbulos proximais, o que não se observa nos túbulos distais, participantes ativos do processo de reabsorção. As células do túbulo contorcido distal sofrem modificação ao se encontrar com o néfron, natural cúbica, suas células se transformam em cilíndricas, altas, com núcleos alongados e próximos uns dos outros. A esse segmento modificado denominamos de mácula densa, que é sensível ao conteúdo dos íons e ao volume de água, induzindo em cadeia a liberação da enzima renina. A urina passa dos túbulos distais para os túbulos coletores, que desembocam nos ductos coletores, que se dirigem para as papilas, sendo os túbulos coletores mais delgados formados por epitélio cúbico. Os ductos coletores da medula atuam na retenção de água do filtrado (Junqueira e Carneiro, 2013).

Entre os vasos sanguíneos e os néfrons há a existência de um espaço, o interstício renal, que é mais fortemente presente na região medular do órgão, onde há as células intersticiais, produtoras de prostaglandinas e prostaciclinas, enquanto as células do interstício cortical renal se encarregam da produção de cerca de 80% da eritropoietina (hormônio que estimula a produção de eritrócitos) do organismo. Há ainda as células justaglomerulares, que se localizam próximas ao corpúsculo renal (Figura 1.9) e são resultado da modificação morfológica sofrida pelas células musculares da arteríola aferente (Junqueira e Carneiro, 2013).

34 Figura 1.9 – (A) Esquema e (B) fotomicrografia de corpúsculo renal (Junqueira e Carneiro, 2013)

35 2. OBJETIVOS

2.1. OBJETIVO GERAL

O estudo tem como objetivo a detecção de antígenos virais e a investigação de células, citocinas e mediadores inflamatórios no tecido renal que possam atuar como marcadores de prognóstico em casos fatais de dengue em crianças.

2.2. OBJETIVOS ESPECÍFICOS

• Descrever os aspectos clínicos e laboratoriais dos casos fatais de dengue em crianças;

• Avaliar os níveis séricos de creatinina e ureia nos casos fatais de crianças estudados.

• Identificar as alterações histopatológicas no tecido renal de casos fatais de dengue ocorridos em crianças através da coloração Hematoxilina & Eosina (H.E.) e das seguintes colorações especiais para tecido renal: Picro-Sirius e Tricrômico de Masson;

• Quantificar os danos observados a partir das colorações realizadas; • Caracterizar por imunohistoquímica a população de CD56+ _{(células NK)} no tecido renal de casos fatais de crianças;

• Caracterizar e quantificar por imunohistoquímica as populações de células CD68+ _{(macrófagos) e TCD8}+ _{no tecido renal de casos fatais de} crianças;

• Investigar se houve replicação viral a partir da detecção do antígeno viral (proteína NS3) de dengue no tecido renal de casos fatais de crianças;

• Detectar e quantificar as principais citocinas inflamatórias (TNF-α e RANTES) no tecido renal de casos fatais de dengue;

• Detectar os mediadores vasculares (VEGFR-2 e MMP-9) no tecido renal de casos fatais de crianças, bem como o marcador de apoptose (Caspase-3).

36 3. MATERIAIS E MÉTODOS

3.1 Considerações éticas

Todos os procedimentos realizados foram aprovados pelo Comitê de Ética da Fundação Oswaldo Cruz/Fiocruz, sob o número de aprovação CAEE: 47525115.3.3001.5279.

3.2 Casos fatais de dengue em crianças

Foram utilizadas amostras de tecido renal de caso fatal de dengue em crianças da epidemia de dengue no Rio de Janeiro em 2008 e em casos ocorridos em 2011 e 2012. O material, que estava previamente arquivado no Departamento de Anatomia Patológica do Hospital Jesus, foi encaminhado em blocos de parafina pelo Dr. Fernando Colonna Rosman para a realização do nosso estudo no Laboratório Interdisciplinar de Pesquisas Médicas (IOC/Fiocruz).

3.3 Descrição da história clínica dos controles e casos fatais (obtidas através de prontuários cedidos pelo Hospital Municipal Jesus)

Controles: Três crianças que tinham aproximadamente a mesma idade (8 a 13 anos) e vieram a óbito por causa natural ou trauma, sem ter nenhum histórico de dengue e outras doenças infecciosas, e sem nenhuma patologia direta ou indiretamente relacionada ao rim.

Caso 1: Menino, melanodérmico, com 7 anos e 8 meses, nascido em 10/5/2000, natural do Rio de Janeiro, internado no HMJ em 30/1/2008. Em 29/1/2008, após cinco dias de febre alta, náuseas e vômitos, a mãe procurou atendimento médico em posto de saúde, sendo medicado com amoxicilina por diagnóstico de “infecção”. Hemograma no local evidenciou: hematócrito: 39.3%; leucócitos: 5.280/μl; hemácias: 4,57 x 103/μl; plaquetas: 70,8 x 103/μl. Não melhorando, em 30/1/2008, a mãe foi ao posto de assistência médica, onde outro hemograma evidenciou: hematócrito: 45.9%; leucócitos: 8.390/μl; hemácias: 5,41 x 103/μl; plaquetas: 17,9 x 103/μl; sendo feito o diagnóstico

37 presuntivo de Dengue, e providenciada a internação hospitalar. Hemocultura se mostrou positiva para comorbidade bacteriana (Pseudomonas aeruginosa). Após 12 dias internado, foi a óbito no dia 12/2/2008.

Caso 2: Menina, com 9 anos, 11 meses, 28 dias, nascida em 27/4/2001, natural de Itaboraí, RJ, em 23/4/2011 começou a apresentar febre (38o_C, 39,5o_{C) e mal-estar geral, sendo levada ao Posto de Saúde em 24/4/2011,} onde hemograma, às 10h27min, revelou Hematócrito de 36,8% (N=32,7a39,6%); Hemácias 4,48 milhões/mm3 (N= 4,0 a 4,9 milhões/mm3), Hemoglobina de 12,9g/dl (N= 10,9 a 13,3g/dl), VGM de 82,1fl (N= 77 a 85fl), HGM de 28,8pg, CHGM de 35,1%; Leucócitos no total de 2.700/mm3 (N= 5,0 a 14,5/mm3); 2% bastões com 54/mm3 (N= 3/mm3), 75% de segmentados com 2.025/mm3 (N= 48 a 52/mm3), 15% de linfócitos com 405/mm3 (N= 37 a 39/mm3), 8% de monócitos com 216/mm3 (N= 4 a 5/mm3); Plaquetas no total de 76.000/mm3 (N=150 mil a 550 mil/mm3); e Hemograma, em 25/4/2011, às 5h50min, mostrou Hematócrito de 33,4% (N= 37 a 47%) Leucócitos no total de 2.200/mm3 (N= 4.500 a 10.000/mm3) e Plaquetas no total de 22.000/mm3 (N= 150 mil a 450 mil/mm3). No exame físico apresentou-se com sonolência e prostração, porém cooperante com o exame, desidratação, hipocorada, eupneica (frequência respiratória de 22irpm, 20irpm, 24irpm), acianótica, taquicárdica (frequência cardíaca de 130bpm), pressão arterial de 90x60mmHg e 90x50mmHg; temperaturas axilares de: 36,2 ºC, 38 ºC, 37 ºC e 36,8 ºC. Auscultas cardíaca e torácica normais. Sem sinal de irritação meníngea. Abdome globoso, com hepatomegalia dolorosa, peristalse presente. Baço não palpável. Observadas petéquias em face e membros inferiores. Recebeu tratamento com ranitidina, dipirona, hidratação de reposição e manutenção com soluções fisiológica e glicosada e com acréscimo de cloreto de sódio e cloreto de potássio. Foi transferida para o hospital em 25/4/2011 e apesar dos esforços para manutenção das funções vitais, não resistiu, tendo seu óbito registrado às 22 horas e 25 minutos do mesmo dia de sua internação.

Caso 3: Menino, com 10 anos, 8 meses e 20 dias, nascido em 30/7/2001, natural do Rio de Janeiro, RJ, apresentou, há noite, febre de 38,5 ºC e cefaleia frontal, em 14/4/2012 antes de procurar atendimento médico em Unidade de Pronto Atendimento, pois no dia anterior, apresentou prostração,

38 vômito não alimentar, e febre de 38 ºC. Recebeu tratamento médico inicial na UPA e foi encaminhado para o Polo Dengue e depois para internação hospitalar, após resultados de hemograma em 18/4/2012, com leucopenia, plaquetopenia, por suspeita de Dengue, não apresentando melhora e tendo seu óbito registrado no dia 20/4/2012.

3.4 Processamento do material e obtenção dos cortes

Os fragmentos de tecido renal provenientes de necropsia de casos fatais de crianças, foram previamente fixados em formaldeído 10%, pH=7,2 e processados no Hospital Municipal Jesus, para obtenção dos blocos de parafina. No Laboratório Interdisciplinar de Pesquisas Médicas (LIPMED/IOC/FIOCRUZ), para obtenção dos cortes (5 μm de espessura), os blocos foram submetidos à microtomia, em micrótomo da marca Leica RM-2235.

3.5 Colorações: Hematoxilina e Eosina (H.E.), Ácido Períodico Shiff (PAS) e Tricômico de Masson

H.E.: Cortes em parafina do tecido renal foram obtidas em micrótomo na espessura de 5μm e coletadas em lâminas. Em seguida, foram incubados em estufa à 60 º_{C por 1h e 30 min, para derreter a parafina. A seguir, os cortes} foram desparafinizados em banhos de xilol e hidratados em concentrações decrescentes de etanol (100 a 70%), lavados em seguida em água corrente e, então, corados em Hematoxilina, durante 50 segundos e Eosina por 40 segundos. Posteriormente, esses cortes foram desidratados em concentrações crescentes de etanol (70% a 100%), e clarificados em xilol para a montagem das lâminas com lamínula e meio de montagem Entelan (MERCK).

Tricrômico de Masson: Após a etapa de desparafinização, os cortes foram lavados em água corrente por 5 minutos. Em seguida, foram corados com as seguintes soluções: Solução de Bouin (incubação por 1 hora na estufa a 60ºC),

39 Hematoxilina Férrica de Weigert, Escarlate de Biebrich, Ácido Fosfotúngstico-Fosfomolíbdico, Azul de Anilina e Ácido Acético Glacial. As lâminas foram lavadas com água corrente entre os intervalos dos corantes utilizados. Por fim, lavadas novamente com água destilada e montadas em Entelan (MERCK).

Picro-sirius: Os cortes obtidos dos fragmentos de tecido renal incluídos em parafina foram incubados na estufa de 60º_{C por 1h e 30 min. A seguir, os} cortes foram desparafinizados em banhos de xilol e hidratados em concentrações decrescentes de etanol (100 a 70%), sendo em seguida corados pela solução de Picro-sirius durante 1 hora. Após isso, foram lavados em água destilada e água ácida, sendo posteriormente coradas pela Hematoxilina de Harris por 6 minutos. Por fim, os cortes foram desidratados e diafanizados, possibilitando a montagem das lâminas com Entelan (MERCK).

3.6 Quantificações no tecido renal

Para as quantificações da população de células, os cortes submetidos à imunohistoquímica foram avaliados utilizando microscópio Nikon ECLIPSE E600 com câmera Cool SNAP-Procf Color acoplada. Para cada marcação, 40 imagens (campos) foram adquiridas aleatoriamente (20 da região cortical e 20 da região medular) com aumento de 1000x usando o software Image Pro versão 5.0. Após a captura das imagens, as células positivas foram quantificadas em cada um dos 40 campos do órgão e a média do número positivo de células foi determinada.

Para quantificar os danos observados a partir da histopatologia dos casos, foi realizada a captura de 40 imagens dos casos estudados submetidos à coloração de Hematoxilina e Eosina. Para a análise dos danos, foi adotada uma escala arbitrária de 0-4 (0 = nenhum; 1 = leve; 2 = moderado; 3 = grave; 4 = muito grave), de acordo com os quadrantes das imagens observadas. Quatro critérios foram analisados: Congestão vascular; presença de infiltrado inflamatório; degeneração tubular e necrose tissular. As 40 imagens (campos) foram adquiridas aleatoriamente (20 da região cortical e 20 da região medular) com aumento de 1000x usando o software Image Pro versão 5.0.

40 Para as quantificações relacionadas ao parâmetro de degradação de matriz extracelular (presença de colágeno), foi realizada a captura de 40 imagens randômicas (20 de cada região) de lâminas dos casos estudados submetidas à coloração de Picrosirius Red. As áreas coradas em vermelho, consideradas como presença de colágeno, foram quantificadas pelo software Image-Pro Plus versão 7.0 (Media Cybermetics, Estados Unidos).

As análises estatísticas e os gráficos foram realizadas com apoio do software GraphPad Prism (La Jolla, CA, USA), versão 5.02, com o teste de Mann-Whitney e t-test.

Os valores foram considerados estatisticamente significativos com p < 0.05.

3.7 Imunohistoquímica

Para a técnica de imunohistoquímica, foram realizados cortes (4 µm) das secções do tecido renal incluídos em parafina e transferidos para lâminas silanizadas. No primeiro dia, as lâminas com os cortes permaneceram 1h e 30 minutos na estufa, e foram desparafinizadas em banhos de xilol, e hidratadas concentrações decrescentes de etanol. Posteriormente, os cortes foram lavados em água corrente e água destilada. A recuperação antigênica foi realizada em banho-maria à 96ºC com tampão citrato (Diagnostic Biosystem, pH 6,0), e posteriormente os cortes foram resfriados em temperatura ambiente neste mesmo tampão. Foram então, lavados uma vez em água destilada e três vezes em tampão Tris-HCl (ph 7,2). Em seguida, foi aplicada a solução de bloqueio da peroxidase (peróxido de hidrogênio + metanol 3%) por 10 minutos. Foram feitas três lavagens com Tris-HCl, e aplicada solução bloqueadora de proteínas (Spring – Cód DPB-125) por 10 minutos. Por fim, os cortes foram lavados três vezes em Tris-HCl, e em seguida foram aplicados os seguintes anticorpos primários:

Anticorpo Marca Diluição

Anti-CD56 Vector 1:200

Anti-CD68 Dako 1:100

41 Anti-NS3 Expresso em Escherichia

coli, purificado e inoculada em camundongos BALB/c.

1:200

Anti-TNF-α Santa Cruz Biotechnology 1:200 Anti-RANTES Santa Cruz Biotechnology 1:100

Anti-MMP9 Santa Cruz Biotechnology 1:200

Anti-Caspase Bd biosciences pharmigen 1:300 Anti- VEGRF-2 Santa Cruz Biotechnology 1:200 Tabela 1 – Anticorpos primários, marcas e diluições.

No segundo dia, após os cortes permanecerem por 20 minutos em temperatura ambiente, foram lavados com tampão Tris-HCl, e aplicados e o complemento do anticorpo secundário (Spring Bioscience) por 10 minutos, seguido do conjugado HRP (Spring Bioscience) por 15 minutos. Foram feitas lavagens com tampão Tris-HCl e água destilada, para aplicação do substrato para peroxidase (Kit DAB – Diagnostic Biosystems) por 5 minutos. Após os cortes serem lavados em água destilada, a hematoxilina de Harris (Sigma) foi aplicada aos cortes (por 1 minuto), e lavados em água corrente. Os cortes foram desidratados em concentrações crescentes de etanol e clarificados em xilol para a posterior montagem das lâminas com Entelan (MERCK).

42 4. RESULTADOS

4.1. Avaliação dos níveis séricos de creatinina e ureia de três casos fatais de dengue em crianças.

A creatinina é um produto da degradação da creatina fosfato (molécula armazenada nas fibras musculares, geradoras de energia). Logo após sua produção, é lançada na corrente sanguínea e eliminada pelos rins, assim como a ureia, que é a principal excreta nitrogenada encontrada na urina humana. Desse modo, um aumento de concentração sérica dessas substâncias implica em um caso de disfunção renal.

Ao analisar os níveis séricos de creatinina e ureia nos dias de infecção, observamos que o caso 1 foi o que apresentou níveis fora dos valores de referência (0,9236 mg/dl e 54,54 mg/dl, respectivamente) para ambas as substâncias; o que já indicaria uma possível disfunção renal. Enquanto isso, os casos 2 e 3, apresentaram valores dentro dos níveis de referência (0,6 mg/dl e 18,0 mg/dl; 0,5 mg/dl e 19 mg/dl), não indicando, a princípio, tal disfunção (Figura 4.1A e B).

Figura 4.1 – Média dos níveis séricos de creatinina e ureia dos três casos fatais de dengue em crianças: (A) Creatinina; (B) Ureia.

43 4.2. Avaliação histopatológica e quantificação de danos do tecido renal de três casos fatais de dengue em crianças.

Após analisar os níveis séricos de creatinina e ureia, buscamos identificar alterações histopatológicas no tecido renal dos três casos. No caso 1 foram observadas áreas difusas de congestão vascular nas alças capilares e, frequência de crescimento e proliferação do epitélio parietal, vindo assim a possivelmente causar a formação de mais uma camada desse epitélio (Fig. 4.2.1C), presença de grupos de túbulos contorcidos proximais com células mortas e material granuloso na luz e com simplificação e, por vezes, com desnudamento do epitélio de revestimento (Figs. 4.2.1B e 4.2.1L). Na região medular foi observada a presença de foco de necrose tissular (Fig. 4.2.1G) e afluxo de células inflamatórias polimorfonucleares e mononucleares (Fig. 4.2.1H).

No caso 2, na região cortical foi observada acentuada ectasia (dilatação ou distensão de estrutura tubular) de túbulos contorcidos próximas e distais, com empilhamento de hemácias e obstrução da luz capilar, causando congestão vascular nas alças capilares peritubulares. Além disso, também foram observados focos de desnudamento epitelial e de infiltrado inflamatório com presença de células mono e polimorfonucleares (Fig. 4.2.1D). Enquanto isso, na região medular, houve a presença de edema intratubular (Fig. 4.2.1I).

No caso 3, na região cortical, houve presença de acentuada tumefação do epitélio de túbulos e focos de degeneração vacuolar (Figs. 4.2.1E e 4.2.1P). Já na região medular, foi observada congestão de capilares peritubulares e necrose tissular nos túbulos coletores (Fig. 4.2.1J). Todas as alterações mencionadas anteriormente não foram observadas no tecido renal controle (Figs. 4.2.1A e 4.2.1F).

44 Figura 4.2.1 - Análise histopatológica do rim de casos fatais de dengue em crianças: (A/F/K) Tecido renal controle exibiu vasos, túbulos e glomérulos regulares nas regiões cortical e medular, respectivamente; (B/D/E/L) Tecido renal de casos fatais apresentou congestão vascular, degeneração vacuolar, desnudamento epitelial e túbulos proximais dilatados na região cortical; (G/H/I/J/M/N) e congestão vascular, infiltrado e necrose tissular na região medular, além de (C) presença de células epiteliais cubóides no espaço de Bowman; Vs – Vaso; T – Túbulos; G – Glomérulos; CB – Cápsula de Bowman; CV – Congestão vascular; E – Edema; CE – Células endoteliais; c – crescimento/proliferação de células epiteliais; DE – Desnudamento epitelial; Inf – Infiltrado inflamatório; DV – Degeneração vacuolar; NT – Necrose tissular; D – Dilatação tubular.

45 Em seguida, a partir das imagens capturadas das lâminas coradas com H.E., realizamos a quantificação dos danos mais observados nos três casos, buscando medir a intensidade dos mesmos e encontrar diferenças na manifestação das lesões renais nos casos estudados. Sendo assim, escolhemos quatro critérios para serem analisados (degeneração tubular, necrose tissular, congestão vascular e infiltrado inflamatório), com níveis medidos de 1 a 4 (1: leve, 2: moderado, 3: grave e 4: muito grave). Desse modo, a degeneração dos túbulos contorcidos proximais e distais foi observada de maneira mais intensa nos casos 2 e 3 (Fig 4.2.2M), enquanto o critério de necrose tissular se apresentou de modo semelhante nos três casos estudados (Fig. 4.2.2M). Já a alteração referente à congestão vascular se mostrou mais intensa no caso 2, em comparação aos outros casos (Fig. 4.2.2N), enquanto a presença de infiltrado inflamatório ocorreu de forma similar nos três casos, possuindo apenas um leve aumento comparativo na região medular do caso 2 (Fig. 4.2.2N).

Figura 4.2.2 – Quantificações dos danos observados na região cortical e medular do rim: (A) Casos 2 e 3 apresentaram degeneração em seus túbulos de forma mais intensa, enquanto o dano de necrose tissular se configurou com intensidade semelhante nos três casos; (B) Os vasos sanguíneos do tecido renal tenderam a apresentar congestão de forma mais frequente e a presença de infiltrado inflamatório ocorreu com expressividade similar na região cortical

46 dos casos estudados, enquanto que se mostrou mais quantitativa na região medular dos casos 2 e 3.

4.3 Coloração e quantificação do colágeno no tecido renal de três casos fatais de dengue em crianças.

Após analisar a histopatologia, foi realizada análise focando nas áreas de colágeno no rim dos casos estudados, com intuito de correlacioná-las com um processo de remodelamento da matriz extracelular do tecido renal. Foram escolhidas imagens representativas da região cortical para o tecido renal controle (Fig. 4.3.1A) e para os casos 1 (Fig. 4.3.1B), 2 (Fig. 4.3.1C) e 3 (Fig. 4.3.1D). Foi possível observar área mais intensa de colágeno tecidual ao redor dos vasos arqueados, na região cortical do caso 1 (Fig. 4.3.1D).

Figura 4.3.1 - Análise de colágeno tecidual no rim: (A) Tecido renal controle exibiu distribuição regular ao redor de vasos, túbulos e glomérulos na região cortical; (B/C/D) Distribuição de colágeno tecidual na região cortical do tecido renal dos casos 1, 2 e 3, respectivamente.

A partir das imagens foi realizada a quantificação do percentual de colágenos por área dos três casos. Dos três casos, o caso 1 sobressaiu, com aumento estatisticamente significativo em relação aos controles 2 e 3.

47 Figura 4.3.2: Quantificação de colágeno por área nos casos estudados: A quantificação do percentual de colágeno/mm² foi realizada nos três controles e três casos. O caso 1 apresentou aumento significativo em relação aos controles 2 e 3.

4.4 Investigação da replicação viral através da detecção da proteína NS3.

A fim de investigar se houve replicação viral no tecido renal, foi realizada a técnica de imunohistoquímica para a detecção do antígeno da proteína NS3, uma proteína não estrutural do vírus que atua no complexo replicativo. Esta proteína foi detectada em células mesangiais da região cortical (Fig. 4.4B) e em células endoteliais, monócitos/macrófagos na região medular (Fig. 4.4D) do tecido renal dos pacientes infectados, evidenciando replicação do vírus nestas células. Como esperado, não houve detecção da proteína NS3 no tecido controle em nenhuma das regiões do rim (Figs. 4.4A/C). A proteína foi detectada nos três casos, contudo foram utilizadas duas imagens representativas para os casos, evidenciando replicação viral em células das regiões cortical e medular.