UNIVERSIDADE PAULISTA UNIP

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UNIVERSIDADE PAULISTA – UNIP

CAMUNDONGO MUTANTE BATE-PALMAS COMO POSSÍVEL

MODELO PARA A SÍNDROME DE KABUKI: MAIOR

SUSCEPTIBILIDADE A INFECÇÕES E PREJUÍZOS NA

VOCALIZAÇÃO?

Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Patologia Ambiental e Experimental da Universidade Paulista - UNIP, para a obtenção do título de Mestre em Patologia Ambiental e Experimental

ERICKA PATRICIA DA SILVA

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ERICKA PATRICIA DA SILVA

CAMUNDONGO MUTANTE BATE-PALMAS COMO POSSÍVEL

MODELO PARA A SÍNDROME DE KABUKI: MAIOR

SUSCEPTIBILIDADE A INFECÇÕES E PREJUÍZOS NA

VOCALIZAÇÃO?

Área de concentração: Patologia Ambiental e Experimental

Orientador: Prof. Dr. Thiago Berti Kirsten

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ERICKA PATRICIA DA SILVA

CAMUNDONGO MUTANTE BATE-PALMAS COMO POSSÍVEL

MODELO PARA A SÍNDROME DE KABUKI: MAIOR

SUSCEPTIBILIDADE A INFECÇÕES E PREJUÍZOS NA

VOCALIZAÇÃO?

Aprovado em : ___/___/_____

Banca Examinadora

Prof (a). Dr.(a) __________________________________________________________ Instituição:_________________________________Julgamento___________________

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AGRADECIMENTOS

O presente trabalho de mestrado certamente não chegaria a sua fase final se eu estivesse nesta caminhada sozinha, sendo assim, jamais poderia deixar de agradecer àqueles que sempre se posicionaram ao meu lado desde o início.

Agradeço ao meu orientador, Prof. Dr. Thiago B. Kirsten, por toda a paciência, seu trabalho impecável, dedicação e determinação durante todas as etapas do mestrado.

Em especial ao Thalles Fagundes Biondi, aluno de Iniciação Científica e Paula da Silva Rodrigues, aluna de Mestrado deste Programa, pela colaboração durante os experimentos.

À Profa. Dra. Maria Martha Bernardi do Programa de Pós-Graduação em Patologia Ambiental e Experimental da Universidade Paulista, pelas ideias na construção e execução do projeto, e por todo o apoio dado durante esses anos de estudo juntas.

À Universidade Paulista, que disponibilizou suas instalações, laboratórios e estrutura geral, onde os experimentos foram realizados. Também aos funcionários da Universidade Paulista, em especial aos técnicos Wilton, Anderson e Toshie.

À CAPES/PROSUP pelo apoio financeiro dado durante todo o mestrado.

À Profa. Dra. Claudia Mori, da FMVZ-USP, pelas ideias na construção e execução do projeto e pela colaboração com os animais de laboratório.

À Profa. Dra. Silvia Massironi, do ICB-USP, pelas ideias na construção do projeto e colaboração com os animais de laboratório bate-palmas.

Ao Prof. Dr. Eduardo Bondan e a Carolina Vieira, aluna de mestrado deste Programa, pela colaboração com a execução e análises do GFAP.

À Deus, por tudo que faz e tem feito em minha vida.

À minha família e amigos pela paciência e apoio incondicional que me deram nessa jornada.

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RESUMO

SILVA, E. P. Camundongo mutante bate-palmas como possível modelo para a síndrome de

kabuki: maior susceptibilidade a infecções e prejuízos na vocalização? 2018. 50 f. Dissertação

(Mestrado em Patologia Ambiental e Experimental) - Universidade Paulista, São Paulo, 2018.

O camundongo mutante recessivo bate-palmas (BALB/cbapa, ou bapa), obtido pelo agente químico ENU, apresenta mutação no gene Kmtd2s (Mll2). A síndrome de Kabuki pode ser causada por mutação neste gene e caracteriza-se também pela maior susceptibilidade às infecções na infância, associadas a prejuízos na fala. Estudamos o bapa em fases de desenvolvimento quanto à susceptibilidade a infecções, comportamento doentio e sua comunicação. Foi administrada uma dose de LPS por camundongo bapa e controles (BALB/c, ou balb) machos e fêmeas, nos dias de vida pós-natal (PND) 30-32 (período pré-púbere). Eles foram avaliados quanto à atividade geral em campo aberto e vocalização ultrassônica (comunicação). Eles foram desafiados com uma dose de LPS nos PND45-47 (puberdade) e avaliados para os mesmos parâmetros. Nos PND30-32: (1) o LPS induziu comportamento doentio (parâmetros comportamentais e expressão astrocitária); (2) os bapa apresentaram maior atividade motora/exploratória; (3) os bapa apresentaram menos comportamento doentio (parâmetros comportamentais e expressão astrocitária); (4) as balb fêmeas foram mais sensíveis ao LPS que os balb machos, porém, os bapa machos foram mais sensíveis ao LPS que as bapa fêmeas. Nos PND45-47: (1) a exposição prévia ao LPS reduziu o comportamento doentio (tolerância); (2) os bapa desafiados com LPS apresentaram maior resposta comportamental doentia (parâmetros comportamentais e expressão astrocitária); (3) os camundongos machos apresentaram maior atividade motora; (4) os balb machos desafiados pelo LPS apresentaram redução do comportamento doentio devido à tolerância ao LPS administrado; (5) os bapa machos não desenvolveram tolerância ao LPS. Foram observadas vocalizações ultrassônicas de 31 kHz somente em fêmeas (balb e bapa) nos PND30-32 não expostas ao LPS. Assim, o LPS induziu comportamento doentio e a exposição prévia pode ter gerado uma resposta de tolerância. Os mutantes bapa apresentaram hiperatividade dopaminérgica bem como maior resposta comportamental doentia, corroborando nossa hipótese de modelo experimental da síndrome de Kabuki. O estudo das vocalizações ultrassônicas parece ter encontrado um padrão em camundongos ainda não reportado.

Palavras-chave: Lipopolissacarídeo; Comportamento doentio; Vocalização ultrassônica;

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ABSTRACT

SILVA, E. P. Bate-palmas mutant mice as possible model of Kabuki syndrome: higher

susceptibility to infections and vocalization impairments? 2018. 50 f. Dissertação (Mestrado em

Patologia Ambiental e Experimental) - Universidade Paulista, São Paulo, 2018.

The mutant recessive knock-out mouse bate-palmas (BALB/cbapa, or bapa), induced by the chemical agent ENU, has a mutation in the Kmtd2s (Mll2) gene. Kabuki syndrome can be caused by mutation in this gene and is also characterized by increased susceptibility to infections associated with speech impairments during childhood. We studied bapa mice in developmental stages regarding susceptibility to infections, sickness behavior and their communication. LPS was administered in male and female bapa and in controls (BALB/c, or balb) mice, on the postnatal days (PND) 30-32 (pre-pubertal period). They were evaluated for the open-field general activity and ultrasonic vocalizations (communication). They were challenged with LPS on PND45-47 (puberty) and the same parameters were evaluated. On PND30-32: (1) LPS induced sickness behavior (behavioral parameters and astrocyte expression); (2) bapa mice presented increased motor/exploratory activity; (3) bapa mice presented a decreased sickness behavior (behavioral parameters and astrocyte expression); (4) female balb mice were more sensitive to LPS than male balb; however, male bapa were more sensitive to LPS than female bapa. On PND45-47: (1) previous exposure to LPS reduced sickness behavior (tolerance); (2) bapa mice challenged with LPS presented increased sickness behavior response (behavioral parameters and astrocyte expression); (3) male mice presented increased motor activity; (4) male balb mice challenged with LPS developed a sickness behavior decrease due to LPS tolerance; (5) male bapa mice did not developed tolerance to LPS. Ultrasonic vocalizations of 31 kHz were observed only in females (balb and bapa) on PND30-32 not exposed to LPS. Thus, LPS induced sickness behavior and a previous LPS exposure seems to have induced a tolerance response. The bapa mice presented dopaminergic hyperactivity as well as increased sickness behavior response, corroborating our hypothesis of bapa being a Kabuki syndrome experimental model. The study of ultrasonic vocalizations seems to have found a pattern in mice not yet reported.

Key-words: Lipopolysaccharide; Sickness behavior; Ultrasonic vocalizations; Open field;

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SUMÁRIO 1. INTRODUÇÃO E JUSTIFICATIVA 09 2. OBJETIVOS 13 2.1 Objetivo geral 13 2.2 Objetivos específicos 13 3. MATERIAL E MÉTODOS 14 3.1 Animais 14

3.2 Tratamentos, grupos e delineamento experimental 14

3.2.1 Bloco 1: avaliações nos PND30-32 15

3.2.2 Bloco 2: avaliações nos PND45-47 15

3.3 Atividade geral em campo aberto 16

3.4 Vocalização ultrassônica 17

3.5 GFAP no encéfalo 18

3.6 Análise estatística 19

4. RESULTADOS 20

4.1 Avaliação da atividade geral em campo aberto nos PND30-32 20

4.2 Avaliação da atividade geral em campo aberto nos PND45-47 23

4.3 Avaliações de vocalizações ultrassônicas nos PND30-32 26

4.4 Avaliações de vocalizações ultrassônicas nos PND45-47 30

4.5 Avaliações de GFAP no encéfalo nos PND30-32 32

4.6 Avaliações de GFAP no encéfalo nos PND45-47 34

5. DISCUSSÃO 36

6. CONSIDERAÇÕES FINAIS 41

REFERÊNCIAS 42

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1. INTRODUÇÃO E JUSTIFICATIVA

Animais de laboratório vêm sendo utilizados há muito tempo em pesquisas científicas para os mais diversos fins, como, por exemplo, no intuito de conhecer os mecanismos das doenças, os possíveis tratamentos e prevenções e promovendo inquestionáveis progressos no campo da saúde. Neste sentido, linhagens de camundongos isogênicos, mutantes espontâneos e induzidos, e geneticamente modificados têm sido desenvolvidas objetivando fornecer modelos de síndromes genéticas humanas. Utilizando o agente mutagênico químico N-Ethyl-N-Nitrosourea (ENU), Massironi et al. (2006) desenvolveram e catalogaram 11 tipos de mutações em camundongos.

O ENU é um poderoso agente químico mutagênico e carcinogênico amplamente utilizado na literatura para provocar mutações no material genético dos animais, agindo diretamente nos pares de base do DNA, ocasionando mudanças que podem originar, por exemplo, pouca ou muita expressão de determinadas proteínas, hiper ou hipoatividade de proteínas e expressões incorretas de genes em diversos tecidos (PROBST; JUSTICE, 2010). Dentre as 11 mutações nos camundongos induzidas pelo ENU obtidas pelo grupo da Massironi et al. (2006), um deles foi denominado como bate-palmas (BALB/cbapa, ou bapa): camundongo mutante recessivo que apresenta incoordenação motora e alteração postural com movimentos anormais dos membros posteriores (semelhantes ao ato de bater palmas) quando levantado pela cauda, o qual é objeto de interesse no presente estudo. Após a realização de técnica de sequenciamento do exoma desses camundongos, identificou-se uma mutação no cromossomo 15, especificamente no gene lysine (K)-specific methyltransferase 2D (Kmtd2s, também conhecido como Mll2 ou Mll4) (Tiago Antonio de Souza, comunicação pessoal). Quando cruzados os dados da literatura, observa-se que tal gene é considerado como principal responsável pela síndrome de Kabuki em humanos, ou seja, a maioria das alterações genéticas encontradas nos pacientes é proveniente deste gene (RATBI et al., 2013; BOGERSHAUSEN et al., 2015; LU et al., 2016; STAGI et al., 2016).

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possuam funções redundantes no hipocampo (KERIMOGLU et al., 2013; SHEN et al., 2014; JAKOVCEVSKI et al., 2015). Diferindo do bapa, quando essas mutações encontram-se em homozigose, observa-se letalidade precoce dos embriões entre 10 e 12 dias de desenvolvimento.

A síndrome de Kabuki, também conhecida como síndrome de Niikawa-Kuroki, é uma desordem congênita multi-sistêmica rara que foi descrita primeiramente no Japão em 1981 pelos pesquisadores Niikawa e Kuroki (KUROKI et al., 1981; NIIKAWA et al., 1981). Sem dúvidas, as características mais típicas desta síndrome, que, aliás, foram os responsáveis pelo nome Kabuki são as malformações congênitas faciais típicas que assemelham os afetados aos atores do teatro japonês de Kabuki: fissuras palpebrais longas, eversão do terço lateral das pálpebras inferiores e sobrancelhas arqueadas. Além disso, destacam-se diversos outros sintomas como retardo mental, baixa estatura, dedos encurtados, má formações cardíacas e no músculo esquelético, problemas renais, dificuldade na fala, hipotonia, maior susceptibilidade a infecções, doenças autoimunes e neoplasias (KUROKI et al., 1981; NIIKAWA et al., 1981).

Vários aspectos encontrados na síndrome de Kabuki estão relacionados a prejuízos nas fases de desenvolvimento do indivíduo, especialmente por atrasar vários aspectos motores e cognitivos (VAN LAARHOVEN et al., 2015). Por exemplo, é documentado o retardo do desenvolvimento mental e psicomotor em mais de 90% dos pacientes (NIIKAWA et al., 1981). Um relato de caso expôs um paciente que se sentou independentemente aos 11 meses, andou aos 18 meses e pronunciou suas primeiras palavras aos dois anos (STRANIERO et al., 2018). Além disso, já foi documentado o atraso da erupção dentária em paciente com a síndrome (DOS SANTOS et al., 2006).

Sua incidência é de aproximadamente um a cada 40.000 nascimentos, onde a maioria dos casos descritos na literatura é de herança genética autossômica dominante (GIORDANO et al., 2014). Não existe predileção por sexo ou etnia (KAWAME et al., 1999). Estudos genéticos revelaram que a síndrome tem como característica a mutação do gene KMT2D (no cromossomo 12 dos humanos) em aproximadamente 56–75% dos casos, definida como síndrome de Kabuki tipo 1 (GIORDANO et al., 2014). Porém existem casos em que a mutação acontece no gene KDM6A (lysine (K)-specific demethylase 6A), localizado no cromossomo X em humanos (aproximadamente 5–8%), definida como tipo 2 (LEDERER et al., 2012; MIYAKE, N. et al., 2013).

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al., 2005), explicado devido a uma desordem imunológica desencadeada pela redução de imunoglobulinas como IgA, IgG e IgM, aumentando a vulnerabilidade do paciente tanto para infecções como para doenças autoimunes (como púrpura trombocitopênica idiopática, anemia hemolítica, tireoidite autoimune e vitiligo) (MATSUMOTO; NIIKAWA, 2003; MING et al., 2005). As infecções mais recorrentes ocorrem nas vias aéreas e no ouvido, especialmente otite média, que é muito frequente em pacientes especialmente na infância (55-92%) e vêm acompanhadas de deficiência/perda auditiva e neurossensorial, acabando por acarretar dificuldades no desenvolvimento da fala e linguagem, que tendem a se perpetuar até a fase adulta (PETERSON-FALZONE; GOLABI; LALWANI, 1997; MATSUMOTO; NIIKAWA, 2003; MING et al., 2005). O motivo para a alta frequência dessa infecção pode estar relacionado à fenda labial, má formação da trompa de Eustáquio e imunodeficiência (BAROZZI et al., 2009).

Ao estudar a linguagem e a fala de crianças com síndrome de Kabuki, notou-se dificuldade na pronúncia de algumas palavras (principalmente aquelas que continham as letras S, G, E, T no meio ou no final de frases), frases no plural (omissão de sons no final e começo de frases) e disartria (VAN LIERDE; VAN BORSEL; VAN CAUWENBERGE, 2000; LIEGEOIS; MORGAN, 2012) (UPTON et al., 2003; DEFLOOR et al., 2005).

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2018).

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2. OBJETIVOS

2.1 Objetivo geral

Estudar camundongos mutantes bate-palmas jovens, em fases de desenvolvimento quanto à susceptibilidade a infecções, comportamento doentio e sua comunicação, relacionados à síndrome de Kabuki.

2.2 Objetivos específicos

Induzir experimentalmente e estudar o comportamento doentio com administrações de LPS (uma dose por camundongo) bate-palmas (bapa) e em controles (BALB/c, ou balb) nos PND 30-32 e 45-47. Especificamente, estudar:

 Atividade geral em campo aberto (parâmetros motores, exploratórios e de ansiedade);

 Vocalização ultrassônica (comunicação);

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3. MATERIAL E MÉTODOS

3.1 Animais

Foram utilizados 48 camundongos (Mus musculus) bate-palmas e 48 camundongos BALB/c jovens (total de 96 camundongos) fornecidos pelo Instituto de Ciências Biomédicas e pelo Departamento de Patologia da Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia, ambos da Universidade de São Paulo (São Paulo, SP). Os camundongos bate-palmas são também referidos como bapa, seguindo nomenclatura científica (OLIVEIRA, 2017); os camundongos BALB/c são também referidos com balb. Metade dos animais era do sexo masculino e a outra metade do sexo feminino. Esses camundongos foram mantidos no Biotério da Universidade Paulista (São Paulo, SP) em gaiolas-moradia (34,5 x 18,5 x 13,5 cm, até cinco camundongos por gaiola) com filtro na parte superior, em sistema de rack ventilado (Tecniplast, Buguggiate, VA, Itália), permitindo aeração e trocas de ar constante. Essas gaiolas-moradia foram forradas com maravalha (esterilizada e livre de resíduos). O ambiente possuía temperatura (23°C ± 2°C) e umidade (entre 55% e 65%) controladas constantemente por sistema automatizado. O ciclo de luz também era automatizado, com luz artificial (12-horas claro/12-horas escuro, com as luzes ligadas às 7h00). Os animais tinham livre acesso a ração irradiada (BioBase, Águas Frias, SC, Brasil) e água filtrada. Os animais foram utilizados nesse estudo de acordo com as normas e procedimentos éticos relativos ao uso de animais de laboratório da Universidade Paulista (CEUA-UNIP nº 035/17). Essas diretrizes são baseadas nas normas do National Institutes of Health (Bethesda, MD). Os experimentos foram realizados de acordo com os protocolos de boas práticas de laboratório com métodos de garantia de qualidade. Todos os esforços possíveis foram realizados para minimizar o sofrimento dos animais.

3.2 Tratamentos, grupos e delineamento experimental

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precisamente entre às 13h00 e às 16h00, para minimizar os efeitos do ritmo circadiano.

3.2.1 Bloco 1: avaliações nos PND30-32

Nos PND30-32 os camundongos bate-palmas e BALB/c machos e fêmeas foram tratados ou não com uma dose de solução LPS. O LPS foi obtido por extração fenólica a partir da bactéria Escherichia coli, sorotipo 0127:B8 (Sigma-Aldrich®, St Louis, MO, USA). A solução de LPS foi formulada em salina estéril a 0,9% e administrada via i.p., na dose de 100 μg/kg, baseado em nossos estudos prévios (KIRSTEN et al., 2015). Essa dose é considerada capaz de induzir comportamento doentio por pelo menos quatro horas, com alterações nos parâmetros comportamentais e imunes (KIRSTEN et al., 2015), sem induzir sepse (BAY-RICHTER et al., 2011). Os respectivos grupos controles foram tratados com solução salina 0,9% estéril, i.p., que é o veículo do LPS. As drogas empregadas foram administradas em volume de 1 ml/kg.

Duas horas após a administração do LPS, os oito grupos (bate-palmas machos e fêmeas e BALB/c machos e fêmeas tratados ou não com LPS) foram avaliados quanto à atividade geral em campo aberto e vocalizações ultrassônicas. Imediatamente após a retirada da arena de avaliação os camundongos foram submetidos à eutanásia e seu sangue/soro e encéfalo foram coletados para análises neuroimunes.

3.2.2 Bloco 2: avaliações nos PND45-47

Além desses oito grupos avaliados nos PND30-32, outros camundongos (bate-palmas e BALB/c, machos e fêmeas) foram avaliados nos PND45-47 sob protocolo semelhante: tratados ou não com uma dose de solução LPS nos PND30-32, desafiados com uma dose de LPS nos PND45-47 e duas horas depois avaliados para atividade geral em campo aberto, vocalizações ultrassônicas, e análises neuroimunes (sangue e encéfalo).

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Tabela 1 – Grupos experimentais: Grupos experimentais, tipo de camundongo avaliado e seus

respectivos tratamentos (soluções administradas) nas diferentes idades (dia de vida pós-natal [PND]). Foram avaliados oito grupos em cada um dos blocos (PND30-32 e PND45-47) (n = 6 camundongos por grupo)

PND camundongo sexo tratamento no PND30-32

tratamento no PND45-47

30-32

BALB/c macho salina (i.p.) x

BALB/c fêmea salina (i.p.) x

bate-palmas macho salina (i.p.) x

bate-palmas fêmea salina (i.p.) x

BALB/c macho LPS (100 μg/kg, i.p.) x BALB/c fêmea LPS (100 μg/kg, i.p.) x bate-palmas macho LPS (100 μg/kg, i.p.) x bate-palmas fêmea LPS (100 μg/kg, i.p.) x

45-47

BALB/c macho salina (i.p.) LPS (100 μg/kg, i.p.) BALB/c fêmea salina (i.p.) LPS (100 μg/kg, i.p.) bate-palmas macho salina (i.p.) LPS (100 μg/kg, i.p.) bate-palmas fêmea salina (i.p.) LPS (100 μg/kg, i.p.) BALB/c macho LPS (100 μg/kg, i.p.) LPS (100 μg/kg, i.p.) BALB/c fêmea LPS (100 μg/kg, i.p.) LPS (100 μg/kg, i.p.) bate-palmas macho LPS (100 μg/kg, i.p.) LPS (100 μg/kg, i.p.) bate-palmas fêmea LPS (100 μg/kg, i.p.) LPS (100 μg/kg, i.p.)

3.3 Atividade geral em campo aberto

Duas horas após a administração do LPS (nos PND 30-32 ou 45-47), os camundongos foram individualmente analisados quanto à atividade geral em campo aberto. Este teste comportamental permite avaliar parâmetros motores, exploratórios e níveis de ansiedade (PRUT; BELZUNG, 2003; PATTI et al., 2005). Mais ainda, quando analisada em conjunto com outros parâmetros neuroimunes, a avaliação da atividade geral em campo aberto permite uma análise confiável da expressão do comportamento doentio nos roedores (LARSON; DUNN, 2001; DANTZER; KELLEY, 2007).

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animais foram individualmente e gentilmente colocados no centro da arena e avaliados em sessões de cinco minutos. Os parâmetros analisados foram: frequência de locomoção (número de unidades do chão adentradas com todas as patas), frequência de levantar (número de vezes que o animal apresenta postura de permanecer apoiado nas patas posteriores, com o tronco perpendicular ao chão, podendo ou não tocar com as patas anteriores as paredes do campo aberto) e tempo em segundos de imobilidade. Além disso, para avaliação dos níveis de ansiedade, foram observados os tempos em segundos de permanência (animal parado ou se deslocando) nas zonas central e periférica. A sala de testes era pequena, com luz fraca e indireta, e isolada do experimentador durante a realização do teste, possuindo ainda uma câmera filmadora montada acima da arena para gravação das sessões, possibilitando análise posterior. O aparato foi limpo com solução álcool/água 5% antes de colocar o animal na arena, para eliminar possíveis traços de odor deixados pelos outros animais, o que poderia interferir no comportamento dos camundongos.

3.4 Vocalização ultrassônica

Simultaneamente a avaliação da atividade geral, foram avaliadas as vocalizações ultrassônicas dos camundongos na arena de campo aberto por cinco minutos. Este teste permite estudar a comunicação por meio das vocalizações ultrassônicas que os roedores emitem de maneira específica a diferentes estímulos, com relação à frequência e a duração das sílabas (TAKAHASHI; KASHINO; HIRONAKA, 2010). Por exemplo, camundongos machos emitem vocalizações ultrassônicas em frequências e em tipos de silabas específicas (40 ou 70 kHz) na presença de fêmeas ou de seus feromônios (PORTFORS, 2007; LAHVIS; ALLEVA; SCATTONI, 2011). Além disso, o estudo das vocalizações ultrassônicas pode servir de ferramenta para estudos do comportamento doentio (KIRSTEN et al., 2015).

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3.5 GFAP no encéfalo

Imediatamente após a avaliação em campo aberto, os camundongos foram decapitados e o sangue do tronco e encéfalos coletados. Os encéfalos foram utilizados para o estudo imuno-histoquímico para marcador de neuroinflamação. Para esta etapa, somente os camundongos machos foram avaliados. Foram feitos cortes coronais das áreas de interesse: córtex frontal e hipotálamo. Estas duas áreas encefálicas foram escolhidas devido a grande importância que elas representam em processos neuroinflamatórios, inclusive para a expressão de GFAP após desafio com LPS, bem como pela importância em processos comportamentais complexos (MORAES et al., 2017; MOLINA et al., 2018). Foi analisada a resposta astrocitária mediante estudo da expressão de GFAP. Os encéfalos dos camundongos foram retirados e imediatamente submersos em solução de formol a 10% em tampão fosfato de Sorensen (pH neutro), onde permaneceram por cerca de três dias. A seguir, foram realizados cortes coronais das regiões escolhidas e cada amostra foi processada para posterior desidratação, diafanização e inclusão em parafina. Cortes transversais de 5 µm das regiões escolhidas foram obtidos, montados em lâminas histológicas e corados pela técnica de Hematoxilina-Eosina (HE). O procedimento imuno-histoquímico realizado seguiu os mesmos protocolos experimentais já estabelecidos em nossos laboratórios (MOLINA et al., 2018). Resumidamente, a marcação imuno-histoquímica para a GFAP foi realizada utilizando o método conjugado a uma cadeia de polímeros (chain polymer-conjugated staining method, DAKO EnVision System). Foi utilizada imunoglobulina anti-GFAP policlonal de coelho (1:1000; Z033401, DAKO, Glostrup, Dinamarca) como anticorpo primário seguida pelo kit EnVision (EnVision+ kit, HRP/Rabbit/DAB+, K4011, DAKO, Glostrup, Dinamarca). Dez fotomicrografias do córtex pré-frontal e do hipotálamo foram feitas usando objetiva de 40x do microscópio Nikon E200. A área de astrócitos e seus processos marcados em marrom, foram calculados automaticamente utilizando o índex per area do software Image-Pro Plus 6.0 (Media Cybernetics, Rockville, Maryland, EUA) calibrado com filtros de cores digitais de forma que apenas células positivas foram incluídas e a coloração de fundo foi excluída da medição. O índex astrocitário per area representa a proporção da área marcada em relação à área total da imagem, sendo zero, a completa ausência de marcação, e um, a marcação total da área.

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do comportamento doentio nos roedores (LARSON; DUNN, 2001; DANTZER; KELLEY, 2007).

3.6 Análise estatística

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4. RESULTADOS

Nos PND30-32: (1) o LPS induziu comportamento doentio (parâmetros comportamentais e expressão astrocitária); (2) os bapa apresentaram maior atividade motora/exploratória; (3) os bapa apresentaram menos comportamento doentio (parâmetros comportamentais e expressão astrocitária); (4) as balb fêmeas foram mais sensíveis ao LPS que os balb machos, porém, os bapa machos foram mais sensíveis ao LPS que as bapa fêmeas. Nos PND45-47: (1) a exposição prévia ao LPS reduziu o comportamento doentio (tolerância); (2) os bapa desafiados com LPS apresentaram maior resposta comportamental doentia (parâmetros comportamentais e expressão astrocitária); (3) os camundongos machos apresentaram maior atividade motora; (4) os balb machos desafiados pelo LPS apresentaram redução do comportamento doentio devido à tolerância ao LPS administrado; (5) os bapa machos não desenvolveram tolerância ao LPS. Foram observadas vocalizações ultrassônicas de 31 kHz somente em fêmeas (balb e bapa) nos PND30-32 não expostas ao LPS. Assim, o LPS induziu comportamento doentio e a exposição prévia pode ter gerado uma resposta de tolerância. Os mutantes bapa apresentaram hiperatividade dopaminérgica bem como maior resposta comportamental doentia, corroborando nossa hipótese de modelo experimental da síndrome de Kabuki. O estudo das vocalizações ultrassônicas parece ter encontrado um padrão em camundongos ainda não reportado.

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5. DISCUSSÃO

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6. CONSIDERAÇÕES FINAIS

Concluindo, os presentes resultados revelaram que camundongos balb e bapa, machos e fêmeas, tratados ou não com LPS, apresentaram respostas comportamentais e neuroimunes diferentes quando avaliados nos períodos pré-púbere e púbere. Nos PND30-32: (1) o LPS induziu comportamento doentio (parâmetros comportamentais e expressão astrocitária); (2) os bapa apresentaram maior atividade motora/exploratória; (3) os bapa apresentaram menos comportamento doentio (parâmetros comportamentais e expressão astrocitária); (4) as balb fêmeas foram mais sensíveis ao LPS que os balb machos, porém, os bapa machos foram mais sensíveis ao LPS que as bapa fêmeas. Nos PND45-47: (1) a exposição prévia ao LPS reduziu o comportamento doentio (tolerância); (2) os bapa desafiados com LPS apresentaram maior resposta comportamental doentia (parâmetros comportamentais e expressão astrocitária); (3) os camundongos machos apresentaram maior atividade motora; (4) os balb machos desafiados pelo LPS apresentaram redução do comportamento doentio devido à tolerância ao LPS administrado; (5) os bapa machos não desenvolveram tolerância ao LPS. Foram observadas vocalizações ultrassônicas de 31 kHz somente em fêmeas (balb e bapa) nos PND30-32 não expostas ao LPS.

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REFERÊNCIAS

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