UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO
ESCOLA DE ENGENHARIA DE SÃO CARLOS
INSTITUTO DE FÍSICA DE SÃO CARLOS
INSTITUTO DE QUÍMICA DE SÃO CARLOS
“Estudos de Obtenção e Caracterização de Esferas
Entrecruzadas de Quitosana e de Filmes Ultrafinos
Depositados sobre Vidro”
REJANE CELI GOY
Tese apresentada à Área de
Interunidades em Ciências e Engenharia de
Materiais, da Universidade de São Paulo,
como parte dos requisitos para a obtenção do
Título de Doutor em Ciência e Engenharia de
Materiais.
Orientador: Prof. Dr. Sérgio Paulo Campana Filho
São Carlos
2007
Livros Grátis
http://www.livrosgratis.com.br
AGRADECIMENTOS
Ao Prof. Dr. Sérgio Paulo Campana Filho pela orientação, dedicação e apoio ao longo de sete anos de trabalho em conjunto.
À minha família pelo amor, paciência, incentivo e apoio em todos os momentos.
Ao meu marido Cristiano pelo amor, paciência e colaboração constantes.
Às amigas Fernanda e Marcinha pela amizade, apoio e colaboração efetiva no decorrer do trabalho.
Aos amigos Carlos Eduardo Borato e Fábio Leite pela amizade e companheirismo durante os trabalhos realizados na Embrapa Instrumentação Agropecuária.
A todos os amigos de laboratório de físico-química orgânica: Ludmila, Dani, Erikinha, Cris, Bianca, Ilce, Luizão, Douglas Britto, Wanderson, Elaine, Franciéli, Vilmar, Juliana, Alexandre e Talita, por tudo.
Aos meus amigos de sempre: Gabriela, Marcia, Marcelo, Ana, Daniel, Alessandra, Lauriberto, Jovanka, Paola pela amizade e carinho.
A todos os técnicos de laboratório, principalmente Silvana, Mauro, Paulo, Augusto e Carlinhos pela colaboração.
Às secretárias da Interunidades, principalmente a Cristiane e Wladerez pela boa vontade, simpatia e ajuda.
Ao Prof. Dr. Odilio G. de Assis da EMBRAPA-Instrumentação Agropecuária pela amizade e por toda ajuda prestada.
À Prof. Dra. Elisabete Frollini pelo apoio durante a viagem do Prof. Campana.
Aos Professores Drs. Luiz Henrique Capparelli Mattoso e Osvaldo Novais de Oliveira Jr (Chu) pela colaboração efetiva nos trabalhos desenvolvidos.
À Embrapa Instrumentação Agropecuária pela infra-estrutura e disponibilização dos laboratórios para realização de parte do trabalho.
SUMÁRIO
LISTA DE FIGURAS ...i
LISTA DE TABELAS... vii
RESUMO ...x
ABSTRACT... xi
APRESENTAÇÃO ... xii
CAPÍTULO 1: REVISÃO BIBLIOGRÁFICA... 1
1.1) Quitina ... 1
1.2) Quitosana... 7
1.2.1) Aplicações de Quitosana ... 11
1.2.2) Derivados de Quitosana: Microesferas e Nanopartículas... 13
1.3) Comportamento Químico de Quitina e Quitosana... 22
1.3.1) Formação de Complexos com Íons Metálicos ... 22
1.3.2) Estudos de Complexação Quitosana-Íons Metálicos ... 25
1.3.3) Estrutura dos Complexos Quitosana-Íons Metálicos ... 27
1.4) Modificação da Quitosana: Entrecruzamento com Glutaraldeído ... 31
1.4.1) Aplicações de Quitosana e Derivados entrecruzados com Glutaraldeído ... 34
1.5) “Língua Eletrônica” – Aplicação de Filmes de Quitosana e Poli(o-etoxianilina) ... 36
CAPÍTULO 2: OBJETIVOS ... 45
CAPÍTULO 3: METODOLOGIA ... 46
3.1) Desacetilação de Quitina: Obtenção e Purificação de Quitosana (QS10170)... 46
3.2) Preparação dos Derivados de Quitosana: Esferas, Microesferas e
Nanopartículas ... 48
3.3) Preparação dos Filmes de Quitosana para Aplicação na Língua Eletrônica ... 52
3.3.1) Experimento 1: Eletrodos de Vidro e Ouro ... 52
3.3.2) Experimento 2: Eletrodos de Cromo... 53
3.4) Caracterização das Amostras ... 57
3.4.1) Viscosimetria ... 57
3.4.2) Espectroscopia de Ressonância Magnética Nuclear de Hidrogênio (rmn1H) ... 59
3.4.3) Espectroscopia na Região do Infravermelho ... 61
3.4.4) Espectroscopia de UV-Visível ... 62
3.4.5) Termogravimetria... 63
3.4.6) Difração de Raios-X... 64
3.4.7) Microscopia Eletrônica de Varredura... 66
3.4.8) Microscopia de Força Atômica ... 66
3.4.9) Diâmetro Médio das Microesferas ... 67
3.4.10) Tamanho de Partículas - FOQELS ... 67
3.4.11) Potencial Zeta... 68
3.4.12) Espectroscopia de Absorção Atômica - Estudo da Interação de Quitosana e Derivados com Íons Cu2+ em Solução Aquosa... 693
4.13) Espectroscopia de Impedância – Língua Eletrônica ... 70
4.1) Desacetilação de Quitina: Obtenção e Purificação de Quitosana
(QS10170)... 74
4.2) Preparação dos Derivados de Quitosana: Esferas, Microesferas e Nanopartículas ... 76
4.3) Caracterização das Amostras de Quitosana (QS10170) ... 78
4.3.1) Viscosimetria ... 78
4.3.2) Espectroscopia de Ressonância Magnética Nuclear de Hidrogênio (rmn1H) ... 81
4.4) Caracterização das Amostras de Quitosana e Derivados ... 83
4.4.1) Espectroscopia na Região do Infravermelho ... 83
4.4.2) Estabilidade Térmica dos Materiais - Termogravimetria... 87
4.4.3) Difração de Raios-X... 96
4.4.4) Microscopia Eletrônica de Varredura... 100
4.4.5) Diâmetro Médio das Microesferas ... 104
4.4.6) FOQELS – Tamanho de Partículas para Nanopartículas de Quitosanas... 105
4.4.7) Análise de Carga Superficial - Potencial Zeta ... 106
4.4.8) Espectroscopia de Absorção Atômica - Estudo da Interação de Quitosana e Derivados com Íons Cu2+ em Solução Aquosa... 112
4.5) Espectroscopia de Impedância – Língua Eletrônica ... 114
4.5.1) Experimento 1: Eletrodos de Vidro e Ouro ... 114
4.5.2) Experimento : Eletrodos de Cromo... 120
CAPÍTULO V: CONCLUSÕES... 158
LISTA DE FIGURAS
Figura 1 - Representação esquemática da estrutura primária idealizada de quitina, sendo n = grau de polimerização. ... 2
Figura 2 - Estruturas polimórficas de quitina... 4
Figura 3 - Representação esquemática da estrutura primária idealizada de quitosana, sendo n = grau de polimerização. ... 8
Figura 4 - Esquema de quelação de íons Cu2+ envolvendo dois grupos -NH2
da mesma cadeia de quitosana. ... 27
Figura 5 - Complexo formado pela quitosana-Cu(II). ... 29
Figura 6 - Modelo de possível estrutura formada entre quitosana e íons metálicos no processo de quelação ... 30
Figura 7 - Estrutura molecular do glutaraldeído. ... 31
Figura 8 - Composição química do glutaraldeído em solução aquosa... 33
Figura 9 - Estrutura química da poli(o-etoxianilina) na forma dopada com HCl 1M... 43
Figura 10 - Fotografia do reator utilizado em reações de desacetilação de quitina. ... 47
Figura 11 - Esquema ilustrativo do sistema de sensores utilizados... 54
Figura 12 - Espectro de RMN1H típico de quitosana, onde R=COCH3 ou R=H
... 60
Figura 13 - Eletrodo de ouro recoberto por fita de teflon, pronto para o uso.70
Figura 14 - Curvas de viscosidade reduzida versus concentração das amostras de quitosana: (a) cinco primeiras reações de desacetilação e (b) cinco últimas reações de desacetilação... 80
Figura 15 - Espectro de rmn1H das quitosanas purificadas: (a) cinco primeiras reações de desacetilação e (b) cinco últimas reações de desacetilação. ... 82
Figura 16 - Espectro de quitina Sigma na região do Infravermelho. ... 84
Figura 17 - Espectro na região do infravermelho da quitosana obtida pela reação de quitina comercial Sigma. ... 85
Figura 18 - Espectros na região do Infravermelho de quitosana, suas nanopartículas e o poli(ácido metacrílico)... 86
Figura 19 - Curva TG de quitina comercial Sigma (atmosfera de ar sintético/razão de aquecimento 10oC/min)... 88
Figura 20 - Curvas TG com perda de massa em porcentagem das amostras das quitosanas (QS10170) (atmosfera: ar sintético/razão de aquecimento
10oC/min). ... 89
Figura 21 - Curva TG com perda de massa em porcentagem das amostras de microesferas de quitosana (atmosfera: ar sintético/razão de aquecimento 10oC/min). ... 92
Figura 22 - Curvas TG com perda de massa em porcentagem das amostras das nanopartículas de quitosanas (atmosfera: nitrogênio/razão de aquecimento 10oC/min)... 94
Figura 23 - Difratograma de quitina comercial Sigma e quitosana (QS10170)
obtida por sua reação de desacetilação. ... 97
Figura 24 - Difratograma de quitosana, nanopartículas e poli(ácido-metacrílico) ... 98
Figura 25 - Fotomicrografias das amostras de quitina comercial Sigma nas aproximações: (a) 75X e (c) 1000X e quitosana purificada (QS10170): (b) 75X
e (d) 10000X. ... 101
Figura 26 - Fotomicrografias das esferas de quitosana e suas respectivas aproximações: esfera seca à temperatura ambiente (a) 200X e (c) 10000X; esfera liofilizada (b) 100X e (d) 10000X... 102
Figura 27 - Fotomicrografias das microesferas de quitosana: (a) aproximação de 1000x e (b) aproximação de 10000x... 103
Figura 28 - Fotomicrografias das nanopartículas S10170 nas aproximações:
(a) 100x, (b) 1000x e (c) 10000x... 104
Figura 29 - Imagens de MFA dos filmes de suspensão de nanopartículas de quitosana com variação no peso molecular das quitosanas de partida. .... 110
Figura 30 - Imagens de MFA dos filmes de suspensão de nanopartículas de quitosana com variação no grau de acetilação das quitosanas de partida.111
Figura 31 - Imagem do filme de quitosana (20 g/L), obtida por Microscopia de Força Atômica... 116
Figura 32 - Varredura de capacitância versus freqüência em água... 118
Figura 33 - Respostas dos eletrodos com filmes de quitosana depositados em soluções de CuCl2 de diferentes concentrações... 119
Figura 34 - Imagens de MFA dos filmes de POEA. ... 122
Figura 35 - Imagem de MFA do filme formado por quitosana e dispersão das nanopartículas de quitosana. ... 123
Figura 36 - Imagens de MFA dos filmes alternados de POEA/dispersão de nanopartículas de quitosana em diferentes pHs para POEA... 124
Figura 37 - Imagens de MFA dos filmes alternados de POEA e quitosana. ... 125
Figura 38 - Imagens de MFA dos filmes das misturas de POEA dopada (pH 3) com quitosana e dispersão de nanopartículas de quitosana. ... 126
Figura 39 - Espectros de UV-Vis de (a) QS10170 0,15% (pH 2,77) e (b) POEA
10-4mol/L (pH 3). ... 131
Figura 40 - Cinética de deposição de quitosana 1,5% (pH 3,27). ... 132
Figura 41 - Espectro de UV-Vis da mistura de soluções de POEA 10-4mol/L e quitosana 0,15% ambas em pH 3. ... 133
Figura 42 - Espectro de UV-Vis da mistura de soluções de POEA 10-4mol/L e dispersão de nanopartículas 0,2% ambas em pH 3... 134
Figura 43 - Gráficos de UV-Vis da deposição das dez camadas de POEA (10-3mol/L) em dois pHs diferentes e os respectivos crescimentos de seus filmes. ... 135
Figura 44 - Crescimento dos filmes de POEA para o polímero dopado e desdopado. ... 137
Figura 45 - Gráficos de UV-Vis da deposição das dez camadas do filme de POEA (0,06%) alternado QS10170 (1,5%) em dois pHs diferentes e os
Figura 46 - Gráficos de UV-Vis da deposição das dez camadas de POEA dopada e desdopada alternada com dispersão de nanopartículas e os respectivos crescimentos dos filmes com POEA (0,06%) e S10170 (0,2%).140
Figura 47 - Comparação do crescimento dos filmes: (a) POEA dopada alternada com S10170, (b) POEA desdopada e POEA desdopada alternada
com S10170 e (c) POEAs e POEAs alternadas com S10170. ... 141
Figura 48 - Resposta elétrica das unidades sensoriais para detecção de cobre: (a) arranjo A sem filme depositado e (b) arranjo A com filmes depositados... 144
Figura 49 - Resposta elétrica das unidades sensoriais para detecção de cobre: (a) arranjo B sem filme depositado e (b) arranjo B com filmes depositados... 145
Figura 50 - Curvas de PCA para as medidas de detecção de cobre dos arranjos A e B sem e com filmes depositados. As concentrações de cobre estão diferenciadas pelas cores, enquanto que os símbolos se referem aos diferentes experimentos realizados. ... 147
Figura 51 - Curvas do número de medidas versus capacitância (F) para os sensores 1 e 2 do conjunto A sem e com filmes depositados. ... 149
Figura 52 - Curvas do número de medidas versus capacitância (F) para os sensores 3 e 4 do conjunto A sem e com filmes depositados. ... 150
Figura 53 - Curvas do número de medidas versus capacitância (F) para os sensores 1 e 2 do conjunto B sem e com filmes depositados. ... 151
Figura 54 - Curvas do número de medidas versus capacitância (F) para os sensores 3 e 4 do conjunto B sem e com filmes depositados. ... 152
Figura 55 - Monitoramento da capacitância quando quantidades de cobre são adicionadas à água para duas unidades sensoriais, uma sem filme outra com filme de 10 bicamadas de filme LbL de POEA desdopada (pH 5) alternado com quitosana... 154
Figura 56 - Curvas de PCA para medidas com o arranjo A em baixas concentrações cobre (a) sem filmes depositados e (b) com filmes depositados... 156
LISTA DE TABELAS
Tabela 1 - Quantidade de quitina em alguns organismos ... 6
Tabela 2 - Algumas aplicações de quitosana. ... 13
Tabela 3 - Diferentes sistemas de obtenção de materiais a base de quitosana e os fármacos usados na liberação controlada. ... 15 Tabela 4 - Identificação das amostras de nanopartículas... 51
Tabela 5 - Concentrações das soluções de quitosana para formação de filmes auto-montados... 53
Tabela 6 - Valores de rendimentos brutos de quitosana obtidos para as dez reações de desacetilação de quitina comercial... 75
Tabela 7 - Valores de viscosidade intrínseca ([ηηηη]), massa molar média viscosimétrica (Mv ) e graus médios de acetilação (GA) das amostras
purificadas de quitosana. ... 78
Tabela 8 - Valores de viscosidade intrínseca ([η]), constante de Huggins (kH)
em solução tampão, massa molar média viscosimétrica (Mv ) e graus médios de acetilação (GA) das amostras purificadas de quitosana (QS10170).
... 83
Tabela 10 - Perda de massa em função da temperatura para nanopartículas de quitosanas... 95
Tabela 11 - Valores de Índice de Cristalinidade e Diâmetro Aparente dos cristalitos para amostras de quitina e quitosanas. ... 99
Tabela 12 - Valores de diâmetros de nanopartículas de diferentes quitosanas em função do tempo. ... 106
Tabela 13 - Tabela de valores de Potencial Zeta para as diferentes nanopartículas e seus respectivos valores de pH... 107
Tabela 14 - Valores de altura média (Z) e rugosidade para os filmes de nanopartículas obtidos pelas diferentes quitosanas de partida... 109
Tabela 15 - Quantidades de moles de Cu2+ presentes nos sobrenadantes e correspondentes porcentagens de remoção dos íons por quitosana e derivados. ... 113
Tabela 16 - Concentrações das soluções de CuCl2 utilizadas... 115
Tabela 17: Concentração de quitosana utilizada na deposição dos filmes sobre eletrodo de vidro. ... 117
Tabela 18 - Valores de altura média (Z) e rugosidade para os filmes obtidos. ... 127
RESUMO
Neste trabalho foram desenvolvidos estudos para a produção de esferas, microesferas, nanopartículas e filmes ultrafinos de quitosana. No caso das microesferas, glutaraldeído foi empregado como agente de reticulação para obtenção de materiais insolúveis em ampla faixa de pH. Os materiais estudados neste trabalho foram caracterizados quanto a: i) estabilidade térmica, ii) morfologia e estrutura microscópica, iii) tamanho de partículas, iv) capacidade de adsorção de íons cobre em água e v) detecção da presença de íons cobre por Espectroscopia de Impedância. Quitosana foi obtida por desacetilação de quitina em suspensão aquosa alcalina e caracterizada quanto a grau médio de acetilação (GA=10%) e massa molar média viscosimétrica (Mv≅170000g/mol). Esferas e microesferas de quitosana foram produzidas por diferentes metodologias (coagulação, inversão de fases) visando controlar as características (morfologia, porosidade) dos materiais obtidos. As esferas obtidas por coagulação foram secas à temperatura ambiente ou liofilizadas, resultando em esferas com diâmetros médios de 700µm e 2mm, respectivamente, enquanto que as microesferas possuíam diâmetro médio na faixa de 12µm. As nanopartículas foram obtidas por reação de polimerização com ácido metacrílico utilizando seis tipos diferentes de quitosana com variados graus de acetilação e massas molares para observar as possíveis variações no produto final. Quitosanas mais acetiladas (30%) geraram partículas com diâmetro médio de aproximadamente 280nm, enquanto que quitosanas menos acetiladas (10%) produziram nanopartículas com diâmetros médios menores (130nm). Quitosana na forma de pó, esferas e microesferas interagiram com soluções aquosas contendo íons cobre e foram capazes de remover grande parte dos íons presentes em solução por adsorção (83,4% para quitosana em pó, 91,6% para esferas liofilizadas e 97,3% para microesferas). .Filmes foram obtidos pela técnica de LbL, pela deposição alternada de camadas de polímeros (quitosana, suspensão de nanopartículas de quitosana e poli(o-etoxianilina), e foram testados em sistemas sensores de íons metálicos presentes em meios aquosos. Todos os eletrodos sobre os quais foram depositados filmes poliméricos foram capazes de detectar a presença de íons cobre até a concentração de 0,1mM, porém aquele contendo o filme LbL de 10 bicamadas de POEA desdopada alternado com quitosana propiciou a detecção de Cu+2 até 0,001mM.
ABSTRACT
The preparation of chitosan-based materials, namely ultrafine films, spheres, microspheres and nanoparticles, was studied. The microspheres were crosslinked with glutaraldehyde to impart insolubillity to the resulting materials. The materials were characterized with respect to: i) thermal stability; ii) morphology and microscopic structure, iii) particle size, iv) capacity to adsorb cooper ions in aqueous medium and v) detection of copper ions by impedance spectroscopy. Chitosan was obtained from the deacetylation of commercial chitin in alkaline aqueous suspension and it was characterized by its average degree of acetylation (DA =10%) and viscosity average molecular weight (Mv=170000g/mol). Chitosan spheres and microspheres were produced by different methodologies (coagulation, emulsion/separation methods) aiming to control the characteristics (morphology, porosity) of the materials. The spheres obtained by the coagulation method were dried at the room temperature or freeze dried, resulting in average diameters of 700µm and 2mm, respectively, whereas the microspheres had average diameter about 12µm. The nanoparticles were prepared by a template polymerization with metacrylic acid in the presence of chitosan. Different chitosans with respect to the average acetylation degrees and molecular weight were employed to evaluate the influence of the chitosan characteristics on the nanoparticles properties. More acetylated chitosans (30%) had generate particles with average diameter of 280nm, whereas less acetylated one (10%) had produced particles with average diameter of 130nm. Chitosan powder, spheres and microspheres were able to remove a great part of the copper ions present in aqueous solution (83.4% for powder chitosan, 91.6% for freeze dried spheres and 97,3% for microspheres). The films were obtained by the layer by layer (LbL) technique, through the deposition of different polymers (chitosan, chitosan nanoparticles suspension and poly(o-etoxyaniline). Chrome electrodes recovered with such
films were tested in sensorial systems for the detection of copper ions in aqueous solutions. All polymer-recovered electrodes were able to detect copper ions up to 0,1mM, however that one composed by 10 alternated layers of dedoped POEA and chitosan films allowed the detection up to 0,001mM.
APRESENTAÇÃO
A água é um elemento fundamental para a manutenção da vida. Dos 0,8% de água doce do planeta, apenas 3% se apresentam na forma de água superficial, cuja extração é facilitada. Esses dados ressaltam a grande importância de se preservar os recursos hídricos do planeta, evitar a sua contaminação ou promover sua descontaminação quando necessário.
Este trabalho, embora em escala laboratorial, vem com o intuito de obter, conhecer a fundo através de caracterizações e utilizar materiais que possam ser eficientes na descontaminação de meios aquosos contaminados com um metal pesado importante e comum de ser encontrado em efluentes industriais que é o cobre. Os materiais utilizados em questão são quitosana e derivados que também possuem grande importância na sociedade por terem origem natural, serem de obtenção relativamente simples e barata. A quitosana é obtida a partir de quitina que é extraída da biomassa, de matérias-primas abundantes e relativamente baratas consideradas como rejeitos da indústria pesqueira e, que muitas vezes, são produtos simplesmente descartados. A quitosana é um produto que alcançou grande destaque e importância na sociedade por ser extremamente versátil e aplicado em áreas como medicina (pele artificial, liberação controlada de fármacos, controle de colesterol, emagrecimento, etc), processos de tratamento de água, indústrias de cosméticos, alimentícia, polpa e papel entre outras.
A cada dia surgem novos estudos, pesquisas e aplicações para quitosana através da produção de derivados que melhoram e aumentam seu desempenho sendo assim, uma matéria-prima além de largamente utilizada ainda muito promissora.
CAPÍTULO 1
REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
1.1) Quitina
Quitina é um polissacarídeo natural de grande importância que foi identificada pela primeira vez em 1884. Pode ser obtida de uma grande quantidade de organismos vivos e, considerando a quantidade biossintetizada anualmente, é o segundo polímero mais abundante na natureza precedida apenas pela celulose. Quitina se apresenta como uma estrutura de fibras cristalinas, sendo o principal componente do exoesqueleto dos artrópodes, porém também está presente na parede celular de fungos e em outros organismos com a função de reforço e proteção [Rinaudo, 2006]. Nos organismos ela está geralmente associada a proteínas, lipídios e carbonato de cálcio. Cascas secas de crustáceos possuem 15-20% de quitina, 25-40% de proteína e 40-55% de carbonato de cálcio. A cutícula descalcificada de crustáceos contém 55-85% de quitina [Mathur e Narang, 1990]. Os gládios de lulas e moluscos, que também são
proteínas e uma quantidade mínima de sais inorgânicos [Campana-Filho et al., no prelo].
A quitina é um homopolímero composto por unidades 2-acetamido-2-desoxi-D-glicopiranose, e sua estrutura está apresentada na Figura 1:
n
O O O HO HOH 2 C NHCOCH 3 O HO HOH 2 C NHCOCH 3Figura 1 - Representação esquemática da estrutura primária idealizada de quitina, sendo n = grau de polimerização.
A importância comercial da quitina vem da vantagem de ser obtida de materiais que constituem rejeitos da indústria pesqueira, como cascas de camarões e carapaças de caranguejos, mas kril e fungos também podem ser empregados vantajosamente para a sua obtenção [Campana-Filho e Desbrières, 2000]. A obtenção de quitina envolve etapas de desproteinização, na qual a matéria-prima é tratada com solução alcalina para hidrólise de proteínas, e de desmineralização, que corresponde a um ataque ácido para eliminação de carbonatos. As condições experimentais empregadas nesses tratamentos variam quanto à concentração dos reagentes, temperatura e duração do tratamento, porém as condições mais brandas são as mais freqüentemente empregadas, pois favorecem a
preservação da estrutura nativa do polissacarídeo [Campana-Filho et al., no
prelo].
A fim de observar a abundância de quitina presente na natureza a Tabela 1 mostra os principais organismos vivos que têm o polímero em sua composição.
Graças à proveniência variada da quitina, devido às diferenças físicas e químicas entre as diversas espécies de crustáceos, as condições de obtenção e as etapas de desproteinização e desmineralização (concentração e temperatura das soluções) devem ser ajustadas para que o produto final sofra o mínimo de alteração possível em sua estrutura evitando a despolimerização.
A quitina possui três formas estruturais cristalinas diferentes denominadas α, β e γ, as quais diferem quanto ao arranjo de suas cadeias nas regiões cristalinas, conforme esquematizado na Figura 2. Essas diferentes estruturas polimórficas estão relacionadas às diferentes funções [Roberts, 1992; Campana-Filho et al., no prelo]. Na natureza a α-quitina é encontrada onde são necessárias resistência e dureza, como em cutículas de artrópodes, e está freqüentemente associada com proteínas ou materiais inorgânicos, ou com ambos. Já as formas β e γ-quitinas são encontradas onde são necessárias flexibilidade e dureza. A β-quitina pode ser encontrada em lulas.
α - quitina β - quitina γ - quitina Figura 2 - Estruturas polimórficas de quitina.
A quitina é um material muito versátil devido as suas características, como biocompatibilidade, biodegradabilidade e atoxicidade.
A limitada solubilidade é o maior obstáculo para o desenvolvimento de aplicações da quitina, pois é um material insolúvel na grande maioria dos solventes orgânicos e aquosos. Quitina é solúvel em alguns ácidos concentrados, como H3PO4, H2SO4 e HCl, mas nesses casos ocorrem
derivatização e/ou degradação parcial de suas cadeias, em maior ou menor extensão em função do ácido considerado. A caracterização do polímero em solução fica prejudicada, porém existem estudos que mostram que a mistura binária N,N-dimetilacetamida/LiCl e também N-metil-2-pirrolidona são bons solventes de quitina. Assim, além das técnicas como difração de raios-X e espectroscopia na região do infravermelho, técnicas como viscosimetria, reologia e fluorescência podem ser utilizadas para caracterização de quitina [Rinaudo, 2006].
Apesar da baixa solubilidade, a quitina por sua baixa toxicidade e por ser inerte ao trato grastrointestinal dos mamíferos é aplicada em dispositivos para a liberação controlada de fármacos. Além disso, muitos derivados podem ser preparados a partir da quitina, ampliando as possibilidades de
imobilização de enzimas, muito empregada na indústria alimentícia para a clarificação de sucos e no processamento do leite com α e β-amilase grafitizadas com quitina, Krajewska apud Rinaudo(1).
Podem ser processados também fibras e filmes de quitina. Blendas de quitina/celulose são hipoalergênicas, bactericidas e controladoras de umidade, Yoshino et al apud Rinaudo (2). Entretanto, as mais importantes aplicações de filmes e fibras de quitina são na farmácia e medicina, por exemplo, para a confecção de dispositivos para a liberação controlada de fármacos e de biomateriais empregados em curativos, bandagens, suturas, Kanke et al e Yusof et al apud Rinaudo (3,4).
Entre muitos derivados possíveis de serem obtidos a partir de quitina, o destaque fica para quitosana, que é o derivado mais importante, versátil e com maior gama de aplicações. Suas principais características e aplicações serão discutidas a seguir.
1
KRAJEWSKA, B. Application of chitin and chitosan-based materials for enzyme immobilizations: a review. Enzyme Microbiol Technol, 35, p. 126-139, 2004.
2
YOSHINO, H. et al. Prepapration and characterization of mercapto-chitin derivatives. In: BrineCJ, Sandford PA, Zikakis JP, editors. Advances in chitin and chitosan. London and New York: Elsevier; p. 565-570, 1992.
3
Tabela 1 -Quantidade de quitina em alguns organismos [Hirano, 1986]. Organismo Quantidade de quitina, (% em massa) Crustáceos Cancer (caranguejo) 72,1(c)
Carcinus (caranguejo) 0,4 – 3,3(a)
Callinectes (caranguejo azul) 14,0(a)
Chionecetes (caranguejo Matsuba) 25,9(d)
Erimacrus (caranguejo) 18,4(d)
Paralithodes (caranguejo rei) 10,6(d)
Pleuroncodes (caranguejo vermelho) 35,0(b), 10,4(a), 1,3 – 1,8(b)
Camarão do Alasca 28,0(d)
Crangon (camarão) 5,8(d), 11,6(d), 69,1(c)
Macrobrachium rosenbergiin (camarão de água doce) 25,3±0,2(e), 24,4±1,0(f)
Metapenaeus 32,4(d) Nephrops (lagosta) 69,8(c) Homarus (lagosta) 60,8 – 77,0(c) Peneus 25,0(d) Lepas 58,3(c) Insetos Blattela (barata) 10(b), 18,4(c), 35(c) Bombyx (bicho-da-seda) 44,2(c) Coleoptera (besouro) 5,0 – 15,0(b)
Diptera (mosca verdadeira) 54,8(c)
Galleria (minhoca) 33,7(c) Gafanhoto 2,0 – 4,0(a) Besouro de maio 16,0(b) Periplaneta (barata) 2,0(c) Pieris (borboleta) 64,0(c) Aranha 38,2(d) Moluscos Concha de molusco 6,1
“Krill” (zooplacton de mares frios) 40,2, 42,0(d)
Concha de ostra 3,6
Lula, esqueleto 41,0
Fungos
Lactarius vellereus (cogumelo) 19,0
Aspergillus niger 42,0(e)
Mucor rouxii 44,5
Penicillium crysogenum 20,1(e)
Penicillium notatum 18,5(e)
Saccharomyces cerevisiae 2,9(e)
(a) massa úmida do corpo; (b) massa seca do corpo; (c) fração orgânica da cutícula; (d) massa total seca da cutícula; (e) massa seca da parede celular.
1.2) Quitosana
A quitosana, um polissacarídeo fortemente relacionado com a quitina, também ocorre na natureza, em alguns fungos, mas é bem menos abundante que quitina. É obtida, geralmente, pela desacetilação de quitina em processos que podem envolver diferentes condições e reagentes, sendo que a utilização de solução de NaOH em elevadas temperaturas é o método mais comum [Campana-Filho e Dèsbrieres, 2000]. Apesar da quitina ter sido identificada pela primeira vez em 1884, a quitosana foi produzida industrialmente pela primeira vez em 1971 no Japão. Em 1986 já eram quinze indústrias produzindo quitina e quitosana em escala comercial [Hirano, 1989].
Quitosana pode ser definida como um copolímero de 2–amino-2– desoxi–D–glicopiranose e 2–acetamido–2–desoxi–D–glicopiranose, de composição variável em função do grau residual de acetilação, cujas unidades também são unidas por ligações β (1→4) (Figura 3).
O termo quitosana é usado para identificar amostras contendo mais de 50% a 60% de unidades desacetiladas, enquanto quitina corresponde a produtos muito mais acetilados. Como consequência de diferentes conteúdos de unidades acetiladas, quitina e quitosana possuem diferentes graus de solubilidade. Assim, enquanto a quitina é insolúvel na maioria dos solventes, a quitosana é solúvel em soluções aquosas de ácidos orgânicos e inorgânicos graças a protonação do grupo amino ligado ao carbono 2 da unidade 2–amino-2–desoxi–D–glicopiranose. Devido à protonação dos
de suas cadeias e exibe as propriedades de polieletrólitos [Campana-Filho e Dèsbrieres, 2000; Rinaudo, 2006]. Geralmente, é difícil a obtenção de quitosana com elevado grau de desacetilação, pois, à medida que este aumenta, a possibilidade de degradação do polímero também aumenta [Silva, et al., 2006].
n
O O O HO HOH 2 C NHCOCH 3 O HO HOH 2 C N H 2Figura 3 - Representação esquemática da estrutura primária idealizada de quitosana, sendo n = grau de polimerização.
No estado sólido, a quitosana é um polímero semi-cristalino e seu principal meio de obtenção é pela desacetilação de quitina, sendo que as suas qualidades e propriedades variam de acordo com os fatores do processo de manufatura. O grau de acetilação (GA) é considerado um dos principais parâmetros na caracterização da quitosana, porém propriedades como pureza, viscosidade, massa molecular e estrutura polimórfica também são fatores muito importantes a serem considerados. A capacidade de adsorver metais, por exemplo, depende do processo de hidrólise dos grupos acetamido. Uma hidrólise homogênea pode resultar em quitosana com maior taxa de adsorção do que aquela preparada por processo heterogêneo com o mesmo grau de acetilação [Li et al., 1992].
Uma das mais importantes propriedades da quitosana é a de agir como quelante [Li et al., 1992; Juang, 2002]. Ela pode se ligar seletivamente
a substâncias como o colesterol, gorduras, proteínas e células tumorais e também íons metálicos, o que tem originado o desenvolvimento de muitos estudos nas últimas décadas visando sua exploração em diversas aplicações [Kurita et al, 1986; Mathur e Narang, 1990; Roberts, 1992;
Rashidova, 2004; Wang et al., 2005]. A capacidade de quitosana interagir
fortemente com íons metálicos dissolvidos em meios aquosos é superior à apresentada por quitina, porém sua aplicação em processos de descontaminação é limitada a efluentes de baixa acidez (pH > 6-7), pois quitosana é solúvel em meios de acidez moderada a forte, o que impede, ou pelo menos dificulta bastante, sua utilização na forma de filtros, membranas ou colunas [Kurita et al., 1986; Li et al., 1992; Roberts, 1992]. Alternativas
viáveis para estender as possibilidades de emprego de quitosana como quelante de íons metálicos a uma faixa mais ampla de pH são: i) a
introdução de substituintes acila portadores de cadeias relativamente longas [Guibal et al., 1997]; ii) a introdução de substituintes quelantes [Peter, 1995;
Varma et al. 2004], iii) a graftização com monômeros selecionados (ácidos
alcenóicos e alcenodióicos) [Peter, 1995] e iv) o estabelecimento de um
certo número de entrecruzamentos ou ligações covalentes intercadeias [Koyama e Taniguchi, 1986; Kurita et al., 1986; Guibal et al., 1997]. Nesse
último caso, se o grau de entrecruzamento, ou de reticulação, é suficientemente elevado, o derivado obtido passa a ser insolúvel e o material obtido passível de ser empregado na forma de filtros, membranas ou como
dissolvidos podem ser eluídos. A presença de grupos hidroxila e amino permitem uma ampla variedade de modificações químicas, incluindo reações com agentes entrecruzadores [Peter, 1995]. Agentes apropriados para o estabelecimento desses entrecruzamentos devem ser bifuncionais e reativos frente aos sítios disponíveis nas cadeias de quitosana, sendo que glutaraldeído tem sido aplicado com relativo sucesso para essa finalidade [Koyama e Taniguchi, 1986; Kurita et al., 1986; Guibal et al. 1997].
Entretanto, é necessário que a amostra de quitosana entrecruzada ainda contenha grupos amino disponíveis para quelação após a etapa de entrecruzamento. Assim, epicloridrina, um agente de entrecruzamento que reage preferencialmente com grupos hidroxila, pode ser empregado para entrecruzar quitosana [Wei et al., 1992], sendo essa alternativa muito
interessante, pois os grupos amino, essenciais para a quelação de íons metálicos, são preservados. Além disso, as propriedades mecânicas de quitosanas entrecruzadas com epicloridrina são superiores às dos materiais obtidos com outros agentes de entrecruzamento [Wei et al., 1992], o que
pode resultar em materiais capazes de suportar fluxos elevados quando empregados em colunas. Por outro lado, ainda que os entrecruzamentos não envolvam grupos amino das cadeias de quitosana, é necessário que o grau de reticulação não seja demasiadamente elevado, pois resultará em produto muito hidrofóbico e com baixa capacidade de intumescimento, limitando severamente a permeação do efluente aquoso e a capacidade do material remover íons metálicos [Koyama e Taniguchi, 1986; Kurita et al.,
insolúvel em água em meio neutro, condição em que enzimas fisiológicas exercem sua atividade. Partindo do princípio que derivados de quitina e quitosana podem ser preparados a fim de se melhorar sua solubilidade em água, as aplicações destes polímeros podem aumentar significativamente [Silva et al., 2006].
A versatilidade da quitosana e justifica a variedade de utilidades e aplicações desse material, que são comercialmente viáveis pelo custo e facilidade de obtenção. Entre as várias formas a quitosana pode ser utilizada na forma de pó, que pode ser de diferentes granulometrias e possuir alta pureza; na forma de filme podendo ser rígido, permeável, claro, flexível e aderir em superfícies negativamente carregadas; na forma de gel com alta resistência e facilmente formado com poliânions; como pérolas que são de fácil obtenção, tamanho selecionável, porosidade variada e facilmente entrecruzável e também na forma de pasta pomada ou loção com excelente textura e fácil formulação [Sandford, 1989].
1.2.1) Aplicações de Quitosana
Características como abundância de matéria-prima; utilização de rejeitos abundantes e relativamente baratos da indústria pesqueira e grande possibilidade de aplicação desse material em diversas áreas têm gerado um constante aumento na produção industrial de quitosana e na obtenção de
grande potencial desse material junto à sociedade. Dentre inúmeros exemplos temos aplicações em suturas cirúrgicas, implantes dentários, pele artificial, reconstrução óssea, lentes de contato, liberação controlada de fármacos em humanos e animais, fórmulas para controle do colesterol e emagrecimento, como agente antiinflamatório, em uso veterinário e também como agente antimicrobiano. Essas diversas aplicações são provenientes de características favoráveis da quitosana como biocompatibilidade, biodegradabilidade, facilidade de formar filmes, propriedades hidratantes, atoxicidade, tolerância biológica, priedades cicatrizantes, capacidade de inibição do crescimento e proliferação de vírus e bactérias, e também capacidade de regeneração de tecidos [Jameela e Jayakrishnan, 1995; Felt
et al., 1998; Hirano, 1999; Gupta e Kumar, 2000; Khor e Lim, 2003; Senel e
McClure, 2004; Wang et al., 2005; Kurita, 2006; Rinaudo, 2006, Silva, et al.,
2006].
Na Tabela 2 são encontradas outras importantes aplicações da quitosana na indústria, pesquisa e desenvolvimento.
Tabela 2 - Algumas aplicações de quitosana*.
Aplicações Exemplos
Tratamento de água
Na remoção de íons metálicos através da quelação dos mesmos; como agente floculante para a eliminação de substâncias tais como proteínas e corantes; clarificação e filtração a partir de membranas de quitosana.
Polpa e Papel
No tratamento da superfície do papel com a finalidade de aumentar a dureza (qualidade) sem afetar o seu brilho; na obtenção de papel isolante mais resistente ao envelhecimento; no uso de papel fotográfico a fim de aumentar suas propriedades antiestáticas.
Cosméticos
Na remoção de sobras de goma em xampu e para dar força e brilho aos cabelos; em cremes de limpeza para conferir maciez à pele. Tratamentos de pele e cabelos, onde soluções formam filmes que aderem à pele ou cabelo, devido ao caráter catiônico da quitosana.
Agricultura e Processamento de Alimentos
No tratamento na superfície da semente o qual inibe a presença de fungos em sua vizinhança; na remoção de corantes em suco de laranja; na remoção de sólidos, β-caroteno e substâncias ácidas de sucos de maçã e de cenoura.
Alimentos Clarificação de vinho e sucos, cobertura protetora para frutos.
*[Sanford, 1988; Li et al. 1992, Peter, 1995; Kumar, 2000; Guibal, 2004; Varma et al., 2004].
1.2.2) Materiais a base de Quitosana: Microesferas e Nanopartículas
Muitos são os métodos de obtenção de microesferas e de nanopartículas de quitosana e inúmeras são as aplicações desses materiais
desempenho como carreadora de fármacos para liberação controlada. A Tabela 3 resume os métodos de obtenção e os principais fármacos utilizados para liberação controlada utilizando esses derivados de quitosana [Agnihotri
et al., 2004].
As esferas e microesferas de quitosana são amplamente aplicadas em diversas áreas e estudos. As microesferas são muito utilizadas nas áreas médica e farmacêutica devido a sua fácil absorção pelo organismo e atoxicidade, como carregadoras de fármacos ou substâncias que podem ser liberadas de forma controlada no organismo [Jameela e Jayakrishnan, 1995; Thomé e Weltrowski, 1997; Genta et al., 1998; Josué et al., 2000, Wang et al., 2006].
O emprego de terapias que utilizam microesferas para liberação de fármacos permite que os tratamentos sejam bastante específicos, além da possibilidade de escolher e formular várias combinações de fármacos/polímeros. Variáveis como a dose do medicamento e a cinética de liberação podem ser controladas para alcançar os resultados desejados.
Tabela 3 - Diferentes sistemas de obtenção de materiais a base de quitosana e os fármacos usados na liberação controlada [Agnihotri et al.,
2004].
Material a base de quitosana Método de Preparação Fármacos
emulsão entrecruzada Teofilina, cisplatina, insulina, diclofenaco sódico, aspirina, progesterona, pentazocina, etc precipitação Prednisolona, propanolol-HCl “Spray-drying” Cimetidina, nizatadina, vitamina D-, diclofenaco sódico, ketoprofen, albumina do soro bovino, ampicilina, etc. Microesferas/Micropartículas
gelificação iônica felodipina
moagem clozapina
precipitação DNA, doxorubicina
gelificação iônica
Insulina, ricina,
albumina do soro bovino, ciclosporina A
método de reversão micelar doxorubicina
Utilizando inovações tecnológicas para microencapsulação, variando a razão de copolímeros, massa molecular do polímero, etc, podem ser desenvolvidos diferentes sistemas para liberação controlada que permitirão sucesso no controle de sintomas e tratamento de doenças. Esses sistemas com base em microesferas podem aumentar a vida dos princípios ativos e controlar a liberação dos agentes bioativos. Devido ao tamanho reduzido, as microesferas possuem uma grande razão superfície/volume e podem ser usadas para controlar a liberação de fármacos insolúveis[Sinha et al., 2004].
Existem estudos que utilizam micro cápsulas de quitosana em conjunto com outros polissacarídeos, como alginato, por exemplo, para liberação controlada administradas por via oral. No caso da utilização dessas micro cápsulas de alginato/quitosana, a principal limitação é a fácil dissolução da quitosana no baixo valor de pH do estômago, entretanto, propriedades favoráveis da quitosana, como aumento na absorção e mucoadesividade, foram observadas em condições de baixo pH. Isto acontece porque como uma base fraca, quitosana requer certa quantidade de ácido para transformar as unidades de glucosamina em unidades positivamente carregadas e solúveis. A baixa solubilidade em água prejudica as propriedades mucoadesivas da quitosana para liberação de fármacos e proteínas no intestino grosso, que é a principal região de absorção do trato gastrointestinal. Entretanto, para que a matriz responsável pela liberação de proteínas e fármacos seja eficiente em suas funções algumas modificações na estrutura da quitosana são necessárias, o que é possível pela execução de reações de entrecruzamento e de derivatização do material [George e
Em trabalhos como o de Chiou e Li as esferas entrecruzadas de quitosana são usadas na área de meio ambiente, para remoção de corantes presentes em efluentes industriais. Indústrias têxteis, de papel, couro, plásticos, etc, geram efluentes que precisam de tratamento e a quitosana apresenta alto potencial para ser utilizada com a finalidade de descontaminar efluentes poluídos. Alguns agentes utilizados na adsorção de corantes têm uma capacidade de remoção de 200-600g/kg e outros, menos ainda, cerca de 50g/kg. A capacidade de adsorção aumenta para 1000-1100g/kg quando quitosana passa a ser empregada. O que ocorre no processo é que em solução ácida os grupos amino da quitosana ficam protonados e, então, há uma interação eletrostática com as cargas negativas presentes nos corantes. Como em meio ácido a quitosana pode se dissolver, alguns autores propõem o entrecruzamento das cadeias, utilizando glutaraldeído, para tornar a quitosana insolúvel [Chiou e Li, 2003].
Peniche, C. et al. estudaram sistemas para liberação de fármacos
com microesferas porosas de quitosana e poli (ácido acrílico). Como a quitosana é um polissacarídeo catiônico em meio ácido, sua interação com o poli (ácido acrílico) resulta na formação de um complexo polieletrolítico. Esses complexos poliméricos podem ser considerados fisicamente como matrizes entrecruzadas ou hidrogéis capazes de serem utilizados em sistemas com varições de pH e com variações de temperatura e força iônica. Essas microesferas geram um grande interesse na preparação de sistemas para liberação controlada de fármacos e outras aplicações biomédicas [Peniche et al., 2003].
Samantha e Harding realizaram a síntese e caracterização de microesferas de quitosana quimicamente modificadas por copolimerização e conseguiram aumentar sua hidrofilicidade embora o impedimento histérico tenha resultado num entrecruzamento ineficiente. Com modificações adequadas, essas partículas de quitosana podem ser exploradas para liberação controlada de novas substâncias [Samanha e Harding, 2002].
No caso de bioadesivos nasais para liberação de anti-histamínicos, como a loratadina, um dos mais usados atualmente, as microesferas de quitosana são utilizadas com sucesso. Graças às cargas positivas presentes no polieletrólito, ocorre uma forte interação eletrostática entre a quitosana e a mucosa nasal, que é carregada negativamente. Neste caso um longo tempo de contato permite que o fármaco possa ser transportado pela membrana nasal antes de ser eliminada pelo mecanismo de limpeza do muco pela ação das células ciliadas. Este mecanismo possui vantagens, como eficiência na absorção do medicamento aumentando seu tempo de residência no organismo e permite um contato mais eficiente com a mucosa, o que promove uma redução na freqüência da administração do fármaco [Martinac et al., 2005].
A quitosana na forma de nanopartículas foi recentemente desenvolvida, e seu estudo tem sido muito explorado com uma grande variedade de aplicações na área de liberação controlada de fármacos devido às vantagens da estrutura nanométrica. A forma de nanopartículas pode ser muito vantajosa por um lado, porém, dificulta a caracterização do material devido ao tamanho muito reduzido.
Schaffazick e colaboradores realizaram um importante trabalho de caracterizações físico-químicas de sistemas poliméricos nanoparticulados para a administração de fármacos, que incluiu a avaliação morfológica, distribuição de tamanho de partículas, determinação do potencial zeta e pH, cinética de liberação do fármaco e a avaliação da estabilidade em função do tempo de armazenamento. Os resultados e as informações obtidas possuem o intuito de propor modelos que descrevam a organização das nanopartículas em nível molecular, que será dependente da composição qualitativa e quantitativa das formulações [Schaffazick et al., 2003].
Banerjee e colaboradores estudaram a utilização de nanopartículas entrecruzadas com glutaraldeído na corrente sanguínea de coelhos. As nanopartículas (menores que 100nm) eram carreadoras do fármaco99mTechnetium. Foi observado que as nanopartículas tiveram um tempo de vida considerável na corrente sanguínea e foram detectadas no coração, fígado, ossos e coluna vertebral, indicando que o material tem um melhor desempenho que as microesferas ou microcápsulas de quitosana, pois na escala nano o acesso à corrente sanguínea é facilitado e as nanopartículas podem circular por todo o organismo pelo sangue [Banerjee
et al, 2002].
Leon e colaboradores realizaram caracterizações físico-químicas das nanopartículas de quitosana na forma de um nanogel entrecruzado com tripolifosfato, devido ao grande interesse nas aplicações farmacêuticas. Foi observado que o material não se mostrou tão estável, sofreu agregação e processos de desintegração em condições ambientais que simulavam
macromoléculas ou fármacos ocorrem interações entre o gel e o fármaco tornando as partículas muito mais estáveis. Foi também concluído que o pH tem uma forte influência sobre as partículas, quanto menor o pH, maior diâmetro é observado devido ás repulsões eletrostáticas intra-moleculares. Quando sal é adicionado, mesmo em concentrações moderadas, ocorre um intumescimento e pode haver a desintegração das partículas [Leon, 2005].
A atividade anti-bacteriana das nanopartículas de quitosana foi estudada por Qi e colaboradores usando vários microorganismos e foi constatada a inibição do crescimento dos mesmos. Pelos estudos de Microscopia de Força Atômica foi concluído que devido ao pequeno tamanho das partículas de quitosana estas podem ser adsorvidas na superfície das células bacterianas e contribuir para o rompimento da membrana celular, comprometendo processos vitais [Qi et al, 2004].
Muitos estudos têm sido realizados utilizando o fármaco Ciclosporina A para tratamentos oculares de doenças como conjuntivite e olho seco, entre outras, porém muitas limitações são encontradas nos sistemas para liberação do medicamento. Assim, os veículos à base de óleo são muito lentos na liberação da ciclosporina A e provocam sintomas como irritação, visão embaçada e alguns efeitos tóxicos para córnea. Como as superfícies da córnea e da conjuntiva possuem carga negativa, polímeros mucoadesivos foram testados e entre eles a quitosana exibiu o melhor desempenho, o que foi atribuído à biocompatibilidade, biodegradabilidade e capacidade de aumentar o transporte paracelular de fármacos. Os resultados dos testes in vivo mostraram que o sistema é vantajoso, pois pode entrar intimamente em
liberação para os tecidos oculares externos sem comprometer as estruturas oculares internas, promovendo uma liberação em longo prazo sobre esses tecidos doentes [Campos et al., 2001].
Calvo e colaboradores prepararam um novo sistema hidrofílico para liberação de proteína utilizando polímeros hidrofílicos como quitosana e óxido de polietileno, que são atóxicos e compatíveis. A principal vantagem dessas nanopartículas é de serem preparadas sob condições brandas e curto espaço de tempo, além possuírem uma excelente capacidade de encapsular proteínas e promover uma liberação contínua por longos períodos de tempo [Calvo et al., 1997].
Estudos in vivo realizados em ratos para tratamento de sarcoma
(S-180) e tumor hepático (H22) em camundongos utilizaram nanopartículas de quitosana para verificação de seu potencial como agente anti-tumoral. Qi e Xu variaram o tamanho das nanopartículas e utilizaram uma solução salina de cisplatina (cDDP) como fármaco de referência (branco). O droga foi administrada a partir do décimo quinto dia após o tumor subcutâneo do camundongo atingir 3mm3. As nanopartículas de quitosana em doses e tamanhos de partículas diferentes foram administradas uma vez ao dia por injeções intravenosas, intra-peritoneais e por administração oral, respectivamente, por sete dias. Como resultado, foi observado que as nanopartículas mostraram uma expressiva eficácia contra ambos os tumores. Entre os três métodos testados a injeção intravenosa se mostrou mais eficaz, quanto ao tamanho das partículas, as de tamanho mais reduzido apresentaram maior eficácia contra os tumores quando injetadas
1.3) Comportamento Químico de Quitina e Quitosana
1.3.1) Formação de Complexos com Íons Metálicos
A quitosana possui uma grande capacidade de complexar metais e agir como agente quelante, devido a grande quantidade de grupos amino presentes em sua estrutura. A quitina, no entanto, não possui uma habilidade tão efetiva de adsorver metais, pois os elétrons dos nitrogênios dos grupos acetamido não estão tão disponíveis como no caso da quitosana [Muzzarelli, 1973].
Embora quitina e quitosana venham sendo estudadas visando a quelação de metais há muitos anos, a comparação dos resultados de diferentes pesquisadores em relação à complexação de íons metálicos se torna difícil devido às diferentes técnicas e condições usadas nos experimentos, e algumas destas diferenças podem ser cruciais. Por exemplo, diferenças no modo de agitação podem ter um efeito considerável, não somente na cinética de adsorção, mas também na quantidade de íons adsorvidos [Roberts, 1992; Schmuhl et al., 2001]. A forma física da
quitosana também é um fator importante, assim suas diferentes formas (flocos, pós ou filmes) possuem diferentes capacidades de quelação, o que pode ser atribuído às diferentes razões superfície/volume desses materiais [Muzzarelli, 1973]. Outro fator que dificulta comparações é que há, freqüentemente, caracterizações insuficientes das amostras de quitosana
formação do complexo quitosana-íon metálico ocorre primariamente através dos grupos amino funcionando como ligantes, tanto que a extensão da desacetilação da quitosana é um fator crítico no controle do nível de quelação do íon, mas muitas vezes essa informação não é fornecida. A falta de uma caracterização rigorosa também leva a confusão no que se refere à capacidade da quitina complexar íons metálicos. Como a quitina isolada em laboratório normalmente contém grupos amino livres (GA>90% originada dos gládios de lulas, por exemplo), espera-se que ela possa complexar os íons, porém em extensão muito menor que a quitosana, como é observado.
Ainda não há indicações conclusivas de que quitina “pura” realmente forme complexos com íons metálicos, mas há algumas delas que indicam que não. Yaku e Koshijima(5) apud Muzzarelli observaram que um filme de quitina preparado por N-acetilação de quitosana não se tornava colorido quando imerso em soluções contendo íons Cu(II), Co(II) e Ni(II), enquanto que o filme preparado com quitosana, e também quitosana parcialmente N-acetilada, tornou-se colorido.
A capacidade de adsorção de íons metálicos pela quitosana depende da concentração dos grupos amino presentes e, além disso, outro fator importante é a acessibilidade desses grupos, pois serão esses que irão interagir e formar os complexos.
Kurita e colaboradores estudaram a complexação da quitosana entrecruzada com glutaraldeído com íons Cu2+. Surpreendentemente, a
5
adsorção dos íons Cu(II) inicialmente aumentou com o aumento da quantidade de glutaraldeído usado na etapa de entrecruzamento, até a razão molar grupos aldeído/grupos amino atingir 1:1 e a partir daí diminuiu rapidamente. O aumento inicial na capacidade de adsorção de íons metálicos foi atribuído aos baixos níveis de entrecruzamento, o que impediu a formação de um polímero muito empacotado, o que diminuiria a sua capacidade de intumescimento. Quando elevados graus de entrecruzamento são atingidos, uma grande redução na capacidade de intumescimento do polímero acontece. Isso ocorre devido ao alto grau de empacotamento e ao caráter mais hidrofóbico que o material adquire, fazendo com que a acessibilidade aos sítios de interação diminua [Kurita et al., 1986]. Em um
trabalho subseqüente, a capacidade de adsorção de íons Cu(II) pelas amostras de quitosana que foram previamente entrecruzadas com glutaraldeído foi examinada e resultados parecidos com os da quitosana solúvel foram obtidos, exceto que o máximo da capacidade de adsorção foi atingido quando a razão molar de grupos aldeído/grupos amino atingiu 0,7:1. A análise de difração de raios-X mostrou que o produto formado por entrecruzamento com a grupos aldeído/grupos amino de 0,7:1 era totalmente amorfo, enquanto que o derivado da quitosana não entrecruzada mostrou um pico em 2θ = 20o, indicando um certo grau de cristalinidade [Koyama e Tanaguchi, 1986].
1.3.2) Estudos de Complexação Quitosana-Íons Metálicos
A alta capacidade da quitosana complexar metais é explicada primeiramente pela formação de um composto de coordenação doador-aceptor no quais os grupos hidroxila e amino da quitosana são os doadores e, segundo, pela estrutura flexível das cadeias do polímero, fator que torna possível para a molécula da quitosana ter a conformação necessária durante a complexação com os íons metálicos [Kolyadina, 2006].
Como regra geral pode ser dito que a quitosana forma complexos com metais de transição, mas não com os íons de metais alcalinos e alcalinos terrosos [Guibal, 2004]. Existem muitos estudos sobre a capacidade de complexação da quitosana com diferentes íons metálicos, mas o principal problema para comparar os resultados desses experimentos diz respeito às condições em que foram realizados, pois nem sempre é informado se as medidas de adsorção de íons foram realizadas após o sistema atingir o equilíbrio. Além disso, freqüentemente não são fornecidas informações acerca das características da quitosana empregada, embora seja reconhecida a importância, por exemplo, do grau médio de acetilação do polímero. Muzzarelli e Tubertini apud Muzzarelli(6) estudaram a cinética de complexação de íons de metais de transição usando um excesso de quitosana, e seus resultados indicam que o equilíbrio pôde ser alcançado em todos os casos após 45 horas de contato. Koshijima et al. apud
Muzzarelli(7) determinaram um tempo de equilíbrio de 50 horas a 30oC para um sistema quitosana-Cu(II), enquanto McKay et al apud
Muzzarelli(8) determinaram um tempo de contato para o mesmo sistema de 168 horas.
Em todos os casos citados acima, a quitosana foi usada na forma de grãos, mas em estudo utilizando filme de quitosana, o qual proporcionou uma superfície de contato menor da solução com o substrato, Averbach apud Muzzarelli(9) mediu a concentração de íons Cu(II) que atravessaram o filme (com espessura de ~100µm) e observou que os íons alcançaram o centro da membrana após cerca de 200 horas de contato da membrana com a solução contendo os íons.
7
KOSHIJIMA,T et al, Cellulose Chem. Technol. 7 p.197, 1973. 8
MCKAY, G.; BLAIR, H.S.; FINDON, A., Chitin in Nature and Technology, R. A. A.
Muzzarelli, C. Jeuniaux and G.W. Goodway (eds), Plenum Press, New York, p.559, 1985. 9
AVERBACH, B.L., Chitin and Chitosan, S. Hirano and S. Tokura (eds), The Japanese
1.3.3) Estrutura dos Complexos Quitosana-Íons Metálicos
Quitosana é freqüentemente considerada como um polímero quelante, porém a formação de quelatos não pode ser conclusiva se o termo quelação se refere uma situação em que o íon metálico está ligado por dois ou mais ligantes na mesma molécula formando uma estrutura cíclica. Assim, para quitosana quelar íons metálicos é necessário o envolvimento dos grupos -OH ou -O- dos resíduos de D-glicosamina como ligantes, ou senão dois ou mais grupos -NH2 de uma única cadeia ligados ao mesmo íon
metálico. Em quitosana derivada de α-quitina, em que ao dobramento da cadeia é atribuída à ocorrência de arranjo antiparalelo de cadeias na cela unitária, os dois grupos -NH2 podem vir de dois segmentos da mesma
cadeia em direções opostas (Figura 4).
NH2 Cu(II)
NH2
L
L
Figura 4 -Esquema de quelação de íons Cu2+ envolvendo dois grupos -NH2
Muzzarelli et al apud Muzzarelli(10) concluiram através de estudos com membranas complexadas com íons Cu(II) que o número de grupos aminos envolvidos na quelação aumenta com o aumento do pH, de 1 em pH<5 a 3 em pH<6-8. Contudo, parece improvável que três grupos aminos possam estar suficientemente próximos para atuar como ligantes e esse conceito acabou não recebendo muita atenção. Em outros estudos a formação de complexos quitosana-Cu(II) em termos de duas estruturas, designadas centro I e centro II, possuíam proporções relativas dependentes do pH.
Em estudosde complexos de quitosana-Cu(II) formados por reações heterogêneas o pH foi variado na faixa de 4,6 até 11,5. Foi concluído que quando pH<6 o complexo envolve somente um grupo -NH2, junto com 3
grupos hidroxilas ou moléculas de H2O, enquanto que para pH>6-7 é mais
provável que o complexo envolva dois grupos -NH2. Quando o pH>7-9
pode-se considerar a desprotonação dos grupos hidroxila, e o complexo predominante envolve dois grupos -NH2 e dois grupos hidroxila dissociados.
Estudos de difração de raios-X de complexos de quitosana e íons de metais de transição eliminaram a possibilidade de complexos de quitosana-Cu(II) conterem dois ou mais grupos -NH2, e isto se aplica também a outros
complexos de quitosana-metal examinados, desde que o comprimento da ligação NCu(II) N é o mais longo dentre os íons metálicos estudados. Foi concluído também que é improvável que os grupos hidroxilas do resíduo de D-glicosamina estejam envolvidos no complexo, desde que os íons metálicos são raramente coordenados com grupos hidroxilas não
dissociados e, portanto, a estrutura mais provável é uma na qual o íon metálico é coordenado apenas a um grupo amino da cadeia de quitosana [Roberts, 1992].
Segundo um estudo de interação em solução entre quitosana e íons de Cu(II) usando potenciometria e dicroismo circular, Domard apud Roberts(11) concluiu que somente um complexo é formado sob as condições estudadas, segundo a estrutura mostrada na Figura 5. O autor propôs que um grupo amino e dois grupos hidroxilaparticipam como ligantes. O quarto grupo poderia ser uma molécula de água ou o grupo hidroxila do C(3).
O O CH2OH HO NH2 Cu OH ou H2O HO
Figura 5 -Complexo formado pela quitosana-Cu(II).
Em trabalhos recentes sobre mecanismos da quelação de metais por quitosana, Wang e colaboradores realizaram estudos sobre a formação de complexos entre a quitosana e íons metálicos como cobre, zinco e ferro e sua ação como agente antimicrobiano, utilizando bactérias gram-positivas e
gram-negativas. Eles propuseram em seus estudos o seguinte modelo para interação da quitosana com íons metálicos:
Figura 6 - Modelo de possível estrutura formada entre quitosana e íons metálicos no processo de quelação [Wang et al., 2005; Kolyadina et al,
2006].
Nesse caso, o metal funciona como uma ponte conectando uma ou mais cadeias de quitosana através dos grupos amino ou hidroxila.
1.4) Modificação da Quitosana: Entrecruzamento com
Glutaraldeído
O glutaraldeído (Figura 7) é uma molécula bifuncional que interage fortemente com compostos que possuem grupos amino em sua estrutura. Inicialmente foi muito utilizado como fixador na histoquímica e microscopia eletrônica, e só depois passou a ser utilizado como reagente bifuncional no estudo estrutural de proteínas simples e macromoléculas agregantes [Monteiro Jr, 1999]. O CH2 H C CH2 CH2 C O H Figura 7 - Estrutura molecular do glutaraldeído.
O glutaraldeído age como agente formador de ligações cruzadas ou reticulações (“crosslinking”). A interação com quitosana se dá pelos seus grupos amino e os grupos aldeídos do glutaraldeído. O mecanismo dessa reação e as estruturas dos compostos obtidos ainda não estão bem esclarecidos, mas afirma-se que há formação de uma base de Schiff [Monteiro Jr, 1999].
Além do mecanismo de reação, a estrutura resultante da interação glutaraldeído/quitosana é motivo de grandes questionamentos. Nos trabalhos publicados, os autores sugerem três estruturas: a) há formação de apenas uma base de Schiff com um dos grupos aldeídos do glutaraldeído, o
reação subseqüente, b) os dois grupos aldeído de uma única molécula de glutaraldeído reagem com duas aminas formando uma ligação cruzada e c) a ligação cruzada é formada por mais de uma molécula de glutaraldeído [Ishii et al. 1995; Cestari e Aroldi, 1997].
A única reação desejável do glutaraldeído seria aquela na qual seus grupos funcionais reagissem com os grupos amino disponíveis na quitosana formando ligações cruzadas tipo base de Schiff ( CH=N). Entretanto, em soluções aquosas ele forma uma mistura complexa em equilíbrio contendo glutaraldeído livre e suas formas mono, di-hidratadas, hemiacetais cíclicos (monomérico e polimérico) e polímeros α, β-insaturados (Figura 8).
Uma solução de glutaraldeído a 25% na temperatura de 25oC apresenta apenas 4% de glutaraldeído livre, o restante está sob a forma de mono e di-hidratos, hemiacetais cíclicos e forma polimérica [Giglioti, 2000]. A polimerização do glutaraldeído em solução depende da temperatura, concentração e pH. Por exemplo, soluções de glutaraldeído quando aquecidas a 50oC, aumentam a concentração do glutaraldeído livre até valores de 35%.
Assim, uma dificuldade adicional ao se utilizar o glutaraldeído como agente de entrecruzamento está relacionada à heterogeneidade dos tipos de ligações cruzadas formadas por esse reagente.
a) Formas Monoméricas C H O (CH2)3 C H O Glut. livre H2O (CH2)3 O H C C HO H OH Monoidratado H2O OH H HO C C HO (CH2)3 H OH Diidratado H2O O OH OH Hemiacetal cíclico b) Hemiacetais Poliméricos 2 O OH Dímero O HO OH O HO O O O O OH Polímero n HO HO OH
c) Polímeros alfa e beta-insaturados
C (CH2)3 C H O H O Glut. livre Glut. livre O H C (CH2)2 C C H O C H (CH2)3 C H O Glut. livre C H O (CH2)3 C H C C H O CH2 Dímero C C O C H H (CH2)3 C H O Trímero
Figura 8 - Composição química do glutaraldeído em solução aquosa [Giglioti, 2000].
