Pub. 1220
Received: 15 June 2014 Accepted: 20 October 2014 Published: 6 November 2014 Centro de Diagnóstico Microbiológico Animal (CEDIMA), Centro de Ciências Agroveterinárias (CAV), Universidade do Estado de Santa Catarina (UDESC), Lages, SC, Brazil. CORRESPONDENCE: A.M. Dall Agnol [alaisagnol@hotmail.com - Tel. +55 (49) 2101-9155]. CEDIMA - CAV, Univer-sidade do Estado de Santa Catarina (UDESC). Av. Luiz de Camões n. 2090, Bairro Conta Dinheiro. CEP 88520-000 Lages, SC, Brazil.
Perfil de resistência a antimicrobianos de Streptococcus suis tipo 2
isolados a partir de tonsilas de suínos de abate
Antimicrobial Resistance Profile of Streptococcus suis Type 2 Isolates from Tonsils of Slaughter Pigs
Alais Maria Dall Agnol, Fernanda Danielle Melo, João Paulo Zuffo, Thaís Costa Nihues & Eliana Knackfuss Vaz
ABSTRACT
Background: Streptococcus suis is an emerging micro-organism responsible for causing meningitis, septicemia, arthritis,
endocarditis and pneumonia, in addition to being an occupational zoonosis. In healthy pigs S. suis is located asymptomati-cally in the tonsils and may be disseminators sources pigs susceptible to the pathogen. To reduce these losses it is neces-sary to have effective control and treatment agent, however, it is known that antimicrobial resistance is a risk point for the success of the therapy. Thus, the aim of this study was to determine the resistance profile and the minimum inhibitory concentration of antimicrobial isolates of Streptococcus suis type 2 from tonsils of pigs at slaughter.
Materials, Methods & Results: Tonsil samples from 302 slaughtered pigs were from three slaughterhouses, they were
isolated and typified 219 S. suis type 2. The antibiogram was performed using the technique of Disk Diffusion and Agar 209 isolates in the following antimicrobials were tested: amoxicillin (10 µg), ampicillin (10 mcg), ceftiofur (30 mcg), ciprofloxacin (5 µg), doxycycline (30 mcg), enrofloxacin (5 mcg), erythromycin (15 µg), florfenicol (30 mcg), norfloxacin (10 µg), penicillin G (10 U) and tetracycline (30 µg). And 117 isolates were subjected to minimum inhibitory concentra-tion (MIC), the following concentraconcentra-tions amoxicillin, doxycycline, enrofloxacin in concentraconcentra-tions of 10, 20 and 30 µg and penicillin/spectinomycin 20, 40 and 60 IU. The antimicrobials that showed higher resistance were tetracycline and erythromycin. Most drugs got low resistance (<10%) as amoxicillin, ceftiofur, enrofloxacin, ampicillin, doxycycline and florfenicol compared to the drug norfloxacin, penicillin and ciprofloxacin, which showed more resistance (17-30.4%). The resistance of isolates by antibiogram was AMO 0%, AMP 5%, CTF1.5%, CIP 17.3%, DOX 5%, ENO 3.9%, ERI 76.9%, FLF 6.1%, NOR 30.4%, PEN 17% and TET 90.2%. In determining the MIC no isolate was resistant to amoxicillin and penicillin/spectinomycin, doxycycline for 23.9% (28/117) obtained an MIC >10 µg, 1.7% (2/ 117) MIC >20 µg and 0.85% (1/ 117) MIC >30 µg enrofloxacin and 5.9% (7/117) obtained an MIC >10 µg.
Discussion: Antimicrobial resistance is an important factor to be considered in the treatment of bacterial diseases, some
pathogens are resistant to a wide range of drugs. This may be due to the inappropriate use of antimicrobials, especially those used as growth promoters, leading to increased incidence of bacterial resistance. The high degree of resistance to tetracycline (90.2%) and erythromycin (76.9%) observed in our study can be explained by its use in the prevention and treatment of disease without an effective control. Errors can easily occur leading to underdosing of antibiotics that lead to selection of resistant strains. However high sensibility to the group of β-lactams, quinolones and florfenicol were found, with amoxicillin and ceftiofur antimicrobials, showing greater sensitivity. These antimicrobial classes are widely used in the prophylaxis and therapy of diseases, however the high sensitivity suggests that not exert high selection pressure to
S. suis. In the MIC technique, antimicrobials showed low resistance, suggesting that they are due to the higher concentra-tions tested in this technique when compared with the antibiogram. These results demonstrate that amoxicillin and ceftiofur are less antimicrobial resistance profile, differing tetracycline and erythromycin which showed increased resistance to antimicrobials tested.
Keywords: resistence, swine, S. suis type 2, antibiogram, MIC. Descritores: resistência, suíno, S. suis tipo 2, antibiograma, CIM.
INTRODUÇÃO
Muitos patógenos acometem a suinocultura e causam diversos prejuízos. Dentre eles destaca-se o Streptococcus suis (S. suis) um micro-organismo emer-gente, responsável por causar meningite, septicemia, artrite, endocardite e pneumonia [10]. Ocasionalmente pode causar uma severa infecção sistêmica em humanos, contaminando pessoas que possuem contato com suínos infectados ou com a carne suína contaminada [8,22].
O S. suis tem distribuição mundial e é dividi-do em 35 tipos com base no polissacarídeo capsular, descritos de 1 ao 34 e ½. Sendo o tipo 2 considerado o mais patogênico e prevalente no mundo [9] e no Brasil [7,15]. As tonsilas de suínos sadios podem carrear o S. suis assintomaticamente [11], tornando esses ani-mais disseminadores do patógeno para suínos suscep-tíveis, levando a ocorrência de surtos, ocasionando morbidade e mortalidade [17].
A utilização de drogas antimicrobianas tanto para o tratamento quanto para a profilaxia demonstram efetividade no controle da infecção bacteriana. Vários antimicrobianos são utilizados com o intuito de reduzir a carga microbiana, sendo as penicilinas e amoxicilina os mais utilizados [9]. No entanto o uso amplo e indis-criminado desses fármacos induz a seleção de bactérias resistentes, e essa resistência pode ser cruzada entre as outras classes de antimicrobianos [19].
A análise in vitro da sensibilidade antimicrobia-na é importante para a utilização de uma droga adequada, auxiliando na diminuição da resistência aos antimicro-bianos [13]. O objetivo deste trabalho foi determinar o perfil de resistência e a concentração inibitória mínima a antimicrobianos de isolados de Streptococcus suis tipo 2 a partir de tonsilas de suínos no abate.
MATERIAIS E MÉTODOS
Coletas das amostras
Foram realizadas três coletas em frigoríficos com Inspeção Federal, sendo dois na região oeste e um da região sul do estado de Santa Catarina, em que foram coletadas tonsilas de 302 suínos e enviadas ao Centro de Diagnóstico Microbiológico Animal - CE-DIMA, sob refrigeração.
Isolamento bacteriano
No laboratório as tonsilas foram fragmentadas, adicionados 5 mL de água peptonada a 1% e
homo-geneizadas no equipamento Stomacher1 por quatro
minutos. O isolamento foi realizado em Agar Sangue Columbia (5% de sangue ovino). Posteriormente foi realizada a classificação como S. suis, pelas carac-terísticas morfotintoriais e bioquímicas da bactéria, como coloração de Gram, catalase com peróxido de hidrogênio, provas de fermentação dos açúcares: ma-nitol, trealose e lactose, e degradação do Agar Amido.
PCR
Os isolados de S. suis foram confirmados e tipificados para o tipo 2 através da reação em cadeia da polimerase, sendo um total de 219 isolados confir-mados como S. suis tipo 2. Após foram congelados para posterior realização dos testes de susceptibilidade.
Teste de susceptibilidade antimicrobiana
Dentre 219 amostras de S. suis tipo 2 con-geladas conseguiu-se recuperar 209, as quais foram submetidas ao teste de susceptibilidade aos antimi-crobianos mais utilizados a campo, através da técnica de Disco Difusão em Agar, de acordo com a CLSI [6]. As bactérias foram suspensas em solução salina 0,85% e a turvação foi comparada ao tubo 0,5 da escala de Mc Farland. Posteriormente foram semeadas em Agar Muller Hinton Sangue (5% de sangue ovino) com o auxílio de um suabe, e adicionados os discos de antimi-crobianos2: amoxicilina (10 µg), ampicilina (10 mcg),
ceftiofur (30 mcg), ciprofloxacina (5 µg), doxiciclina (30 mcg), enrofloxacina (5 mcg), eritromicina (15 µg), florfenicol (30 mcg), norfloxacina (10 µg), penicilina G (10 U) e tetraciclina (30 µg). As placas foram incu-badas em estufa bacteriológica a 37°C em aerobiose, por 18 a 24 h, após foi mensurado o diâmetro dos halos de inibição do crescimento bacteriano, determinando assim o perfil de sensibilidade ou resistência da bactéria ao antimicrobiano.
CIM
Devido o S. suis ser um micro-organismo fastidioso foi possível recuperar 117 amostras para re-alização deste teste. Para preparação da Concentração Inibitória Mínima (CIM) foi seguida a metodologia do CLSI [6], foram utilizadas placas de Agar Mul-ler Hinton com 5% de sangue ovino, nas diferentes concentrações antimicrobianas. Foram testados os seguintes antimicrobianos: amoxicilina3, doxicilina3,
enrofloxacina4 nas concentrações de 10, 20 e 30 µg
concentrações dos antibióticos foram selecionadas conforme o recomendado pela bula do medicamento, sendo assim concentração intermediária, e a partir desta utilizou-se uma dose menor, sendo a metade da dose recomendada e uma dose maior, sendo a metade mais a dose recomendada. Todas as concentrações foram diluídas 1000 vezes. Para os inóculos foram utilizadas culturas dos isolados com 24 h, diluídos em salina 0,85% até a turvação do tubo 0,5 da esca-la de Mc Faresca-land. Foram inocuesca-lados 2 µL em cada placa das diferentes concentrações antimicrobianas e incubados por 24 h em aerobiose a 37°C. Foram utilizadas as cepas Escherichia coli ATCC 25922 e Staphylococcus aureus ATCC 29213 como controle positivo da técnica.
RESULTADOS
Dos isolados 209 foram submetidos ao antibio-grama, os antimicrobianos que apresentaram maiores valores de resistência foram a tetraciclina (90,2%),
seguida da eritromicina (77%). A maioria das drogas obteve baixos níveis de resistência (<10%) como a amoxicilina, ceftiofur, enrofloxacina, ampicilina, do-xiciclina e florfenicol, quando comparadas às drogas norfloxacina, ciprofloxacina e penicilina, que apresen-taram maior resistência, entre 17-30,4% (Tabela 1).
Na realização do CIM, todos os 117 isolados foram sensíveis a amoxicilina e penicilina/espectino-micina em todas as concentrações testadas. Vinte e oito isolados obtiveram CIM > 10 µg, dois isolados CIM > 20 µg e um isolado CIM > 30 µg para doxiciclina. Para enrofloxacina sete isolados apresentaram CIM > 10 µg, no entanto, nas demais concentrações todos se demonstraram sensíveis.
Em 4/17 cepas (3,4%) demonstraram resis-tência a multidrogas (doxiciclina e enrofloxacina) nas concentrações de CIM >10 µg para ambos antimicro-bianos. E 74,3% (87/117) dos isolados demonstraram--se sensíveis a todos os antimicrobianos e em todas as concentrações testadas.
Tabela 1. Perfil de resistência aos antimicrobianos através do teste de antibiograma de S. suis tipo 2, isolados de tonsilas de suínos no abate,
coletadas em três frigoríficos da região oeste e sul de Santa Catarina, no período de março a julho de 2013.
Frigorífico Resistência aos antimicrobianos (%)
AMO AMP CTF CIP DOX ENO ERI FLF NOR PEN TET
Frigorífico 1 0 2,9 1 17 9,9 5,7 64,8 2,9 31 7,1 81,7
Frigorífico 2 0 6,8 3,4 22,1 0 3,4 74,6 5,1 27,2 32,3 95
Frigorífico 3 0 5,1 0 12,7 5,1 2,6 91,2 10,2 33 11,4 93,7
Total 0 5 1,5 17,3 5 3,9 76,9 6,1 30,4 17 90,2
AMO: Amoxicilina, AMP: Ampicilina, CTF: Ceftiofur, CIP: Ciprofloxacina, DOX: Doxiciclina, ENO: Enrofloxacina, ERI: Eritromicina, FLF: Florfenicol, NOR: Norfloxacina, PEN: Penicilina, TET: Tetraciclina.
DISCUSSÃO
A resistência aos fármacos é um importante problema em diversas áreas envolvidas com doenças infecciosas, como as enfermidades bacterianas, virais, parasitárias e fúngicas. Especialmente na bacteriologia destaca-se por alguns patógenos serem resistentes a uma ampla gama de classe antimicrobiana, sendo que alguns deles são sensíveis a apenas uma classe. Tudo isso se deve principalmente ao uso inadequado dos an-timicrobianos, sobretudo utilizados como promotores de crescimentos, que levam ao aumento da incidência de resistência bacteriana [21].
Sabidamente há uma grande diversidade de resistência entre os fármacos antimicrobianos.
Dessa forma, dentre as drogas testadas nesse estudo, a tetraciclina demonstrou ser a droga com maior percentual de resistência, sendo encontrados 90,2% (189/209) de isolados resistentes. Esses resultados condizem com um trabalho realizado na China, em que foi encontrado um alto nível de resistência por meio da técnica de CIM, em que 91,7% dos isolados de animais clinicamente saudáveis demonstraram-se resistentes [23]. Outros trabalhos realizados no Brasil [2,14] demonstraram, pela técnica do antibiograma, que 81,2% e 85,7% dos isolados foram resistentes a tetraciclina, respectivamente. Através da técnica de MIC foi detectado que 85,3% das amostras somente foram inibidas entre as concentrações de 64 e 128 µg/
mL da tetraciclina, demonstrando-se um antibiótico com alta resistência [16].
Esse alto grau de resistência à tetraciclina encontrado neste estudo (90,2%) pode ser explicado pelo seu uso na prevenção e tratamento de doenças, sem um controle efetivo. Este hábito é amplamente utilizado, com o intuito de promover aumento sig-nificativo no desempenho dos animais. No entanto podem ocorrer erros, levando a subdosagens dos antimicrobianos que propiciam a seleção de cepas resistentes, além do risco, do aparecimento de resí-duos do medicamento nas carcaças [18]. A doxici-lina, mesmo pertencendo ao grupo das tetraciclinas, evidenciou índices de resistências bem inferiores no teste do antibiograma com apenas 5% das amostras resistentes. Já pela técnica de MIC 28/117, 2/117 e 1/117 isolados demonstraram-se resistentes nas concentrações 10, 20 e 30 µg, respectivamente a este fármaco. Mesmo assim, divergiu de outro es-tudo que apresentou 79% de resistência na técnica de CIM [12].
Evidenciou-se alto nível de resistência a eritromicina, em que 76,9% (161/209) dos isola-dos foram resistentes. O resultado encontrado foi semelhante aos estudos realizados na China, em que se obteve 67,2% e 67,9% de cepas resistentes a este antimicrobiano [23, 4], respectivamente. A resistência desta droga é sugerida decorrente da sua utilização como promotora de crescimento ou do uso de dosagens inferiores que as terapêuticas recomendadas para o tratamento [20]. Estudou-se a relação do uso in vivo de diferentes concentrações de antimicrobianos com o surgimento de resistência de S. suis in vitro, observou que ao passar do tempo em dosagens baixas ocorreu resistência do micro--organismo a eritromicina [5].
Mesmo com a proibição do uso das tetracicli-nas e da eritromicina, como promotor de crescimento, não se pode descartar a influencia delas nos índices de resistência [20]. A doxiciclina mesmo pertencendo ao grupo das tetraciclinas, ao contrário da tetraciclina teve baixa resistência. Este dado pode estar relacionado ao fato, da menor utilização da doxiciclina nos rebanhos, como promotora de crescimento e até mesmo na forma terapêutica.
Neste estudo observou-se uma grande sensibi-lidade ao grupo dos β-lactâmicos (amoxicilina, ampici-lina, ceftiofur e penicilina), quinolonas (ciprofloxacina,
enrofloxacina e norfloxacina) e florfenicol. De acordo com a susceptibilidade das quinolonas, apenas a nor-floxacina teve níveis pouco superiores de resistência de 30,4%. Neste país também foi encontrada resistência a este antimicrobiano, porém superior a este estudo, em que 75% das amostras demonstraram-se resistentes [14]. Condizendo com os resultados deste trabalho, outros estudos encontraram alta sensibilidade aos β-lactâmicos [1], aos β-lactâmicos e ao florfenicol [12], aos β-lactâmicos e a enrofloxacina (>89%) [20]. Em um estudo recente na Bélgica, relatou-se alta sensibi-lidade ao florfenicol e a enrofloxacina [3]. Apesar de esses antimicrobianos serem utilizados amplamente na profilaxia e terapia de enfermidades, a alta sensibili-dade sugere que não exercem alta pressão de seleção ao S. suis [20].
Mesmo com baixos índices de resistência ao ceftiofur (1,5%), cabe ressaltar que este antimicro-biano é administrado no tratamento de enfermidades relacionadas ao S. suis em suínos doentes. Entretanto deve ser realizado com cautela, pois as cefalosporinas de terceira geração têm sido utilizadas como drogas de primeira linha nas terapias humanas de meningites [23].
No geral os antimicrobianos obtiveram baixa resistência na técnica da CIM, isso pode ser explicado devido às concentrações utilizadas serem maiores, comparadas com as do antibiograma.
CONCLUSÃO
Os resultados demonstram que a amoxicilina e o ceftiofur são os antimicrobianos com menor perfil de resistência, diferindo da tetraciclina e eritromicina que apresentaram maior resistência aos antimicrobia-nos testados.
SOURCES AND MANUFACTURERS
1Stomacher Lab-Blender MK 1204, ITR Ltd., Esteio, RS, Brazil.
2Laborclin®, Pinhais, Brazil. 3Farmabase®, Jaguariúna, Brazil. 4Bayer®, São Paulo, Brazil. 5Novartis®, São Paulo, Brazil.
Declaration of interest. The authors report no conflicts of
interest. The authors alone are responsible for the content and writing of the paper.
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