UNIVERSIDADE FEDERAL DO PARÁ
PRÓ-REITORIA DE PESQUISA E PÓS-GRADUAÇÃO DEPARTAMENTO DE PESQUISA
PROGRAMA INSTITUCIONAL DE BOLSAS DE INICIAÇÃO CIENTÍFICA – PIBIC CNPq e PIBIC UFPA
RELATÓRIO TÉCNICO – CIENTÍFICO
Período: Agosto/2014 a Julho/2015
( ) PARCIAL (X) FINAL
IDENTIFICAÇÃO DO PROJETO
Título do Projeto de Pesquisa (ao qual está vinculado o Plano de Trabalho): A DEPENDÊNCIA AO ESTUÁRIO É UMA RESTRIÇÃO AO FLUXO GÊNICO ENTRE POPULAÇÕES DE PEIXES? UM ESTUDO NA COSTA NORTE BRASILEIRA
Nome do Orientador: Horacio Schneider Titulação do Orientador: Doutor
Unidade: Instituto de Estudos Costeiros (IECOS) – Campus de Bragança
Título do Plano de Trabalho:
CERTIFICAÇÃO MOLECULAR DE FILÉS DE PEIXES
Nome do Bolsista: Juliet Figueiredo Gonçalves de Souza
INTRODUÇÃO
Peixes são reconhecidos como uma importante fonte de nutrientes para o consumo humano. Estudos recentes têm demonstrado que a ingestão deste recurso alimentar com maior frequência está associado a uma melhor qualidade de vida (SARTORI et al., 2012). Com isto, a produção mundial de pescado proveniente tanto da pesca extrativa quanto da aquicultura tem crescido nos últimos anos. Segundo dados do Ministério da Pesca e Aquicultura (MPA, 2011), atualmente os principais mercados são: China com aproximadamente 63,5 milhões de toneladas por ano (mt/a); Indonésia com 11,7 mt/a; Índia com 9,3 mt/a e o Japão com cerca de 5,2 mt/a. Neste cenário, o Brasil contribuiu com cerca de 1,2 milhões de toneladas, que corresponde a 0,75% da produção mundial.
Em consequência do aumento da procura e consumo de pescados, o comércio mundial de produtos pesqueiros atingiu em 2012 de cerca de 130 mil milhões dólares (FAO, 2014). Este crescimento do mercado pesqueiro está associado à atual comodidade oferecida ao cliente, graças ao processamento do pescado. O processamento do pescado é feito de forma sistêmica, pois o peixe é eviscerado, tendo sua cabeça e cauda removidas e sua carcaça passa por um processo de lavagem para minimizar a contaminação. Posteriormente é realizada a remoção do filé (SOUZA, 2003; ARGENTA, 2012).
O processamento do pescado permite a extensão do período de conservação deste produto para fins alimentícios, o que proporciona que tais produtos alcancem mercados mais distantes. Além disto, gera maior valor financeiro agregado, pois os filés são comercializados a preços mais elevados que o peixe in natura.
Uma consequência importante do processamento do pescado é que o reconhecimento taxonômico das espécies pelos consumidores e orgãos reguladores fica extremamente prejudicado, já que a maioria dos caracteres diagnósticos são removidos durante o processo de filetagem. Desta forma, os rótulos destes gêneros alimentícios devem apresentar, sem nenhuma restrição, todas as informações necessárias para identificação do produto
comercializado. Entretanto, estudos recentes tem relatado casos de fraudes dos filés de peixes comercializados (MARKO et al., 2004; WARNER et al., 2012; De BRITO et al., 2015). Portanto, a autenticidade destes produtos tornou-se um problema, pois a embalagem é rotulada como sendo de uma determinada espécie, entretanto, dentro da embalagem os filés são de outra espécie. Tais substituições podem ocorrer de forma intencional ou acidental (VELOSO et al., 2002).
A substituição acidental geralmente ocorre quando as espécies em questão são muito similares morfologicamente. Enquanto, a substituição intencional ocorre para gerar benefícios econômicos as empresas realizam o processamento de filetagem, pois geralmente a substituição ocorre por um peixe de qualidade inferior ou de valor comercial mais baixo.
Uma alternativa na identificação das espécies é a utilização de sequências de DNA. Atualmente marcadores moleculares, a partir de fragmentos de DNA têm sido amplamente utilizados para tais fins (VENEZA et al., 2014, De BRITO et al., 2015).
Neste contexto, investigamos os filés rotulados como “Pescada Amarela” (figura 1), conhecida popularmente como pescada amarela vendidos em supermercados no nordeste paraense. A pescada amarela (Cynoscion acoupa) é amplamente distribuída no oceano Atlântico Ocidental desde o Panamá até a Argentina (Figura 2). Possuem corpo alongado, prateado no dorso, amarelado no ventre e nadadeiras. O comprimento total dos indivíduos adultos é de 51 a 125 cm (MATOS E LUCENA, 2006; MOURÃO, 2007). É um dos peixes mais apreciados na costa norte brasileira. Estimativas sugerem que aproximadamente 19% dos peixes desembarcados na costa norte do Brasil, seja C. acoupa (MOURÃO et al., 2009).
Figura 1. Indivíduo da espécie Cynoscion acoupa (Pescada Amarela). Fonte: MPA.
Figura 2. Mapa da distribuição de Cynoscion acoupa. (Fishbase, 2015).
OBJETIVO
Verificar se os filés rotulados como Pescada amarela comercializados em supermercados de Belém, Pará realmente correspondem à espécie
Cynoscion acoupa.
MATERIAL E MÉTODOS
Para o presente estudo foram feitas análises de 28 amostras de filés de pescada amarela, vendidos congelados em diferentes supermercados de Belém no período de 7 meses, de dezembro de 2014 a junho de 2015. Foram comprados diferentes lotes com 500 gramas cada, de uma única empresa (“a”),
que possuíam em média seis pedaços de filés em cada lote. Cada pedaço foi considerado uma amostra individual. De cada peça de filé foi separado um pequeno pedaço de tecido de uma região mais interna, a fim de evitar contaminação por contato com outra amostra, e tais sub-amostras foram conservadas em álcool 70%.
As extrações do DNA total foram realizadas com o auxílio do Kit Wizard
Genomic® Promega, seguindo instruções do fabricante. Após a extração do
DNA, as amostras foram submetidas à eletroforese de 30 minutos por 70 volts, em gel de agarose 1% com o corante GelRed.
A amplificação da região genômica foi realizada por meio da técnica de Reação em Cadeia da Polimerase (PCR). A partir do DNA total foi amplificada um fragmento do rRNA 16S com primers descritos por PALUMBI et al. (1991) (Tabela 1). As reações de PCR foram realizadas com volume final de 25 µl contendo os seguintes reagentes: 4 µl de DNTPs (1,25 mM); 2,5 µl de solução tampão (10X); 1 µl de solução de MgCl2 (25mM); 2,0 µl de DNA; 1,0 µl de cada
primer; 0,10 µl da enzima Taq polimerase (5U/µl), e água bidestilada estéril
para completar o volume final da reação.
O protocolo de amplificação utilizado foi o seguinte: desnaturação inicial de 95º C por 4 minutos, em seguida 30 ciclos de desnaturação de 95º C a 30 segundos, hibridação dos iniciadores a 65º C por 30 segundos e extensão a 72º C por 30 segundos. Por fim foi feita uma extensão final de 72º C durante 5 minutos. Os produtos de amplificação da PCR foram submetidos à reação de sequenciamento de DNA com o Kit Big Dye Terminator Cycle Sequencing
Reading Reaction (Applied Biosystems), seguindo-se de eletroforese no
sequenciador automático ABI 3500 (Applied Biosystems).
As sequências de DNA obtidas após o sequenciamento foram alinhadas automaticamente pelo programa CLUSTALW (THOMPSON, 1994), implementado no programa BioEdit versão 7.2 (HALL, 1999). As sequências foram submetidas ao banco de dados público GenBank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/) mais especificamente no Basic Local
Alignment Search Tool (BLAST) para comparação com sequências já
depositadas. Além disto, utilizamos algumas destas sequências depositadas no GenBank, como os seguintes códigos de acesso: AY603011; JX903970;
JX903967; AY603013; KC208695; KC208694; JX903966; AY603010; KM508065; FJ025974.
Tabela 1. Primers utilizados.
Primer Sequência
16S-L 5’-GCCTCGCCTGTTTACCAAAAAC-3’
16S-H 5’-CCGGTCTGAACTCAGATCACG-3’
No software MEGA 6.0 (TAMURA et al., 2013) realizamos uma matriz de divergência nucleotídica, utilizando o modelo Kimura 2P e uma árvore filogenética com o método de agrupamentos de vizinhos, também com o modelo Kimura 2P e 1000 réplicas de bootstrap.
RESULTADOS E DISCUSSÃO
O sequenciamento do fragmento do rRNA 16S gerou uma sequência de 580 pares de bases (pb). Todas as amostras possuíam o mesmo haplótipo (mesma sequência de DNA). Este fragmento foi submetido ao Blast no
GenBank e obtivemos um resultado de 100% de similaridade com as
sequências de Cynoscion virescens depositadas. Desta forma, podemos afirmar que as postas de peixe nos pacotes são de uma outra espécie e não condiziam com a espécies rotulada e comercializada.
A análise de divergência genética demonstra uma pequena distância entre as espécies, menor que 0.5% entre as espécies do gênero Cynoscion (Tabela 2). Na análise filogenética observou-se que as amostras de filés que coletamos agrupam com a espécie C. virencens. Enquanto, C. acoupa é grupo irmão do clado C. reticulatus – C. jamaicensis (Figura 3).
C. virescens é uma corvina de porte médio, bastante diferente
morfologicamente de C. acoupa (Figura 3). Isto minimiza a possibilidade de substituição acidental dos filés, ou seja, uma substituição causada por similaridade morfológica.
Tabela 2. Distância genética de um fragmento do rRNA 16S para espécies da família Sciaenidae. 1 2 3 4 1 C. virescens 2 C. acoupa 0.043 3 C. leiarchus 0.048 0.036 4 C. reticulatus e jamaicensis 0.040 0.044 0.043 5 P. squamosissimus 0.053 0.054 0.057 0.056
Figura 3. Relação filogenética entre espécies da família Sciaenidae baseadas em um fragmento do rRNA 16S com o método de agrupamento de vizinhos.
Dentre as espécies da família Sciaenidae, a pescada amarela é a espécie de maior valor comercial (Tabela 3). A diferença de preço entre a pescada amarela e as demais espécies da família que são comerciais pode chegar a 100%. Segundo dados do DIEESE, o preço médio do quilo da pescada amarela entre os meses de outubro de 2014 e fevereiro de 2015 foi R$ 14,71 enquanto a corvina custava R$ 9,41 no mesmo período. Com isso, há um prejuízo considerável aos consumidores, pois com a substituição, a corvina
está sendo vendida pelo valor da pescada amarela, e a margem de lucro é de 56% a mais do que o preço de mercado.
Tabela 3. Preço médio em reais do pescado inteiro comercializados em Belém (DIEESE/Pará, 2015).
Tipo de Pescado out/14 nov/14 dez/14 jan/15 fev/15 Pescada amarela 12,80 14,16 14,57 15,94 16,15
Corvina 8,17 - 8,27 10,46 10,77
Pescada Branca 8,68 7,52 8,86 10,81 10,97
Pescada gó 8,21 8,77 8,87 10,70 10,31
Neste caso especifico, o fato de duas ou mais espécies possuírem o mesmo nome popular não pode ser considerado um o motivo plausível para a substituição. Cynoscion acoupa é conhecida apenas por pescada amarela e é a única espécie da família Sciaenidae que possui essa denominação popular em qualquer área geográfica da costa brasileira (OLIVEIRA, 2005; BARBOZA, 2006; MORAES, 2008). Além disto, na listagem do Instituto Brasileiro do Meio Ambiente e dos Recursos Naturais Renováveis (IBAMA) C. acoupa também é conhecida como pescada amarela (IBAMA, 2007). Segundo o Ministério da Pesca e Aquicultura, C. virescens é conhecida popularmente por Pescada-cambuçu ou Pescada-cururuca.
Os resultados do presente estudo revelaram índice total de substituição de uma espécie comercializada na forma de filés, e isto acarreta prejuízos econômicos, ambientais e até mesmo de saúde pública. Na questão econômica, o consumidor é prejudicado pois paga mais caro por um produto que te menor valor comercial. Resultados similares estão sendo demonstrados em diversas partes do mundo (Von Der HEYDEN et al. 2010; GALAL-KHALLAF et al., 2014; De BRITO et a., 2015;), o que sugere que esta é uma pratica recorrente e generalizada entre diversas empresas de processamento de pescados.
Em relação à questão de saúde, destaca-se que a substituição de peixe pode ser preocupante quando a espécie vendida contém substâncias nocivas ao ser humano que a rotulada não conteria. WARNER et al (2012) detectou que o pargo-vermelho (Lutjanus) foi substituído por Lopholatilus
chamaeleonticeps, que de acordo com o Food and Drug Administration (FDA)
estava proibido à comercialização devido conter alto teor de mercúrio. Outra preocupação é a substituição de peixes selvagens por peixes de viveiros, pois podem conter antibióticos e corantes que prejudicam a saúde humana.
As substituições também podem gerar graves problemas ambientais e a biodiversidade, pois talvez haja uma sobrepesca de determinada espécie que não constará em estatísticas pesqueiras oficiais, mascarando assim a real situação de algumas espécies. MARKO et al (2004) abordaram esta questão no artigo em que demonstraram que 70% dos filés comercializados nos Estados Unidos como sendo do pargo vermelho Lutjanus campechanus eram na realidade de outras espécies da família Lutjanidae.
CONCLUSÃO
Filés rotulados como Pescada amarela comercializados em supermercados de Belém, Pará, obtidas no periodo de dezembro de 2014 a junho de 2015, e fornecidos pela empresa “a” não correspondem à espécie
Cynoscion acoupa como era especificado na embalagem de comercialização.
Esses dados sugerem substituição intencional, com a finalidade de obter maior retorno financeiro, uma vez que a substituição ocorreu por uma espécie de menor valor comercial e que é pouco similar morfologicamente com C. acoupa. Tais substituições podem resultar em problemas econômicos, mascarar as estatísticas de pesca e comercialização das espécies. Além disso, podem causar problemas à saúde humana. Diante destes fatos faz-se necessário uma maior fiscalização a esta prática comercial.
REFERÊNCIAS
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PARECER DO ORIENTADOR:
A bolsista Juliet Gonçalves desenvolveu seu plano de trabalho como estava previsto originalmente. Trata-se de um projeto de Genética Forense, que terá continuidade no período 2015-2016, e a mesma está se dedicando com muito afinco ao aprendizado da metodologia genética, que não é trivial.
Os resultados apontaram para 100% de fraude na rotulagem de filés comercializados por uma única empresa (por questões éticas não identificada), então para o próximo período de bolsa, será feita uma análise mais abrangente em produtos de várias empresas de filetagem de peixes.
DATA : 10/08/2015
_________________________________________ Prof. Horacio Schneider
