TESE DE DOUTORADO
ATIVIDADE INSETICIDA E MECANISMOS DE AÇÃO DE
LECTINAS DE Myracrodruon urundeuva CONTRA Nasutitermes
corniger, Aedes aegypti E Sitophilus zeamais
THIAGO HENRIQUE NAPOLEÃO
ORIENTADORA: Profª Dra. PATRÍCIA MARIA GUEDES PAIVA
RECIFE 2012
THIAGO HENRIQUE NAPOLEÃO
ATIVIDADE INSETICIDA E MECANISMOS DE AÇÃO DE
LECTINAS DE Myracrodruon urundeuva CONTRA Nasutitermes
corniger, Aedes aegypti E Sitophilus zeamais
ORIENTADORA: Profª Dra. PATRÍCIA MARIA GUEDES PAIVA
RECIFE 2012
“Atividade inseticida e mecanismos de ação de lectinas de Myracrodruon
urundeuva contra Nasutitermes corniger, Aedes aegypti e Sitophilus
zeamais”
Tese apresentada para o
cumprimento parcial das exigências
para obtenção do título de Doutor em
Bioquímica e Fisiologia pela
Universidade Federal de Pernambuco.
Aprovado por:
______________________________________________
Profa. Dra. Patrícia Maria Guedes Paiva
Presidenta
______________________________________________
Profa. Dra. Luana Cassandra Breitenbach Barroso Coelho
______________________________________________
Profa. Dra. Maria Tereza dos Santos Correia
______________________________________________
Profa. Dra. Daniela Maria do Amaral Ferraz Navarro
______________________________________________
Prof. Dr. Roberto Araújo Sá
Dedico esta Tese aos meus pais, aos meus irmãos, a toda minha família e a todos os meus amigos, por serem a minha razão e inspiração. para seguir sempre em frente.
A Deus, por me presentear com mais esta oportunidade de evolução neste planeta, pela família a qual me confiou, pelos amigos maravilhosos que recruta para acompanharem minha jornada, pela inspiração de serenidade nos momentos necessários, pelos caminhos que me são apresentados, pelas “dificuldades” encontradas, pelos desafios, pelos sonhos realizados, pela esperança mantida, enfim, por tudo e todas as coisas.
Aos meus pais, Rosângela e Luiz Carlos, pelo amor, carinho, paciência, apoio e incentivo; por me compreenderem e apoiarem sempre meus objetivos; pelos valores ensinados; pelo desafio diário e por toda dedicação com que cuidaram e cuidam de mim. Aos meus irmãos Daniella e Guilherme, pelo amor e convívio; pelos desafios enfrentados juntos; pelas tantas emoções divididas; pelo companheirisimo e pela presença e apoio sempre; por compartilharem a imaginação, as invenções e os sonhos; pela paciência e compreensão; por fazerem a minha vida mais alegre, divertida e preciosa; enfim, por tudo.
A toda minha família pelo amor, incentivo e confiança; à minha avó Irani e meu avô Alcides, pelos ensinamentos e por todo amor, cuidado, carinho e incentivo transmitidos; à minha bisavó, Maria de Lourdes (in memorian), pelo exemplo, pelo carinho e por todo o tempo em que iluminou nossas vidas e que hoje continua iluminando a todos lá de cima; às minhas tias Anita, Elisabete, Raquel e Sandra e ao meu tio Roberto por sempre acreditarem em mim e por todo carinho, apoio e incentivo constantes; aos meus primos Ilka, Talys e Tacianna, pelo carinho e pela convivência harmoniosa e divertida.
À professora Patrícia Paiva, pelos imensuráveis apoio, estímulo, dedicação, exemplo, amizade e orientação durante toda a Graduação, Mestrado e Doutorado. E pela confiança e batalha incessante para me ajudar a alcançar meus objetivos.
À minha amiga Nataly, pela amizade inabalável e sincera; por toda consideração e toda confiança; pela sua imensa alegria que, infalivelmente, contagia e coloca pra cima em
anos de trabalho; pelo olhar vibrante e lindo sorriso; pela cumplicidade; por me honrar com sua amizade e por todo apoio.
Ao meu amigo Francis, pelo companheirismo, pela confiança, e pela amizade; por toda sua dedicação e competência nos experimentos dessa Tese e ao longo de toda a jornada acadêmica desde nossa Graduação.
Ao meu amigão Emmanuel, por ser uma luz em minha vida; pela sua compreensão, gentileza, lealdade e generosidade; pela enorme paciência, por sua sinceridade e honestidade; por me ajudar a crescer e ser a cada dia uma pessoa melhor; pelo seu ombro e amigo e seu sorriso com os quais posso sempre contar; por acreditar em minhas idéias e meus sonhos, me estimular e me ajudar a executá-los; pelo seu apoio inestimável nos experimentos realizados para essa Tese e em tantos outros mais; enfim, por presentear meu coração com sua amizade.
À minha amiga Lidiane, pelo carinho e pela compreensão tão preciosos; pelo apoio e pela mão amiga e gentil; pela paciência; pela doce companhia em tantos momentos importantes; enfim, pela sua amizade tão importante para mim.
À minha amiga Thâmarah, pelo imenso carinho, confiança e incentivo; pelo entusiasmo de sempre e pela força em momentos difíceis; pela sua imensa dedicação, pela sua compreensão e por embarcar comigo e a professora Patrícia em nossas aventuras pelo mundo da Bioquímica.
Às queridas amigas Luciana, Tati, Thamara, Maiara, Kézia e Belany, pelo carinho, apoio e incentivo, por embelezarem, suavizarem e alegrarem meu dia-a-dia. Ao meu amigo Afonso, pela amizade extremamente agradável, pelo companheirismo, por sua gentileza e por todo apoio. Aos amigos e alunos Bernardo e Lívia, por todo apoio e pela confiança e paciência; por me proporcionarem o exercício e desenvolvimento de importantes etapas. Aos
A todos os amigos que fazem ou fizeram parte do Laboratório de Glicoproteínas durante esses sete anos de convivência, em especial: Giselly, Fernando, Michele, Igor, Priscila, Dalila, Kaleen, Erika, Andréa Sales, Chrisjacele, Idila, Léo, Carlos Bob, Felipe, Regina, Rodrigo, Adriana, Lucíola, Ana Luiza, Juliene, Cris, Vanessa, Mariana, Andréa Santos, Raiana, Mary, Cássia, Mychely, Larissa, Amanda, Cynarha, Marília, Mércia, Carina e Mariana “Reflita!”. Minha gratidão por todo carinho e consideração, sempre.
A todos os demais amigos, de todos os lugares e épocas: Lígia, Inabelle, João, Edson, Carla, Carol, Paulo, Syllas, Breno, Thiago Buonafina, Artur, Sheila, Meyriene, e todos os demais.
Às professoras Luana Coelho, Tereza Correia do Departamento de Bioquímica da UFPE pelo apoio, incentivo, confiança e consideração. À professora Márcia Vanusa, também do Departamento de Bioquímica, pelo apoio, incentivo e imenso esforço dedicados. Ao professor Roberto Sá, do Centro Acadêmico do Agreste da UFPE, pela amizade, incentivo e confiança, por me introduzir na vida científica e por tudo que proporcionou para o meu crescimento como pessoa e pesquisador. À professora Daniela Navarro, do Departamento de Química Fundamental da UFPE, pela disponibilidade, simpatia, exemplo e por sempre abrir com tanta alegria as portas de seu laboratório e de sua sala para nos receber e nos orientar.
Aos demais professores e funcionários do Departamento de Bioquímica da UFPE, em especial Maria Reis, João Virgínio, Neide, Miron, Djalma e professor Ranilson. À professora Vera Menezes, e novamente à professoa Patrícia, por toda dedicação e esforço na coordenação do Programa de Pós-Graduação em Bioquímica e Fisiologia da UFPE durante seus respectivos mandatos.
financeiro para realização dos trabalhos desta Tese
À Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) pela concessão de Bolsa de Estudos através do Programa de Fomento à Pós-Graduação (PROF), durante meu Curso de Doutorado.
“Nenhum caminho é longo demais quando amigos nos acompanham”. (Autor desconhecido) “Aprende – humildemente Ensina – praticando Administra – educando Obedece – prestativo Ama – edificando Teme – a ti mesmo Sofre – aproveitando Fala – construindo Ouve – sem malícia Ajuda – elevando Ampara – levantando Passa – servindo Ora – serenamente Pede – com juízo Espera – trabalhando Crê – agindo Confia – vigiando Recebe – distribuindo Atende – com gentileza Coopera – sem apego Socorre – melhorando Examina – salvando Esclarece – respeitoso Semeia – sem aflição Estuda – aperfeiçoando Caminha – com todos Avança – auxiliando Age – no bem geral Corrige – com bondade Perdoa – sempre”. André Luiz (psicografia de Chico Xavier)
entrecasca (MuBL) e do cerne (MuHL) da aroeira-do-sertão (Myracrodruon urundeuva) foram agentes inseticidas contra operários e soldados de Nasutitermes corniger (MuHL) e larvas de Aedes aegypti (MuBL e MuHL). A presente Tese descreve a purificação da lectina de folha de M. urundeuva (MuLL), a atividade termiticida de MuBL e MuLL sobre N.
corniger, a atividade larvicida de MuLL sobre larvas de A. aegypti no quarto estágio (L4), o efeito de MuLL sobre o gorgulho do milho (Sitophilus zeamais) e o estudo dos potenciais mecanismos de ação inseticida. O procedimento de purificação de MuLL incluiu extração de proteínas das folhas com NaCl 0,15 M, precipitação com sulfato de amônio e cromatografia em coluna de quitina. MuLL foi caracterizada quanto ao perfil eletroforético em condições nativas e desnaturantes, bem como quanto ao efeito de carboidratos, temperatura e pH sobre a atividade hemaglutinante. Ensaio de determinação da atividade termiticida de MuBL e MuLL foi realizado em placas de Petri contendo discos de papel de filtro impregnados com diferentes quantidades de lectina. Quanto aos mecanismos de ação sobre os cupins, foram investigados a resistência das lectinas à degradação proteolítica e os efeitos das mesmas sobre bactérias simbiontes do trato intestinal. Para determinação da atividade larvicida contra A.
aegypti, larvas L4 foram incubadas por 24 h em soluções contendo diferentes concentrações do extrato de folhas ou de MuLL isolada. A resistência de MuLL à proteólise e o efeito da lectina sobre as atividades de enzimas digestivas (proteases, tripsina e α-amilase) das larvas foram investigados. Para determinação da atividade inseticida contra S. zeamais adultos o extrato ou MuLL foram incorporados a discos de farinha de trigo que serviram como dieta para os insetos durante 7 dias. Os parâmetros avaliados foram sobrevivência, índice de deterrência alimentar, taxa de consumo relativo, taxa de crescimento relativo, eficiência na conversão do alimento ingerido e atividades de enzimas digestivas (proteases, tripsina, celulases, fosfatases e α-amilase). MuLL, uma lectina ligadora de quitina, é um polipeptídeo catiônico, glicosilado, de massa molecular 14,2 kDa cuja atividade hemaglutinante é inibida por glicoproteínas e estável ao aquecimento a 100 °C e em ampla faixa de pH. Atividade termiticida foi detectada para MuBL (CL50 de 0,974 mg/mL sobre operários e 0,787 mg/mL
sobre soldados) e MuLL (CL50 de 0,374 mg/mL sobre operários e 0,432 mg/mL sobre
soldados). As atividades hemaglutinantes de MuBL, MuHL e MuLL foram resistentes a extratos de intestino de N. corniger contendo atividade de tripsina e as três lectinas apresentaram ação bacteriostática (concentração mínima inibitória de 62,5 µg/mL para bactérias de operários e 125 µg/mL para bactérias de soldados). MuBL e MuHL foram agentes bactericidas mais eficientes sobre simbiontes de operários (concentração mínima bactericida de 125 µg/mL) do que MuLL (250 µg/mL), enquanto as três lectinas apresentaram atividade bactericida similar sobre as bactérias do intestino dos soldados (concentração mínima batericida de 250 µg/mL). O extrato de folhas e MuLL foram larvicidas contra A.
aegypti com CL50 de 10,9 e 0,202 mg/mL, respectivamente. Estes resultados indicam MuLL
como princípio ativo do extrato de folhas. MuLL foi resistente a hidrólise pelas enzimas do intestino das larvas, inibiu a atividade proteolítica total e de tripsina (Ki: 2,8 µM) e estimulou
a atividade de α-amilase das larvas. O extrato de folhas matou S. zeamais (CL50 de 72,4 mg de
proteínas/g de farinha de trigo) e apresentou efeito deterrente alimentar moderado enquanto MuLL apenas exerceu forte efeito deterrente (índices de deterrência de 82% a 91% em concentrações de 45 a 150 mg/g). A toxicidade do extrato e o efeito deterrente de MuLL resultaram em perda de biomassa pelos insetos, o que foi refletido em valores negativos para as taxas de crescimento relativo e eficiências de conversão do alimento ingerido. As atividades de proteases, tripsina, fosfatase ácida e amilase em extratos do intestino de adultos alimentados com dieta contendo o extrato ou a lectina foram significativamente (p<0,05)
MuBL e MuLL como potenciais candidatos a inseticidas biodegradáveis para controle de N.
corniger, A. aegypti e S. zeamais; (2) resistência das lectinas ao ambiente proteolítico do intestino de N. corniger e A. aegypti; (3) modulação de atividades de enzimas digestivas do intestino de insetos pelas lectinas; (4) atividade antibacteriana de MuHL, MuBL e MuLL sobre microorganismos intestinais simbiontes de N. corniger; (5) atividade inseticida contra
N. corniger e A. aegypti por ingestão das lectinas e contra S. zeamais por rejeição da dieta contendo MuLL. A Tese contribui para o “estado da arte” no estudo da atividade inseticida de lectinas, fornecendo os primeiros dados para a compreensão dos mecanismos envolvidos nos efeitos deletérios exercidos por estas proteínas sobre N. corniger, A. aegypti e S. zeamais. Palavras-chaves: Myracrodruon urundeuva; lectina; Nasutitermes corniger; Aedes aegypti;
(MuBL) and heartwood (MuLL) of the “aroeira-do-sertão” (Myracrodruon urundeuva) were insecticidal agents against workers and soldiers of Nasutitermes corniger (MuHL) and Aedes
aegypti larvae (MuBL and MuHL). This Thesis describes the purification of M. urundeuva leaf lectin (MuLL), the termiticidal activity of MuBL and MuLL against N. corniger, the larvicidal activity of MuLL on A. aegypti larvae in the fourth stage (L4), the effect of MuLL on the maize weevil (Sitophilus zeamais), and the study of the potential mechanisms of insecticidal action. The MuLL isolation procedure included extraction of leaf proteins with 0.15 M NaCl, precipitation with ammonium sulphate and chromatography on chitin column. MuLL was characterized for electrophoresis profile on native and denaturing conditions, as well as for the effect of carbohydrates, temperature and pH in hemagglutinating activity. Assay for determination of termiticidal activity of MuBL and MuLL was performed on Petri dishs containing filter paper disks impregnated with different amounts of lectin. Regarding the mechanisms of action on termites, it was investigated the resistance of lectins to proteolytic degradation and their effects on symbiotic bacteria from intestinal tract. To determine the larvicidal activity against A. aegypti, L4 larvae were incubated for 24 h in solutions containing different concentrations of leaf extract or isolated MuLL. The MuLL resistance to proteolysis and its effect on the activity of digestive enzymes (proteases, trypsin and α-amylase) of larvae were investigated. For determination of insecticidal activity against
S. zeamais, the extract or MuLL was incorporated to wheat flour disks that served as diet for the insects during 7 days. The parameters evaluated were survival, feeding-deterrence index, relative consumption rate, relative growth rate, efficiency in conversion of ingested food, and activities of digestive enzymes (proteases, trypsin, cellulases, phosphatases and α-amylase). MuLL, a chitin-binding lectin, is a cationic and glycosylated polypeptide with molecular mass 14.2 kDa, which hemagglutinating activity is inhibited by glycoproteins and stable towards heating at 100 °C and broad pH range. Termiticidal activity was detected for MuBL (LC50 of
0.974 mg/mL on workers and 0.787 mg/mL on soldiers) and MuLL (LC50 of 0.374 mg/mL on
workers and 0.432 mg/mL on soldiers). The hemagglutinating activities of MuBL, MuHL and MuLL were resistant to N. corniger gut extracts containing trypsin-like activity and the three lectins showed bacteriostatic action (minimal inhibitory concentrations of 62.5 µg/mL on worker’s bacteria and 125 µg/mL on soldier’s bacteria). MuBL and MuHL were bactericide agents more effective on worker’s symbionts (minimal bactericide concentration of 125 µg/mL) than MuLL (250 µg/mL) while the three lectins showed similar bactericide activity on bacteria from soldier gut (minimal bactericide concentration of 250 µg/mL). M. urundeuva leaf extract and MuLL were larvicidal against A. aegypti with LC50 of 10.9 and 0.202 mg/mL,
respectively. These results indicate MuLL as active principle of leaf extract. MuLL was resistant to hydrolysis by larval gut enzymes, inhibited total protease and trypsin (Ki: 2.8 µM)
activities and stimulated α-amilase activity. Leaf extract killed S. zeamais (LC50 of 72.4 mg of
proteins per g of wheat flour) and showed moderate feeding-deterrent effect while MuLL only exerted strong deterrent effect (feeding-deterrence indices from 82% to 91% in concentrations of 45 to 150 mg/g). The extract toxicity and MuLL feeding-deterrent effect resulted in loss of biomass by insects, which was reflected in the negative values for relative growth rates and effciencies in conversion of ingested food. The protease, trypsin-like, acid phosphatase and amylase activities in gut extracts from adults fed on diet containing extract or lectin were significantly (p<0.05) lower than those detected in gut extract from insects of control group. The ingestion of diet containing MuLL also resulted in decrease of endoglucanase and alkaline phosphatase activities. In conclusion, the results obtained reveal (1) MuHL, MuBL and MuLL as potential candidates to biodegradable insecticides for control of N. corniger, A.
corniger; (5) insecticidal activity against N. corniger and A. aegypti by lectin ingestion and against S. zeamais by rejection of diet containing MuLL. The thesis contributes to the “state-of-art” in the study of insecticidal activity of lectins, yielding the first data for the comprehension of the mechanisms involved in the deleterious effects exerted by these proteins on N. corniger, A. aegypti and S. zeamais.
Keywords: Myracrodruon urundeuva; lectin; Nasutitermes corniger; Aedes aegypti;
FUNDAMENTAÇÃO TEÓRICA
Figura 1. Esquema representando a aglutinação de eritrócitos promovida por lectinas. (A) Rede de aglutinação formada pela ligação de uma lectina aos carboidratos da superfície dos eritrócitos. (B) Inibição da formação da rede de aglutinação por carboidratos livres.
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Figura 2. Myracrodruon urundeuva. (A) Aspecto geral; (B) indivíduo do Cerrado que já perdeu parte de suas folhas; (C) folhas; (D) inflorescência; (E) flores.
34
Figura 3. Myracrodruon urundeuva. (A) Casca; (B) madeira; (C) toras de
aroeira. 35
Figura 4. Cromatografia em coluna de quitina para isolamento de MuBL (A) e MuHL (B). Eletroforeses de MuBL (a) e MuHL (b) em gel de poliacrilamida em condições nativas para proteínas básicas (1) e em condições desnaturantes (2).
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Figura 5. Cupins do gênero Nasutitermes. Rainha de Nasutitermes euphratae (A). Operário (B) soldado (C) e ninho construído no solo (D) de Nasutitermes
corniger.
41
Figura 6. Ensaio termiticida. O disco de papel de filtro (d), de 4 cm de diâmetro, é impregnado com solução da amostra a ser avaliada.
42
Figura 7. (A) Ciclo de vida do A. aegypti. (B). Larva de A. aegypti no estágio L4.
43
Figura 8. Sitophilus zeamais. (A) Inseto adulto explorando grão de milho, com destaque para o rostro (1). (B) Inseto adulto, com destaque para o rostro (1) e as manchas avermelhadas (2) nos élitros. (C) Adultos em infestação de grãos de milho armazenados. (D) Fêmea ovipositando dentro do grão de milho (3), larva em desenvolvimento (4) e pupa (5).
47
ARTIGO 1
Fig. 1. Chromatography of 60-80% precipitate from leaf extract on chitin column. Washing step used 0.15 M NaCl; arrows represent eluents added. Fractions (2.0 mL) were collected and evaluated for hemagglutinating activity (HA). Absorbance (ABS) at 280 nm (◊) and log HA (♦) are represented. Electrophoresis profiles of MuLL (fractions 90 to 166) on PAGE for native basic proteins (a), and SDS-PAGE stained with Coomassie Brilliant Blue (b).
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Fig. 2. Contact effect of MuBL (A and B) and MuLL (C and D) on N.
corniger workers (A and C) and soldiers (B and D). Treatments of MuLL [0.125 (–), 0.25 (○), 0.35 (♦), and 0.5 (∆) mg mL-1] as well as MuBL [0.1 (–),
ARTIGO 2
Fig. 1. Mortality of A. aegypti L4 incubated with M. urundeuva leaf extract
(A) and MuLL (B). Lethal protein concentration required to kill 50% (LC50) of larvae in 24 h was determined by probit analysis with a reliability interval of 95%.
Fig. 2. Effect of MuLL on A. aegypti L4 digestive enzymes. (A) Protease
activity from L4 gut extract in presence of MuLL; inset: zymography for
proteases of L4 gut extract (1) and L4 gut extract incubated with lectin (2).
Arrows indicated the polypeptides bands with reduced intensity of the lytic zone after incubation of L4 gut extract with MuLL. The 100 % activity of L4
gut protease corresponded to absorbance of 1.019 ± 0.036. (B) Trypsin-like activity from gut extract towards 8 mM BApNA in presence of MuLL. The 100 % activity of L4 gut trypsin corresponded to absorbance of 0.235 ± 0.014.
(C) Effect of MuLL on α-amylase activity from L4 gut extract. ARTIGO 3
84
84
Fig. 1. Effect of M. urundeuva leaf extract and lectin (MuLL) on feeding of S.
zeamais adults by determination of feeding-deterrence indices. The insects were reared on artificial diet consisting on wheat flour disks containing leaf extract at 10 to 150 mg of protein per g of wheat flour (A) and MuLL at 3 to 150 mg per g of wheat flour (B). Each bar correponds to the mean ± SD of four replicates. Different letters indicate significant (p<0.05) differences between treatments.
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Fig. 2. Nutritional parameters of S. zeamais adults reared on artificial diets consisting in wheat flour disks (control) or M. urundeuva leaf extract (10 to 150 mg of protein per g of wheat flour). (A) The relative consumption rate indicates the amount of food consumed in mg per insect body weight in mg every day. (B) The relative growth rate indicates the amount of biomass in mg gained every day per mg of initial body weight. (C) The efficiency in conversion of ingested food (%) indicates the amount of ingested food incorporated by insects as biomass. Each bar correponds to the mean ± SD of four replicates. Different letters indicate significant (p<0.05) differences between treatments.
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Fig. 3. Nutritional parameters of S. zeamais adults reared on artificial diets consisting in wheat flour disks (control) or MuLL (3 to 150 mg per g of wheat flour). (A) The relative consumption rate indicates the amount of food consumed in mg per insect body weight in mg every day. (B) The relative growth rate indicates the amount of biomass in mg gained every day per mg of initial body weight. (C) The efficiency in conversion of ingested food (%) indicates the amount of ingested food incorporated by insects as biomass. Each bar correponds to the mean ± SD of four replicates. Different letters indicate significant (p<0.05) differences between treatments.
ARTIGO 1
Table 1. Properties of MuBL, MuHL, and MuLL. 75 Table 2. Trypsin-like activity in gut extracts from N. corniger and
hemagglutinating activity of MuBL, MuHL and MuLL after incubation with termite gut extracts.
76
ARTIGO 2
Table 1. Protease and MuLL specific haemagglutinating activity from MuLL and L4 gut extract mixture.
85
ARTIGO 3
Table 1. Survival rates of S. zeamais adults reared for 7 days on diets containing M. urundeuva leaf extract or MuLL.
Table 2. Digestive enzyme activities in gut extracts from S. zeamais adults reared on diets consisting on wheat flour disks containining M. urundeuva leaf extract or MuLL.
115
AH: atividade hemaglutinante
BApNA: N-α-benzoil-DL-arginil-ρ-nitroanilida Bs: Bacillus sphaericus
Bti: Bacillus thuringiensis var. israelensis
CL50 (LC50): concentração letal necessária para matar 50% dos insetos
Con A: concanavalina A (lectina de sementes de Canavalia ensiformis) DNS: ácido 3,5-dinitrosalicílico (do inglês 3,5-dinitrosalycilic acid) FDI: índice de deterrência alimentar (do inglês feeding-deterrence index)
MBC: concentração mínima bactericida (do inglês minimal bactericide concentration) MIC: concentração minima inibitória (do inglês minimal inhibitory concentration)
MuBL: lectina de entrecasca de Myracrodruon urundeuva (do inglês M. urundeuva bark
lectin)
MuHL: lectina de cerne de M. urundeuva (do inglês M. urundeuva heartwood lectin) MuLL: lectina de folha de M. urundeuva (do inglês M. urundeuva leaf lectin)
NA: meio Ágar Nutriente (do inglês Nutrient Agar) NB: meio Caldo Nutriente (do inglês Nutriente Broth)
PAGE: eletroforese em gel de poliacrilamida (do inglês polyacrylamide gel electrophoresis) ρNP: ρ-nitrofenol
SDS: sulfato sódico de dodecila (do inglês dodecyl sodium sulphate) Tris: Trishidroximetilaminometano
2. FUNDAMENTAÇÃO TEÓRICA ... 23
2.1. Substâncias naturais envolvidas na defesa das plantas ... 23
2.2. Controle de insetos ... 24
2.3. Lectinas ... 26
2.3.1. Purificação e caracterização de lectinas ... 28
2.3.2. Atividades biológicas e aplicações biotecnológicas de lectinas ... 29
2.3.2.1. Lectinas inseticidas e seus mecanismos de ação ... 30
2.4. A aroeira-do-sertão (Myracrodruon urundeuva) ... 33
2.4.1. Lectinas de M. urundeuva ... 36
2.5. Cupins ... 38
2.5.1. O gênero Nasutitermes ... 41
2.6. Aedes aegypti ... 42
2.7. O gorgulho do milho, Sitophilus zeamais ... 46
3. OBJETIVOS ... 50
3.1. GERAL ... 50
3.2. ESPECÍFICOS ... 50
3.2.1. Purificação de MuLL e caracterização das lectinas de M. urundeuva ... 50
3.2.2. Estudo da atividade inseticida contra N. corniger ... 50
3.2.3. Estudo da atividade larvicida de MuLL contra A. aegypti... 51
3.2.4. Estudo da atividade inseticida do extrato de folhas e MuLL contra S. zeamais ... 51
4. REFERÊNCIAS ... 53
6. ARTIGO 2 ... 80
Effect of Myracrodruon urundeuva leaf lectin on survival and digestive enzymes of Aedes aegypti larvae ... 80
7. ARTIGO 3 ... 89
Deleterious effects of Myracrodruon urundeuva leaf extract and lectin on maize weevil, Sitophilus zeamais (Coleoptera, Curculionidae) ... 89
8. CONCLUSÕES ... 120
9. ANEXO ... 122
1. INTRODUÇÃO
Insetos e plantas mantêm complexos mecanismos de interações na natureza que podem ser benéficos para ambos ou para apenas um deles. Dentre estas interações, estão polinização, abrigo e alimentação. Ao mesmo tempo, as plantas também estão expostas ao ataque de fitopatógenos, geralmente microorganismos, que causam doenças por meio de distúrbios no metabolismo celular (através de enzimas, toxinas e fitorreguladores, por exemplo) e absorção de nutrientes da célula vegetal para seu próprio crescimento. Ainda, diversos insetos e outros animais se alimentam das partes não-reprodutivas e reprodutivas das plantas. A fim de aumentar as chances de sobrevivência e reprodução, as plantas desenvolveram então um vasto “arsenal” de estratégias de defesa em resposta à pressão de herbívoros e patógenos (EDWARDS & WRATTEN, 1981; AGRIOS, 1997; DEL-CLARO & SILINGARDI, 2001).
As estratégias de defesa das plantas contra herbívoros envolvem a participação de fatores físicos, tais como tricomas e espinhos. Em paralelo, grande parte da evolução das interações entre insetos e plantas tem ocorrido ao nível químico. A defesa química é proporcionada por substâncias tóxicas e repelentes produzidas pela planta. As toxinas de origem vegetal podem ser compostos do metabolismo primário, como algumas proteínas de defesa, ou do metabolismo secundário, tais como alcalóides, taninos, flavonóides e aminoácidos não-protéicos, como a canavanina e a cianoalanina (HARBORNE, 1993). Lectinas, proteínas que se ligam reversivelmente a carboidratos, são amplamente encontradas em plantas e tem sido descritas como participantes da defesa contra microorganismos e insetos (PEUMANS & VAN DAMME, 1995; PAIVA et al., 2010, 2011a).
Lectinas encontradas em tecidos vegetais naturalmente resistentes ao ataque de insetos constituem potenciais candidatos a agentes inseticidas eficazes e biodegradáveis. A aroeira-do-sertão, Myracrodruon urundeuva, é uma árvore “madeira-de-lei”, resistente ao ataque dos
principais agentes biodeterioradores, tais como os cupins, insetos que degradam a celulose com o auxílio de simbiontes (bactérias e protozoários flagelados) presentes no trato digestivo. Lectinas ligadoras de quitina foram isoladas do cerne (MuHL: M. urundeuva heartwood lectin) e entrecasca (MuBL: M. urundeuva bark lectin) desta planta (SÁ et al., 2008; SÁ et al., 2009b). MuHL foi capaz de induzir a mortalidade de operários e soldados de Nasutitermes
corniger, espécie de cupim considerada praga urbana (SÁ et al., 2008). MuHL e MuBL apresentaram atividade inseticida sobre o quarto estágio larval de Aedes aegypti, mosquito vetor da dengue (SÁ et al., 2009b).
Diferentes mecanismos de ação têm sido propostos para as lectinas inseticidas. Geralmente, essas proteínas são resistentes à degradação proteolítica, sendo capazes de exercer seus efeitos deletérios quando ingeridas pelos insetos. Essa resistência pode ser considerada como um fator defensivo conservado por algumas plantas (MACEDO et al., 2007). Uma vez presentes no trato digestivo do inseto, as lectinas podem interagir com glicoconjugados presentes na superfície da membrana de células epiteliais. Quitina e proteínas glicosiladas contendo resíduos de N-acetilglicosamina presentes na matriz peritrófica são alvos para lectinas ligadoras de quitina. Lectinas também podem interferir na atividade de enzimas e afetar indiretamente os mecanismos regulatórios de algumas enzimas devido à perturbação da organização da membrana peritrófica e da borda escovada (FITCHES & GATEHOUSE, 1998; FITCHES et al., 2008; PAIVA et al., 2012). Ainda, as lectinas podem exercer uma ação deterrente sobre a alimentação dos insetos por um efeito pré-ingestão, envolvendo sensores gustatórios, ou por um efeito pós-ingestão, ao promoverem intoxicação (SAUVION et al., 2004; MICHIELS et al., 2010; SPRAWKA & GOŁAWSKA, 2010). Contudo, o mecanismo de ação de lectinas com atividade termiticida sobre N. corniger e larvicida sobre A. aegypti ainda precisa ser elucidado.
O gorgulho do milho, Sitophilus zeamais, é uma praga cosmopolita do milho, sendo capaz de atacar grãos armazenados, bem como antes da coleta, ainda no campo. Os grãos atacados apresentam valor nutricional e peso reduzidos, baixa porcentagem de germinação e valor de mercado consideravelmente reduzido (YUYA et al., 2009; TEFERA et al., 2011). Não são encontrados na literatura estudos concernentes à atividade inseticida de lectinas sobre
S. zeamais.
Os estudos apresentados nesta Tese descrevem os esforços iniciais na identificação de possíveis mecanismos de ação de lectinas contra N. corniger e A. aegypti, bem como a primeira avaliação do efeito de uma lectina sobre adultos de S. zeamais. A primeira investigação reporta o isolamento de uma nova lectina ligadora de quitina extraída das folhas de M. urundeuva (MuLL: M. urundeuva leaf lectin), a atividade termiticida de MuBL e MuLL sobre operários e soldados de N. corniger e possíveis mecanismos da ação termiticida das três lectinas isoladas da aroeira. O segundo trabalho descreve a atividade larvicida de MuLL sobre o quarto-estágio larval de A. aegypti e seu efeito sobre a atividade de enzimas digestivas das larvas. A terceira investigação discorre sobre o efeito do extrato de folhas de M. urundeuva e de MuLL na sobrevivência e comportamento alimentar de S. zeamais, avaliando as alterações promovidas em parâmetros nutricionais e na atividade de enzimas digestivas deste inseto.
2. FUNDAMENTAÇÃO TEÓRICA
2.1. Substâncias naturais envolvidas na defesa das plantas
A evolução do conhecimento dentro da Bioquímica Ecológica tem iluminado os diversos degraus de complexas interações e adaptações co-evolucionárias que ocorrem entre plantas, animais e microorganismos. As plantas desenvolveram mecanismos de resposta e defesa a agressões de predadores e infecções por microrganismos. Dessa forma, elas sempre conseguiram dominar as paisagens do planeta (HARBORNE, 1993; RICKLEFS, 2003). A dimensão dos danos causados por fitopatógenos e pestes de insetos depende do hábito e do tamanho da população do agente causador e da resistência da planta ao tipo de ataque (KOGAN, 1994).
Adaptações morfológicas relacionadas à defesa das plantas contra herbívoros incluem, por exemplo, espinhos, acúleos, tricomas, caules rígidos e superfícies foliares mais espessas ou mais lisas (KENNEDY & BARBOUR, 1992; RAVEN et al., 2004). A defesa química das plantas ao ataque de microorganismos e herbívoros pode ser mediada por diversas substâncias, incluindo metabólitos primários (por exemplo, proteínas de defesa) e secundários (por exemplo, alcalóides, flavonóides, saponinas, taninos, terpenos e rotenóides). Esses compostos agem de diferentes maneiras, apresentando efeitos repelente, deterrente alimentar, deterrente de oviposição, inibidor de crescimento e tóxico (HARBORNE, 1993; CAVALCANTE et al., 2006).
Proteínas de plantas que podem estar envolvidas em mecanismos de defesa são as lectinas, as proteínas inativadoras de ribossomos, os inibidores de proteases e glicohidrolases, as arcelinas, as quitinases, a canatoxina e formas modificadas de proteínas de reserva. Muitas das proteínas de reserva acumuladas em sementes e frutos também desempenham função de
defesa contra patógenos e pragas de invertebrados, além de sua função de armazenamento. As proteínas de defesa podem ser de natureza constitutiva ou sua expressão pode ser induzida em reposta ao ataque, sendo relativamente conservadas durante o curso da evolução. A maioria das plantas produzem ou acumulam proteínas protetoras semelhantes estrutural e funcionalmente, independentemente de suas diferenças morfológicas (VAN LOON et al., 1999; CARLINI & GROSSI-DE-SÁ, 2002; MACEDO et al., 2003).
Os metabólitos secundários parecem não participar diretamente no crescimento e desenvolvimento das plantas, mas estão associados com a adaptação, transporte de íons metálicos e estabelecimento de simbioses, atuando também como hormônios, efetores diferenciais e moléculas de defesa (DEMAIN & FANG, 2000). A síntese de metabólitos secundários com papel de defesa pode ser induzida por estresse hídrico, variações sazonais de temperatura e luminosidades, ataque de herbívoros e infecção por patógenos (BRAY et al. 2000; BULBOVAS et al., 2005). Após ingestão por herbívoros, os metabólitos secundários podem afetar o processo de neurotransmissão, induzir modificações no DNA, complexar com proteínas e afetar a integridade de membranas, induzindo formação de poros e causando distúrbios na permeabilidade (WINK, 2003).
A variedade de compostos produzidos pelas plantas envolvidos em mecanismos de defesa contra herbívoros e patógenos pode ser explorada na busca por produtos naturais que possam ser utilizados na manutenção da fitossanidade e no controle de insetos (REGNAULT-ROGER et al., 2004).
2.2. Controle de insetos
Uma substância que seja letal, repelente, deterrente ou inibidora para insetos é classificada como inseticida (ADDOR, 1994). Os inseticidas são amplamente utilizados para
controlar populações de espécies-praga que atacam construções e plantações, bem como de espécies que transmitem agentes etiológicos de doenças que acometem humanos e podem inclusive levar à morte.
Substâncias inorgânicas sintéticas foram utilizadas em larga escala a partir da Segunda Guerra Mundial para controlar insetos. Em seguida, vários compostos orgânicos passaram a ser sintetizados, muitos a partir de produtos que ocorrem naturalmente em algumas plantas (como os análogos de piretróides). O uso de inseticidas químicos sintéticos, tais como organofosforados, carbamatos (organofosfatos), organoclorados e piretróides, ainda constitui a principal estratégia para controlar insetos. Entretanto, o uso contínuo em larga escala desses produtos tem levado à emergência de populações de insetos resistentes, danos ambientais persistentes, efeitos deletérios sobre organismos não-alvo, bem como distúrbios graves à saúde humana, principalmente em trabalhadores de grandes lavouras (PRIMACK & RODRIGUES, 2001; VIEGAS JÚNIOR, 2003; BARROS et al., 2006; LEITE et al., 2007; LIU et al., 2011).
Neste cenário, a busca por inseticidas naturais e biodegradáveis representa uma alternativa ecológica promissora e tem sido estimulada visando identificar novos compostos que promovam a mortalidade dos insetos resistentes (REGNAULT-ROGER et al., 2004; BERNARDI et al., 2010). Embora os inseticidas naturais (ou bioinseticidas) muitas vezes não sejam tão efetivos quanto os inseticidas químicos sintéticos, sua utilização minimiza os riscos de efeitos deletérios sobre espécies não-alvo e reduz os riscos de danos à saúde humana (MENEZES, 2005; PAIVA et al., 2011a). Ainda, a ampliação do leque de substâncias naturais inseticidas aumenta as possibilidades de rotatividade, minimizando a aquisição de resistência pelos insetos (VIEGAS JÚNIOR, 2003; CAVALCANTE et al., 2006).
Os inseticidas de origem vegetal (fitoinseticidas) têm sido intensivamente estudados em programas de manejo de pragas. Esses produtos geralmente apresentam baixa persistência
e ação residual, sendo rapidamente degradados. A utilização de extratos de plantas contendo diferentes princípios ativos pode dificultar a seleção de insetos resistentes, pois a variedade de compostos presentes se reflete em vários mecanismos de ação (REGNAULT-ROGER et al., 2004). O uso direto de extratos é também considerado viável quando aplicados de forma integrada, associado a outros métodos de controle, e particularmente útil em países em que a planta em estudo tem ampla utilização popular e/ou é encontrada em abundância (ISMAN, 2006).
A identificação e isolamento dos componentes ativos do extrato são importantes para que os tratamentos se baseiem na aplicação dos componentes ativos de maior eficiência. Taninos, óleos essenciais, rotenóides, limonóides, flavonóides, terpenos, esteróis, fenilpropanóides, quinonas e saponinas apresentam efeito deletério sobre insetos. Atividade inseticida de lectinas de plantas tem sido descrita contra insetos de diversas ordens, como Lepidoptera (mariposas e borboletas), Coleoptera (besouros), Diptera (moscas e mosquitos), Homoptera (cigarras, pulgões e cochonilhas) e Isoptera (cupins), dentre outras (PAIVA et al., 2011a).
2.3. Lectinas
As lectinas são proteínas ou glicoproteínas que se ligam a carboidratos, sendo capazes de induzir a aglutinação de células ao interagirem com glicoconjugados presentes na superfície celular (PAIVA et al., 2010). A detecção de lectinas em uma amostra é feita através do ensaio de hemaglutinação, em que a lectina se liga aos carboidratos da superfície dos eritrócitos, promovendo a formação de uma rede entre eles (Figura 1A). O ensaio de inibição da atividade hemaglutinante (Figura 1B) em presença de carboidratos livres em solução
(monossacarídeos, dissacarídeos ou glicoproteínas) confirma o caráter lectínico do fenômeno de aglutinação.
Figura 1. Esquema representando a aglutinação de eritrócitos promovida por lectinas. (A) Rede de aglutinação formada pela ligação de uma lectina aos carboidratos da superfície dos
eritrócitos. (B) Inibição da formação da rede de aglutinação por carboidratos livres.
Fonte: PAIVA et al. (2011b)
As lectinas estão presentes em todos os reinos da natureza, sendo encontradas em bactérias (IMBERT et al., 2004), algas (HAN et al., 2010), fungos (KHAN et al., 2007), liquens (SILVA et al., 2009), invertebrados – esponjas (MOURA et al., 2006), cnidários (FENTON-NAVARRO et al., 2003), moluscos (KONG et al., 2011), crustáceos (XU et al., 2010) e insetos (OURTH et al., 2005) – e vertebrados – peixes (TERADA et al., 2007), répteis (NUNES et al., 2011), aves (HOGENKAMP et al., 2006) e mamíferos (OLA et al., 2007). Em plantas, as lectinas têm sido detectadas em cascas (NASCIMENTO et al., 2008; SÁ et al., 2009b; VAZ et al., 2010; ARAÚJO et al., 2012), cerne (SÁ et al., 2008), cladônias (SANTANA et al., 2009), flores (SANTOS et al., 2009), folhas (COELHO & SILVA, 2000; COSTA et al., 2010), raízes (SOUZA et al., 2011), rizomas (BAINS et al., 2005; SANTANA
Nas plantas, vários papéis fisiológicos têm sido atribuídos às lectinas, dentre os quais se destacam a possível ação defensora contra microorganismos patógenos e insetos, a participação no mecanismo de nodulação em leguminosas, a estocagem e mobilização de proteínas e carboidratos de reserva e o alongamento da parede celular (KENNEDY et al., 1995; HIRSCH, 1999; ISIDRO et al., 2001; CARLINI & GROSSI-DE-SÁ, 2002; LIMPENS & BISSELING, 2003). Além disso, as lectinas têm se mostrado importantes na ativação de algumas enzimas, como fosfatases (AOYAMA et al., 2001), galactosidades (BRECHTEL et
al., 2001) e manosidases (KESTWAL et al., 2007).
2.3.1. Purificação e caracterização de lectinas
A primeira etapa na purificação de lectinas é a extração de proteínas em solução salina ou tampão. Caso apresentem atividade hemaglutinante inibida por carboidratos (monossacarídeos, dissacarídeos, oligossacarídeos ou glicoproteínas), os extratos são submetidos ao fracionamento de proteínas utilizando sulfato de amônio (SANTANA et al., 2012) ou desnaturação pelo calor (SANTANA et al., 2008), por exemplo. Em seguida, as frações obtidas são submetidas à diálise exaustiva, para eliminar pequenas moléculas, como carboidratos e sal.
Técnicas cromatográficas purificam as lectinas de acordo com tamanho da molécula (cromatografia de exclusão molecular), carga (cromatografia de troca iônica) e afinidade específica de ligação a carboidratos (cromatografia de afinidade). Métodos eletroforéticos são utilizados para a caracterização estrutural das lectinas, assim como para estabelecer o grau de pureza das mesmas. Eletroforese em gel de poliacrilamida (PAGE) para proteínas nativas revela a natureza de carga líquida da proteína purificada e PAGE sob condições desnaturantes (na presença de dodecilsulfato de sódio) e redutoras (na presença de β-mercaptoetanol ou
ditioteitrol, por exemplo) desdobra a proteína em suas subunidades constituintes e revela a massa molecular das mesmas. Além disso, coloração específica com o reativo de Schiff no gel de poliacrilamida pode indicar a natureza glicoprotéica da proteína (PAIVA et al., 2011a).
As massas moleculares acuradas podem ser obtidas por espectrometria de massas e a estrutura primária (seqüência de aminoácidos) definida por espectrometria ou degradação de Edman, por exemplo. Estudos da composição de estruturas secundárias e de conformação (estruturas terciária e quaternária) podem ser realizados através de técnicas como dicroísmo circular e cristalografia de raios X (SHIRAI et al., 2009; ROCHA et al., 2011).
O ensaio de hemaglutinação é um método simples, versátil e de baixo custo que possibilita caracterizar a lectina quanto à especificidade de ligação a carboidratos, estabilidade em diferentes valores de pH e após aquecimento a temperaturas elevadas, bem como na presença de enzimas e outras substâncias que podem alterar a atividade da proteína. Ainda, devido às diferenças nos tipos de carboidratos presentes na superfície do eritrócito, as lectinas podem apresentar uma afinidade maior por células de determinado animal (KENNEDY et al., 1995; PAIVA et al., 2011a).
2.3.2. Atividades biológicas e aplicações biotecnológicas de lectinas
Devido às suas diversas propriedades biológicas, as lectinas apresentam uma vasta gama de aplicações biotecnológicas, com os mais diversos fins. Atualmente, as lectinas aparecem como ferramentas de destaque no campo da tecnologia de bioreconhecimento. Na área conhecida como lectinômica, técnicas de microarrays utilizando lectinas têm sido desenvolvidas como ferramentas eficientes para decifrar o glicocódigo que reflete o estado fisiológico da célula (GEMEINER et al., 2009). Com base na elevada capacidade de reconhecimento de carboidratos, as lectinas se tornaram importantes ferramentas no
isolamento, em estudos estruturais e no mapeamento de oligossacarídeos e glicoconjugados (HAYUNGA et al., 1986; MONZO et al., 2007; XIE et al., 2009). Colunas das lectinas imobilizadas de Canavalia ensiformis (QIU et al., 2007) e de Cratylia mollis (LIMA et al., 1997) foram eficientes na separação de glicoproteínas de soro humano. Uma proteína de soja (Glycine max) com ação anti-agregante sobre plaquetas foi isolada utilizando matriz de afinidade contendo a lectina de C. mollis imobilizada em Sepharose 4B (SILVA et al., 2011).
O reconhecimento entre lectinas e carboidratos permite a utilização das lectinas na Histologia e Patologia como ferramentas em ensaios citoquímicos para localização de glicoconjugados e resíduos glicosilados e como ferramentas histoquímicas para análises de estruturas de tecidos humanos normais e alterados (FRANCESCHINI et al., 2000; PEDINI et
al., 2001; LIMA et al., 2010).
As lectinas apresentam diversas atividades biológicas, como: estimulação da proliferação de linfócitos (MACIEL et al., 2004), macrófagos (ANDRADE et al., 1999) e neutrófilos (TIMOSHENKO et al., 1995), estimulação da produção de interferon γ por linfócitos (MELO et al., 2010), atividade antiinflamatória (MELO et al., 2010), antitumoral (FANG et al., 2010; NUNES et al., 2012), antifúngica (SÁ et al.; 2009a; SANTANA et al., 2009; SOUZA et al., 2011) antibacteriana (OLIVEIRA et al., 2008; SÁ et al., 2009a; NUNES
et al., 2011), antiviral (SATO et al., 2011), hipotensiva (WANG et al., 1996), antinociceptiva (FIGUEIREDO et al., 2009) e inseticida.
2.3.2.1. Lectinas inseticidas e seus mecanismos de ação
Atividade inseticida de lectinas tem sido descrita contra estágios de desenvolvimento e formas maduras de insetos das Ordens Coleoptera, Diptera, Hemiptera, Homoptera, Hymenoptera, Isoptera, Lepidoptera e Neuroptera (PAIVA et al., 2011a).
conhecidos e tem ganhado interesse nos últimos anos. Lectinas entomotóxicas são geralmente resistentes à degradação proteolítica no trato digestivo de insetos (OLIVEIRA et al., 2011). A ligação de lectinas a moléculas glicosiladas do trato intestinal dos insetos pode interferir nas funções de enzimas digestivas e proteínas assimilatórias, inibindo a digestão e absorção de nutrientes (COELHO et al., 2007).
Quando ingeridas, as lectinas podem interferir nas atividades enzimáticas por: (1) ligação à porção glicídica de enzimas glicosiladas; (2) ligação às enzimas através de sítios diferentes do sítio de ligação ao substrato; (3) ligação ao substrato; (4) ligação tanto à enzima quanto ao substrato, aumentando a afinidade entre eles (MACEDO et al., 2007). A lectina de folha de Bauhinia monandra estimulou in vitro a atividade de α-amilase em larvas de
Callosobruchus maculatus (MACEDO et al., 2007). Fitches & Gatehouse (1998) reportaram que, em curto prazo, a lectina de Galanthus nivalis apresentou efeito estimulatório sobre tripsina, α-glicosidase e aminopeptidase de larvas de Lacanobia oleracea causando, em longo prazo, uma diminuição na atividade de α-glicosidase. Larvas da mosca do melão (Bactrocera
cucurbitae) apresentaram redução nas atividades de fosfatases ácidas e alcalinas quando alimentadas com a lectina de tubérculos de Arisaema helleborifolium, enquanto a atividade de esterases aumentou consideravelmente (KAUR et al., 2006).
A matriz peritrófica constitui uma membrana encontrada no intestino médio de insetos, exceto os das ordens Hemiptera e Homoptera (BANDYOPADHYAY et al., 2001; DAMASCENO-SÁ & SILVA, 2007), que separa o conteúdo do lúmen intestinal das células epiteliais digestivas. A matriz contém uma rede composta por quitina (polímero de N-acetilglicosamina) e glicoproteínas, como as peritrofinas (TELLAM et al., 1999). Sua integridade é importante, pois a matriz peritrófica compartimentaliza os processos digestivos, bem como atua na proteção contra infecções por microorganismos e danos mecânicos provocados por partículas alimentares abrasivas (HEGEDUS et al., 2009). Lectinas de plantas
com afinidade por N-acetilglicosamina e propriedade de ligação à quitina são inseticidas para muitos insetos por se ligarem à quitina e proteínas glicosiladas da matriz peritrófica, interferindo nos processos de digestão e absorção de nutrientes (PEUMANS & VAN DAMME, 1995; ZHU-SALZMAN et al., 1998; ZHU-SALZMAN & SALZMAN, 2001; CARLINI & GROSSI-DE-SÁ, 2002; MACEDO et al., 2004; MACEDO et al., 2007). Estudos ultraestruturais mostraram anormalidades na formação da matriz peritrófica de insetos alimentados com a lectina ligadora de quitina de Triticum vulgaris (WGA), tais como a hipersecreção de muitas camadas desorganizadas em larvas de Ostrinia nubilalis e alterações morfológicas nas microvilosidades de larvas de Drosophila (HARPER et al., 1998; LI et al., 2009; VANDENBORRE et al., 2011). Lectina das sementes de Canavalia
ensiformis (Con A) promoveu redução da permeabilidade da matriz peritrófica, assim como restrição no movimento de nutrientes e enzimas digestivas através dos poros da membrana peritrófica (EISEMANN et al., 1994)
Lectinas podem cruzar a barreira epitelial por transcitose e entrar no sistema circulatório do inseto, interferindo com moléculas de autodefesa presentes na hemolinfa (FITCHES et al., 2001). Lectinas podem também ser internalizadas em vesículas nas células epiteliais por endocitose e bloquear a proliferação celular (YU et al., 1999).
No caso de afídeos (Homoptera), que não possuem matriz peritrófica, foi demonstrado que a lectina de Allium sativum se ligou a resíduos de carboidratos de proteínas receptoras específicas presentes nas vesículas da membrana em borda escovada, o que pode resultar na diminuição da permeabilidade (BANDYOPADHYAY et al., 2001). Banerjee et al. (2004) sugeriram que o alvo da lectina de A. sativum sobre o afídeo da mustarda (Lipaphis erysimi) não é uma molécula produzida pelo próprio inseto, mas uma chaperonina conhecida como “simbionina” que é produzida pela bactéria Buchnera aphidicola, um simbionte obrigatório dos afídeos.
2.4. A aroeira-do-sertão (Myracrodruon urundeuva)
Myracrodruon urundeuva (Figura 2), descrita por Francisco Allemão & Cysneiro em 1862, é uma anacardiácea que pode ser encontrada desde o México até a Argentina (BARKLEY, 1968; GARRIDO & POGGIANI, 1979). No Brasil, é conhecida como aroeira, aroeira-do-sertão, aroeira-preta, aroeira-do-campo, aroeira-verdadeira ou urundeúva, entre outras denominações. A denominação “aroeira” é uma corruptela de “arara” e “eira”, com significado de “árvore da arara”. Já o termo urundeúva é de origem tupi-guarani e possui o significado “não se deteriora na água” (LORENZI, 2000; ALMEIDA-CORTEZ et al., 2007).
Apesar de ser considerada típica de regiões da Caatinga e do Cerrado formando agrupamentos densos, é também encontrada em formações muito úmidas e fechadas, incluindo florestas pluviais com até 2000 mm de precipitação anual. Distribui-se em ampla faixa do território brasileiro, desde o Maranhão até o Paraná, sendo mais freqüente nos estados de Minas Gerais, Bahia, São Paulo, Mato Grosso e Goiás (LORENZI, 2000). A aroeira-do-sertão não é encontrada na Floresta Amazônica (RECORD & HESS apud LEITE, 2002).
Na Caatinga e no Cerrado, os indivíduos alcançam de 5 a 15 m de altura e 15 a 60 cm de diâmetro, enquanto alguns podem chegar a 30 m de altura e 100 cm de diâmetro em regiões de florestas tropicais (ORGANIZAÇÃO DAS NAÇÕES UNIDAS PARA AGRICULTURA E ALIMENTAÇÃO, 1986). A aroeira-do-sertão é encontrada regularmente em solos ricos e sobrevive a longos períodos de baixa umidade (GARRIDO & POGGIANI, 1979; LEITE, 2002). O tamanho da árvore é diretamente proporcional à disponibilidade de água (MUÑOZ, 1990).
A aroeira-do-sertão é uma árvore decídua (Figura 2B) com um tronco reto e cilíndrico (LÓPEZ, 1987). As folhas são compostas imparipinadas (Figura 2C), com 10 a 30 cm de comprimento, ápice ligeiramente acuminado e borda serreada. As inflorescências consistem em racemos (Figura 2D), formando cachos nas pontas de ramos sem folhas. As flores (Figura 2E) são unissexuais e hipóginas e apresentam 5 pétalas. As sépalas são persistentes e permanecem ao redor do fruto, uma drupa esférica com 3 a 4 mm de diâmetro (LEITE, 2002).
Figura 2. Myracrodruon urundeuva. (A) Aspecto geral; (B) indivíduo do Cerrado que já perdeu parte de suas folhas; (C) folhas; (D) inflorescência; (E) flores.
A, C e D: retirado de Lorenzi (2000). B e E: ©Fernando Tatagiba.
A floração ocorre geralmente após a queda das folhas, entre os meses de Novembro e Janeiro, no Brasil. Abelhas da espécie Trigona spinips foram descritas como agentes polinizadores e as sementes são dispersas pelo vento. O tempo de dormência pode variar entre as variedades encontradas (M. urundeuva var. urundeuva e M. urundeuva var. candollei), com a germinação ocorrendo após 4 a 7 dias, ou somente após 2 semanas, dependendo das condições do local (LEITE, 2002).
C
D
E
A casca é marrom-escura (Figura 3A), apresentando escamas nos indivíduos mais velhos, sendo mais lisa nos mais jovens (RIZZINI, 1978). A infusão da entrecasca é um dos remédios mais utilizados na medicina popular contra doenças respiratórias e urinárias (NAPRALERT, 2001). Extratos aquosos da casca apresentaram também atividades antiulcerogênica, anticolinérgica (MENEZES et al., 1986), antiinflamatória (RAO et al., 1986), antidiarréica e analgésica (ALMEIDA-CORTEZ et al., 2007).
A madeira de M. urundeuva (Figuras 3B e 3C) não apresenta listras, é muito densa (densidade de 1,19 g/cm3) e com elevada resistência mecânica, sendo incluída entre as madeiras-de-lei. O alburno é bem diferenciado do cerne e pode ser facilmente decomposto. O cerne de M. urundeuva é uniforme, de coloração vermelho-cereja ou, quando exposto ao ar, vermelho-amarronzado escuro. A madeira é extremamente resistente à biodeterioração, mesmo quando caída no solo, sendo uma das mais tradicionalmente escolhidas na indústria de móveis e construção civil, naval e hidráulica. Também é utilizada na produção de carvão vegetal (LÓPEZ, 1987; MORAIS et al., 1999; LORENZI, 2000).
Figura 3. Myracrodruon urundeuva. (A) Casca; (B) madeira; (C) toras de aroeira.
A e B: retirado de Lorenzi (2000). C: ©Porto Seguro Madeiras.
Devido à intensa exploração de suas propriedades, principalmente para confecção de cercas, estacas e postes, a aroeira-do-sertão se tornou uma das espécies de plantas lenhosas mais ameaçadas no mundo, figurando na lista de espécies ameaçadas de organizações
(governamentais ou não) de defesa do meio ambiente. Os principais fatores que ameaçam a aroeira-do-sertão são a destruição do habitat (principalmente no Cerrado e na Caatinga, que têm sofrido com a devastação e o uso excessivo e/ou inadequado da terra) e a superexploração da madeira (LEITE, 2002; OLIVEIRA et al., 2007).
A ameaça de extinção e o interesse mundial em fitoterápicos têm estimulado o desenvolvimento de estratégias de conservação de plantas medicinais. O grande valor da aroeira-do-sertão relacionado à produção de fármacos e à sua madeira faz dela uma das espécies que mais precisam de medidas de conservação. Nesse sentido, estudos visando à obtenção de informações sobre a biologia, ecologia, manejo e silvicultura da aroeira-do-sertão que sejam relevantes para sua conservação genética e valorização como um recurso sustentável têm se tornado cada vez mais necessários (OLIVEIRA et al., 2007).
Resultados obtidos no estudo da possibilidade de desenvolvimento de M. urundeuva em plantações se mostraram contraditórios e o uso de plantações comerciais da aroeira-do-sertão não tem sido considerado a principal estratégia de conservação, ainda que existam possibilidades. Leite (2002) considera que a conservação efetiva de M. urundeuva em território brasileiro se encontra ameaçada devido à falta de conhecimentos sobre a biologia reprodutiva da espécie e à ausência de medidas mais eficazes das instituições responsáveis que visem regulamentar a conservação dessa espécie.
2.4.1. Lectinas de M. urundeuva
Extratos salinos da casca, cerne e alburno de M. urundeuva foram avaliados quanto à atividade hemaglutinante. Apenas o extrato de alburno não foi capaz de aglutinar eritrócitos (SÁ et al., 2009c). Sá et al. (2009b) isolaram as lectinas de casca (MuBL) e cerne (MuHL) de
seus padrões eletroforéticos (Figura 4). As lectinas se apresentaram como proteínas básicas formadas por subunidades de massas moleculares 14,4 (MuHL) e 14,0 (MuBL) kDa. MuBL e MuHL também adsorveram em matriz contendo N-acetilglicosamina imobilizado em Agarose (SÁ et al., 2009b).
Figura 4. Cromatografia em coluna de quitina para isolamento de MuBL (A) e MuHL (B). Eletroforeses de MuBL (a) e MuHL (b) em gel de poliacrilamida em condições nativas para
proteínas básicas (1) e em condições desnaturantes (2).
Fonte: SÁ et al. (2009b).
MuHL apresentou elevada toxicidade para cupins da espécie N. corniger (com maior efeito nos soldados), mas não promoveu efeito repelente (SÁ et al., 2008). A atividade inseticida detectada assinala a possibilidade da participação de MuHL na resistência do cerne de M. urundeuva à biodeterioração por cupins. Adicionalmente, MuHL foi capaz de inibir o crescimento de espécies de fungos do gênero Fusarium (SÁ et al., 2009a).
MuBL e MuHL apresentaram potente atividade inseticida sobre o quarto estágio larval de A. aegypti com CL50 de 0,125 e 0,04 mg/mL, respectivamente (SÁ et al., 2009b), mosquito
de grande importância na saúde pública por ser o vetor de vírus causadores de doenças como a dengue, a febre amarela e a febre chikungunya.
2.5. Cupins
Os cupins ou térmitas (Ordem Isoptera) constituem um grande grupo de insetos eusociais que vivem em colônias compostas por várias castas e indivíduos em diferentes estágios de desenvolvimento (HOJO et al., 2005). Os cupins vivem em ninhos ou cupinzeiros e as tarefas relacionadas à reprodução, defesa e limpeza estão divididas entre as castas, que são diferenciadas morfologicamente (BERTI FILHO, 1993).
A cabeça é livre, de forma e tamanho variáveis. Olhos compostos estão presentes nas formas aladas e, nos cupins superiores, em lugar dos ocelos, há uma depressão chamada fontanela, que possui um poro central no qual se abre uma glândula cefálica que secreta um líquido com função de defesa. O aparelho bucal é mastigador e bem desenvolvido e o tórax achatado, com o protórax destacado. O órgão auditivo está situado na tíbia anterior. O abdome é volumoso, séssil e com 10 segmentos. Os dois pares de asas são membranosos e o desenvolvimento é por paurometabolia (ovo→ninfa→adulto) (GALLO et al., 1988).
Os indivíduos alados (aleluias) são temporários e responsáveis pela reprodução sexuada da colônia. Os reprodutores voam do ninho no crepúsculo. Após o vôo, caem no chão, livram-se de suas asas e então realizam a primeira cópula, ao encontrarem um parceiro. Formado o casal real, eles encontram um local adequado e iniciam a instalação do ninho, que inicialmente consiste em poucas galerias e uma câmara nupcial, onde a fêmea realiza as posturas e o casal copula outras vezes. Os novos indivíduos constituirão as demais castas e o cupinzeiro cresce rapidamente, podendo atingir milhões de indivíduos. A rainha, que quando completamente desenvolvida pode apresentar uma relação entre o abdome e o resto do corpo
de 200:1 em algumas espécies, pode viver de 6 a 10 anos, ovipositando até cerca de 50 mil ovos em toda sua vida (ZANETTI et al., 2002).
As formas ápteras são permanentes e podem ser férteis ou estéreis. Dentre as férteis, estão o casal real após o vôo e as rainhas e os reis de substituição, que substituem o casal quando esse morre ou uma colônia é fragmentada. Dentre os indivíduos gerados, encontram-se algumas ninfas que encontram-se deencontram-senvolverão em formas aladas, as quais, por sua vez, formarão novas colônias. As formas estéreis constituem as castas de operários e soldados. Os soldados defendem a colônia. São cegos e apresentam mandíbulas bem desenvolvidas, que são utilizadas para defesa e não para mastigação. Os operários são também, normalmente, cegos e cuidam da prole, forrageiam alimento e constroem o ninho. Por serem fototrópicos negativos, desenvolvem suas atividades na escuridão (PFDAT, 1985; GALLO et al., 1988; BERTI FILHO, 1993; ZANETTI et al., 2002).
Os cupins são capazes de se alimentar de materiais ricos em celulose como madeira, papel, plantas vivas e de matéria orgânica em decomposição. A capacidade de aproveitar a celulose como fonte energética se deve à presença de uma comunidade simbiótica de microrganismos encontrada no trato intestinal dos cupins (FRÖHLICH et al., 2007). Essa microbiota é capaz de hidrolisar a celulose e a hemicelulose, fermentar e despolimerizar produtos a ácidos graxos de cadeia curta, que são absorvidos pelo hospedeiro, e fixar nitrogênio, além de estar envolvida no metabolismo de hidrogênio (BRUNE, 1998; FRÖHLICH et al., 2007; WARNECKE et al., 2007).
A Ordem Isoptera compreende sete famílias: Mastotermitidae, Kalotermitidae, Termopsidae, Hodotermitidae, Serritermitidae, Rhinotermitidae e Termitidae, que estão subdivididas em quatorze subfamílias (GRASSÉ, 1986; KAMBHAMPATI & EGGLETON, 2000). Os cupins das seis primeiras famílias são chamados “cupins inferiores”, enquanto que os cupins da família Termitidae são denominados “cupins superiores”. Essa designação
refere-se à presença de protozoários flagelados simbiontes que auxiliam na degradação da celulose no trato digestivo de térmitas inferiores, enquanto nos térmitas superiores, apenas bactérias simbiontes estão presentes (COSTA-LEONARDO, 2002).
O papel ecológico dos térmitas é dos mais importantes. Juntamente com as formigas, atuam na reciclagem dos nutrientes acumulados em enorme parte da biomassa nos ecossistemas tropicais, funcionando como consumidores primários e decompositores. Também promovem benefícios no solo, aerando, drenando e transportando nutrientes (VASCONCELLOS et al., 2005). Por outro lado, cerca de 10% das espécies conhecidas de isópteros estão registradas como pragas. Os cupins estão entre os mais severos agentes destruidores da madeira (PAES & VITAL, 2000) e também danificam uma variedade de materiais que variam de telas de papel a materiais não-celulósicos tais como o betume do asfalto e folhas de metal (BULTMAN et al. apud CHENG et al., 2007).
Os cupins atacam madeiras não-resistentes penetrando no tronco da árvore através de duas rotas principais: a casca e as raízes. Alguns cupins são capazes de penetrar pelas raízes das árvores e construir galerias no interior do tronco, destruindo o cerne e deixando as árvores ocas. Quando mortas, essas madeiras se tornam ainda mais suscetíveis ao ataque. Estimou-se que os prejuízos causados pela ação de cupins sobre madeiras e outros materiais contendo celulose excederiam US$ 50 bilhões anuais mundialmente (KORB, 2007).
O controle de cupins tem sido convencionalmente feito com inseticidas organofosforados e piretróides, que podem ser tóxicos para outros seres vivos e apresentam considerável risco de contaminação ambiental. Extratos de diversas partes das plantas, extrativos de madeiras e entrecascas, feromônios, análogos do hormônio juvenil e inibidores da síntese de quitina são tidos como potenciais componentes de produtos alternativos para combater espécies-praga de cupins, sem oferecer grande perigo ao meio ambiente (SOGABE
2.5.1. O gênero Nasutitermes
Os cupins nasutos da subfamília Nasutiterminae (Família Termitidae), a mais diversificada da ordem Isoptera (KAMBHAMPATI & EGGLETON, 2000), são assim chamados porque a cabeça dos soldados se estreita na parte anterior, em uma projeção semelhante a um nariz, que é utilizada para defesa, emitindo substâncias adesivas ou tóxicas (HOJO et al., 2005).
O gênero Nasutitermes (Figura 5) tem distribuição mundial e é um dos mais ricos em espécies. O número de indivíduos em um ninho (Figura 5A) pode chegar a 3 milhões e a longevidade máxima das colônias de Nasutitermes varia de 40 a 80 anos (KAMBHAPATTI & EGGLETON, 2000). Constroem ninhos no tronco ou no sistema radicular de árvores e acima ou abaixo do nível do solo (SCHEFFRAHN et al., 2002; ALBUQUERQUE et al., 2005). Enquanto gênero, os Nasutitermes são morfologicamente bem diferenciados da grande maioria dos cupins pelo aspecto bem característico da cabeça nos soldados (Figura 5C), mas a classificação ao nível de espécie não é uma tarefa fácil (CONSTANTINO, 1992; MIURA et
al., 2000; SCHEFFRAHN et al., 2002).
Figura 5. Cupins do gênero Nasutitermes. Ninho (A), operário (B) e soldado (C) de
Nasutitermes corniger. (D) Rainha de Nasutitermes euphratae.
Fontes: A: © Reginaldo Constantino. B e C: Thiago H. Napoleão. D: Michele D.C. Silva.
