Avaliação toxicológica pré-clínica com extrato bruto seco das folhas de Vitex agnus castus Linn

Texto

(1)UNIVERSIDADE FEDERAL DE PERNAMBUCO CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE DEPARTAMENTO DE CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS. DISSERTAÇÃO DE MESTRADO. AVALIAÇÃO TOXICOLÓGICA PRÉ-CLÍNICA COM EXTRATO BRUTO SECO DAS FOLHAS DE Vitex agnus castus Linn.. JUSSARA DINIZ BARROS. RECIFE-PE SETEMBRO, 2008.

(2) JUSSARA DINIZ BARROS. AVALIAÇÃO TOXICOLÓGICA PRÉ-CLÍNICA COM EXTRATO BRUTO SECO DAS FOLHAS DE Vitex agnus castus Linn.. Dissertação apresentada ao Programa de Pós-graduação em Ciências Farmacêuticas, da Universidade Federal de Pernambuco, como parte dos requisitos para obtenção do grau de mestre em Ciências Farmacêuticas. Área de concentração: Avaliação e Obtenção de Produtos Bioativos e Naturais Orientador (a): Prof.(a) Dr.(a) Jane Sheila Higino Co-orientador: Prof. Dr. Arquimedes Fernandes Monteiro de Melo. RECIFE-PE SETEMBRO, 2008.

(3) Barros, J.D.; Avaliação toxicológica pré-clínica com extrato bruto seco das folhas de vitex agnus castus linn... Barros, Jussara Diniz Avaliação toxicológica pré-clínica com extrato bruto seco das folhas de Vitex agnus castus Linn / Jussara Diniz Barros. – Recife: O Autor, 2008. ix, 81 folhas: il., tab., fig., gráf. Dissertação (mestrado) – Universidade Federal de Pernambuco. CCS. Ciências Farmacêuticas, 2008.. Inclui bibliografia e apêndice. 1. Vitex agnus castus Linn - Folhas. 2. Extrato bruto seco. 3. Avaliação toxicológica. I. Título.. 615.322 615.32. CDU (2.ed.) CDD (20.ed.). UFPE CCS2010-038. 40.

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(5) UNIVERSIDADE FEDERAL DE PERNAMBUCO CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE DEPARATMENTO DE CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS. Reitor Amaro Henrique Pessoa Lins. Vice-Reitor Gilson Edmar Gonçalves e Silva. Pró-Reitor para Assuntos de Pesquisa e Pós-Graduação Anísio Brasileiro de Freitas Dourado Diretor do Centro de Ciências da Saúde José Thadeu Pinheiro. Vice-Diretor do Centro de Ciências da Saúde Márcio Antonio de Andrade Coelho Gueiros. Chefe do Departamento de Ciências Farmacêuticas Jane Sheila Higino. Vice-Chefe do Departamento de Ciências Farmacêuticas Samuel Daniel de Sousa Filho. Coordenador do Programa de Pós-Graduação em Ciências Farmacêuticas Pedro José Rolim Neto. Vice-Coordenadora do Programa de Pós-Graduação em Ciências Farmacêuticas Beate Saegesser Santos.

(6) “A gente foge da solidão quando tem medo dos próprios pensamentos.” Érico Veríssimo.

(7) DEDICO ESTE TRABALHO AOS MEUS PAIS, A MEU GRANDE AMOR E AOS MEUS AMIGOS QUE ME ACOMPANHARAM DURANTE MINHA VIDA.TODOS FORAM E SERÃO SEMPRE INCENTIVADORES CONSTANTES DA MINHA FORMAÇÃO. AMO MUITO VOCÊS!.

(8) AGRADECIMENTOS. Aos meus pais, Joaquim Cícero Diniz Barros e Clara Valgueiro Diniz Barros, pelo apoio, incentivo, investimento e principalmente compreensão nos momentos mais difíceis. A meu amor, Dhiogo Camarotti da Cunha Sales, por ter me proporcionado tanta força para concluir mais esse projeto de minha vida. Aos meus amigos, que são muitos, e que me ajudaram em vários momentos desse projeto e em especial a uma amiga que esteve comigo em todos os momentos desse mestrado Sarah Ximenes..

(9) SUMÁRIO. LISTA DE ABREVIATURAS........................................................................................III LISTA DE FIGURAS......................................................................................................V LISTA DE TABELAS.....................................................................................................VI LISTA DE GRÁFICOS………………………………………………………………...VIII RESUMO.........................................................................................................................X INTRUDUÇÃO...............................................................................................................1 REVISÃO DE LITERATURA......................................................................................12 OBJETIVO.......................................................................................................................20 GERAL..............................................................................................................................21 ESPECÍFICO....................................................................................................................21 ARTIGO I: DETERMINAÇÃO DA CL50 E AVALIAÇÃO TOXICOLÓGICA AGUDA DO EXTRATO BRUTO SECO DAS FOLHAS DE Vitex agnus castus Linn..................................................................................................................................22 RESUMO.........................................................................................................................23 INTRODUÇÃO...............................................................................................................24 MATERIAIS E MÉTODOS............................................................................................26 RESULTADOS................................................................................................................29 DISCUSSÃO...................................................................................................................29 REFERÊNCIAS BIBLIOGRAFICAS...........................................................................34 ARTIGO II: ESTUDO TOXICOLÓGICO CRÔNICO DO EXTRATO BRUTO SECO DAS FOLHAS DE Vitex agnus castus Linn....................................................38 RESUMO........................................................................................................................39 I.

(10) INTRODUÇÃO..............................................................................................................39 MATERIAIS E MÉTODOS...........................................................................................44 RESULTADOS...............................................................................................................49 CONCLUSÃO.................................................................................................................63 CONCLUSÃO FINAL…………………………………………………………………69 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS...........................................................................71. II.

(11) LISTA DE ABREVIATURAS. COBEA:COLÉGIO BRASILEIRO DE EXPERIMENTAÇÃO ANIMAL OMS: ORGANIZÇÃO MUNDIAL DE SAÚDE CEME: CENTRAL DE MEDICAMENTOS PPPM: PROGRAMA DE PESQUISAS DE PLANTAS MEDICINAIS RDC: RESOLUÇÃO DA DIRETORIA COLEGIADA RE: RESOLUÇÃO ESPECÍFICA PE: PERNAMBUCO PA: PARA MA: MARANHÃO a.C: ANTES DE CRISTO EBS: EXTRATO BRUTO SECO ANVISA: AGÊNCIA NACIONAL DE VIGILÂNCIA SANITÁRIA LAPETOX: LABORATÓRIO DE PESQUISAS TOXICOLÓGICAS CL50: CONCENTRAÇÃO LETAL QUE MATA 50 PORCENTO DA POPULAÇÃO EXPERIMENTAL Mg: MILIGRAMA ºC: GRAU CÉLSIO UFPE: UNIVERSIDADE FEDERAL DE PERNAMBUCO Kg: KILOGRAMA %: PORCENTAGEM CCD: CROMATOGRAFIA EM CAMADA DELGADA ml: MILILITRO. III.

(12) µg: MICROGRAMA h: HORA EDTA: ÁCIDO ETILENODIAMINO TETRACÉTICO VCM:VOLUME CORPUSCULAR MÉDIO HCM: HEMOGLOBINA CORPUSCULAR MÉDIA CHCM: CONCENTRAÇÃO DA HEMOGLOBINA CORPUSCULAR MÉDIA DL50: DOSE LETAL QUE MATA 50 PORCENTO DA POPULAÇÃO EA: EXTRATO AQUOSO µm: MICROMETRO AST: ASPARTATO TRANSFERASE ALT: ALANINA TRANSFERASE GGT:GAMA GLUTAMIL TRANSFERASE cm: CENTÍMETRO rpm: ROTAÇÃO POR MINUTO SAS: STATISTICAL ANALYSIS SYSTEM G: GRAMA. IV.

(13) LISTA DE FIGURAS. Figura 1: Folha da Vitex agnus castus Linn. Figura 2: Curva Concentração-Resposta da toxicidade do extrato aquoso de Vitex agnus castus Linn. Sobre Artemia salina Leach. Figura 3: Estatística da parte da planta utilizada pela população. Figura 4: Estatística do modo de utilização da folha da planta. Figura 5: Estatística do uso popular da folha da agnus castus Linn. Figura 6: Administração por via oral do EBS da agnus castus Linn. Figura 7: Coleta de sangue intraventricular. Figura 8: Observação macroscópica dos órgãos. Figura 9: Baço sem alteração histológica. Figura 10: Coração sem alteração histológica. Figura 11: Fígado sem alteração histológica. Figura 12: Rim sem alteração hisatológica. Figura 13: Microfotografia de esfregaço sanguíneo preparado com amostras de sangue dos ratos tratados com a maior dose. Figura 14: Microfotografia de esfregaço sanguíneo preparado com amostras de sangue dos ratos tratados com a maior dose. Figura 15: Microfotografia de esfregaço sanguíneo preparado com amostras de sangue dos ratos tratados com a maior dose.. V.

(14) LISTA DE TABELAS. Tabela 01: Efeito do EBS da Vitex agnus castus Linn. (4g/Kg) por via oral sobre os parâmetros hematológicos em ratos Wistar adultos tratados com dose única. Tabela 02: Efeito do EBS da Vitex agnus castus Linn. (4g/Kg) por via oral sobre os parâmetros bioquímicos em ratos Wistar adultos tratados com dose única. Tabela 03: Avaliação da temperatura corpórea dos ratos machos e fêmeas tratados cronicamente com água ou Vitex agnus castus Linn. Via oral. Toxicologia pré-clínica Tabela 04: Avaliação da glicemia dos ratos machos e fêmeas tratados cronicamente com água ou Vitex agnus castus Linn. Via oral. Toxicologia pré-clínica. Tabela 05: Avaliação diária de água dos ratos machos e fêmeas tratados cronicamente com água ou Vitex agnus castus Linn. Via oral. Toxicologia pré-clínica. Tabela 06: Avaliação diária de ração dos ratos machos e fêmeas tratados cronicamente com água ou Vitex agnus castus Linn. Via oral. Toxicologia pré-clínica. Tabela 07: Avaliação da evolução ponderal (em gramas) dos ratos machos e fêmeas tratados cronicamente com água ou Vitex agnus castus Linn. Via oral. Toxicologia préclínica. Tabela 08: Avaliação dos parâmetros hematológicos dos ratos machos e fêmeas tratados cronicamente com água ou Vitex agnus castus Linn. Via oral. Toxicologia pré-clínica. Tabela 09: Avaliação dos parâmetros bioquímicos dos ratos machos e fêmeas tratados cronicamente com água ou Vitex agnus castus Linn. Via oral. Toxicologia pré-clínica.. VI.

(15) LISTA DE GRÁFICOS. Gráfico 01: Representação gráfica da temperatura corporal por grupo de ratos machos, tratados, durante 13 semanas, com diferentes doses de EBS de Vites agnus castus Linn. (dose usual, dose 5x, dose 25x e dose satélite). N= 06 animais. Teste de Dunnett *p<0,05. Gráfico 02: Representação gráfica da temperatura corporal por grupo de ratos fêmeas, tratadas, durante 13 semanas, com diferentes doses de EBS de Vites agnus castus Linn. (dose usual, dose 5x, dose 25x e dose satélite). N= 06 animais. Teste de Dunnett *p<0,05. Gráfico 03: Representação gráfica da glicemia por grupo de ratos machos, tratados, durante 13 semanas, com diferentes doses de EBS de Vites agnus castus Linn. (dose usual, dose 5x, dose 25x e dose satélite). N= 06 animais. Teste de Dunnett *p<0,05. Gráfico 04: Representação gráfica da glicemia por grupo de ratos fêmeas, tratadas, durante 13 semanas, com diferentes doses de EBS de Vites agnus castus Linn. (dose usual, dose 5x, dose 25x e dose satélite). N= 06 animais. Teste de Dunnett *p<0,05. Gráfico 05: Representação gráfica do consumo de água por grupo de ratos machos, tratados, durante 13 semanas, com diferentes doses de EBS de Vites agnus castus Linn. (dose usual, dose 5x, dose 25x e dose satélite). N= 06 animais. Teste de Dunnett *p<0,05. Gráfico 06: Representação gráfica do consumo de água por grupo de ratos fêmeas, tratadas, durante 13 semanas, com diferentes doses de EBS de Vites agnus castus Linn. (dose usual, dose 5x, dose 25x e dose satélite). N= 06 animais. Teste de Dunnett *p<0,05. Gráfico 07: Representação gráfica do consumo de ração por grupo de ratos machos, tratados, durante 13 semanas, com diferentes doses de EBS de Vites agnus castus Linn. (dose usual, dose 5x, dose 25x e dose satélite). N= 06 animais. Teste de Dunnett *p<0,05.. VII.

(16) Gráfico 08: Representação gráfica do consumo de ração por grupo de ratos fêmeas, tratadas, durante 13 semanas, com diferentes doses de EBS de Vites agnus castus Linn. (dose usual, dose 5x, dose 25x e dose satélite). N= 06 animais. Teste de Dunnett *p<0,05. Gráfico 09: Representação gráfica da evolução ponderal por grupo de ratos machos, tratados, durante 13 semanas, com diferentes doses de EBS de Vites agnus castus Linn. (dose usual, dose 5x, dose 25x e dose satélite). N= 06 animais. Teste de Dunnett *p<0,05. Gráfico 10: Representação gráfica da evolução ponderal por grupo de ratos fêmeas, tratadas, durante 13 semanas, com diferentes doses de EBS de Vites agnus castus Linn. (dose usual, dose 5x, dose 25x e dose satélite). N= 06 animais. Teste de Dunnett *p<0,05.. VIII.

(17) RESUMO Inúmeros estudos científicos vêm sendo realizados no sentido de validar as informações populares referentes ao uso de plantas medicinais. É comum no estado de Pernambuco, assim como em todo o Brasil, a existência de feiras livres que comercializam produtos feitos com ervas e extratos naturais (com composição não padronizada), que associada à suscetibilidade do indivíduo agrava o quadro de acidentes por plantas tóxicas. Estes ensaios tiveram como objetivo a verificação da toxicidade do Extrato Bruto Seco e do Extrato aquoso mimetizando o seu uso popular (na forma de infusão), da folha da planta Vitex agnus castus Linn. popularmente conhecida por erva-de-caboclo e Liamba (PE), alecrim-de-planta (PA) e pau-de-angola (PA e MA). Este projeto visou esclarecer possíveis alterações provocadas pelo Extrato Bruto Seco (EBS) das folhas da Vitex agnus castus Linn no Sistema Nervoso Central e determinar sua toxicidade. A avaliação toxicológica pré clínica aguda (CL50) usando metanáuplios de Artemia salina Leach deu um valor de 801,266 µg/mL para Vitex agnus castus Linn. Os valores obtidos são próximos a 1000 µg/mL, indicando uma baixa toxicidade para esta planta. O extrato aquoso de V. agnus-castus não apresentou DL50 inferior a dose de 4g/kg, indicando baixa toxicidade aguda em ratos. Já o estudo toxicológico pré clínico crônico dos ratos por 90 dias com o EBS das folhas da Vitex anus castus Linn com doses de 2,18 mg/kg (uso popular), 10,9 mg/kg (dose 5x) e 54,5 mg/kg (dose 25x) nas doses usual , 5x a usual, 25x a usual mostrou uma pequena alteração já esperadas das transaminases hepáticas não apresentando nenhuma alteração histopatológica considerável.. PALAVRAS-CHAVE: Vitex anus castus Linn, Artemia salina Leach, Toxicidade aguda, Toxicidade crônica. IX.

(18) ABSTRACT Numerous scientific studies have already been carried out to validate folk knowledge regarding the use of medicinal plants. Open markets selling products containing herbs and natural extracts are common in the State of Pernambuco, as they are throughout Brazil. The composition of these products does not following any standard and this, in combination with the susceptibility of the individual, can lead to an increase in cases of accidental poisoning involving plants. The purpose of these tests was to confirm the toxicity of the use (in the form of infusions) of home-made dry crude extract and aqueous colored extract of the leaves of Vitex agnus castus Linn., commonly known as erva-de-caboclo or Liamba (in the State of Pernambuco), alecrim-de-planta (in the State of Pará) or pau-de-angola (in the States of Pará and Maranhão). The aim of the project was to determine what alterations to the central nervous system may be brought about by dry crude extract of the leaves of Vitex agnus castus Linn. and to measure its toxicity. The acute preclinical toxicological assessment (CL50) using Artemia salina Leach metanauplia produced a figure of 801.266 µg/mL for Vitex agnus castus Linn. The figures obtained are close to 1000 µg/mL, indicating that this plant has low toxicity. The aqueous extract of V. agnus-castus did not display a lower DL50 at a dose of 4g/kg, indicating low acute toxicity in rats. The chronic preclinical toxicological study in rats after 90 days of exposure to dry crude Vitex anus castus Linn leaf extract at doses of 2.18 mg/kg (home-made), 10.9 mg/kg (dose 5x) and 54.5 mg/kg (dose 25x) revealed an already expected slight alteration in the levels of hepatic transaminases, but did not give rise to any significant histopathological alterations. Key words: Vitex anus castus Linn, Artemia salina Leach, acute toxicity, chronic toxicity. X.

(19) Barros, J.D.; Avaliação toxicológica pré-clínica com extrato bruto seco das folhas de vitex agnus castus linn... 1. INTRODUÇÃO. 1.

(20) Barros, J.D.; Avaliação toxicológica pré-clínica com extrato bruto seco das folhas de vitex agnus castus linn... 1. INTRODUÇÃO. O emprego de plantas no combate a enfermidades é uma tradição que tem uma longa história, remontando aos períodos mais longínquos da humanidade. A fitoterapia empírica esteve sempre ligada a sociedades primitivas, vinculando-se a sistemas religiosos e a ritos mágicos (MATTOS, 1982). Na formação da Medicina Popular brasileira foram fundamentais três elementos étnicos que se amalgamaram para estruturação dos conhecimentos que hoje a constituem: o branco (português), o indígena e o negro (CAMARGO,1988). Alguns dos negros trazidos como escravos para o Brasil, nos primórdios de sua colonização, eram feiticeiros e curandeiros, que por meio de práticas divinatórias, transes místicos e rituais específicos, invocavam as forças superiores para propiciar conselhos e intervenções para problemas de saúde. Este caráter fetichista e mágico ainda hoje perdura nas práticas religiosas de influência africana, como por exemplo, nas beberagens medicinais, as chamadas garrafadas (CAMARGO,1988). A contribuição do negro, seus conhecimentos, sua mágica, ainda subsistem nos cultos. e ritos remanescentes de sua etnia e persistem nos. sistemas religiosos originados da união dos elementos culturais de brancos e índios brasileiros, as religiões afro-brasileiras. O resgate desse conhecimento, em todos os seus aspectos, se faz imperioso e necessário para ampliação do conhecimento científico nas áreas de interesse, particularmente a antropologia e a botânica, cabendo este papel interdisciplinar à etnobotânica que, munida da. 2.

(21) Barros, J.D.; Avaliação toxicológica pré-clínica com extrato bruto seco das folhas de vitex agnus castus linn... metodologia das Humanidades e das Biológicas, oferecerá subsídios para investigações de cunho farmacológico, por exemplo (ALBUQUERQUE, 1997). A pesquisa com produtos naturais pode ser guiada pelo conhecimento etnofarmacológico. A Medicina Popular representa um importante papel social, na medida em que, por meio de seus elementos, põe em ação os símbolos compartilhados por toda a sociedade. Isso também é verdadeiro no caso das plantas utilizadas para fins medicinais: sua eficácia pode ser resultante de um efeito farmacológico sobre a fisiologia do indivíduo, ou pode ser simbólica, agindo também sobre o indivíduo, mas no contexto específico de uma determinada cultura (DI STASI, 1996). As plantas têm fornecido um grande número de agentes clinicamente úteis e têm considerável potencial como fontes de novas substâncias. Estimase que existam aproximadamente duzentas e cinqüenta mil espécies de plantas no mundo, várias delas sob o perigo de extinção no próximo século (KUTCHN, 1993). Há uma correlação entre a aplicação clínica de um composto puro e o uso tradicional de seu extrato bruto pela comunidade. Farnsworth, Akerele e Bingel em 1985 revisaram 117 drogas botânicas e verificaram que 86 substâncias possuíam um uso específico ou relacionado com o das plantas das quais foram descobertas. Deve-se salientar, como um fato interessante, que na metade desses casos a fonte botânica era proveniente de área tropical. As informações sobre o uso de plantas na medicina popular são tão antigas quanto a necessidade que o homem tem de curar seus males e dores (FARNSWORTH;. MORRIS,. 1976).. Embora. tenha. ocorrido. o. avanço. tecnológico da indústria farmacêutica e mesmo que a terapêutica a partir de. 3.

(22) Barros, J.D.; Avaliação toxicológica pré-clínica com extrato bruto seco das folhas de vitex agnus castus linn... medicamentos industrializados seja crescente, podemos sempre observar que, em comunidades mais carentes financeiramente, as drogas de origem biológica continuam sendo o esteio para cura e alívio das enfermidades. Este conhecimento, embora empírico, serve-nos como base para estudos científicos sobre aspectos químicos e farmacológicos que envolvem o uso adequado das drogas de origem vegetal (RAMSTAD, 1959a). Inúmeros estudos científicos vêm sendo feitos no sentido de validar as informações populares referentes ao uso de plantas medicinais. Podemos mencionar o atual e intenso interesse que os cientistas, bem como a Indústria Farmacêutica denotam ao desenvolver pesquisas com o objetivo de descobrir novos princípios ativos e também aprimorar as descobertas de novas atividades farmacológicas de substâncias já conhecidas e oriundas de plantas. Verificamos que os segmentos acima citados demonstram preocupação quanto ao desenvolvimento de técnicas de isolamento e identificação, produção e cultivo de drogas (origem vegetal), biogênese de princípios ativos e outros métodos que levam ao melhoramento de seus produtos (RAMSTAD, 1959a). O conhecimento etnofarmacológico serve como guia para novos caminhos e novas indicações terapêuticas. Delta 9 – tetrahidrocanabinol, o principal canabinóide psicoativo da Canabis sativa, serviu como moléculamodelo para o desenvolvimento do composto sintético dronabinol, que pode ser usado como um antiemético e como estimulador do apetite, prevenindo a perda de peso em pacientes aidéticos (BEAL; OLSON; LAUBENSTEIN et al., 1995; McCHOULAM; BREUER; FEIGENBAUM et al., 1991). A medicina popular é, inicialmente, uma medicina tradicional. Isso não significa que seja imutável, porém designa certo modo de transmissão. 4.

(23) Barros, J.D.; Avaliação toxicológica pré-clínica com extrato bruto seco das folhas de vitex agnus castus linn... essencialmente oral e gestual (“por ouvir - falar e ver - fazer”) que não se comunica através da instituição médica, mas por intermédio da família e da vizinhança (LAPLANTINE; RABEYRON, 1989). Vários medicamentos da medicina oficial tiveram suas bases a partir de plantas popularmente conhecidas. A rica flora brasileira ainda guarda seus mistérios, tantas vezes nas mãos da sabedoria popular ou da tradição indígena (SERRANO, 1984). Não obstante, sabe-se que grande parte desse acervo de espécies vegetais e animais, bem como de experiências milenares perdeu-se irremediavelmente em decorrência da dicotomia homem-natureza. Só nas últimas décadas foi dado início ao estudo sistemático em etnobotânica e em etnozoologia, ciências que registram e analisam a utilização da flora e fauna nativa, respectivamente, domesticada por parte da comunidade local (POSEY, 1987). Oliveira (1984) define a expressão medicina popular como um conjunto de práticas, sejam elas científicas ou não, utilizadas por um grande número de pessoas que, em diferentes circunstâncias e diferentes concepções, opiniões e valores, torna-se uma alternativa para o alívio e cura de seus males e angústias. Constituindo-se uma entre várias modalidades da medicina, a medicina popular deve ser entendida na sua relação com as demais opções de cura oferecidas pela sociedade. Assim, se a medicina popular existe e resiste é porque os seus recursos de cura respondem aos interesses e necessidades de alguns setores da população. Caso contrário, provavelmente já teria sido sufocada por outras formas de cura, realizadas em nome da ciência e do saber legitimado (OLIVEIRA, 1984).. 5.

(24) Barros, J.D.; Avaliação toxicológica pré-clínica com extrato bruto seco das folhas de vitex agnus castus linn... Atualmente, a Medicina Popular é objeto de estudo da etnofarmacologia. Trata-se de um campo de investigação ainda pouco explorado. Neste intuito, pesquisas etnofarmacológicas estão sendo empregadas como ferramenta metodológica para a captação do conhecimento popular sobre o uso das plantas medicinais. Esta abordagem é particularmente útil para a descoberta de fármacos com utilidade terapêutica em humanos (ELISABETSKY, 1997). Entende-se por planta medicinal todo vegetal que tem atividade biológica, possuindo um ou mais princípios ativos úteis à saúde do homem. Os princípios ativos produzidos pelas plantas medicinais resultam de uma resposta metabólica secundária, em função da interação ecológica do vegetal com o meio ambiente, para defender-se de seus predadores naturais (BRAGANÇA, 1996; DI STASI, 1996). No organismo humano, aquele princípio ativo pode determinar respostas fisiológicas, desejáveis ou não. Segundo Abreu Matos em 1982, a expressão plantas medicinais abrange em seu contexto diversos conceitos dos usuários de diferentes níveis culturais. Para o autor, uma planta deve ser considerada como medicinal quando, através da experimentação científica, tiver validado suas ações farmacológicas e, portanto, possa ser usada na terapêutica ou como matériaprima para a fabricação de medicamento fitoterápico. Embora, no Brasil, a Resolução n° 17, de 24 de fevereiro de 2000, da Secretaria da Vigilância Sanitária do Ministério da Saúde, em vigor a partir daquela data, regularmente o registro de medicamentos fitoterápicos junto ao Sistema de Vigilância Sanitária, não é aplicada satisfatoriamente. As plantas medicinais e seus produtos derivados são comercializados de diversas formas,. 6.

(25) Barros, J.D.; Avaliação toxicológica pré-clínica com extrato bruto seco das folhas de vitex agnus castus linn... podendo ser adquiridas em farmácias de manipulação, supermercados ou feiras-livres. Segundo Bonfim e Mercucci (1997), dentre os problemas enfrentados pela fitoterapia que a têm mantido num patamar da medicina de segunda classe, destaca-se a ausência de estudos científicos na área dos fitoterápicos, muitos deles sem classificação e apresentados como suplementos alimentares. A combinação entre as informações populares referentes ao uso das plantas medicinais e os estudos farmacológicos e químicos permitiu a descoberta de inúmeros fármacos usados hoje na clínica, entre eles, a morfina, obtida da Papaver somniferum L, um eficiente analgésico. Existem outros exemplos, tais como quinina, atropina, codeína, cocaína, efedrina, digoxina e reserpina (BARREIRO, 1990; FARNSWORTH; AKERELE; BINGEL, 1985; KOROLKOVAS; BURKHALTER, 1988; SVENDESEN; SCHEFFERM, 1992). O Brasil tem o maior número de espécies vegetais de todo o planeta, cerca de 56.000. Dentre as estudadas, parte significativa tem importância econômica, alimentar ou medicinal, das quais muitas têm um potencial tóxico (ANDRADE, et al., 2001). Aproximadamente 20.000 espécies de plantas são utilizadas na Medicina Popular, sendo a maioria das espécies não avaliada, tanto química como farmacologicamente. Há que se considerar que as plantas produzem uma grande variedade de moléculas químicas e por isso têm um grande espectro de atividade farmacológica. Técnicas modernas de farmacologia utilizam ensaios para ligação específica de compostos a receptores ou enzimas, e tais ensaios podem ser utilizados para orientar o fracionamento da complexa mistura de agentes químicos presentes nos extratos de plantas.. 7.

(26) Barros, J.D.; Avaliação toxicológica pré-clínica com extrato bruto seco das folhas de vitex agnus castus linn... Esses estudos oferecem um caminho lógico para a descoberta de novos medicamentos e para a identificação de moléculas-modelo e desenvolvimento de análogos (CRAGG; NEWMAN; SNADER, 1997). Comparando com animais, plantas são bioquimicamente avançadas, produzindo todas as moléculas requeridas para o metabolismo primário (respiração, fotossínteses, proteínas, lipídios, síntese de ácidos nucléicos e avarias). As plantas têm desenvolvido uma incrível disposição para produzir componentes secundários, que têm um papel de defesa, de armazenamento e outras funções. Para lidar com diferentes tipos de herbívoros e suas diferenças alimentares, muitas plantas têm diversificado seus arsenais químicos, produzindo mais de um tipo de toxina ao mesmo tempo. Os alvos variam. Os componentes podem ser venenosos para Sistema Nervoso Central, coração, fígado, impedir o funcionamento dos rins, perturbar a coagulação sanguínea ou causar anemia, interferir com o metabolismo do iodo, causar alterações gastrintestinais, bloquear enzimas respiratórias chaves e atuar como carcinógeno. Em outros casos, o simples contato com a planta pode produzir reações alérgicas severas e reações na pele (PIP, E., 2006). Por sua vez, a Universidade não deve ficar de fora deste projeto tão grandioso e importante, que é conhecer as propriedades químicas e farmacológicas das plantas medicinais, não apenas com o objetivo de gerar lucro, mas também com a visão de prestar um serviço de informação às comunidades, haja vista ser a própria sociedade quem custeia, com o pagamento de impostos, a sua manutenção. Estes serviços podem ser prestados a partir do momento em que são desenvolvidos programas de. 8.

(27) Barros, J.D.; Avaliação toxicológica pré-clínica com extrato bruto seco das folhas de vitex agnus castus linn... formação e informação sobre plantas medicinais junto à população ( DINIZ; OLIVEIRA; MEDEIROS et al., 1998). A pesquisa de plantas medicinais leva em seu bojo a possibilidade de aproveitar a planta in natura e/ou preparados simples obtidos a partir dela. Apesar de exigir estudos sobre sua eficácia e toxicidade, estes se tornam menos. extensos,. extremamente. simplificados. e. menos. onerosos,. se. comparados com a metodologia seguida pelas indústrias farmacêuticas ou grandes laboratórios para o desenvolvimento de novas drogas (ELISABETSKY, 1997). Do ponto de vista social, são as camadas mais baixas da população mundial que detêm os conhecimentos básicos da medicina tradicional, os quais foram e estão sendo extensivamente utilizados como a principal e mais importante fonte de informações, que permitiram a descoberta da maioria dos medicamentos de origem natural disponíveis na medicina moderna (DI STASI, 1996). Estima-se que 60% dos brasileiros recorrem às plantas medicinais, principalmente por falta de recursos. Apesar de o mercado brasileiro estar entre o quarto e o quinto do mundo na venda de produtos farmacêuticos, 60% dos remédios são consumidos por apenas 23% da população. É nesse contexto social que as plantas medicinais e os fitoterápicos adquirem importância como agentes terapêuticos disponíveis (LAPA; CADEN; LIMA-LANDMAN et al., 1999; VAITSMAN, 1995). A importância social das plantas tem sido abordada pela Organização Mundial da Saúde (O.M.S.), especialmente a partir de 1978, quando publicou uma Resolução determinando a criação de um programa mundial para avaliar. 9.

(28) Barros, J.D.; Avaliação toxicológica pré-clínica com extrato bruto seco das folhas de vitex agnus castus linn... as espécies vegetais utilizadas na medicina popular, com a finalidade de estimular sua utilização (BRAGANÇA, 1996). Em 1982, a Central de Medicamentos – CEME promoveu um Encontro sobre Plantas Medicinais que resultou na elaboração do Programa de Pesquisas de Plantas Medicinais (PPPM), com o objetivo de promover a investigação científica sobre propriedades terapêuticas de espécies vegetais utilizadas pela população brasileira, favorecendo o futuro desenvolvimento de medicamentos; tem ainda o objetivo de orientar a população sobre o potencial terapêutico e os possíveis efeitos tóxicos dessas plantas, normalmente utilizadas de forma curiosa (FERREIRA, 1998). Precisamos estar alerta com relação a muitas plantas medicinais usadas na terapêutica que podem ser tóxicas se usadas em dosagens não apropriadas, armazenadas ou preparadas incorretamente, ter sido cultivadas sobre condições questionadas (metais pesados, nitratos ou pesticidas), como por exemplo a beira de estradas muito movimentadas se expondo a metais pesados liberados pelos carros, ou se elas são usadas em combinação com outros ingredientes (drogas ou comida), que podem interagir com as mesmas (PIP, E., 2006). Plantas tóxicas são tidas como aquelas que possuem algum tipo de efeito lesivo ou substância nociva, causando distúrbios ao organismo seja por contato ou por ingestão. As crianças de um a cinco anos são as principais vítimas por intoxicação com plantas, devido as brincadeiras de cozinhar e a curiosidade da idade. Já para o adulto, as principais causas de intoxicação ocorrem por tentativa de suicídio, uso abusivo e na forma de chá como. 10.

(29) Barros, J.D.; Avaliação toxicológica pré-clínica com extrato bruto seco das folhas de vitex agnus castus linn... abortivo. As estatísticas sobre esses tipos de acidentes não revelam o número real devido a subnotificação nos serviços de saúde (ANDRADE, et al., 2001). É comum no estado de Pernambuco, assim como em todo o Brasil, a existência de feiras livres que comercializam produtos feitos com ervas e extratos naturais (com composição não padronizada), que associada a suscetibilidade do indivíduo agrava o quadro de acidentes por plantas tóxicas (ANDRADE, et al., 2001). Para comprovação e avaliação das plantas utilizadas na fitoterapia popular, instituições de ensino e pesquisa têm realizado ensaios farmacológicos e toxicológicos. No Brasil, as normas para a realização de ensaios toxicológicos estão contidas na Resolução da Diretoria Colegiada (RDC) no 48/2004 da Agência Nacional de Vigilância Sanitária (ANVISA), e na Resolução Específica (RE) no 90/2004, que padroniza os ensaios toxicológicos pré-clínicos.. 11.

(30) Barros, J.D.; Avaliação toxicológica pré-clínica com extrato bruto seco das folhas de vitex agnus castus linn... 2. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA. 12.

(31) Barros, J.D.; Avaliação toxicológica pré-clínica com extrato bruto seco das folhas de vitex agnus castus linn... 2. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA. O nome Vitex é derivado do latim vitilium, que significa trançado, entrelaçado. Os ramos duros, mas flexíveis, eram usados na construção de cercas e vergas. O nome da espécie, agnus castus, é originário do latim castitas, que significa castidade; o termo agnus é comparado ao termo grego agnos, que significa cordeiro. Nativa da Europa, esta planta, um arbusto grande com até 5m de altura, de ramos mais ou menos tomentosos, folhas longo-pecioladas, opostas, digitadas, 3-5-7 folíolos lanceolados, verde-escuros na página superior e branco-tomentosos na página inferior, flores lilases em cachos paniculados com cerca de 30cm, axilares e terminais; fruto drupa pequena, 4-locular (PIO CORRÊA, 1926), pertencente à família Verbenaceae, cujo gênero Vitex é utilizado na medicina popular, sua espécie Vitex agnus-castus Linn., é muito difundida no Brasil (PIO CORRÊA, 1926). Os frutos têm aroma e sabor semelhantes a pimenta e quando maduros e secos, é a parte da planta utilizada medicinalmente. Pertence a ordem Lamiales, a família Verbenaceae, que possui aproximadamente 100 gêneros e 2600 espécies, o gênero Vitex possui. aproximadamente. 250. espécies.. São. naturais. da. região. do. Mediterrâneo e da Criméia, sendo encontradas também em regiões quentes da Ásia, África e Américas (MAIA, A.C.C.M. et al., 2001).. 13.

(32) Barros, J.D.; Avaliação toxicológica pré-clínica com extrato bruto seco das folhas de vitex agnus castus linn... Na região Nordeste do país, mais especificamente no interior do estado de Pernambuco, ela é conhecida como “liamba”, sendo suas folhas comumente utilizadas na fitoterapia popular para o alívio da dor e transtornos hormonais femininos. A maioria dos estudos clínicos com Vitex agnus castus foram realizados com a tintura obtida a partir dos frutos. Os textos médicos e monografias da Europa, citam essa preparação como "ativa farmacologicamente". Essa é uma indicação de que a atividade medicinal do fruto foi examinada como um todo, e que compostos ativos específicos ainda não foram isolados (ALBUQUERQUE, 1997). O fruto contém óleos essenciais, glicosídeos iridóides e flavonóides. No óleo essencial estão incluídos o limoneno, 1,8 cineol e sabineno. (KUSTRAK, 1992; ZOGHBI,1999; ZWAVING, 1996). Os flavonóides primários contêm casticina, orientina e isovitexina. Os dois glicosídeos iridóides isolados são agnusideo e aucubina (WILKINSON, 1998). O agnosídeo é utilizado como material de referência para controle de qualidade na fabricação dos extratos de Vitex. Outros ensaios demonstram delta 3-cetoesteroides nas folhas e flores e. 14.

(33) Barros, J.D.; Avaliação toxicológica pré-clínica com extrato bruto seco das folhas de vitex agnus castus linn... mencionam de maneira vaga, a existência provável de progesterona e 17hidroxiprogesterona; testosterona e epitestosterona parecem também estar presentes. Vitex agnus castus Linn. é conhecida desde a antigüidade conforme verificado pelos escritos de Dioscórides (Font Quer, 1978). Na Idade Média, usava-se o lenho como amuleto e comia-se os frutos aqueles que faziam voto de castidade (CORRÊA, 1984). Conforme Hoehne (1939), os antigos atribuíam à propriedade de atenuar as sensações sexuais. Por isto as donzelas castas espalhavam folhas e flores dele (Vitex agnus castus Linn.) em seus leitos e os monges prescreviam o uso do chá da mesma nos conventos ou preparavam xaropes com tais matérias para ministrarem a título de peitoral aos noviços. Mas o decocto das flores era também considerado emenagogo (quando interfere no fluxo menstrual, provocando ou aumentando) e os frutos fortemente picantes serviam para combater moléstias sifilíticas. O emprego do decocto das flores e folhas de outras espécies de Vitex, para efeitos emenagogos generalizou-se e vem sendo feito até os nossos dias. Lima (1975), citando Maurizio (1933), relata que. povos antigos, na. busca de fortificantes a serem introduzidos na preparação de cerveja, entre outras plantas, empregavam ramos e bagos de vitex agnus castus Linn.. Segundo aquele autor, era um trabalho feminino de caráter mágico, em que se utilizavam plantas capazes de produzir efeitos fisiológicos intensos. Figueiredo (1983) refere-se a essa planta como sendo alecrim-deangola, usada nos banhos de cheiro, nas casas de cultos afro-brasileiros de Belém do Pará. Tais banhos sabem-se serem utilizados em várias situações. 15.

(34) Barros, J.D.; Avaliação toxicológica pré-clínica com extrato bruto seco das folhas de vitex agnus castus linn... ritualísticas, principalmente com a finalidade de purificação. Segundo Albuquerque & Chiappeta (1994), liamba está entre as plantas mais utilizadas nos cultos afro-brasileiros do Recife. A espécie é conhecida popularmente por erva-de-caboclo (PE), liamba (PE), alecrim-de-planta (PA), pau-de-angola (PA, MA). Segundo Albuquerque (1989) o chá das folhas de alecrim-de-angola é empregado na medicina popular na Amazônia e em outras regiões do País como antiespasmódico, antiséptico, diurético, carminativo e contra dores de estômago e de cabeça (Albuquerque, 1989). Além dos estudos sobre sua ação antinociceptiva, alguns efeitos farmacológicos desta planta têm sido estudados, tais como controle dos níveis de progesterona, da secreção de prolactina e alívio dos sintomas da síndrome pré-menstrual e da mastodínia cíclica, que são queixas muito freqüentes na clínica ginecológica (HALASKA; RAUSS; BELES et al., 1988; LAURITZEN; REUTER; REPGES et al., 1997; LOCH; SELLE; BOBLITZ, 2000; SLIUTZ; SPEISER; SCHULTZ et al., 1993). Estudos in vitro comprovaram seu efeito dopaminérgico e outras ações farmacológicas via receptores opióides (MEIER; BERGER; HOBERG et al., 2000). Um paradoxo está estabelecido: de um lado, o agnus castus promove a restauração dos órgãos reprodutores à condição funcional saudável; de outro lado, a inibição do impulso sexual. Segundo Staden, o desejo sexual que o agnus castus supostamente poderia suprimir, é potencialmente tão perigoso à ordem social quanto um útero com problemas ou um órgão masculino doente (STADEN, 1992).. 16.

(35) Barros, J.D.; Avaliação toxicológica pré-clínica com extrato bruto seco das folhas de vitex agnus castus linn... A primeira referência à planta como Vitex, é encontrada nos escritos de Plínio, o Velho, no século 1 a.C.. Fez parte das plantas medicinais da Antiguidade, sendo mencionada nos trabalhos de Hipócrates, Dioscórides e Theofrasto. A primeira indicação medicinal específica pode ser encontrada nos escritos de Hipócrates, no 4o século a.C., como remédio feminino, para hidropsia, injúrias, inflamação e inchaço do baço, fígado, doenças de pele, olhos, feridas; suas folhas em vinho são indicadas para hemorragias e eliminação da placenta ( STADEN, 1992 ). Os cientistas e escritores da Antiguidade são unânimes em atribuir poderes especiais ao agnus castus, como o restabelecimento das funções normais do útero e funções femininas ligadas à reprodução, isto é, a lactação, bem como restabelecer à normalidade, as funções reprodutivas masculinas. O que é fundamental nesses dois casos, é a possibilidade da reprodução e com isso, a possibilidade do nascimento. O agnus castus está ligado à restauração da ordem biológica, ao mesmo tempo, assegurando a ordem social ou a perpetuação harmoniosa da comunidade. A divisão das funções que torna isso possível, depende, sem dúvida, da manutenção da ordem reprodutiva (STADEN, 1992 ). Vitex agnus castus Linn. possui efeitos estimulante e normalizador das funções da glândula pituitária, especialmente a função progesterona. Restabelece o equilíbrio normal estrógenoprogesterona e reduz alguns sintomas indesejáveis da menopausa, associados com a redução da produção de progesterona. É indicada no tratamento da dismenorréia, estresse prémenstrual e outras desordens relacionadas com a função hormonal .. 17.

(36) Barros, J.D.; Avaliação toxicológica pré-clínica com extrato bruto seco das folhas de vitex agnus castus linn... A ação normalizadora e balanceadora (estrógeno-progesterona) é benéfica no tratamento de menstruação irregular e dolorosa, infertilidade, síndrome pré-menstrual, problemas de menopausa e outros desequilíbrios hormonais. É útil no tratamento de endometriose e também para normalizar o sistema após o uso descontinuado de pílulas anticoncepcionais (BERGER et al, 2000; AMANN, 1975; SCHELLENBERG, 2001; VEAL, 1998) . Pesquisas recentes indicam que o agnus castus contém compostos com estrutura semelhante à progesterona; a planta atua sobre a glândula pituitária, a liberação do hormônio folículo estimulante é bloqueado, enquanto que a secreção do hormônio luteinizante é estimulado; o equilíbrio na produção de estrógeno e progesterona é estimulado ( MERZ, 1996; MILEWICZ et al, 1993). Ensaios "in vitro" realizados com extratos alcoólicos têm demonstrado inibição da secreção da prolactina em cultura de células pituitárias de ratas (SLIUTZ, 1993). Dados sobre a farmacocinética e estudos sistêmicos sobre toxicologia são desconhecidos (WILKINSON, 1998). Esse aspecto da valorização científica do agnus castus não é, entretanto, exclusivo da medicina, farmacologia ou botânica, mas ao contrário, tem suas origens no uso pela cultura e rituais místicos gregos. A heterogeneidade dos usos do vegetal na cultura e na ciência é considerável, não obscurecendo o seu poder em manter o controle, onde o excesso ameaça, reprimir o impulso sexual e ainda promover a fertilidade e reprodução, curar doenças físicas e mentais, evitar ameaças colocadas pela natureza representadas pelo selvagem e não civilizado e, geralmente, restaurar e regenerar a ordem biológica e social (STADEN, 1999).. 18.

(37) Barros, J.D.; Avaliação toxicológica pré-clínica com extrato bruto seco das folhas de vitex agnus castus linn... O agnus castus aparentemente era conhecido dos persas, no último período do século IX. Era indicado para curar insanidade, loucura e epilepsia. Os frutos eram vendidos nos bazares egípcios como "calmante para histeria". Na Renascença e, principalmente após a invenção da imprensa (1455), Vitex foi oficializado em algumas farmacopéias européias, incluindo a Pharmacopoeia Londinensis de 1618; em 1713, no New English Dispensatory, juntamente com várias outras drogas vegetais; em 1777, no Dispensatorium Pharmaceuticum Brunsvicence e, recentemente, listada no Martindale's Extra Pharmacopoeia XX22. Na região do Mediterrâneo, onde crescia naturalmente, Vitex era indicado para doenças como cólicas, gases e outros problemas digestivos. Na Inglaterra, era utilizado para as mesmas doenças, baseado nos escritos dos gregos e romanos e a sua forte reputação foi mantida por séculos. Na Alemanha e França, o vegetal tinha mais popularidade, pois os frutos eram considerados picantes, aromáticos, promoviam boa digestão, eram diuréticos e carminativos, removendo "obstruções intestinais" . Cazin, em 1880, menciona em seus escritos, o uso do Vitex para "esfriar" paixões; menciona também um famoso xarope, como um "infalível remédio para manter a castidade e reprimir os ardores de Vênus" feito das sementes por uma sacerdotisa. O remédio era distribuído nos conventos para inibir paixões, mas Cazin colocava em dúvidas o seu efeito; antes disso, ele considerava que a planta apresentava uma "propriedade muito estimulante".. 19.

(38) Barros, J.D.; Avaliação toxicológica pré-clínica com extrato bruto seco das folhas de vitex agnus castus linn... 3. OBJETIVOS. 20.

(39) Barros, J.D.; Avaliação toxicológica pré-clínica com extrato bruto seco das folhas de vitex agnus castus linn... 3. OBJETIVOS. 3.1 OBJETIVO GERAL ¾. Realizar ensaios toxicológicos com o extrato bruto seco (EBS) das folhas da. Vitex agnus castus L. com base nas determinações da Resolução no. 01/88 do Conselho Nacional de Saúde e da Resolução Específica no.90/2004 e na Resolução da Diretoria Colegiada n° 48/2004 da Secretaria Nacional de Vigilância Sanitária (ANVISA), com algumas modificações.. 3.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS ¾ Realizar o bioensaio da Artemia salina Leach. ¾ Realizar investigações de toxicidade aguda, em roedores (ratos). ¾ Realizar investigação de toxicidade crônica em ratos.. 21.

(40) Barros, J.D.; Avaliação toxicológica pré-clínica com extrato bruto seco das folhas de vitex agnus castus linn... 4. ARTIGO. I. Submetido. de. a. revista. Brasileira. Farmacognosia.. 22.

(41) Barros, J.D.; Avaliação toxicológica pré-clínica com extrato bruto seco das folhas de vitex agnus castus linn... Estudo toxicológico pré-clínico agudo e determinação da CL50 do extrato bruto seco da vitex agnus castus linn. .. Jussara D. Barros II*; Alex B. SilveiraI; Isabely S. V. Cruz II;; Sarah C.C. Ximenes II; Samuel D. Sousa Filho II; Valérium T. N. A. Castro II; Jane S. Higino II; Arquimedes F. M. Melo II.. Laboratório de Citologia e Histologia Qantitativa I,LAPETOX/UFPE – Laboratório de Pesquisas Toxicológicas II- Departamento de Ciências Farmacêuticas – Universidade Federal de Pernambuco – Cidade Universitária – 50.670-901 – Recife – PE.. RESUMO. A Vitex agnus castus Linn. é uma planta pertencente à família Verbenaceae e se destaca por seu uso na medicina popular em doenças reumáticas e disfunções femininas, principalmente. Também é utilizada em rituais afro-brasileiros com o objetivo afastar mau-olhado, maus espíritos, entre outros. Este trabalho teve como objetivo realizar ensaios toxicológicos pré-clínicos do extrato bruto seco (EBS) das folhas dessa planta em ratos. Inicialmente foram feitas a coleta, identificação e a obtenção do extrato.Determinou-se a CL50 utilizando o microcrustáceo Artemia salina Leach, as quais foram expostas por 24h às diferentes concentrações do EBS. Para realização do ensaio toxicológico agudo, administrou-se uma dose única de 4 g/kg v.o. de EBS a grupos de ratos Wistar, e para o ensaio crônico administrou-se 54,5 mg/kg v.o. durante 90 dias. Após um período de 14 dias para o agudo e 90 dias para o crônico, sacrificou-se os animais e coletou-se o sangue para análises bioquímicas e hematológicas. E diante dos resultados concluiu-se que esta planta não apresentou toxicidade aguda e crônica. 23.

(42) Barros, J.D.; Avaliação toxicológica pré-clínica com extrato bruto seco das folhas de vitex agnus castus linn... significativa para os parâmetros analisados, sendo necessário testes mais aprofundados para avaliar o grau de periculosidade da mesma.. INTRODUÇÃO. O Brasil tem o maior número de espécies vegetais de todo o planeta, dentre as estudadas, parte significativa tem importância econômica, alimentar ou medicinal, das quais muitas têm um potencial tóxico (ANDRADE, et al., 2001). Comparando com animais, plantas são bioquimicamente avançadas, produzindo todas as moléculas requeridas para o seu metabolismo primário (respiração, fotossínteses, proteínas, lipídios, síntese de ácidos nucléicos). As plantas têm desenvolvido uma incrível disposição para produzir componentes secundários, que têm um papel de defesa, de armazenamento e outras funções. Para lidar com diferentes tipos de herbívoros e suas diferenças alimentares, muitas plantas têm diversificado seus arsenais químicos, produzindo mais de um tipo de toxinas ao mesmo tempo. Os alvos variam. Os componentes podem ser venenosos para sistema nervoso central, coração, fígado, podem impedir o funcionamento dos rins, perturbar a coagulação sanguínea ou causar anemia, interferir com o metabolismo do iodo, causar alterações gastrintestinais, bloquear enzimas respiratórias chaves e atuar como carcinógeno. Em outros casos, o simples contato com a planta pode produzir reações alérgicas severas e reações na pele (PIP, E., 2006). O emprego de plantas no combate a enfermidades é uma tradição que tem uma longa história, remontando aos períodos mais longínquos da humanidade. A fitoterapia empírica esteve sempre ligada a sociedades primitivas, vinculando-se a sistemas religiosos e a ritos mágicos (MATOS, 1982).. 24.

(43) Barros, J.D.; Avaliação toxicológica pré-clínica com extrato bruto seco das folhas de vitex agnus castus linn... É comum no estado de Pernambuco, assim como em todo o Brasil, a existência de feiras livres que comercializam produtos feitos com ervas e extratos naturais (com composição não padronizada), que associada a suscetibilidade do indivíduo agrava o quadro de acidentes por plantas tóxicas (ANDRADE, et al., 2001). Para comprovação e avaliação das plantas utilizadas na fitoterapia popular, instituições de ensino e pesquisa têm realizado ensaios farmacológicos e toxicológicos. No Brasil, as normas para a realização de ensaios toxicológicos estão contidas na Resolução da Diretoria Colegiada (RDC) no 48/2004 da Agência Nacional de Vigilância Sanitária (ANVISA), e na Resolução Específica (RE) no 90/2004, que padroniza os ensaios toxicológicos pré-clínicos. Vitex agnus castus Linn. é um arbusto bastante ramificado com folhas fortemente aromáticas, digitadas, opostas e flores labiadas, violáceas, em cachos terminais. Floresce no verão e desenvolve frutos de coloração marrom, quase preto, com cerca de 3,5 mm de diâmetro. Pode alcançar de 2 a 3 metros de altura. Os frutos têm aroma e sabor semelhantes á pimenta e quando maduros e secos, é a parte da planta utilizada medicinalmente. Pertence a ordem Lamiales, á família Verbenaceae, que possui aproximadamente 100 gêneros e 2600 espécies, o gênero Vitex possui aproximadamente 250 espécies. São naturais da região do Mediterrâneo e da Criméia, sendo encontradas também em regiões quentes da Ásia, África e Américas. A maioria dos estudos clínicos com Vitex agnus castus Linn. foram realizados com a tintura obtida a partir dos frutos. Os textos médicos e monografias da Europa citam essa preparação como "ativa farmacologicamente". Essa é uma indicação de que a atividade medicinal do fruto foi examinada como um todo, e que compostos ativos específicos ainda não foram isolados. Este trabalho se propõe a realizar uma avaliação da toxicidade do extrato bruto seco da Vitex agnus castus com o objetivo de gerar dados que permitam uma análise dos riscos do uso popular.. 25.

(44) Barros, J.D.; Avaliação toxicológica pré-clínica com extrato bruto seco das folhas de vitex agnus castus linn... MATERIAIS E MÉTODOS. Material vegetal e seu extrato bruto. Coletaram-se folhas da planta Vitex agnus castus Linn., no bairro de cidade universitária, Recife, Pernambuco as quais foram encaminhadas ao herbário do Centro de Ciências Biológicas da universidade Federal de Pernambuco para serem identificadas e catalogadas. O material foi seco a sombra em temperatura ambiente durante oito dias. Em seguida foram colocadas em estufa de fluxo de ar forçado a 40°C, para secagem. Posteriormente, foram trituraradas até atingirem baixa granulometria. O pó foi submetido a uma infusão em um litro de água destilada, após a fervura (100ºC) foi vertido o líquido sobre um béquer contendo 20g de pó da planta, e feita homogeneização. Cobriu-se com papel-alumínio, e a solução permaneceu em repouso ate chegar a temperatura ambiente (25ºC). Após esse período, filtrou-se o sobrenadante em papel-filtro do tipo coador descartável. O filtrado foi colocado em cápsula de porcelana em banho-maria a 50° C ate secura, o extrato seco obtido foi transferido para um cristalizador, e transferido para um dissecador contendo cristais de sílica ativada e H2SO4. Obtendo um extrato seco com rendimento de 99,5% sobre o peso seco da planta processada.. Animais. Empregaram-se ratos Wistar, albinos (Rattus norvegicus), adultos, machos e fêmeas (nulípara e não grávidas), pesando entre 200 e 300 gramas para o teste toxicológico agudo, todos adquiridos do Biotério do Departamento de Ciências Farmacêuticas da Universidade Federal de Pernambuco com 70 dias de nascidos. Todos foram agrupados. 26.

(45) Barros, J.D.; Avaliação toxicológica pré-clínica com extrato bruto seco das folhas de vitex agnus castus linn... em gaiola de polietileno, contendo seis animais em cada, mantidos em condições controladas de temperatura (22 ºC ± 2º), ciclo claro-escuro de 12 h, tendo acesso a comida tipo pellets de ração Purina e água potável em garrafas graduadas de polietileno. O protocolo experimental foi aprovado pelo Comitê de Ética em Experimentação Animal (CEEA) da UFPE, processo número 23076.009417/2008-15.. Toxicidade aguda. Os protocolos experimentais foram orientados pelas normas vigentes no país e por obras de referência (BARROS; DAVINO, 2003; BRASIL, 2004; JACOBSON-KRAM; KELLER, 2001; BRITO, 1994). Quatro grupos de animais (n=24) foram utilizados. Os grupos A e B receberam o EBS dissolvido com soro fisiológico, por via oral, através de cânula, na dose de 4 g/kg de peso. Os grupos C e D, grupos controle, receberam apenas o veículo, soro fisiológico. Os ratos (Rattus norvegicus) foram observados durante 48 horas, e, no fim desse período, foi registrada a mortalidade de cada grupo. Após 14 (quatorze) dias da administração da dose de 4g/Kg utilizada para investigação da DL50, todos os animais sacrificados, então,. foram previamente anestesiados com Ketamina e Xilasina e. examinados macroscopicamente, com ressecção e pesagem. consecutiva de baço, coração, fígado e rins (seccionados por incisão sagital). As secções teciduais dos órgãos excisados, fixados em formalina tamponada, após 24 horas, foram resseccionados para processamento histopatológico: desidratação com séries crescentes de álcool (70º a 100º), a diafanização em xilol, impregnação e inclusão em parafina, segundo métodos habituais. Em micrótomo, aos fragmentos tissulares foram seccionados em espessura de 3,0µm e subseqüentemente submetidos à coloração hematoxilinaeosina e tricômico de Masson, e examinados ao microscópio óptico.. 27.

(46) Barros, J.D.; Avaliação toxicológica pré-clínica com extrato bruto seco das folhas de vitex agnus castus linn... Determinação da CL50 com Artemia salina Leach.. Determinou-se a Concentração Letal para 50% da população (CL50) utilizando o microcrustáceo Artemia salina Leach. Os metanáuplios da Artemia salina Leach foram obtidos através da eclosão em água salina (água do mar e água destilada, 1:1), segundo método de Meyer, onde foram incubados sob luz 25 mg de cistos. Foram preparadas em triplicatas as seguintes concentrações de EBS: 1000 µg/ml, 750 µg/ml, 500 µg/ml, 250 µg/ml, 100 µg/ml e 50 µg/ml. Em cada tubo colocou-se 10 a 12 Artemia salina Leach. Após 24 h de exposição, fez-se a leitura de quantas morreram por tubo e os valores são lançados no programa PROBITOS que através de uma equação Y=ax+b fornece a CL50.. Avaliação laboratorial do sangue. Após 13 semanas, término do experimento para avaliação da toxicidade crônica, foram coletadas amostras de sangue intraventricular, de todos os animais, machos e fêmeas, dos grupos tratados com EBS e do grupo controle. O sangue foi coletado em tubos contendo. anticoagulante. EDTA,. para. avaliação. de. parâmetros. hematológicos. (hemograma completo e contagem de plaquetas) e em tubos contendo gel separador, que foram centrifugados por 10 minutos a 3500 rpm, para obtenção do soro, destinado a análise bioquímica (glicose, uréia, creatinina, transaminases AST e ALT, colesterol, triglicerídios, acido úrico, fosfatase alcalina, proteínas totais e frações, sódio, potássio, magnésio).. Exame anatomopatológico. 28.

(47) Barros, J.D.; Avaliação toxicológica pré-clínica com extrato bruto seco das folhas de vitex agnus castus linn... Os 24 ratos tanto do grupo controle quanto do grupo tratado com EBS, foram sacrificados sob anestésia, submetidos a exame necroscópico, efetuando-se consecutiva retirada e pesagem de coração, fígado, baço e rins. Os órgãos após seccionamento foram imerso em solução de formol a 10%, tamponada. Após 24 horas de fixação dessas peças anatômicas, foram obtidas amostras necessárias para processamento histopatológico, empregando-se técnicas de inclusão em parafina e coloração com hematoxilina-eosina e tricrômo de Masson.. Microscopia óptica. A citologia sanguínea é geralmente estudada em esfregaços preparados pelo espalhamento de uma gota de sangue sobre uma lâmina. Desta forma as células ficam estiradas, o que facilita a observação de sua estrutura. Após a fixação, os esfregaços sanguíneos foram submetidos a coloração do tipo Romanowsky.. Análise estatística. Os resultados numéricos foram expressos em média aritmética (± erro padrão). As diferenças entre grupos foram determinadas através do Teste T. Os resultados foram considerados estatisticamente significativos quando p<0,05.. RESULTADOS E DISCUSSÃO. Determinação da CL50 com Artemia salina Leach.. 29.

(48) Barros, J.D.; Avaliação toxicológica pré-clínica com extrato bruto seco das folhas de vitex agnus castus linn... A determinação da CL50 que é realizada através do uso de metanáuplios de Artemia salina Leach, fornece um indicativo do nível de toxicidade de uma determinada substância. A literatura refere-se que uma CL50 inferior a 1000 µg/mL, apresenta uma potencial toxicidade para os organismos que possam ser expostos à ela. Esta metodologia que utiliza Artemia salina Leach forneceu uma CL50 de 801,266 µg/mL para Vitex agnus castus Linn. Os valores obtidos são próximos a 1000 µg/mL, indicando uma baixa toxicidade para esta planta (Figura 01).. B 100. Equação Y=ax+b = 801,266µg/mL % DE VIVOS. 80. 60. 40. 20. 0. 200. 400. 600. 800. 1000. CONCENTRAÇÃO Ug/mL. Figura 01: Curva Concentração-Resposta da toxicidade do extrato aquoso de Vitex agnus castus Linné sobre Artemia salina Leach.. Determinação dos parâmetros hematológicos e bioquímicos. 30.

(49) Barros, J.D.; Avaliação toxicológica pré-clínica com extrato bruto seco das folhas de vitex agnus castus linn... Após 14 dias de administração do EBS da Vitex agnus castus Linn. dissolvido em água destilada (4 g/Kg) foram feitos os exames hematológicos (tab.01), cujas comparações com os animais controle, não mostraram mudanças significativas para nenhum item considerado. Mesmo observando valores diferenciados em alguns itens como plaquetas e linfócitos, ambos não apresentaram significância estatística. Considerando os resultados obtidos na avaliação dos parâmetros bioquímicos (tab.02), podemos observar que também não houve alterações significativas relacionadas ao grupo controle. As análises das enzimas transaminases séricas (ALT e AST) são importantes indicadores de lesões nas células hepáticas. Uma droga não provoca dano algum no fígado sem interferir com a atividade normal dessas enzimas. A fosfatase alcalina é fundamental para a formação de constituintes. da. membrana. celular,. influenciando. na. sua. permeabilidade.. As. transaminases existem em concentrações muito pequenas no sangue e são liberadas pelos hepatócitos quando estes sofrem algum tipo de lesão. Os aumentos nos níveis plasmáticos de ALT observados em nosso estudo, além de serem estatisticamente significantes em relação ao grupo controle, ficaram acima do nível de referência para a espécies, situado entre 21 – 52 UI/L, segundo Coimbra et al. (1995). Estes dados fornecem indícios de alterações na função hepática, uma vez que os níveis séricos de ALT aumentam quando ocorrem alterações na permeabilidade ou injúria nos hepatócitos. A AST é essencialmente mitocondrial e não é liberada tão rapidamente quanto a ALT, que é citoplasmática. Isto pode vir a justificar o fato de termos encontrado alterações significativas apenas nos níveis de ALT. Além disso, a ALT é indicador mais sensível de hepatotoxicidade do que a AST, pois enquanto a primeira é essencialmente hepática, a segunda também pode ser encontrada em altas concentrações em outros órgãos, como rins, pulmões e coração. Por outro lado, os estudos histológicos não encontraram alterações no fígado.. 31.