UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS FACULDADE DE CIÊNCIAS MÉDICAS
LUÍS FERNANDO GODOY FALCO
ESTUDO COMPARATIVO ENTRE ATIVOS FARMACÊUTICOS E ESPÉCIES RELACIONADAS UTILIZANDO IMAGEAMENTO OBTIDO POR
ESPECTROMETRIA DE MASSAS-MALDI: QUALIDADE VERSUS ADULTERAÇÃO EM COMPRIMIDOS DE SILDENAFILA
A COMPARATIVE STUDY BETWEEN AN ACTIVE PHARMACEUTICAL INGREDIENT AND ITS RELATED SPECIES USING MALDI IMAGING MASS
SPECTROMETRY: QUALITY VS. ADULTERATIONS IN SILDENAFIL TABLETS
CAMPINAS 2018
LUÍS FERNANDO GODOY FALCO
ESTUDO COMPARATIVO ENTRE ATIVOS FARMACÊUTICOS E ESPÉCIES RELACIONADAS UTILIZANDO IMAGEAMENTO OBTIDO POR
ESPECTROMETRIA DE MASSAS-MALDI: QUALIDADE VERSUS ADULTERAÇÃO EM COMPRIMIDOS DE SILDENAFILA
A COMPARATIVE STUDY BETWEEN AN ACTIVE PHARMACEUTICAL INGREDIENT AND ITS RELATED SPECIES USING MALDI IMAGING MASS
SPECTROMETRY: QUALITY VS. ADULTERATIONS IN SILDENAFIL TABLETS
Dissertação apresentada à Faculdade de Ciências Médicas da Universidade Estadual de Campinas, como parte dos requisitos exigidos para a obtenção do título de Mestre em Ciências.
Dissertation presented to College of Medical Sciences of the University of Campinas - UNICAMP as part of the requirements for obtaining the degree of Master in Sciences
ORIENTADOR: PROF. DR. RODRIGO RAMOS CATHARINO
ESTE EXEMPLAR CORRESPONDE À VERSÃO FINAL DA DISSERTAÇÃO DEFENDIDA PELO
ALUNO LUÍS FERNANDO GODOY FALCO, E ORIENTADO PELO PROF. DR. RODRIGO RAMOS CATHARINO.
CAMPINAS 2018
Agência(s) de fomento e nº(s) de processo(s): Não se aplica.
Ficha catalográfica
Universidade Estadual de Campinas Biblioteca da Faculdade de Ciências Médicas
Maristella Soares dos Santos - CRB 8/8402
Falco, Luís Fernando Godoy,
F182e FalEstudo comparativo entre ativos farmacêuticos e espécies relacionadas utilizando imageamento obtido por espectrometria de massas-MALDI: qualidade versus adulteração em comprimidos de sildenafila / Luís Fernando Godoy Falco. – Campinas, SP : [s.n.], 2018.
FalOrientador: Rodrigo Ramos Catharino.
FalDissertação (mestrado) – Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas.
Fal1. Medicamentos falsificados. 2. Medicamentos - Análise. 3. Espectrometria de massas. 4. Espectrometria de massas por ionização e dessorção a laser assistida por matriz. I. Catharino, Rodrigo Ramos, 1977-. II. Universidade Estadual de Campinas. Faculdade de Ciências Médicas. III. Título.
Informações para Biblioteca Digital
Título em outro idioma: A comparative study between an active pharmaceutical ingredient and its related species using MALDI imaging spectrometry: quality vs. adulterations in sildenafil tablets
Palavras-chave em inglês: Counterfeit drugs
Drugs, Analysis Mass spectrometry
Spectrometry, Mass, Matrix-assisted laser desorption-ionization Área de concentração: Fisiopatologia Médica
Titulação: Mestre em Ciências Banca examinadora:
Rodrigo Ramos Catharino [Orientador] Celia Regina Garlipp
Monica Siqueira Ferreira Data de defesa: 30-01-2018
Programa de Pós-Graduação: Fisiopatologia Médica
BANCA EXAMINADORA DA DEFESA DE MESTRADO
LUÍS FERNANDO GODOY FALCOORIENTADOR: PROF. DR. RODRIGO RAMOS CATHARINO
MEMBROS:
1. PROF. DR. RODRIGO RAMOS CATHARINO
2. PROFA. DRA. CELIA REGINA GARLIPP
3. PROFA. DRA. MÔNICA SIQUEIRA FERREIRA
Programa de Pós-‐Graduação em Fisiopatologia Médica, da Faculdade de Ciências Médicas, da Universidade Estadual de Campinas.
A ata de defesa com as respectivas assinaturas dos membros da banca examinadora encontra-‐se no processo de vida acadêmica do aluno.
Aos meus pais e minha irmã, por serem a fonte de inspiração e motivação de todos os dias. Aos meus amigos, pelo apoio, paciência, compreensão e dedicação. Aos meus avós, pelo carinho, amor e exemplos de vida. Aos meus Professores, pelos ensinamentos, pela dedicação, pelos bons momentos durante todo o período de graduação, dentro e fora da sala de aula, por terem se mostrado mais do que docentes, mas sim amigos.
AGRADECIMENTOS
Primeiramente a Deus, pelas graças alcançadas até os dias de hoje e pela benção de estar vivo e ter tido a oportunidade de ingressar em uma das melhores Universidades do Brasil, junto de pessoas fantásticas que acompanharei para o resto de minha vida.
Ao Professor Dr. Rodrigo Ramos Catharino, orientador, professor e amigo, de longa data, sem o qual a realização deste trabalho seria impossibilitada; com seus ensinamentos e apoio. Só Alegria!
Aos meus queridos amigos e amigas, a família que escolhi e pedi a Deus, que dividiram comigo muitas felicidades, angústias, alegrias, tristezas; mas que sobretudo me fazem feliz, a cada dia. Em especial Carol, Marina, Maurício e Olício. Obrigado a todos pela paciência, pelo apoio e pelo companheirismo.
Aos meus amados avós, Mathilde e Alcides (em memória) por me fazerem o neto mais querido e mimado do mundo inteiro, com todo o carinho e amor que alguém pode receber.
Aos meus amados pais, Mario e Marlene, pelos incentivos diários, pelo exemplo de pessoas que são, pelo amor incondicional, pela presença em minha vida.
À minha querida irmã, Daniela, que com tanta sinceridade sempre está por perto como fiel escudeira, com todo amor e carinho que lhe são característicos.
Aos amigos Cibele, Diogo, Estela, Fernando, Tati, sempre cuidadosos e atenciosos no apoio às dificuldades e cooperação com as diversas técnicas desenvolvidas no laboratório Innovare.
RESUMO
Medicamentos falsificados são hoje um problema endêmico em todo o mundo, que causa muitos problemas, sejam de cunho financeiro ou relacionados à perda de qualidade da saúde. O desenvolvimento de métodos de análise rápidos e confiáveis, com capacidade de produção de resultados baseados em marcadores químicos das drogas, tem sido buscado por todos aqueles envolvidos na cadeia de produção e distribuição de ativos farmacêuticos. É proposto no presente trabalho o desenvolvimento de um método baseado em imageamento obtido por MALDI, produzido com mínima e simples preparação de amostras, combinando um robusto tratamento estatístico que seleciona marcadores químicos específicos para Sildenafila, uma droga amplamente prescrita em muitos países para tratamento da disfunção erétil, em uma plataforma que permite aplicação teórica a qualquer produto farmacêutico com elevada especificidade.
Palavras-chave; Medicamentos falsificados. Medicamentos – Análise. Espectrometria de massas. Espectrometria de massas por dessorção a laser assistida por matriz.
ABSTRACT
Falsified drugs are an endemic problem worldwide that results in both monetary and health-related losses. Developing fast and reliable methods that are able to present a timely result based on the drug’s fingerprint is an effort that is being sought by those involved in the whole distribution chain. We propose herein a MALDI imaging-based method that provides simple and minimal sample preparation, combined with a robust statistical treatment that elects specific markers for sildenafil, a widely prescribed drug for erectile dysfunction, in a platform that may be applied for virtually any pharmaceutical product with great specificity.
Keywords: Falsified Medicine. Medicine – Analysis. Mass spectrometry. Matrix-assisted laser desorption/ionization.
LISTA DE FIGURAS
Figura 1 Foto do sistema Maldi-ltq-xl (thermo scientific, san jose, ca)...…………...15
Figura 2 Princípios do MALDI-MS. A) Efeito do laser sobre a matriz e ionização / separação do analito , produzindo sinais de intensidade x razão carga/massa do íon. B) Esquema de espectro de massas obtido na faixa de leitura 2 a 20kDA. C) Amplificação do espectro de massas na faixa de 5 a 8kDA ..…….………..………...…... 17 Figura 3 Espectro de massas representativo de todos os grupos de amostras
analisados: Medicamento referencia (R) , produto falsificado (CF) e medicamentos genéricos (G1-G4). Modo de análise positivo...…. 35 Figure 4 Análise PLS-DA demonstrando a organização das amostras em grupos
separados………..…..………..……….… 36 Figure 5 Gráficos de semi quantificação obtidos após análise MALDI-Imaging dos 11 compostos elegidos, protonados [M+H]+ além do íon Sildenafila (475 m/z)....37
Figure 6 Dendrograma obtido após análise de agrupamentos hierárquicos, demonstrando clara distribuição das amostras, mesclando diferentes grupos de acordo com suas semelhanças...………...………... 38
LISTA DE TABELAS
Tabela 1
Espécies relacionadas à Sildenafila identificadas após análises de VIP Scores ………...………...…….33/34
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
PDE-5 Enzima Fosfodiesterase tipo 5 cGMP Monofosfato Cíclico de Guanosina
NO Óxido Nítrico
MALDI Ionização por dessorção a laser assistida por matriz (Matrix-assisted laser desorption/ionization)
MS Espectrometria de massas (Mass spectrometry)
MSI Imageamento obtido por espectrometria de massas (Mass spectrometry imaging)
SP-LDI-MS
Espectrometria de Massas por Ionização/Dessorção a Laser em Placa de Sílica (Silica Plate Laser Desorption/Ionization Mass Spectrometry)
CHCA Ácido α-ciano-4-hidroxicinaminico TOF Tempo de voo – do inglês: time of flight
VIP Presença muito importante – do inglês: very important in presence PLSDA Análise discriminante de mínimos quadrados parciais – do inglês:
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO ... 13
2 OBJETIVOS ... 18
3 METODOLOGIA ... 19
3.1 Amostras ... 19
3.2 Preparação das amostras ... 19
3.3 MALDI-MSI ... 20
3.4 Elucidação da estrutura ... 20
3.5 Semi-quantificação por MSI ... 20
3.6 Análise estatística ... 21
4 RESULTADOS ... 22
5 DISCUSSÃO GERAL ... 39
6 CONCLUSÃO ... 42
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1 INTRODUÇÃO
A adulteração de produtos farmacêuticos tem se tornado um grande problema, em escala mundial, especialmente em países subdesenvolvidos. Estima-se que mais de 10% de todos os medicamentos comercializados, atualmente, tenham sofrido algum tipo de adulteração ou falsificação. A adulteração pode ser proveniente de vários fatores, como por exemplo a quantidade, a natureza química do princípio ativo ou mesmo a embalagem do produto. [1] Uma grande dificuldade no controle deste tipo de insumo, refere-se ao fato de não haver uma legislação internacional uniformizada para estabelecer parâmetros que definem e qualificam medicamentos falsificados e adulterados, bem como as sansões sobre aqueles que praticam ilicitudes para alcançar e comercializar estes compostos. [2]
Autoridades sanitárias estimam milhares de mortes, anualmente, devido ao uso de medicamentos e insumos farmacêuticos adulterados. Segundo dados informados pela Agência Nacional de Vigilância Sanitária – ANVISA os maiores índices de falsificação e adulteração de medicamentos no Brasil recai sobre aqueles de alto custo, especialmente os anti neoplásicos, anabolizantes e medicamentos para o tratamento de disfunção erétil e inibidores seletivos da fosfodiesterase-5 (PDE-5). [3]
A Sildenafila é um potente inibidor seletivo da enzima fosfodiesterase-5, prescrito atualmente em larga escala mundial para o tratamento da disfunção erétil masculina. Seu efeito farmacológico culmina na melhora da performance sexual, causada pela intumescência peniana. [4]
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Após a inibição seletiva da PDE-5, a ação do medicamento resulta em interrupção da degradação de cGMP , um segundo mensageiro relacionado à síntese de NO intracelular, presente em células da musculatura lisa do endotélio vascular dos corpos cavernosos penianos bem como dos vasos pulmonares. [5]
Ao longo dos anos tem sido cada vez maior a busca por métodos analíticos precisos e sensíveis para a determinação da massa molecular de biopolímeros e outros compostos de interesse farmacológico. Métodos tradicionais de espectrometria de massas, são utilizados para a análise de compostos de baixo peso molecular.[6]
Durante as últimas duas décadas o aprimoramento de técnicas de ionização e o aparecimento de novas matrizes de volatilização permitiram a solução deste problema. [6-7]
O avanço nas tecnologias associadas ao imageamento obtido por espectrometria de massas (MSI) permite a análise de inúmeros compostos, como por exemplo drogas e seus metabólitos, biomoléculas endógenas e micro estruturas com elevada rapidez, sensibilidade e especificidade. [8]
As técnicas de ionização por eletronspray e dissorção a laser assistida por matriz associadas à espectrometria de massas (da sigla em inglês MALDI-MS) mostram-se como as mais promissoras para análise de biocompostos com peso molecular variando entre alguns milhares e algumas centenas de milhares de daltons. [6-7]
Na área médica, o uso do MALDI-MS mostra-se promissor uma vez que provê uma revolução diagnóstica com o estabelecimento de novos biomarcadores para doenças em ensaios histoquímicos . Recentemente a técnica permitiu a determinação de moléculas associadas a regiões cancerosas em amostras de tecidos biológicos, além de fornecer testes sobre o monitoramento do metabolismo de drogas em vários organismos. [9-10]
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Graças à sensibilidade e especificidade molecular dos equipamentos mais modernos, moléculas como drogas, metabólitos e outros biomarcadores podem ser monitorados diretamente em amostras de tecidos. [11]
Utilizando-se MALDI-MS, o pacote inicial de íons é produzido após um pulso de laser ser absorvido pela matriz depositada sobre a amostra. Esta é responsável pela ionização do composto a ser analisado. Sua função primordial é absorver a energia imposta pela radiação do laser e também separar as moléculas do analito umas das outras. [6-12]
Apesar de simples, a etapa de preparo da amostra a ser analisada é extremamente importante e crucial para garantir o sucesso do experimento, bem como sua reprodutibilidade. Detalhes como a utilização ou não de matriz, a quantidade de matriz utilizada, a forma de aplicação ou mesmo a espessura da amostra imposta irão interferir diretamente no resultado final. [13-14]
Para que um componente apresente-se como matriz para a técnica em questão, é preciso que tenha uma boa absorbância frente o comprimento de onda estabelecido pela radiação do laser e, tenha alta capacidade de se sublimar. [9]
Figura 1:Foto do sistema Maldi-ltq-xl (thermo scientific, san jose, ca) – Imagem Reproduzida de:
https://www.thermoscientific.com/content/dam/tfs/ATG/CMD/CMD%20Marketing%20Material/Ma ssSpectrometryCollateral/Brochures/BR30159-MALDI-LTQ_Orbitrap.pdf ; visita em 21/05/2015
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O protocolo típico para o preparo de amostras para análise de biomarcadores no MALDI-MS consiste em cobrir a amostra com uma solução que contenha pequenos compostos orgânicos, como por exemplo, ácido α-ciano-4-hidroxicinaminico (CHCA) ou ácido sinapinico (SA). Após a cristalização da matriz, a amostra é analisada no interior do aparelho. [9]
Após a ionização, a massa de uma amostra pode ser medida através da razão massa/carga da mesma, obtida pela análise de sua velocidade e tempo de voo em um analisador de massas. [6]
No aparelho um pacote de íons é acelerado, segundo uma energia cinética fixa, sobre um potencial elétrico. A velocidade será proporcional à razão massa / carga ( m / z ) -1/2 da espécie em questão. Por fim, sinais são produzidos por um detector sempre que um pacote de íons o atinge. [6]
No modo positivo de ionização, íons positivos protonados são formados a partir do analito na amostra em questão (íons + H )+ enquanto que no modo
negativo de análise, íons desprotonados são gerados (íons – H)- . Ambos são
reconhecidos pelos diferentes tipos de analisadores de massas presentes no sistema MALDI-MS. [15]
Após serem processados pelo analisador de massas, é possível a integração dos dados obtidos de forma a reconstruir virtualmente a superfície da amostra e determinar a distribuição de determinada molécula na área determinada, ou mesmo quantificá-la, seguindo um padrão de calibração. [11]
Alguns importantes analisadores de massas tem sido associados para a composição dos mais modernos sistemas MALDI. São eles: tempo de voo (do inglês: time of flight – tof), quadrupolo-tempo de voo, armadilha de íons (do inglês: ion trap) e transofrmadores de Fourier. [11]
O imageamento obtido com a espectrometria de massas associada à dissorção a laser pode ser utilizado para elucidar a localização espacial de compostos dentro de uma área definida de análise. A intensidade do sinal obtido dentro de determinadas coordenadas geométricas está associada à quantidade do composto analisado. [16] A técnica tem sido utilizada para a determinação de substâncias como proteínas, lipídios, insumos farmacêuticos e seus metabólitos. Nos últimos anos, tem apresentado grande importância no mapeamento de regiões cancerosas através da localização de biomarcadores em amostras de tecidos celulares. [17]
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Uma outra técnica de espectrometria de massas, comumente chamada de Ms/Ms, ou ainda Ms2, refere-se ao método em que tem-se dois detectores de massas após a fonte de ionização. Os íons obtidos após o primeiro analisador, são fragmentados, segundo quantidade de energia controlada para dar origem a fragmentos de íons, que são posteriormente caracterizados. [18] A técnica tem grande importância de uso uma vez que tem caráter confirmatório de análises anteriormente efetuadas, visto que o padrão de fragmentação de cada composto é previamente conhecido e pode ser utilizado para confirmação de identificação de uma molécula. [19]
Figura 2: Princípios do MALDI-MS. A) Efeito do laser sobre a matriz e ionização / separação do analito , produzindo sinais de intensidade x razão carga/massa do íon. B) Esquema de espectro de massas obtido na faixa de leitura 2 a 20kDA. C) Amplificação do espectro de massas na faixa de 5 a 8kDA (Imagem reproduzida de Schwamborn et al [15])
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2 OBJETIVOS
Desenvolver metodologia analítica, com o uso de MALDI-IMAGING, com pouco ou nenhum preparo de amostra, de forma rápida e segura, para determinar e elucidar marcadores químicos que possam servir como ferramentas no controle de qualidade e autenticidade de medicamentos, cosméticos e outros insumos farmacêuticos.
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3 METODOLOGIA
3.1 Amostras
Foram comprados comprimidos de citrato de sildenafil de seis fabricantes diferentes, de acordo com a seguinte lógica: um oriundo do fabricante de medicamentos de referencia e quatro de fabricantes genéricos, comprados em farmácias regulares e registradas na cidade de Campinas-SP, e um obtido no mercado informal. Todos os comprimidos eram revestidos com película, com uma concentração nominal de 50 mg.
Os nomes e/ou marcas comerciais foram suprimidos aqui devido a razões legais e éticas
Os números dos grupos foram distribuídos aleatoriamente para evitar viés e foram identificados como “R” (medicamento de referência), “CF” (medicamento falsificado) e “G (1-4)“ (medicamentos genéricos).
3.2 Preparação das amostras
Os comprimidos foram divididos pela metade ao longo da linha do sulco, utilizando uma lâmina afiada; o lado cortado foi então levemente esfregado em uma placa de gel de sílica de TLC, com dimensões de1,5 cm x 1,5 cm (Merck, Darmstadt, Alemanha), tendo sido previamente ativada a 120oC, por 20 minutos.
A placa foi enviada, em seguida, para o imageamento no espectrômetro de massas (MSI).
Nenhuma matriz foi adicionada à superfície manchada.
As amostras foram analisadas em triplicatas técnicas, cada uma com quintuplicata analítica associada.
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3.3 MALDI-MSI
Um aparelho MALDI LTQ-XL (Thermo Scientific, San Jose, CA) foi utilizado para aquisição de dados MSI.
As condições de operação foram as seguintes: energia de laser de nitrogênio de 20 µJ, três disparos de laser por etapa e 20-50 unidades de energia em dissociação colisão-induzida (CID) para análises MS/MS.
Todos os espectros foram adquiridos no modo íon positivo, na faixa de massa de 50 a 1000 m/z.
3.4 Elucidação da estrutura
As moléculas propostas foram baseadas no perfil de fragmentação MS/MS (íons produto) gerado.
A elucidação da estrutura foi orientada pela busca de compostos relacionados à sidenafila no PUBCHEM e confirmadas com modelos de cálculo teórico, fornecidos pelo software Mass Frontier (v.6.0, Thermo Scientific, San Jose, CA).
3.5 Semi-quantificação por MSI
As imagens químicas das amostras analisadas foram geradas usando o recursos MSI e processadas usando o software Image Quest (Thermo Scientific, San Jose, CA).
Depois de processar as imagens em escala de cinza, todas as repetições para cada amostra (n=15) tiveram sua área padronizada convertida em valores não dimensionais pelo software ImageJ (National Institutes of Health, Bethesda, MD – open source), que são diretamente proporcionais à
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concentração do íon selecionado na amostra, conforme descrito em contribuições anteriores [20-21].
3.6 Análise estatística
A análise estatística foi realizada por Quadrados Mínimos Parciais – Análise Discriminante (PLS-DA), com uma importante variável na lista de pontuação de projeção (VIP).
O conjunto de dados foi padronizado para a amostra de referencia. A escolha de marcadores químicos utilizados para comparar formulações foi baseada em um score VIP superior a 2,5.
Os dados semi-quantitativos dos marcadores foram testados usando o teste ANOVA unidirecional, depois que a normalidade foi verificada pelo teste de Kolmogorov-Smirnov.
A análise de agrupamento hierárquico foi realizada utilizando a medida de distância euclidiana e o algoritmo de agrupamento Ward.
A significância estatística da modelagem PLS-DA foi realizada por teste de permutação.
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4 RESULTADOS
A MASS SPECTROMETRY IMAGING-BASED APPROACH TO ASSESS ADULTERATIONS IN PHARMACEUTICALS PRODUCTS
Luís Fernando Godoy Falco, Carlos Fernando Odir Rodrigues Melo, Diogo Noin de Oliveira, Tatiane Melina Guerreiro, Rodrigo Ramos Catharino*
Innovare Biomarkers Laboratory, School of Pharmaceutical Sciences, University of Campinas, Campinas, SP, Brazil, 13083-877.
*Corresponding author: Prof. Rodrigo Ramos Catharino (rodrigo.catharino@fcf.unicamp.br)
ABSTRACT
Falsified medicines are an endemic problem worldwide that results in both monetary and health-related losses. Developing fast and reliable methods that are able to present a timely result based on the drug’s fingerprint is an effort that is being sought by those involved in the whole distribution chain. We propose herein a LDI imaging-based method that provides simple and minimal sample preparation, combined with a robust statistical treatment that elects specific markers for sildenafil, a widely prescribed drug for erectile dysfunction that is often target of adulterations. The method is able to provide quality markers, which can be applied in the fast screening of any product within the same molecular class. This same strategy may be a useful alternative to provide accurate measurements with high specificity for unraveling contaminants and/or byproducts in virtually any given pharmaceutical product.
Keywords: Falsified medicines; direct analysis; mass spectrometry imaging, LDI, chemical fingerprints
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1. Introduction
Falsification of pharmaceutical products is becoming a huge problem worldwide, especially in developing countries. [1] It is estimated that 10% of drugs marketed present some degree of falsification [2]; these numbers, however, vary according to the existing sanitary controls. A general rule is that the falsification or adulteration rates have an inverse relationship with the stringency of regulations [3]. It is estimated that 60% of the marketed drugs in Africa are falsified, 30% in Latin America and 1% in Europe [3-5]. Although there is no clear international definition on what a falsified drug is, which impairs legal and regulatory sanctions in an international environment [6], the World Health Organization establishes as falsified drugs those which are purposely tampered regarding its identity, packaging and/or source, including branded and generic products, with or without the active pharmaceutical ingredient (API), both qualitatively and quantitatively [4]. Alternatively, there are adulterated drugs, which are genuine products, produced by authorized and regulated manufacturers that fail to comply with predefined quality standards. Drug falsification, especially in developed countries, is highly facilitated by electronic commerce, where an estimated 50% of marketed drugs are fake. This phenomenon occurs essentially due to a combination of easy access and considerably lower prices of drugs that normally require a prescription, in addition to the great difficulty for government authorities in effectively restraining this practice [7].
The continuous development of simple and highly specific yet comprehensive techniques for identifying a large number of falsified drugs is necessary, so that reliable results can be achieved in a fast and accurate way. There is currently a large number of methodologies designed for drug analysis, that range from quick tests with little specificity such as colorimetric [8] and thin-layer chromatography (TLC) [9], to more sophisticated and sensitive approaches such as HPLC [10], infrared (IR) spectroscopy [11], nuclear magnetic resonance (NMR) [12] and, mass spectrometry (MS) [13, 14]. The latter may be coupled with a chromatographic technique for falsified screening; nevertheless, limitations may arise from these combinations due to analyte
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coelution, and the need for large amounts of ultrapure solvents, which generate a great amount of residues, in addition to long sample preparation protocols and analysis time [3]. Spectroscopic techniques such as Raman, IR and NMR, on the other hand, have little requirements regarding sample preparation. However, the acquisition of customized libraries is necessary from the manufacturer and, when unidentified species are present in the sample, it often demand laborious data interpretation, requiring great time and expertise to provide accurate results [15, 16].
Sildenafil is a common prescription drug for erectile dysfunction, which improves penile tumescence, improving quality and satisfaction during the sexual relation. [17] The drug is a selective inhibitor of phosphodiesterase tybe 5 (PDE5). The effect results in degradation interruption of cGMP, a second messenger associated with nitric oxide (NO) production and vascular dilation. [18] Aiming at simplifying drug adulteration and falsification screening, this contribution proposes the development of an analytical platform using MALDI-MSI, allowing direct and semiquantiative analysis of samples, with virtually no sample preparation [19]. For this purpose, we elected an API that is often target of falsifications and fraud: sildenafil citrate. Our results indicate that this approach is capable of distinguishing pharmaceuticals with the same active ingredient, in different formulations, produced by several manufacturers. We were able to differentiate successfully the reference drug from its generic, similar and falsified versions, providing quality markers that can be used for fast screening of any product within the same class.
2. Materials and Methods
2.1. Samples
Sildenafil citrate tablets from six different manufacturers were purchased, according to the rationale: 1 from the reference drug manufacturer and 4 from generic manufacturers, purchased from regular, registered drugstores in
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Campinas, and 1 obtained from the informal market. All tablets were film-coated, with a nominal concentration of 50 mg. Commercial names and/or brands are suppressed herein due to legal and ethical reasons. Group numbers were randomly assigned to avoid bias, and were identified as R (reference drug), CF (falsified product), and G(1-4) (generic drugs).
2.2. Sample preparation
Tablets were split in half along the groove line by using a sharp blade; the cut side was then lightly smeared onto a 1.5 x 1.5 cm TLC silica gel 60G plate (Merck, Darmstadt, Germany), which was previously activated at 120ºC for 20 minutes. The plate was then sent for mass spectrometry imaging (MSI). No matrix was added to the smeared surface. Samples were analyzed in technical triplicates, with each having an analytical quintuplicate associated.
2.3. MALDI-MSI
A MALDI LTQ-XL instrument (Thermo Scientific, San Jose, CA) was used for MSI data acquisition. Operating conditions were as follows: 20 µJ nitrogen laser energy, three laser shots per step, and 20–50 units of energy in collision-induced dissociation (CID) for MS/MS analyses. All spectra were acquired in the positive ion mode, in the mass range of 50 to 1000 m/z.
2.4. Structure elucidation
Proposed molecules were based on the MS/MS fragmentation profile (product ions) generated. Structure elucidation was guided by the search for sildenafil-related compounds in PUBCHEM and confirmed with theoretical calculation
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models provided by software Mass Frontier (v. 6.0, Thermo Scientific, San Jose, CA).
2.5. Semi-quantification by MSI
Chemical images of the analyzed samples were generated using the MSI feature and processed using Image Quest software (Thermo Scientific, San Jose, CA). After processing images into grayscale, all replicates for each sample (n = 15) had their standardized area converted into non-dimensional values by the ImageJ software (National Institutes of Health, Bethesda, MD – open source), which are directly proportional to the concentration of the selected ion in the sample, as described by previous contributions [20-21].
2.6. Statistical analysis
Statistical analysis was performed by Partial Least Squares - Discriminant Analysis (PLS-DA) with a variable importance in projection (VIP) score list. The dataset was standardized for the reference sample. The choice of chemical markers used to compare formulations was based on a VIP score greater than 2.5. Semi-quantitative data from the markers were tested using one-way ANOVA, after normality was checked by Kolmogorov-Smirnov test. Hierarchical clustering analysis was performed using the Euclidean distance measure and the Ward clustering algorithm. The statistical significance of PLS-DA modeling was performed by permutation test.
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By analyzing the survey scan spectra alone, it was not possible to verify clear differences among formulations, as the existing differences in spectra are very subtle, according to Figure 1. However submitting the dataset to hierarchical clustering statistical analysis, a clear separation of the samples into three groups was observed (Supplementary Material, Figure S1). Samples were clustered as group (i), the reference drug (R) in a single branch and, in another branch, group (ii), formed by generic drugs G1 and G2, and group (iii), formed by generic drugs G3 and G4, and the falsified product (CF). This analysis also provided a VIP scores list, with ions that favored the formation of each group, i.e. molecules that are more prominent in one group and thereby define it. From this list, 11 features were selected and characterized as the species that contributed the most to indicate differences between formulations (Table 1). Out of those, three species were visibly different in the spectra: ions 489 and 523, were not presence in the reference spectrum, while ion 703 was only detected in the reference spectrum. All 11 ions were then selected to perform a PLS-DA. As observed in Figure 2, this scores plot presented a considerably resolved profile, where the reference drug (R) is isolated on the left, with the falsified product (CF) grouped in the right, and all four generic drugs regularly marketed in Brazil falling between these two groups. These data allow us to infer that the proximity of hierarchical clusters is related to the degree of similarity of a given formulation with that of the reference drug.
For the three visibly distinct ions listed above , selected by VIP scores, 489 was characterized as homosildenafil, a non-regulated sildenafil analog with potential PDE5-inhibiting activity, and ion 523 was characterized as the sodium adduct of a cyclohexyl-linked derivative, substituted in the pyrazol ring. The presence of these two molecules may be understood as relevant markers, since they might be formed in a number of synthetic pathways used to reach sildenafil. These routes are not used only by generic manufactures, but also by falsifiers. Therefore, their presence would be a strong indication of a falsified product in suspected cases. Following this logic, ion 703 was characterized based on the premise of an entirely different synthetic pathway for the reference product. It is an ammonium ion byproduct formed by the cleavage of the pyrazol-guanine derivative ring and the addition of a second carboxyethoxyphenylsulfonyl unit. The presence of this ion in the reference
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product is warranted by the intermediates and reagents used in the process found in patent literature, thus confirming our hypothesis that different manufacturers use different synthetic routes. Interestingly, this species was not observed when submitted to HRMS, nor was it ever described in literature, probably because of the nature of the ammonium ion, which may be easily cleaved under acid conditions provided by sample preparation steps. Hence, when submitted to a soft ionization method in solid phase such as MALDI-MSI, there is little or no interference from the environment and the ion is ultimately observed in the reference product’s spectra.
To further assess the effectiveness of PLS-DA/VIP scores and validate these results, the 11-ion set was then submitted to semi-quantification by MSI, with the addition of ion 475 m/z, sildenafil, as a comparator. The results confirmed all previous interpretations, where the amounts of ions 523 m/z and 489 m/z in sample LB1 are 6.3 and 3.1 times lower than in the other formulations, respectively. On the other hand, the species at 703 m/z showed amounts up to 5.7 times greater in R when compared to other formulations, corroborating it as a feature that clearly describes the reference product over any other comparator. These three species, therefore, were considered validated as the most relevant markers for fast product tampering screening, reinforcing the relevance of the developed method in assessing both presence and concentration of API-related molecules, as their usefulness in forensic analysis aimed at identifying falsified products is evident. Furthermore, the absence of sildenafil in PLS-DA-elected markers, combined with results from semiquantification by MSI confirmed that API concentration has no significance in the evaluation of suspected falsified products, as even CF showed a concentration of sildenafil that may be considered equal to that of the reference formulation (Figure 3). When comparing only generic formulations, however, significant differences for the API parameter were observed among them, indicating the usefulness of this method also in monitoring sildenafil as a parameter to evaluate the quality of generic formulations.
The remaining eight ions elected by VIP scores were all characterized to be sildenafil-related compounds (Table 1). Ion 448 is a sildenafil molecule cleaved at the piperazine ring, possibly arising from either synthesis or during the product’s shelf-life; 503 has a N-pyrrolidinylethyl substituent in the
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sulfonylphenyl portion instead of the regular methylpiperazine, potentially due to problems in the synthesis. Likewise, ions 621 and 571 also show modifications at the methylpiperazine end, with structures that appear to be derived from the same byproduct formation pathway, and ion 785 is a heavily modified version of ion 703, with further additions of methylpiperazine moieties and rearrangements that were traced back to side reactions that may have occurred during synthesis as well. Finally, ions 931, 946 and 964 are dimeric versions of sildenafil with a modified sulfonyl group, a carbonyl fusion at both piperazine sites, and a composition of both sildenafil and homosildenafil, respectively.
4. Conclusion
Our results indicate that this approach is capable of distinguishing pharmaceuticals with the same active ingredient, in different formulations, produced by several manufacturers. We were able to differentiate successfully the reference drug from its generic, similar and falsified versions, providing quality markers that can be used for fast screening of any product within the same class. The proposed method shows great potential to be employed in forensic analyses and quick screening for quality control purposes, according to the sensitivity and specificity provided by the combination of LDI-MSI and robust multivariate statistical analyses. It is important to remark that this method may be used in quality control process for medicines regularly marketed, as falsification markers are easily identifiable. In addition to composing a practical and straightforward method for routine application, the use of MS/MS data to identify ions is a strong remark that the utilized approach is capable of identifying possible adulterants used in the falsification process without any prior knowledge. Moreover, this method uses a simple and effective sample preparation that does not use any solvents or matrices for LDI, with tangible results in less than three minutes per run, which allows the analyst to check target molecules qualitatively and quantitatively in a timely fashion.
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Finally, PLS-DA emerges as a useful tool to infer proximity and uniformity of sample clusters from each drug, indicating similarities among formulations, and potentially providing prediction for contaminants, byproducts, analogues, and even degradation products.
Acknowledgements
The authors would like to acknowledge the São Paulo Research Foundation (FAPESP) for the financial support through the grants for RRC (2011/50400-0 and 2015/06809-1), as well as CAPES for the fellowships for CFORM, DNO and TMG.
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Figure captions
Figure 1. Representative mass spectra of all sample groups analyzed: reference drug (R), falsified product (CF) and generic drugs (G1 to G4). Positive ion mode.
Figure 2. PLS-DA scores plot portraying the clusters of samples into clear, separate groups. Notice the wide separation between the reference drug (R, left) and the falsified product (CF, right).
Figure 3. Mass spectrometry imaging semi-quantification graphs of all eleven VIP-elected species, plus the addition of the [M+H]+ ion of sildenafil (475 m/z). It is noticeable that the most relevant species are ions 489 and 523 for their absence, and ion 703 for its presence in the reference drug.
Figure S1. Dendrogram provided by hierarchical clustering analysis, presenting a clear distribution of sample groups merging into different clusters according to similarities.
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Figura 3: Espectro de massas representativo de todos os grupos de amostras analisados: Medicamento referencia (R) , produto falsificado (CF) e medicamentos genéricos (G1-G4). Modo de análise positivo
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Figura 5: Gráficos de semi quantificação obtidos após análise MALDI-Imaging dos 11 compostos elegidos, protonados [M+H]+ além do íon Sildenafila (475 m/z)
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Figura 6: Dendrograma obtido após análise de agrupamentos hierárquicos, demonstrando clara distribuição das amostras, mesclando diferentes grupos de acordo com suas semelhanças
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5 DISCUSSÃO GERAL
Ao analisar os espectros de massas isolados, não foi possível identificar diferenças claras entre as formulações, já que aquelas existentes nos são muito sutis, conforme apresentado pela Figura 1. Contudo, ao submeter o conjunto de dados à análise estatística de agrupamento hierárquico, foi observada uma nítida separação das amostras (Figura 6). As amostras foram agrupadas como: grupo (i), com o medicamento de referência (R) em um único ramo; em outro ramo, o grupo (ii), formado por medicamentos genéricos G1 e G2; e o grupo (iii), formado por medicamentos genéricos G3 e G4, aqui incluso o produto falsificado (CF). Esta análise também forneceu uma lista de itens mais importantes após aparecimento (VIP), com íons que favoreceram a formação de cada grupo, ou seja, moléculas que são mais proeminentes em um grupo e assim o definem. A partir desta lista, 11 características foram selecionadas e caracterizadas como as espécies que mais contribuíram para identificar diferenças entre as formulações (Tabela 1). Dessas, três espécies eram visivelmente diferentes nos espectros: íons 489 e 523 não estavam presentes no espectro de referência, enquanto o íon 703 só foi detectado no espectro de referência. Todos os 11 íons foram então selecionados para análise PLS-DA. Conforme observado na Figura 4, esse gráfico de resultados apresentou um perfil consideravelmente resolvido, onde o medicamento de referência (R) é isolado à esquerda, com o produto falsificado (CF) agrupado à direita e os quatro medicamentos genéricos, regularmente comercializados no Brasil, caindo entre esses dois grupos. Esses dados nos permitem inferir que a proximidade de clusters hierárquicos está relacionada ao grau de similaridade de uma dada formulação com a do medicamento de referência.
Os três íons visivelmente distintos, listados acima, foram selecionados por pontuação VIP. O íon 489 foi caracterizado como homosildenafil, um análogo de sildenafil não regulado, com potencial atividade inibidora de PDE5, e o íon 523 como aducto de sódio de um derivado ligado a ciclohexilo,
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substituído no anel de pirazol. A presença dessas duas moléculas pode ser entendida como marcadores relevantes, uma vez que podem ser formadas em uma série de caminhos sintéticos usados para alcançar o sildenafil. Essas rotas não são usadas apenas por fabricantes de genéricos, mas também por falsificadores. Portanto, sua presença seria uma forte indicação de um produto falsificado, em casos suspeitos. Seguindo essa lógica, o íon 703 foi caracterizado com base na premissa de uma via sintética inteiramente diferente para o produto de referência. É um subproduto de íon amônio, formado pela clivagem do anel derivado de pirazol-guanina e a adição de uma segunda unidade de carboxietoxifenilsulfonilo. A presença desse íon no produto de referência é garantida pelos intermediários e reagentes utilizados no processo encontrado na literatura de patentes, confirmando assim nossa hipótese de que diferentes fabricantes usam diferentes rotas sintéticas. Curiosamente, essa espécie não foi observada quando submetida à SAH, nem foi descrita na literatura, provavelmente por causa da natureza do íon de amônio, que pode ser facilmente cortado em condições ácidas providas pelas etapas de preparação da amostra. Assim, quando submetido a um método de ionização suave em fase sólida, como MALDI-MSI, há pouca ou nenhuma interferência do meio e o íon é finalmente observado nos espectros do produto de referência.
Para avaliar ainda mais a eficácia dos resultados PLS-DA/VIP e validar esses resultados, o conjunto de 11 íons foi então submetido à semi-quantificação por MSI, com a adição de 475 m/z, sildenafil, como comparador. Os resultados confirmaram todas as interpretações anteriores, em que as quantidades de íon 523 m/z e 489 m/z na amostra LB1 são 6,3 e 6,1 vezes menores, respectivamente, do que nas outras formulações. Por outro lado, a espécie a 703 m/z mostrou quantidades até 5,7 vezes maiores em R, quando comparada a outras formulações, corroborando-a como uma característica que descreve claramente o produto de referência em relação a qualquer outro comparador. Essas três espécies, portanto, foram consideradas válidas como os marcadores mais relevantes para o rastreio rápido de adulteração destes produtos, reforçando a relevância do método desenvolvido na avaliação da presença e concentração de moléculas relacionadas à adulteracão, como sua evidente utilidade na análise forense destinada a identificar produtos
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falsificados. Além disso, a ausência de sildenafila em marcadores eleitos pelo teste PLS-DA, combinada com os resultados da semiquantificação por MSI, confirmou que a concentração de ativo não tem significância na avaliação de suspeitas de produtos falsificados, já que a amostra CF trouxe uma concentração de sildenafila que pode ser considerada equivalente à da formulação de referência (Figura 5). Ao comparar apenas as formulações genéricas, no entanto, observaram-se diferenças significativas para o ativo, indicando a utilidade deste método também na monitoração da sildenafila como parâmetro para avaliar a qualidade das formulações genéricas.
Os oito íons restantes, eleitos pelas pontuações VIP, foram caracterizados como compostos relacionados à sildenafila (Tabela 1). O Íon 448 é uma molécula de sildenafila clivada no anel de piperazina. Possivelmente decorrente da síntese ou decomposição natural do produto; o íon 503 tem um substituinte N-pirrolidiniletilo na porção de sulfonilfenilo em vez da metilpiperazina regular, potencialmente devido a problemas na síntese. Do mesmo modo, os íons 621 e 571 também mostram modificações na extremidade da metilpiperazina, com estruturas que parecem derivadas da mesma via de formação de subprodutos. O íon 785 é uma versão fortemente modificada do íon 703, com adicionais de porções metilpiperazina e rearranjos que foram rastreados como reações secundárias que podem ter ocorrido durante a síntese também. Finalmente, os íons 931, 946 e 964 são versões diméricas do sildenafil, com um grupo sulfonilo modificado, uma fusão de carbonilo em ambos os locais de piperazina e uma composição de sildenafil e homosildenafil, respectivamente.
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6 CONCLUSÃO
A proposta de desenvolvimento de metodologia para determinação de marcadores químicos de qualidade e autenticidade do medicamento estudado, utilizando-se a técnica imageamento por MALDI mostrou-se satisfatória.
Através da metodologia desenvolvida identificou-se marcadores químicos responsáveis que podem assegurar autenticidade ou fornecer indícios de adulteração do medicamento estudado, Sildenafila, tendo como base comparativa o medicamento referência registrado no mercado brasileiro . Além disso, ao observarmos os resultados obtidos após as análises estatísticas, podemos questionar, inclusive, indícios de desvio de qualidade de medicamentos genéricos, regularmente comercializados no Brasil, visto que pode-se verificar, presença dos marcadores de desvio de qualidade em alguns destes produtos farmacêuticos.
O novo método apresenta muitas vantagens em relação às técnicas corriqueiramente utilizadas no controle de autenticidade e qualidade de medicamentos, cosméticos e alimentos, como mínimo preparo de amostra, tempo de análise reduzido e análise realizada diretamente no insumo em questão, com alta especificidade, seletividade e reduzido custo operacional.
A elucidação adequada dos marcadores, fornecidos pela técnica, permite seu uso tanto para verificação de falsificações e adulterações quanto para verificação de qualidade do produto.
Este trabalho retrata o desenvolvimento de uma técnica promissora para uso não somente em indústrias mas também por autoridades governamentais.
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