Captação de uma emulsão lipídica semelhante a LDL por fragmentos vasculares e pericárdio de pacientes submetidos a cirurgia de revascularização miocárdica

Texto

(1)UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO FACULDADE DE CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS Programa de Pós-Graduação em Farmácia Área de Análises Clínicas. Captação de uma emulsão lipídica semelhante a LDL por fragmentos vasculares e pericárdio de pacientes submetidos a cirurgia de revascularização miocárdica. Ricardo David Couto. Dissertação para obtenção do grau de MESTRE Orientador: Prof. TIT. Raul Cavalcante Maranhão. São Paulo 2002.

(2) Ficha Catalográfica Elaborada pela Divisão de Biblioteca e Documentação do Conjunto das Químicas da USP.. C871c. Couto, Ricardo David Captação de uma emulsão lipídica semelhante a LDL por por fragmentos vasculares e pericárdio de pacientes submetidos a cirurgia de revascularização miocárdica / Ricardo David Couto. -- São Paulo, 2002. 83p. Dissertação (mestrado) - Faculdade de Ciências Farmacêuticas da Universidade de São Paulo. Departamento de Análises Clínicas e Toxicológicas. Orientador: Maranhão, Raul Cavalcante I. Bioquímica clínica: Medicina 2. Metabolismo lipídico 3. Doenças metabólicas: Medicina I. T. 11. Maranhão, Raul Cavalcante, orientador. 616.0756. CDD.

(3) Ricardo David Couto. Captação de uma emulsão lipídica semelhante a LDL por fragmentos vasculares e pericârdio de pacientes submetidos a cirurgia de revascularização miocárdica. Comissão Julgadora da Dissertaçao para obtençao do grau de Mestre. Prof. TIT. Raul Cavalcante Maranhão orientador/presidente. Prof. Or. Raul Dias Santos 10 examinador. Profa. Ora. Ana Campa 2° examinador. São Paulo, 08 de fevereiro de 2002..

(4) o~,uonqea. apnwlel. "apn.lua,d ns AeJJal. e, sa JQuas ,ao".

(5) ·OllleqeJl alsap o,~eZlleaJ e J!lIWJad Jod 'eras 0llPuaq. 'sn.a ".

(6) Ao meu bisavô Hanoch David Pandiott (Henrique David) Shochet, Razan e Baal Core, de bendita memória, pelo estímulo ao estudo.

(7) Ao meu avô Henrique David Filho, de bendita memória, pela educação dentro dos principios éticos e morais judaicos transmitidos durante a minha infância A minha Avó Elza David pela presença, pelo amor e pelo carinho.

(8) 'ep'A ellu,w ep sO:Juawow so sopo:J wa OARua3U, a 0llU,Je3 'Jowe OJad o,uo:Ju'f ,ed naw oe a J,ual3 avw ellu,w 'f.

(9) Ao meu único irmão Or. Fábio David Couto Bsc, MS, estudante do programa de doutoramento da FIOCRUZ, pelo amor, companheirismo e por trilar de forma esplêndida os árduos caminhos da pesquisa..

(10) AGRADECIMENTOS. • Ao Prof. Titular Raul C. Maranhão pela amizade, atenção, paciência e pelo incentivo como orientador deste trabalho e de muitos outros que ainda virão.. Unidade de Cardiopatias Congênitas InCor-HCFM-USP:. • Ao Prof. Titular Sérgio A. de Oliveira pela colaboração e incentivo indispensáveis à realização deste trabalho e pela atenção em todos os momentos necessários. • Ao Prof. Dr. Luis A. Oliveira Dallan pela colaboração indispensável, amizade, orientação, incentivo, atenção e presença em todos os momentos da realização deste trabalho. • Ao Df. Luiz A. Ferreira Lisboa pela colaboração, amizade, atenção e incentivo durante a realização deste trabalho. • A Sra. Malú Ribeiro (secretária) pela amizade, atenção e pelo auxílio indispensável à realização deste trabalho.. Unidade de Controle do Paciente Cirúrgico InCor-HCFM-USP:. • Ao Dr. Lauro Takumi Kawabe pela colaboração, amizade, auxílio e paciência durante a seleção dos pacientes deste trabalho. • A Sra. Ana Maria Piesco M. da Costa (secretária) pela atenção, amizade e auxílio durante a realização deste trabalho. • A Sra. Marisa do Carmo Siqueira (secretária) pela atenção, amizade e auxílio durante a realização deste trabalho..

(11) Laboratório de Metabolismo de Lípides-lnCor-HCFM-USP. • A Ora. Carmem Vinagre peja amizade, assistência técnica e incentivo em todas as etapas da realização deste trabalho. • Ao Dr. Roberto Shireiber pela amizade, pelo desenvolvimento e auxílio nas técnicas de biologia molecular e incentivo em todas as etapas da realização deste trabalho. • A Ora. Claudete Valduga pela amizade, pelo incentivo e auxílio durante a revisão final deste manuscrito. • As Dra(s). Débora Rodrigues e Denise Fernandes pela amizade, carinho e incentivo em todas as etapas da realização deste trabalho. • A Dra(s). Maria Conceição e Rosangela pela amizade e auxílio durante a realização deste trabalho. • Ao Renato, a Ana Cristina e a Ora. Débora Deus pela amizade, paciência e pelo suporte técnico para a preparação da LDE. • As amigas Dra(s) Kátia, Camila, Aleksandra, Raquel e a EJisabeth pela amizade, atenção e auxílio durante o programa de pós-graduação. • Ao Dr Raul Dias Santos pela amizade, estímulo e atenção durante a elaboração deste manuscrito. • Ao Prof. Dr. Jayme Dyament pela amizade, atenção e pelo valoroso auxílio no direcionamento deste trabalho e preparo deste manuscrito.. • FCF/USP. • Aos Professores do Departamento de Análises Clínicas e Toxicológicas da Facuidade de Ciências Farmacêuticas da USP pela atenção, paciência e por serem responsáveis pelo aprimoramento de jovens que procuram as carreiras acadêmica e cientifica.. • Especialmente a Prata. Ora. Ana Campa pela amizade e pelos conselhos durante o programa de pós-graduação..

(12) • A Profa. Ora. Primavera - Coordenadora do Programa de pós-graduação em Farmácia - Área de Análises Clínicas, pela atenção sempre que necessária. • As secretárias da pós-graduação (B17), Sras. Márcia, Suely e Ana pela atenção e amizade. • A secretaria de pós-graduação (B13-A), Sras. Benê e Efaine pela atenção, paciência e amizade desde o início do programa de pós-graduação e ao Sr. Jorge Lima pela amizade, paciência e por ter me acolhido como irmão em sua residência e família. • Ao Sr. Paulo Carvalho, a Sra. Lígia Carvalho, o Neto e a Mami por me receberem como filho e com muito carinho em sua família desde quando cheguei em São Paulo. • Ao Prot. Oscar Manuel de Castro Ferreira pela amizade, paciência e ensinamentos durante a revisão ortográfica deste manuscrito.. • A CAPES (bolsa de estudos) e a FAPESP pelo suporte para a realização deste estudo.. • Aos pacientes que participaram deste estudo pela confiança depositada em mim e pelo sacriffcio pessoal..

(13) 3JION!.

(14) ÍNDICE. LISTAS RESUMO SUMMARY 1. INTRODUÇÃO 1.I.DOENÇAS V ASCULARES......................................................................................................................... 1.2 ARQlJITETURA VASCULAR NORMAL. 1.3 CÉLULAS DA PAREDE VASCULAR...................................................................................................... 1.4 CÉLULAS ENDOTELIAIS............................................................................. 1.5 CÉLULAS MUSCULARES LISAS............................................................................................................. 1.6 ESTENOSE DA INTIMA E RESPOSTA À LESÃO VASCULAR.......................................................... 1.7 ATEROSCLEROSE...................................................................................................................................... 1.8 INFLAMAÇÃO E ATEROSCLEROSE...................................................................................................... 1.9 SIGNIFICÂNCIA CLÍNICA........................................................................................................................ 1.10 DOENÇA ARTERIAL CORONÁRIA...................................................................................................... 1.11 FATORES DE RISCO PARA A DOENÇA ARTERIAL CORONÁRIA.............................................. 1.12 FISIOPATOLOGIADADOENÇA ARTERIAL CORONÁRIA............................................................ 1.13 TRANSPORTE DO COLESTEROL. LÍPIDES. LIPOPROTEÍNAS E ATEROSCLEROSE............. 1.14 TRANSPORTE DO COLESTEROL......................................................................................................... 1.15 TRANSPORTE EXÓGENO DE LÍPIDES (DIETA)............................................................. 1.16 TRANSPORTE ENDÓGENO DE LÍPIDES (HEPÁTICO).................................................................... 1.17 FATORES GENÉTICOS ASSOCIADOS.............................................. 1.18 LIPOPROTEÍNAS ARTIFICIAIS E SUAS POSSmlLIDADES TERAPÊUTICAS............................. 1.19 EMULSÃO LIPÍDICA ,ARTIFICIAL (LDE)............................................................................................. 2. JUSTIFICATIVA_._••_._._._.__._._._._._. 3. OBJETIVOS DO ESTUDO. ._. 4. CASUÍSTICA.__•__._._.. •. .... 10 10 11 13 16 16 19 20 24 25 28 29. ---.-.---.-.-_.-.-... 30. 4.1 OS PACIENTES..... 4.3 cRITÉRIOS DE INCLUSÃO....................................................................................................................... 4.4 CRITÉRIOS DE EXCLUSÃO........................................................................... ._ _.. 5 6 8 8. . .--.---.-.-.-.---.--.-.-.--.-.--. •__• • • .__. 4.2 PACIENTES SELECIONADOS PARA O ESTUDO:................................................................................ 5 MATERIAL E MÉTODOS.._._._._._.. 1 2 3 3 4. _ _._.. .. •. 5.1 MATERIAIS UTILIZADOS......................................................................................................................... 5.2 ESTERILIZAÇÃO DO MATERIAL........................................................................................................... 5.3 PREPARAÇÃO DA LDE MARCADA COM CE}4C E CL-1-L............................................................. 5.4 PROTOCOLO DE ESTUDO........................................................................................................................ 5.5 DETERMINAÇÕES LABORATORIAIS................................................................................................... 5.6 DETERMINAÇÃO DA CINÉTICA DE REMOÇÃO DA LDE................................................................ 5.7 ANÁLISE DA CINÉTICA DOS LÍPIDES MARCADOS:......................................................................... 5.8 CÁLCULO DA TAXA FRACCIONAL DE REMOÇÃO........................................................................... 30 31 31 32 35 35 36 37 38 39 39 41 42.

(15) ÍNDICE 5.9 PROCEDIMENTO CIRURGlCO E OBTENÇÃO DOS FRAGMENTOS.............................................. 5.10 EXTRAÇÃO DE LÍPIDES......................................................................................................................... 5.11 GERAÇÃO DO ÉSTER DE COLESTEROL A PARTIR DO COLESTEROL LIVRE....................... 5.12 AVALIAÇÃO DO PROCESSO DE ESTERIFICAÇÃO DO COLESTEROL LNRE......................... 5.13 EXTRAÇÃO DO DNA GENÔMICO....................................................................................................... 5.14 AMPLIFICAÇÃO DAS SEQÜÊNCIAS GÊNICAS DE apo E................................................................ 5.15 DIGESTÃO COM ENZIMA DE RESTRIÇÃO............................................ 43 44 45 47 47 49 50. _............... 51. 6.1 TESTE T........................................................................................................................................................ 6.2 ANALISE DE V ARIÂNCIA........... 51 51. 6.3 TESTE DE CORRELAÇÃO LINEAR......................................................................................................... 52. 6 ANÁLISE ESTATÍSTICA. _. _. __. _. _-......................... 53. 7.1 LÍPIDES PLASMÁTICOS............................................................................................................................ 53 54 55 58 59 61. 7. RESULT ADOS. _. _. _. 7.2 ESTIJDOS cINÉTICOS... 7.3 CAPTAÇÃO DA LDE.................................................................................................................................. 7.4 ESTERIFICAÇÃO DO COLESTEROL...................................................................................................... 7.5 GENOTIPAGEM DAapo E......................................................................................................................... 7.6 ESTIJDO DE CORRELAÇÃO.............................. 8. DISCUSSÃO 9. CONCLUSÓES 10. ANEXOS A. _. _. _._... _._. _. .. _. -............................ -................................. 10.1 ANEXO B..................................................................................................................................................... 11. REFERÊNCIAS BmLIOGRÁFICAS. _. _. _................................... 62 66 67 69 70.

(16) 5tfHn.1 tf/1\3H8tf 3a tf.15/1.

(17) LISTA DE ABREVIATURAS. Abreviaturas ACAT- acil coenzima A: colesterol acil transferase ANOVA- análise de variância apo- apolipoproteína bFGF- fator de crescimento básico de fibroblastos p-VLDL- remanescentes de VLDL CCD- cromatografia em camada delgada CE- colesterol esterificado 14. CE_ C - colesterol éster marcado com carbono 14 CE-3H_colesterol éster gerado a partir do CL-3H CETP- proteína de transferência de éster de colesterol CL- colesterol livre CL-3H - colesterol livre marcado com trício CT-colesterol total C677- polimorfismo C677 ~ T do gene da MTHFR DAC- doença arterial coronária DNA- ácido desoxiribonucléico Hhal- Enzima de restrição usada para determinar o genótipo da apo E HDL- lipoproteína de alta densidade HDL-C- colesterol de HDL HMGCoA-redutase - 3-hidroxi-3-metil-glutaril coenzima A redutase IDL- lipoproteína de densidade intermediária IFN-y- interferon gama (k)- taxa fracionai de transferência Kbq- quilobequerel.

(18) KBr- brometo de potássio LCAT- lecitina colesterol acil transterase LDE- emulsão lipídica semelhante a LDL LDL- lipoproteína de baixa densidade LDL-C- colesterol de LDL LDL-r- receptor de LDL LP(a)-lipoproteína (a) LOX 1 e 2- receptores para LDl oxidada LLA- leucemia Iinfóide aguda LMA- leucemia mielóide aguda lPL- lipase lipoprotéica LRP- proteína relacionada ao receptor de lDl MTHFR- metileno tetrahidro tolato redutase N.S.- não significante Ox-LDL- LDL oxidada PCR- reação da polimerase em cadeia POGF- fator de crescimento derivado de plaquetas QM- quilomícrons RMN- ressonância magnética nuclear SMC- Smooth muscle cells (células musculares lisas) TFR- taxa fracionai de remoção TG- triglicérides VLDL- lipoproteína de densidade muito baixa VLDL-C - colesterol de VLDL vWf- fator de Von Willebrand.

(19) StfHn91::J 30 tf.LS/l.

(20) LISTA DE FIGURAS. Figura 1 - Esquema hipotético de espessamento intimai, células endoteliais, musculares lisas (camada média) e produção de matriz extracelular. (Modificado de: COTRAN e cal. 1999). Figura 2 - Mecanismo da aterogênese - Lipoproteínas portadoras de apo 8-100 LDL, p-VLDL (remanescentes de VLDL), Lp(a), o HDL no transporte reverso do colesterol, célula espumosa e ateroma (Modificado de KWITEROVICH, 2000). Figura 3 - Metabolismo das lipoproteínas plasmáticas -. Vias: exógena e. endógena, oxidação da LDL, transporte reverso do colesterol e transferência de ésteres de colesterol e triglicérides entre as partículas de HDL e p-VLDL (Modificado de KWITEROVICH, 2000). Figura 4 - Efeitos adversos da homocisteína. GAG, via do glicosaminoglicanoantitrombina 111, Proteína CITM, via anticoagulante da trombomodulina C, TF, fator tecidual, tPa, ativador do plasminogênio tecidual (Modificado de THAMBYRAJAH e col. 2000) Figura 5 - Molécula de [1_ 14 C] oleato de colesterol (CE- 14C) utilizado na marcação da LDE. Figura 6 - Molécula de [7(n)-3H ] colesterol (CL- 3H) utilizado na marcação da LDE. Figura 7 - Protocolo de estudo da LDE - administração, coletas das amostras de sangue e recebimento dos fragmentos de enxerto vascular.

(21) Figura 8 - Curvas de decaimento plasmático do CE-14C e CL-3H nos pacientes submetidos a revascularização miocárdica (n =9), (média ± erro padrão da média). Figura 9 - Captação da LDE em % da radioatividade injetada por grama de tecido nos fragmentos vasculares e pericárdio. 1- radial (n=6), 2 - veia safena (n=7), 3 torácica interna (n=8), 4 - aorta (n=5) e 5 - pericárdio (n=4), (média ± erro padrão da média). Figura 10 - Taxa de esterificação obtida através da razão CE- 3H I CE- 3H + CL- 3H, a partir da radioatividade contida nos lípides extraídos dos fragmentos vasculares e pericárdio, (média ± erro padrão da média). BIBLIOTECA Faculdade de Ciências Farmacêutica Umversidade de São Paulo.

(22) Stf13f1tf.L 30 tf.LS/l.

(23) LISTA DE TABELAS. TABELA 1 - Idade e características gerais dos pacientes (média e erro padrão da média). TABELA 2 - Antecedentes pessoais, familiares e medicação concomitante dos pacientes. TABELA 3 - Perfil lipídico dos pacientes (média e erro padrão da média). TABELA 4 - Teste de comparação múltipla de Tukey-Kramer, após ANOVA, entre as médias de captação da LDE, trício total, nos fragmentos vasculares e pericárdio em % da radioatividade injetada por grama de tecido. TABELA 5 - Captação da LDE nos fragmentos vasculares e pericárdio em % da radioatividade injetada por grama de tecido (média ± erro padrão da média). TABELA 6 - Resultados da genotipagem da apolipoproteína E dos pacientes.

(24) ownS3H.

(25) COUTO, R.D. CAPTAÇÃO DE UMA EMULSÃO LIPíDICA SEMELHANTE A LDL POR. FRAGMENTOS. VASCULARES. E. PERICÁRDIO. DE. PACIENTES. SUBMETIDOS À CIRURGIA DE REVASCULARIZAÇÃO MIOCÁRDICA. São. Paulo, 2002. Dissertação (Mestrado). Departamento de Análises Clínicas e Toxicológicas da Faculdade de Ciências Farmacêuticas da Universidade de São Paulo.. A doença arterial coronária (DAC) tem sido a maior causa de morte por doenças nos paises ocidentais. Existem vários fatores responsáveis pela iniciação e progressão desta doença - fatores ambiental ou genético. Muitos fatores de risco para a DAC estão relacionados a alterações do metabolismo lipídico, como acúmulo de lipoproteína de baixa densidade (LDL) no plasma seguida da deposição da lipoproteína na parede arterial. Recentemente, foi demonstrado que uma emulsão rica em colesterol que se assemelha a composição lipídica da LDL liga-se aos receptores que captam a lipopoteína da circulação e internalizanl-na no citoplasma. A emulsão, denominada LDE, é feita sem proteína mas quando injetada na circulação sangüínea adquire várias apolipoproteínas (apo) como apo E que pode ser reconhecida pelo receptor de LDL. A apo E tem mais afinidade pelo receptor do que a apo B, a apo que liga a LDL nativa ao receptor. No presente estudo, para esclarecer o processo metabólico que a LDL enfrenta no plasma e o processo de captação da lipoproteína pelos vasos, a LDE marcada com colesterol livre-3H (CL) e oleato de colesterol-14C (CE) foi injetada em 10.

(26) pacientes portadores de DAC (57 ± 2,2 anos) submetidos à cirurgia de revascularizaçáo miocárdica. Amostras de sangue foram coletadas em intervalos de tempo pré-determinados. A radioatividade presente nas alíquotas de plasma foi determinada por cintilação líquida e a taxa fracionai de remoção (TFR) calculada por análise compartimental. Os fragmentos dos enxertos de aorta, artérias radial e torácica interna, veia safena e pericárdio removidos durante o procedimento cirúrgico foram coletados para extração lipídica, separação por cromatografia de camada delgada e quantificação radioativa. A remoção plasmática do CE da LDE foi similar a do CL da LDE (0,0617 ± 0,0087 vs 0,0528 ± 0,0123, p = 0,5635, respectivamente). A captação do CL da LDE foi maior do que a do CE da LDE na aorta (21°,fa vs 3,10/0, P. = 0,0049),. artéria torácica interna (10,3% vs 2%, P. =. 0,0007) e veia safena (8% vs 2%, P = 0,0326). Nos fragmentos de artéria radial (14,40/0 vs 4,3%) e de pericardio (2,2% vs 0,30/0), a captação do CL tendeu ser. maior do que a captação do CE, porém não foi estatisticamente confirmado. A taxa de esterificação foi maior nos fragmentos de aorta, de toráxica interna e de pericárdio do que nos fragmentos de veia safena (p < 0,001). Concluindo, a LDE foi captada pelos vasos e pericardio em quantidades concideráveis e a captação do CL pelos tecidos foi maior do que a do CE. Ainda, a taxa de esterificação do colesterol livre foi mais intensa nos fragmentos de aorta e torácica interna do que nos fragments de veia safena..

(27) Á HtfWWnS.

(28) COUTO, R.D. UPTAKE OF A CHOLESTEROL-RICH EMULSION RESEMBLING. LDL. PERICARDIUM. OF. BY. VESSEL'S. PATIENTS. REVASCULARIZATION.. São. FRAGMENTS. UNDERGOING. Paulo,. 2002.. AND. MYOCARDIAL. Dissertação. (Mestrado).. Departamento de Análises Clínicas e Toxicológicas da Faculdade de Ciências Farmacêuticas da Universidade de São Paulo.. Coronary artery disease (CAD) is the main mortality cause in westem countries. There are many factors responsible for the onset and progression of the disease - either environmental or genetic. Many risk factors in CAD are related with disorders of Iipid metabolism, such as accumulation of low-density lipoprotein (LDL) in the plasma with deposition of the lipoprotein in the arterial wall. Recently, it was shown that a cholesterol-rich emulsion that mimics the lipid composition of LDL binds to the receptors that take-up the Iipoprotein from the circulation and internalizes it into the cytoplasm. lhe emulsion, denominated LDE, is made without protein but when injected into the bloodstream it picks-up severaI apolipoproteins (apo) such as apo E that can be recognized by the LDL receptor. Apo E has even more affinity for the receptor than apo 8, the apo that binds native LDL to the receptors. In the current study, aiming to clarity the metabolic processes that LDL undergoes in the plasma and the process of lipoprotein uptake by the vessels, LDE labeled with 3H- Cholesterol (CL) and 14C-Cholesteryl Oleate (CE) was injected into 10 CAD patients (57 ± 2,2 yr.) scheduled to be submitted to myocardial.

(29) revascularization surgery. Blood samples were collected over 24 hour at preestablished intervals. Radioactivity present in plasma aliquots was determined in a scintillation solution and the fractional clearance rate (fCR) was calculated by compartimental analysis. The graft's fragments of aortic, radial, internai thoracic arteries, safenous vein and pericardium discarded during the surgical procedure were collected for lipid extraction, separation by thin layer chromatography and radioactive counting. The removal from plasma of the LDE CE was similar to that of the LDE CL (0,0617 ± 0,0087 vs 0,0528 ± 0,0123, P = 0,5635, respectively). The uptake of LDE CL was greater than that of LDE CE in aorta (21 % vs 3,1%, P 0,0049), internai toracic artery (10,3% vs 2%, P vs 2%, P. =. =0,0007) and safenous vein (8%. =0,0326). In the radial artery (14,40/0 vs 4,30/0) and pericardium (2,2%. vs. 0,3%) fragments, the CL uptake also tended to be greater than that of CE, but this was not statistically confirmed. The esterification rate was greater in the aorta, internai thoracic artery and pericardium fragments than in safenous vein fragments (p < 0,001). In conclusion, LDE was taken-up by vessels and pericardium at considerable amounts and LDE CL uptake by those tissues was greater than that of CE. In addition, the cholesterol esterification rate was more intense in the aorta and internai thoracic artery than in venous fragments..

(30) o 'f~naOl:J.1NI.

(31) 1. 1.. 1.1. INTRODUÇÃO. Doenças vasculares. o endotélio vascular não é uma camada inerte às células sangüíneas como se acreditava nos anos 60 (HUNT, 2000) mas uma interface altamente especializada. entre. o. sangue. e. os. tecidos. adjacentes.. O. endotélio,. metabolicamente ativo, apresenta funções diversas como manter o tônus vascular, resistência à formação de trombas e ainda exercer permeabilidade seletiva às células e proteínas. O endotélio está exposto a uma gama de substâncias carreadas pelo sangue que podem tanto alterar suas funções quanto causar comprometimentos vasculares. As doenças vasculares representam em média a maior causa de morbidade e mortalidade em relação a qualquer outra categoria de doenças (YLAHERTTUALA e col. 1996; COTRAN e col. 1999). As anormalidades vasculares podem causar eventos clínicos por dois mecanismos principais: Estenose, podendo ser por obstrução progressiva completa do lúmen vascular. (ex. aterosclerose) ou por evento agudo (ex. trombose),. freqüentemente induzindo deficiência no fluxo sangüíneo, diminuindo assim o aporte de sangue aos tecidos perfundidos por esses vasos..

(32) 2. Enfraquecimento das paredes vasculares, levando a dilatação ou ruptura (ex. aneurisma). Sendo assim vamos dedicar um pouco de atenção à arquitetura normal das artérias e veias.. 1.2. Arquitetura vascular normal. A arquitetura vascular varia e reflete requisitos funcionais distintos às localizações vasculares específicas. Para suportar a pulsação e as altas pressões sangüíneas, as paredes arteriais são geralmente mais espessas do que as das veias. A parede vascular vai diminuindo gradativamente acompanhando a diminuição do calibre dos vasos, porém a relação entre parede vascular e lúmen vascular permanece alta (COTRAN e col. 1999). As veias, por outro lado, possuem maior diâmetro do lúmen e suas paredes são menos espessas. As artérias são divididas em três tipos, baseados no seu tamanho e características estruturais: (1) artérias grandes ou elásticas (ex. aorta e suas ramificações maiores); (2) médias ou musculares (ex. outras ramificações da aorta, como coronárias e artérias renais) também conhecidas como artérias distribuidoras; e (3) artérias pequenas, freqüentemente menores que 2 mm de diâmetro que se dirigem para dentro do parênquima dos órgãos. Os constituintes básicos dos vasos sangüíneos são: as células endoteliais, células musculares lisas e matriz extracelular incluindo as substâncias elásticas como colágeno e proteoglicanos (COTRAN e col. 1999). Esses constituintes básicos se encontram distribuídos em camadas concêntricas à íntima (adjacente.

(33) 3. ao lúmen), à média e à adventícia (externamente). A quantidade relativa e disposição desses constituintes básicos varia, no decurso do sistema vascular, devido a adaptações mecânicas e necessidades metabólicas locais.. 1.3. Células da parede vascular. Em maior parte os componentes celulares da parede vascular dos vasos sanguíneos são: células endoteliais e musculares lisas. Ambas possuem papel importante na patogênese vascular (COTRAN e col. 1999).. 1.4. Células endoteliais. As células endoteliais formam uma monocamada que recobre todo o sistema. vascular. (endotélio).. Sua estrutura. e integridade funcionais. são. importantes para a manutenção da hemostasia e função circulatória. As células endoteliais são poligonais, alongadas e possuem várias vesículas pinocitóticas formando ainda complexos juncionais com células vizinhas. Elas unicamente contêm corpos de Weibel-Palade (0,1 mm de largura por 3 mm de comprimento) que representam a organela de armazenamento para o fator de Von Willebrand (vWF). As células endoteliais são identificadas imunohistoquimicamente por anticorpos anti-vWF (também conhecidos como antígeno relacionado ao fator VIII) ou outro antígeno endotelial (ex. CD 31). O endotélio vascular é um tecido versátil, multifuncional, que possui tanto propriedades sintéticas quanto metabólicas (HUNT, 2000)..

(34) 4. o endotélio é um participante ativo da interação entre o sangue e os tecidos (HUNT, 2000). A lesão endotelial contribui para a formação do trombo, visto que o sub-endotélio é extremamente trombogênico, sendo esse evento critico para a iniciação da aterosclerose.. 1.5. Células musculares lisas. As células musculares lisas ou "smooth muscle cells" (SMC) são capazes de realizar muitas funções, incluindo constrição e dilatação em resposta a estímulos tanto fisiológicos quanto farmacológicos, síntese de colágeno, elastina e proteoglicanos, síntese de fatores de crescimento e citocinas, migração para a camada íntima e proliferação. Sendo o elemento vascular predominante da camada média, as SMC constituem um elemento importante não apenas para o reparo, mas também, relacionadas à patogênese da aterosclerose, por exemplo. A migração e atividade proliferativa das SMC são fisiologicamente reguladas por regiões promotoras de crescimento e inibição contidas no DNA. Como fatores transcricionais atuantes nestas regiões promotoras podemos citar: o fator de crescimento derivado de plaquetas (PDGF), fator de crescimento básico de fibroblastos (bFgF) e a interleucina I. Como inibidores podemos citar: o sulfato de heparan, óxido nítrico, IFN-y e TGF-J3 (LIAO, 1998)..

(35) 5. 1.6. Estenose da intima e resposta à lesão vascular. A lesão vascular estimula o crescimento das células musculares lisas pelo rompimento do equilíbrio fisiológico. e~istente. entre inibição e estimulação. A. reconstituição da parede vascular lesada, incluindo o endotélio, envolve uma resposta fisiológica de cicatrização com formação de uma neointima, envolvendo(1) migração das SMC da camada média para a íntima; (2) subseqüente multiplicação das células intimais; e (3) síntese e deposição de matriz extracelular (Figura 1).. 1. Migração das Células Musculares 2. Mitose das Células da Usas para aIntinla Vascular. Muscular Usa. 3. Elaboração de Midriz Extracelular. Endotélio. TI. Intima. Lâmina Elástíca Interna Células Muscularés Lisas •. J JMédia ···,1. Figura 1 - Esquema hipotético de espessamento intimai, células endoteliais, musculares lisas (camada média) e produção de matriz extracelular. (Modificado de: COTRAN e col. 1999)..

(36) 6. o. processo de cicatrização exagerado causa proliferação intimai com. subseqüente estenose ou oclusão de vasos sangüíneos de pequenos e médios calibres e também de enxertos vasculares (ex. revascularização do miocárdio). Este cenário contribui para a formação de doenças vasculares clinicamente bem estabelecidas, às quais o estímulo varia predominantemente do mecânico (ex. estenose após angioplastia) e imunológico (ex. aterosclerose do transplante) ao multifatorial (ex. aterosclerose). As doenças vasculares afetam primeiramente as artérias, sendo a aterosclerose a mais prevalente e de maior importância clínica. A aterosclerose é caracterizada pela formação de lesões intimais chamadas de ateromas ou placas fibro-gordurosas que se projetam para dentro do lúmen, enfraquecendo a camada média local e evoluindo associada a eventos multifatoriais (COTRAN e col. 1999).. 1.7. Aterosclerose. A aterosclerose é uma doença que acomete as artérias e tem geralmente progressão lenta. Ela é caracterizada por placas fibro-gordurosas na camada íntima, formada pela deposição de lípides, pelo aumento da síntese de matriz extracelular e pelo infiltrado celular. A proliferação das células da musculatura lisa é devida provavelmente à presença de receptores para LDL (LDL-r) nestas células (IKEDA e col. 1994) e receptores para Ox-LDL (LOX-1 - Lectinlike Ox-LDL receptor 1) nas células endoteliais da camada intima (KATAOKA e col. 1999). Pelo menos cinco tipos celulares participam da formação da placa de ateroma: células endoteliais, macrófagos teciduais (derivados a partir dos monócitos circulantes no.

(37) 7. sangue), células T, plaquetas e células musculares lisas (IKEDA e col. 1994). Artérias musculares de grande e médio calibre e elásticas de grande calibre são acometidas. pelo. processo. aterogênico,. principalmente. as. artérias. aorta. abdominal, coronária, popliteal, aorta torácica descendente, carótidas e o círculo de Willis (em ordem decrescente de freqüência). As lesões tendem inicialmente a serem focais, tomando apenas parte da circunferência da luz do vaso e se posicionam de forma bastante irregular em sua extensão (COTRAN e col. 1999). Na placa aterosclerótica, células musculares lisas e macrófagos da camada íntima da aorta e artérias de grande calibre estão cheias de vacúolos lipídicos, muitos dos quais são constituídos por colesterol e ésteres de colesterol. Essas células têm aparência espumosa (células espumosas) e agregados destas na camada íntima produzem as estrias gordurosas, características do processo aterogênico. A ruptura de estrias gordurosas evoluídas (ateromas), liberando Iípides e fragmentos celulares no espaço intravascular, causa muitas vezes eventos tromboembólicos.. o. metabolismo celular do colesterol é especificamente regulado para que. as células usem o colesterol na síntese de membranas celulares sem que haja acúmulo intracelular de colesterol e/ou ésteres de colesterol. Acúmulos, entretanto, manifestam-se histologicamente como vacúolos intracelulares e estão implicados em vários processos patológicos, como Inflamação e necrose. As células espumosas são freqüentemente encontradas nos sítios de lesão e inflamação celular, devido provavelmente à fagocitose (ou captação pelos receptores scavenger e LOX-1) de colesterol oriundo de membranas de células lesadas, incluindo células parenquimatosas, eritrócitos, leucócitos e plaquetas. Os BIBllOT Faculdade de Ciências Farmacêutlc Universidade. de São Paulo.

(38) 8. fosfolípides e as figuras mielínicas são também encontradas no foco inflamatório. Quando em abundância, as células espumosas transformam-se em estrias gordurosas dando uma coloração amarelada ao foco inflamatório (COTRAN e col. 1999).. 1.8. Inflamação e aterosclerose. Evidencias indicam que a aterosclerose é um processo imunológico envolvendo. tanto. as. células. da. parede. vascular. quanto. sangüíneas. mononucleares, linfócitos T, citocinas e fatores de crescimento (LlBBY e col. 1990; LlAO, 1998). Macrófagos, células T e células da parede vascular, particularmente as SMC, elaboram citocinas e fatores de crescimento que regulam a celularidade e composição da matriz da parede vascular (LIAO, 1998). São várias as hipóteses existentes para justificar a complexidade multifatorial da aterosclerose, como o estresse vascular - hipertensão, infecções por microrganismos (MENDALL e col. 1992), formação de produtos glicosados - diabetes melitus (KRAUSS e col. 1998), homocisteina e aterotrombose (WELCH e col. 1998), fenótipo da apolipoproteína E (ILVESKOSKI e col. 2000).. 1.9. 5ignificância clfnica. A aterosclerose contribui com aproximadamente mais da metade das mortes por doenças e possui uma alta morbidade nas sociedades industrializadas (YLA-HERTIUALA e col. 1996). Na distribuição global ela já alcança proporções.

(39) 9. epidêmicas nas sociedades economicamente desenvolvidas. Apesar do grande impacto da aterosclerose, progressos significativos no tratamento e prevenção vêm sendo alcançados desde a última década nos Estados Unidos da América (EUA) e também em outras sociedades desenvolvidas. Entre 1963 e 1995 houve uma. diminuição de aproximadamente 50%. nas taxas de morte por doenças. isquêmicas do coração e 70% nas mortes por trombose. A redução na mortalidade tem aumentado a expectativa de vida em aproximadamente 5 anos nos EUA. A origem dessa tendência tem sido atribuída a (1) prevenção da aterosclerose a partir de mudanças no estilo de vida, incluindo diminuição do tabagismo, alterações nos hábitos alimentares. (com redução no consumo do colesterol e. outras gorduras saturadas de origem animal) e controle da hipertensão; (2) avanços. nos. protocolos. terapêuticos. do infarto do. miocárdio e outras. complicações oriundas das doenças isquêmicas do coração; e (3) prevenção da recorrência de eventos clínicos relacionados à aterosclerose em pacientes anteriorrrlente acometidos. A aterosclerose primeiro afeta as artérias elásticas (ex. aorta, artérias carótidas e ilíacas) e as artérias musculares de grande e médio porte (ex. coronárias e popliteal). A aterosclerose tem início na infância mas os sintomas clínicos, geralmente, tornam-se evidentes a partir da quarta década de vida ou tardiamente quando a lesão existente precipita um evento isquêmico nos órgãos pertundidos. Qualquer artéria em órgão ou tecido do corpo pode ser acometida pelo. processo. aterosclerótico.. A. aterosclerose. assintomática. é. mais. freqüentemente localizada nas artérias que suprem o fluxo de sangue para o coração, cérebro, rins, extremidades inferiores e intestino delgado..

(40) 10. o. Infarto do miocárdio, cerebral e o aneurisma da aorta são as maiores. conseqüências dessa doença. Os dados epidemiológicos obtidos da aterosclerose são expressos em números de casos novos (incidência) ou número de mortes causadas por doença isquêmica do coração. A aterosclerose ainda é responsável por conseqüências agudas ou crônicas como: gangrena nas pernas, oclusão mesentérica, morte súbita, doença cardíaca isquêmica crônica e encefalopatia isquêmica, por diminuir a perfusão do sangue arterial nos órgãos.. 1.10. Doença arterial coronária. A doença arterial coronária (DAC) é uma das causas mais comuns de insuficiência cardíaca e morte na maioria dos países desenvolvidos. Os homens são mais freqüentemente acometidos do que as mulheres, porém após a menopausa as mulheres são similarmente acometidas. Nos homens, o pico de incidência das manifestações clínicas ocorre entre os 40-60 anos e nas mulheres entre os 60-70 anos (BI5HOP e col. 2000).. 1.11. Fatores de risco para a doença arterial coronária. Estudos epidemiológicos têm identificado um grande número de fatores de risco para a doença arterial coronária, tais como uma história familiar positiva (particularmente quando ocorre antes dos 50 anos), idade, atividade ocupacional, anormalidades do perfil lipídico sangüíneo (dislipidemias), hipertensão arterial, inatividade. física,. tabagismo,. diabetes. melito,. fatores. genéticos. e.

(41) 11. hipoestrogenemia em mulheres menopausadas. As pesquisas mais recentes têm se concentrado nas anormalidades do perfil lipídico, o qual tem um papel importante. na. fisiopatologia. dessa. condição. clínica.. O. risco. cresce. progressivamente com altos níveis de Iipoproteínas de baixa densidade (LDL - low density Iipoprotein) e decresce com altos níveis de lipoproteínas de alta densidade (HDL - high density lipoprotein). Entretanto, a razão entre LDL-C e HDL-C é um marcador de risco importante, onde razões inferiores a 3 indicam baixo risco e razões acima de 5 indicam alto risco (BI5HOP e col. 2000). Entre os indivíduos com aterosclerose acelerada encontramos níveis elevados de Iipoproteína (a) (Lp(a» e partículas de LDL pequenas e densas. Ainda assim, o problema continua cheio de controvérsias. Evidências acumuladas sugerem a hipertrigliceridemia como fator de risco independente para a doença arterial coronária. (KARPE e co I. 2001).. Níveis elevados de triglicérides. freqüentemente ocorrem em associação com outras anormalidades do perfil lipídico, incluindo baixos níveis de HDL-C, altas concentrações de (Lp(a» e partículas de LDL-C pequenas e densas (BI5HOP e col. 1998; GRUNDY, 1998; KREI5BERG, 1998; HOWARD, 1999).. 1.12. Fisiopatologia da doença arterial coronária. Anormalidade no metabolismo lipídico ou dieta rica em colesterol e ácidos graxos saturados, especificamente quando superpostos a uma predisposição genética, podem ser a ignição inicial necessária para o desenvolvimento do processo aterosclerótico (COTRAN e 001. 1999)..

(42) 12. As lipoproteínas de baixa densidade LDL são as partículas sabidamente mais aterogênicas até o momento (ASSMANN e col. 1989; KEYS e col. 1970). As lipoproteínas de alta densidade HDL, são protetoras e provavelmente ajudam na mobilização da LDL. O papel de outros lípides, incluindo os triglicérides na fisiopatologia desse processo, não estão ainda bem esclarecidos. A LDL sofre oxidação in situ o que a torna menos mobilizável, por tanto capaz de causar citotoxidade localizada e ativação das células endoteliais (KATAOKA e col. 1999) e linfócitos T precocemente presentes no foco inflamatório (LIBBY e col. 1991; WITZTUM e col. 1997). Estudos demonstraram que 10 % de uma população de células T clonadas a partir de amostras de arterectomia das carótidas, reagem especificamente contra LDL oxidada (Ox-LDL) (STEMME e col. 1995; WITZTUM e col. 1997). O ponto principal no processo aterosclerótico é a captação de lípides pelos macrófagos. Os macrófagos migram para o espaço sub-endotelial e captam LDL modificada (SILVA e col. 1995) através dos receptores scavenger (MSR-A, CD36, classe B tipo I e macrosialina / CD68) (KATAOKA e col. 1999), transformando-se em células espumosas (tanto macrófagos quanto células musculares lisas fibroblastos) (KATAOKA e col. 1999), devido ao acúmulo de lípides. Com a progressão da placa aterosclerótica, as células da muscular lisa vascular iniciam a sua migração para o sítio da lesão. Nesse estágio a lesão pode ser hemodinamicamente insignificante, mas a função endotelial está seguramente anormal e a sua capacidade de limitar a entrada de lipoproteínas na parede vascular está prejudicada. Se a placa permanecer estável, uma capa fibrosa se.

(43) 13. forma, a lesão se torna calcificada e o diâmetro da luz do vaso vai diminuindo gradativamente (COTRAN e col. 1999). Muitas. placas. ateroscleróticas. permanecem. estáveis. ou. progridem. gradualmente, outras rompem com liberação de fragmentos da placa e fatores teciduais que resultam em uma cascata de eventos que culminam muitas vezes em trombose intravascular. O resultado pode ser a oclusão total ou parcial do vaso (causando os sintomas de angina instável ou infarto do miocárdio) ou a placa pode ser reestabilizada freqüentemente seguida de estenose mais acentuada. Vários fatores estão associados com o aumento da vulnerabilidade da placa, incluindo uma grande concentração de macrófagos e presença de capa fibrosa fina (ABRAMS e col. 1996).. 1.13. Transporte do colesterol, Upides, lipoproteínas e aterosclerose. A escolha de uma opção terapêutica apropriada para pacientes sob risco de desenvolver doença cardiovascular é de grande importância. Dessa forma, o conhecimento necessário do metabolismo das Iipoproteínas plasmáticas e dos lípides que elas transportam como colesterol e trigIicérides, toma-se essencial. Como sabemos, o metabolismo das Iipoproteínas plasmáticas é altamente integrado, ou seja, devemos considerar cada lipoproteína e suas subclasses, evitando o que outrora era feito - focalizar apenas uma ou duas Iipoproteínas para determinar a escolha terapêutica (KWITEROVICH, 2000). A lipoproteína de densidade muito baixa (VLDL) , lipoproteína de baixa densidade (LDL) e a Iipoproteína (a) (Lp(a», formam o grupo de lipoproteínas plasmáticas.

(44) 14. que possuem apo 8-100. Níveis plasmáticos elevados dessas lipoproteínas e seus remanescentes (ex. lipoproteína de densidade intermediária (IDL», podem promover a aterosclerose (BROWN, 1997) (Figura 2). Plasmina. Plasminogênio. "1. Pa.ede Vascular. Pla,ma. Lp(a. Célula espumosa. Células Musculares Lisas. Figura 2 - Mecanismo da aterogênese - Lipoproteínas portadoras de apo 8-100 LOL, (3-VLDL (remanescentes de VLDL), Lp(a), o HDL no transporte reverso do colesterol, célula espumosa e ateroma (Modificado de KWITEROVICH, 2000).. Quando essas Iipoproteínas atravessam a barreira de células endoteliais e penetram na parede vascular podem ser oxidadas e então removidas por macrófagos, que são subseqüentemente transformados em células espumosas (Figura 2). Células endoteliais e espumosas ativadas secretam fatores de crescimento que estimulam a proliferação e migração das células musculares lisas. Esse processo culmina na formação da lesão aterosclerótica..

(45) 15. A apolipoproteína (a), componente da lipoproteína (a), pode promover trombose. Embora existam evidências apontando para a Lp(a) como um fator de risco independente para a DAC estudos recentes não encontraram correlação para suportar estas evidências. Geneticamente determinada, ela interfere na conversão do plasminigênio a plasmina, competindo pelos sítios de ligação de superfície existentes nas células endoteliais. Dessa forma desfaz-se o estado normal anticoagulante da superfície endotelial para a formação de um ambiente pro-coagulante (estímulo à síntese do inibidor do ativador do plasminogênio 1) e pro-aterogênico. Pesquisas têm demonstrado que o HDL impede a oxidação da LDL e ainda pode transferir o colesterol contido nos macrófagos para o plasma em um processo conhecido como transporte reverso do colesterol. O colesterol no plasma é basicamente transportado por três classes de lipoproteínas: VLDL, LDL e HDL. O colesterol total é o somatório do colesterol carreado por estas 3 lipoproteínas (após 10-12 horas de jejum). Tanto a VLDL quanto a LDL estão associadas ao processo aterogênico. Por outro lado o HDL-C alto demonstra a funcionalidade do transporte revesso do colesterol pela partícula de HDL, prevenindo a aterogênese. Essas 3 lipoproteínas podem ser separadas e subdivididas em subclasses por vários métodos, por exemplo a espectroscopia de ressonância magnética nuclear (RMN). A RMN subdivide as lipoproteínas do plasma nas seguintes subclasses: (1) VLDL, V6-V1, sendo V6 a maior e V1 a menor, (2) IDL, (3) LDL, L3-L1, L1 menor e mais densa, e (4) HDL, H5-H1, sendo H5, H4 e H3 as partículas maiores (FREEDMAN e col. 1998)..

(46) 16. As subclasses de VLDL, IDL e LDL, particularmente IDL e L1, estão positivamente correlacionadas com a iniciação e progressão da DAC. As subclasses de HDL, H5, H4 e H3 estão negativamente correlacionadas com a DAC. As subclasses H5, H4 e H3 correspondem ao HDL 2-C e as subclasses H2 e H1 correspondem aproximadamente ao HDL3-C. A Lp(a) não pode ser determinada por RMN só apenas por métodos imunoquímicos (FREEDMAN e co I. 1998; MARQUINA, e col. 1998). Níveis elevados de Lp(a) promovem aterosclerose devido ao seu conteúdo rico em ésteres de colesterol .. 1.14 Transporte do colesterol. 1.14.1. Transporte exógeno de lípides (Dieta) - A gordura da dieta é. secretada, após elaboração, pelas células intestinais (enterócitos) em partículas denominadas quilomícrons (QM), um processo que requer a presença de apo B48. Os triglicérides presentes no centro da partícula são hidrolisados a ácidos graxos e glicerol pela lipoproteína lípase (LPL) endotelial, sendo necessária a presença da apo C-li como cofator, produzindo assim quilomícrons menores denominados remanescentes de quilomícrons. Os remanescentes de quilomícrons são principalmente removidos pelo fígado devido à presença dos receptores da proteína relacionada ao receptor da LDL (LRP) (MAHLEY e col. 1996) (Figura 3). Quando esses remanescentes aumentam o seu tempo de residência no compartimento plasmático podem promover a aterogênese. Em indivíduos normais os níveis pós prandiais de triglicérides (TG) retornam ao nível basal entre.

(47) 17. 8-10 horas após uma dieta gordurosa. Por outro lado, pacientes portadores de DAC, apresentam níveis de TG pós prandiais elevados após uma dieta gordurosa devido ao maior tempo de residência das partículas de QM no espaço intravascular (PATSCH e co/. 1992). Uma dieta pobre em gordura total e saturada é importante para pacientes portadores de DAC, pois diminuindo a produção de QM e seus remanescentes, evita-se que estas partículas permaneçam por tempo superior ao normal no espaço intravascular..

(48) 18. Quilomicron Remanescente de Quilomicron Oxidação LRP. ~. LDl-r. . SR-81. Figado. ~. ---I HP1.. Figura 3 - Metabolismo das lipoproteínas plasmáticas - Vias: exógena e endógena, oxidação da LDL, transporte reverso do colesterol e transferência de ésteres de colesterol e triglicérides entre as partículas de HDL e (3-VLDL (Modificado de KWITEROVICH, 2000)..

(49) 19. 1.14.2. Transporte endógeno de lípides (Hepático) - As partículas de. VLDL, ricas em TG, são sintetizadas e secretadas pelo fígado, um processo dependente de apo 8-100 (Figura 3). No plasma, o TG das VLDLs é hidrolisado a ácidos graxos e glicerol (evento semelhante acontece com os OM) sob ação da LPL, na presença do seu cofator a apo C-li. Esse evento resulta na produção de VLDLs menores, chamadas remanescentes de VLDL, como remanescente final origina-se a partícula de IDL. Algumas partículas de IDL são removidas pelos receptores de LDL - receptor B/E, como resultado da interação entre a apo E presente nesta partícula e o receptor presente na superfície hepática, ou o seu conteúdo de TG pode ser hidrolisado, pela Iípase hepática (HL), produzindo a partícula de LDL (Figura 3). A LDL é normalmente removida pela interação entre a apo B-100 e o receptor B/E, localizado em. vários órgãos e tecidos corpóreos, principalmente no fígado. Porém se a LDL for oxidada ela pode ser removida por vários receptores, como: família do CO 36, SR-A, SR-B1, CO 68 e LOX-1 (RICCIARELLI e colo 2000) presente nas lesões ateroscleróticas em macrófagos e células SMC (formadores das células espumosas), que normalmente (na ausência de estímulos) além destes, expressam o receptor B/E e o LRP (LLORENTECORTÉS e col. 2000). A LDL é normalmente removida pela interação entre a apo B-100 e o receptor S/E, localizado em vários órgãos e tecidos corpóreos, principalmente no fígado. Porém se a LDL for oxidada ela pode ser removida por vários receptores,.

(50) 20. como: família do CO 36, SR-A, SR-B1, CD 68 e LOX-1 (RICCIARELLI e col. 2000) presente nas lesões ateroscleróticas em macrófagos e células SMC (formadores das células espumosas),. que normalmente (na ausência de. estímulos) além destes, expressam o receptor B/E e o LRP (LLORENTE-CORTÉS e col. 2000).. 1.15 Fatores genéticos associados. Fatores. genéticos. múltiplos,. incluindo. variações. em. loei. gênicos,. responsáveis pela estrutura e metabolismo das Iipoproteínas podem contribuir com a DAC (SALAZAR e col. 2000). Muitas dessas variações têm sido propostas como agravantes do risco para a DAC e algumas têm sido positivamente correlacionadas com alterações no perfil lipídico (GALTON, 1997; SALAZAR e col. 2000). O gene da apo E tem sido apontado como gene candidato, o qual expressa uma glicoproteína polimórfica (apo E) que possui uma importante influência no metabolismo lipídico (ILVESKOSKI e co I. 2000). As três isoformas dessa glicoproteína são designadas E2, E3 e E4, e a herança codominante forma os 6 fenótipos: E2I2, E3/2, E4/2, E3/3, E4/3 e E4/4, sendo o E3/3 o mais comum (UTERMANN e col. 1977). Vários estudos têm demonstrado que o alelo e4 da apolipoproteína E (apo E) está associado com um aumento no risco para DAC, entretanto, seu impacto varia com fatores como ocupação, grupo étnico e estilo de vida (DAVIGNON e col..

(51) 21. 1988; TIRET e col. 1994; BERCEDO -SANZ, 1999). Em algumas populações com uso de dietas classicamente cardioprotetoras e com uma incidência relativa baixa de doença cardiovascular, as isoformas da apo E4 demonstraram ter influência mínima nas concentrações dos lípides plasmáticos (SALAZAR e col. 2000). Salazar e col (2000) demonstraram que o polimorfismo Hhal do gene da apo E está fortemente associado com a DAC. Resultados então similares aos demonstrados por Galton e col. (1997). Tem sido observado que o genótipo E3/E4 é mais prevalente em pacientes DAC do que nos indivíduos não OAC em várias populações de estudo. Como o polimorfismo da apo E afeta os níveis de LOL-C e o risco na DAC ele pode também estar relacionado ao desenvolvimento da aterosclerose (ILVESKOSKI e col. 2000). Estudos demonstraram que tanto a aterosclerose quanto a espessura da íntima das artérias carótidas estão relacionados com o genótipo E3/2 e o alelo E4 da apo E (ILVESKOSKI e col. 2000). O isotipo da apo E adquirida pelas lipoproteínas artificiais e sua biodisponibilidade são extremamente importantes para a endocitose destas partículas por vários tipos celulares (CARPENTIER e col. 1997). A teoria da aterosclerose causada pela homocisteína, um aminoácido que contém. um. grupamento sulfidrílico,. um. intermediário formado. durante o. catabolismo do aminoácido essencial - metionina - (THAMBYRAJAH e col. 2000), apareceu da observação de doenças homozigóticas como a homocisteinúria, a qual é caracterizada por hiperhomocisteinemia grave (> 0,1 mmoI.L- 1), onde se observa doença vascular prematura (MCKULLY, 1969; MUDO e col. 1995). Valores ligeiramente elevados têm sido observados em mais de 7%) da população.

(52) 22 (0,015-0,03 mmoI.L-1) (THAMBYRAJAH e col. 2000). Evidências epidemiológicas sugerem que uma pequena elevação no nível plasmático da homocisteína é um fator de risco e possivelmente um agente causador da doença aterosclerótica. Podemos citar as seguintes evidências a respeito: 1. Estudos de corte transversal tem demonstrado uma associação entre a homocisteína plasmática e a doença aterosclerótica (GRAHAM e col. 1997). 2. Estudos caso-controle pareados prospectivos demonstram que níveis elevados da homocisteína plasmática precedem o desenvolvimento da doença aterosclerótica (THAMBYRAJAH e col. 2000). 3. O alto valor preditivo para a concentração plasmática da homocisteína como um indicador de mortandade futura em pacientes com doença arterial coronária estabelecida (NYGARD e col. 1997) O suporte para a teoria da aterosclerose causada pela homocisteína, vem de experimentos que investigam os possíveis mecanismos em que a homocisteína induz a aterogênese (Figura 4), como: 1. Lesão endotelial, 2. Ativação de plaquetas, 3. Proliferação das SMC, 4. Modificação oxidativa das Lipoproteínas (ex. OX-LDL), 5. Interação endotélio e leucócitos..

(53) 23. Homociateína. 1-. I. !. +. nTRBSa OxaATNO POlI: QllRAÇAo . . RADICAI8 ~ lII8IÇAo DAGWTAT1ONA~. +LUAo. ... "GRADAçAo DO T. I!NDOTI!LW.. OXIDO NITRIcO. I. ,............,.....+. VAeOC:OMTRICÇAD. •. I. a'BTOS 1!NDOTeL.JAa. _TaJo~. LESllIlO. } ,--. ~~. ..._rÂnros. Figura 4 - Efeitos adversos da homocisteína. GAG, via do glicosaminoglicanoantitrombina 111, Proteína CfTM, via anticoagulante da trombomodulina C, TF, fator tecidual, tPa, ativador do plasminogênio tecidual (Modificado de THAMBYRAJAH e col. 2000). A deficiência grave da MTHFR causa um aumento nos níveis de homocisteína. e está. associada. a. retardos. do. desenvolvimento. mental,. anormalidades neurológicas e complicações vasculares (MOrri e col. 1998). Muitos indivíduos com elevação discreta nos níveis da homocisteína possuem a forma termolábil da MTHFR que tem a sua atividade enzimática defeituosa (KANG e col. 1991). Recentemente foi identificada a substituição de C para T no.

(54) 24. nucleotídeo 677 do gene da MTHFR, que converte a alanina ao resíduo de valina, e é responsável pela termolabilidade da enzima (MOTII e col. 1998). A freqüência relativa de homozigotos para a mutação varia de 0,05 a 0,15 entre as populações (MOTULSKY, 1996). 677. A associação entre o polimorfismo C. ~ T e o risco para doença. coronária tem sido descrito por vários autores (KLUIJTMANS e col. 1996; GALLAGHER e col. 1996).. 1.16. Lipoproteinas artificiais e suas possibilidades terapêuticas. As lipoproteínas plasmáticas servem como veículo para o transporte de lípides hidrofóbicos (triglicérides, colesterol e vitaminas), dos sítios de formação para locais de uso e armazenamento (CARPENTIER e col. 1997). Desde muito o suplemento lipídico tem sido considerado como um meio de prover os tecidos com fontes nutricionais, particularmente em algumas situações especiais. Pouca atenção estava sendo dada ao metabolismo das emulsões lipídicas e aos possíveis outros componentes que podem ser veiculados por elas, além de ácidos graxos e triglicérides. Avanços recentes indicam o grande potencial do suprimento lipídico para modular funções essenciais do corpo, como influenciar na resposta celular a estímulos, metabolismo intracelular assim como ação de mediadores importantes veiculados por essas partículas. Estas propriedades podem influenciar nas respostas inflamatória, trombótica, microperfusão tecidual e ainda evitar reações.

(55) 25 de peroxidação (CARPENTIER e col. 1997). Com o progresso tecnológico recente sobre o metabolismo dessas partículas lipídicas, em futuro próximo, há possibilidade de veicular eficientemente agentes terapêuticos incluídos nestas partículas para tecidos específicos (CARPENTIER e col. 1997).. 1.17. Emulsão lipídica artificial (LOE). A partir do conhecimento adquirido com os estudos das características físico-químicas das lipoproteínas plasmáticas, foram desenvolvidos modelos de emulsões, semelhantes tanto aos QM quanto a LDL, que são utilizadas no estudo do metabolismo das lipoproteínas (GISBURG e col. 1982; MILLER & SMALL, 1983A.; MILLER & SMALL, 19838).. Em 1993 Raul Maranhão e colaboradores, na Universidade de São Paulo, demonstraram em ratos e seres humanos que a utilização de uma emulsão artificial (LOE), semelhante à porção lipídica da LOL, mas desprovida de apolipoproteínas, apresentava cinética plasmática semelhante à da lipoproteína natural. Quando injetada no compartimento plasmático dos indivíduos, a LOE adquire as apolipoproteínas das lipoproteínas naturais, sendo a mais importante a apo E, que lhe confere a capacidade de ligar-se aos receptores 8,E principalmente hepáticos, porém, existentes também em outras células, como vasculares, de órgãos esteroidogênicos e pancreáticas (CNOP e co I. 2000). Além disso, experimentos. mostraram. aumento. da. captação. da. LOE. marcada. com. radioisótopos em ratos, quando tratados com 17 a-etinilestradiol, hormônio que.

(56) 26 sabidamente aumenta a expressão dos receptores B,E (MARANHÃO e col. 1993). Em seres humanos portadores de patologia em que a expressão dos receptores B,E está aumentada, como a leucemia miel6ide aguda (LMA) (HO e col. 1978) ou diminuída,. como. na. hipercolesterolemia. familiar. forma. heterozig6tica. (GOLDSTEIN & BROWN, 1983), a cinética plasmática da LDE está alterada (ROLAND, 1992; MARANHÃO e col. 1994). Em tese de Doutoramento, Roland (1992), citado por SANTOS, 1995, demonstrou que a cinética plasmática da LDE encontrava-se retardada em indivíduos portadores de hipercolesterolemia familiar, quando comparada a indivíduos normais. Por outro lado, Maranhão e colaboradores (1994) encontraram que em indivíduos portadores de LMA, com a doença ativa, a remoção plasmática da LDE foi significativamente mais rápida quando comparada a indivíduos portadores de leucemia linf6ide aguda (LLA). As células da LLA, sabidamente, não têm expressão aumentada dos receptores B,E (CHAIT e col. 1982). Após a remissão da LMA induzida por quimioterapia, as características cinéticas (remoção) da LDE voltaram aos valores normais. Desta maneira o comportamento da LDE pode servir de ferramenta para avaliarmos o metabolismo da LDL ou provavelmente como veículo para o transporte de drogas devido a sua captação por células neoplasicas (MARANHÃO e col. 1994). A LDE é produzida em laboratório, de forma prática, em condições estéreis e apirogênicas e a partir de materiais fornecidos pela indústria químicofarmacêutica. Não apresenta os inconvenientes das Iipoproteínas naturais, que são isoladas e marcadas por metodologias trabalhosas e que só podem ser.

(57) 27 utilizadas de maneira autóloga, devido ao risco da transmissão heteróloga de doenças por via parenteral. Outra característica importante das emulsões é que se pode variar a sua composição (MARANHÃO e col. 1986) e, desta forma, estudarmos outros aspectos do metabolismo lipídico como a esterificação do colesterol livre, a atividade de proteínas de transferência, o efeito de drogas hipolipemiantes e posteriormente mecanismos de captação vascular..

(58) tfl\l.L tfJI:JI.Lsnr.

(59) 28. 2.. JUSTIFICATIVA. Durante os últimos trinta anos temos presenciado um declínio razoável da mortalidade por causas cardiovasculares em países desenvolvidos, enquanto que elevações relativamente rápidas e substanciais têm ocorrido em países em desenvolvimento, dentre os quais o Brasil é um dos representantes. Dessa forma, visamos avaliar cuidadosamente a captação da LDE no tecido vascular e pericárdio de pacientes portadores de doença arterial coronária submetidos à cirurgia de revascularização miocárdica para que em futuro próximo exista a possibilidade de veicular eficientemente agentes terapêuticos incluídos nesta partícula para tecidos específicos acometidos de processo aterosclerótico. As emulsões lipídicas semelhantes à LDL vêm sendo apontadas como carreadores promissores para drogas utilizadas no tratamento de doenças malígnas (VITOLS e col. 1991; LESTAVEL-DELATIRE e col. 1992). Cumpre ressaltar que a LDE já vem sendo empregada no transporte de drogas antineoplãsicas (MARANHÃO e col. 1994; GRAZIANE e col. 1999), para o tratamento de neoplasias consideradas importantes..

(60) SOI\/1.3rElO.

(61) 29. 3.. OBJETIVOS DO ESTUDO. Avaliar a captação da LDE em fragmentos de enxerto vascular de aorta que normalmente são retirados para o implante das pontes de veia safena, assim como outros fragmentos oriundos das artérias mamária e radial de veia safena e de. pericárdio,. provenientes. de. pacientes. submetidos. à. cirurgia. de. revascularizaçáo miocárdica. Determinar a cinética da LDE, a taxa de esterificação do CL captado e o genótipo do apo E..

(62) tfJI.Ls/nstfJ.

(63) 30. 4.. 4.1. CAsuíSTICA. Os pacientes :. Foram avaliados 10 pacientes (Tabelas 1-2) portadores de doença arterial coronária (DAC) submetidos à cirurgia de revascularização miocárdica no centro cirúrgico do Instituto do Coração do Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo (InCor-HCFMUSP). Foi avaliada a captação da LDE em fragmentos das artérias aorta, torácica interna, radial, da veia safena e do pericárdio, habitualmente retirados durante a revascularização miocárdica. A porcentagem da captação média da LDE nos fragmentos foi comparada entre si e com os fragmentos de enxerto que habitualmente são isentos de aterosclerose (ex. artéria radial). O DNA foi extraído do sangue periférico para determinação do genótipo para apo E, fator extremamente importante para a interpretação dos dados obtidos a partir do decaimento plasmático e captação da LDE no tecido vascular. Ressaltamos que essas amostras obtidas já fazem parte do procedimento cirúrgico do paciente, portanto, não foram realizados quaisquer procedimentos adicionais visando obtê-Ias para estudo. Esse protocolo de estudo utilizando emulsões artificiais foi aprovado pela Comissão Científica e de Ética do Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina.

(64) 31. da Universidade de São Paulo e do Instituto do Coração - InCor e faz parte do Projeto "Lipoproteínas artificiais na investigação das dislipidemias e no tratamento do câncer', aprovado na sessão 345/99/09, protocolo de pesquisa SOC 1517/99n2.. 4.2. Foram selecionados para o estudo indivrduos com os seguintes. critérios:. 4.2.1 Critérios de inclusão. 1. Sexo masculino, 2. Idade entre 40 e 70 anos, 3. Consentimento, após informação, em realizar o estudo, 4. Doença arterial coronária, confirmada por angiocoronariografia,. 5. Perfil lipídico entre os valores normais de referência, mesmo em portadores de diabetes melito ou dislipidemia, usando ou não medicação hipolipemiante (ex. vastatinas), 6. Realizar cirurgia. de. administração da LDE.. revascularização. miocárdica. 24. h após.

(65) 32 4.2.2 Critérios de exclusão. 1. Indivíduos. portadores. de. disfunção. hepática. (atividade. de. protrombina < 50%, ALT e A5T > 2x o valor de referência), 2. Indivíduos portadores de disfunção renal (creatinina sérica > 2,0. mg/dl) e ou síndrome nefrática (proteinúria > 3,0 g/l e albumina sérica < 3,0 g/l), 3. Indivíduos com disfunção tireoideana, 4. Procedimento de revascularização miocárdica sem obtenção de fragmentos (ex. cirurgia a laser)..