UNIVERSIDADE FEDERAL DE SÃO JOÃO DEL-REI – UFSJ CAMPUS CENTRO-OESTE DONA LINDU – CCO PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS
DA SAÚDE
ADRIANA BENATTI BILHEIRO
BIOLOGIA E ÍNDICES DE INFECÇÃO NATURAL POR TRIPANOSOMATÍDEOS EM Rhodnius montenegrensis (HEMIPTERA, REDUVIIDAE, TRIATOMINAE) NO ESTADO DE RONDÔNIA, BRASIL.
DIVINÓPOLIS/MG JULHO/2016
UNIVERSIDADE FEDERAL DE SÃO JOÃO DEL-REI – UFSJ CAMPUS CENTRO-OESTE DONA LINDU – CCO PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS
DA SAÚDE
ADRIANA BENATTI BILHEIRO
BIOLOGIA E ÍNDICES DE INFECÇÃO NATURAL POR TRIPANOSOMATÍDEOS EM Rhodnius montenegrensis (HEMIPTERA, REDUVIIDAE, TRIATOMINAE) NO ESTADO DE RONDÔNIA, BRASIL.
Orientador: Prof. Dr. Luís Marcelo Aranha Camargo
DIVINÓPOLIS/MG JULHO/2016
Dissertação apresentada ao Programa de Pós Graduação em Ciências da Saúde, da Universidade Federal de São João Del Rei, como requisito parcial para a obtenção do grau de Mestre.
Agradecimentos:
À minha família, meu pai Benone e minha mãe Marcia pelo apoio, o carinho, a atenção e principalmente a fé no meu trabalho que me renovava a cada momento em que a minha própria fé falhava. Ao meu companheiro Willian pela presença constante, por todas as contribuições que foram inúmeras e essenciais, pelo amor de sempre e pelo cuidado de sempre.
Ao meu orientador Dr. Luís Marcelo Aranha Camargo, pela oportunidade de trabalhar lado a lado, pela acolhida carinhosa e pelos inúmeros exemplos dados que seguirei sempre. Demonstro aqui a minha mais profunda admiração e carinho pelo profissional grandioso com o qual tive a honra de conviver.
Ao grande mestre Dr. Gilberto Fontes, pelas lições valiosas e pelo cuidado de sempre. Desde a graduação até aqui me inspirando e me ajudando a crescer e me superar a cada dia. Seu trabalho primoroso influencia gerações de estudantes e transforma vidas. Sou grata pelo convívio, pelo aprendizado, pelo exemplo.
Ás Universidade Federal de São João del Rei, Universidade de São Paulo e á FAPEMIG pelo auxílio e pela estrutura oferecida que possibilitou a conclusão deste projeto.
Aos colaboradores Dr. Jansen Medeiros da FioCruz de Rondônia, Dr. João Aristeu da Rosa da UNESP de Araraquara e Dra. Paola Ortiz da USP de São Paulo. Agradeço imensamente pelo auxílio e pelo apoio na conclusão deste trabalho.
Por fim, agradeço aos amigos de Monte Negro que colaboraram direta ou indiretamente no desenvolvimento do projeto seja trabalhando lado a lado ou dividindo comigo momentos de descanso fundamentais. O carinho de vocês estará sempre no meu coração, espero brevemente estar novamente no convívio de todos vocês.
“Quem atribui à crise seus fracassos e penúrias, violenta seu próprio talento e respeita mais os problemas do que as soluções (...) sem crise não há mérito e é na
crise que se aflora o melhor de cada um.” (Albert Einstein)
Resumo
Triatomíneos (“barbeiros”) são vetores do agente etiológico da doença de Chagas, Trypanosoma cruzi, além de outros tripanosomatídeos. O gênero Rhodnius, apesar de majoritariamente silvestre, pode colonizar domicílios tendo, portanto, potencial para transmissão da doença de Chagas. A espécie Rhodnius montenegrensis foi descrita em 2012, sendo divulgados relatos desta espécie em palmáceas próximas a residências rurais em três municípios no estado de Rondônia e em um município no estado do Acre. O objetivo deste estudo foi analisar a biologia de R. montenegrensis em condições de laboratório e a infecção natural por tripanosomatídeos em Monte Negro, Rondônia. Foram capturados espécimes de R. montenegrensis em palmáceas da espécie Obgnya speciosa, identificados por morfometria tradicional e por amplificação por reação em cadeia da polimerase. Os parâmetros biológicos foram analisados em espécimes provenientes de colônias mantidas no Instituto de Ciências Biomédicas 5-USP. A análise biométrica foi realizada a partir de amostra de 184 ovos, observados diariamente até a eclosão e no decorrer de todo o ciclo de desenvolvimento dos triatomíneos gerados. Para determinação da positividade para tripanosomatídeos foi realizado o exame a fresco de material fecal de 60 espécimes, sendo que dos positivos foi extraído o trato intestinal para realização da PCR específica para T. cruzi e T. rangeli. São descritos parâmetros biológicos com relação à viabilidade de ovos, a massa total dos ovos embrionados e eclodidos, o período de incubação, a massa dos triatomíneos antes e após o repasto sanguíneo, os percentuais de ecdises por estádio, o percentual de mortalidade, a razão de sexo e duração do ciclo de desenvolvimento. A partir do exame a fresco de material fecal de 60 espécimes capturados em palmáceas, observou-se que 22 (36,7%) estavam infectados por tripanosomatídeos e pela análise molecular 16 (72,7%) estavam infectados por T. cruzi, dois (9,1%) por T. rangeli, dois (9,1%) por T. rangeli e T. cruzi (infecção mista) Esse estudo fornece informações relevantes para o entendimento dos parâmetros biológicos da espécie R. montenegrensis. Além disso, é relatado pela primeira vez a infecção natural de R. montenegrensis por T. cruzi no estado de Rondônia. Os dados obtidos mostram a necessidade de uma maior atenção pelo sistema de vigilância epidemiológica da doença de Chagas na região.
Palavras-Chave: Triatominae, Rhodnius montenegrensis, Trypanosoma cruzi, Trypanosoma rangeli, biologia, Rondônia.
Abstract
Triatominae (“kissing bugs”) are insects notorious as the vectors of Trypanosoma cruzi, the etiologyc agent of Chagas disease. The triatomines of the genus Rhodnius are primarily silvatic, nevertheless, the widespread occurrence of native species that invade households are suggesting their possible role in the transmission of the disease. Rhodnius montenegrensis was described in 2012. Since them, reports of the occourence of this specie associated with palm trees near households in Rondônia and Acre have been published. This study aimed to analyze the biologial aspects of Rhodnius montenegrensis and the contamination of triatomines by trypanosomatids in Monte Negro, Rondônia. The capture of triatomines occoured in Obgnya speciosa (babassus) specimens around the households. For the identification of the collected triatomines, morphologic and molecular analysis were made by the tradicional morphometric analysis followed by amplification of the DNA using PCR. For the study of the biological parameters of the colonies maintained in the laboratory three groups of triatomines were used for obttaining 184 eggs that were observed daily and analysed in accordance to Rabinovich, 1972. The positivity for trypanosomatids were confirm by examining the intestinal contente followed by PCR amplification of the Catepsina L-like gene specific for T. cruzi and T. rangeli. A serie of biometric parameters were observed, as: Viability of the eggs, total mass of eggs, incubation period, total mass of the triatomines before and after the blood meal, sex ratio, mortality ratio and duration of the egg to adult development cycle. The analysis for contamination by trypanosomatids showed a total of 22 (36,7%) positive triatomines by examining the intestinal contente and after the molecular analysis 16 (72,7) were positive for T. cruzi, two (9,1%) were positive for T. rangeli and tow (9,1%) were positive for both T. cruzi and T. rangeli. This data provides relevant informations that can be useful to create new strategies for vector control and suggests the need to reassess the actual status of Chagas disease in the state of Rondônia.
Key words: Triatominae, Rhodnius montenegrensis, Trypanosoma cruzi, biology, Rondônia.
Sumário
Resumo I
Abstract II
Lista de Figuras V Lista de Tabelas VI
Lista de Gráfico VII
Lista de Quadros VII
1.Introdução 1 1.1.Revisão de literatura 4 2.Objetivos 17 2.1.Objetivos gerais 17 2.2.Objetivos específicos 17 3.Materiais e Métodos 18 3.1.Área de estudo 18 3.2.Capturas 20 3.3.Identificação de triatomíneos
3.3.1Identificação morfológica de triatomíneos 3.3.2 Caracterização específica ou diagnose
3.3.3 Estudos moleculares e por análise filogenética Bayesiana de Triatomíneos
3.3.4 Extração e amplificação do DNA genômico
3.3.5 Purificação e sequenciamento do DNA amplificado 3.3.6 Identificação molecular 3.3.7 Análises filogenéticas 3.3.8 Inferência Bayesiana 22 22 22 23 23 25 25 25 25 3.4.Dados biométricos 27 3.4.1.Material biológico 27
3.4.2.Ciclo biológico do triatomíneo 28
3.5.Análise estatística 31
3.6.Identificação dos tripanosomatídeos 32
3.6.1.Exame a fresco do material fecal de triatomíneos 32 3.6.1. Amplificação por PCR do domínio catalítico de Catepsina L-like (CATL) para T. rangeli (PCR DTraCatL) e T. cruzi (PCR DTcrCatL)
4.Resultados 35 4.1.Identificação de triatomíneos
4.1.1 Identificação morfológica de triatomíneos 4.1.2 Caracterização específica ou diagnose
4.1.3 Estudos moleculares e por análise filogenética Bayesiana de triatomíneos 35 35 35 36
4.2.Ciclo biológico dos triatomíneos 38
4.2.1.Viabilidade de ovos 38
4.2.2.Peso dos ovos 38
4.2.2.Período de incubação e duração do ciclo de desenvolvimento 39
4.2.3.Ecdises por estádio 41
4.2.4.Razão de sexo 42
4.2.5.Peso em gramas por estádio de desenvolvimento 42 4.2.6.Número de alimentações por estádio e percentual de mortalidade 44
4.3.Identificação de tripanosomatídeos 46
4.3.1.Resultados obtidos a partir do exame a fresco de material fecal 46 4.3.2. Resultados obtidos a partir da análise molecular por amplificação por PCR do domínio catalítico de Catepsina L-like (CATL) para T. rangeli (PCR DTraCatL) e T. cruzi (PCR DTcrCatL)
47
5.Discussão 50
5.1.Dados biométicos 50
5.1.1.Viabilidade de ovos em Rhodnius montenegrensis 50
5.1.2.Peso dos ovos 50
5.1.3.Período de incubação e duração do ciclo de desenvolvimento 51
5.1.4.Ecdises por estádio 52
5.1.5.Razão de sexo 52
5.1.6.Peso em gramas por estádio de desenvolvimento 53 5.1.7.Número de alimentações por estádio e percentual de mortalidade 54 5.2.Infecção por tripanosomatídeos
6.Conclusão
55 59
7.Considerações Finais 61
Lista de Figuras
Figura 1 Diferenças morfológicas dos hemípteros 4
Figura 2 Via de transmissão clássica (vetorial) do Trypanosoma cruzi. 11 Figura 3 Mapa do município de Monte Negro, Rondônia 19 Figura 4 Acondicionamento de espécimes para análise biométrica. (A) e (C): Bandejas contendo frascos para acondicionamento de espécimes. (B): Espécime de Rhodnius montenegrensis adulto observado em análise biométrica.
29
Figura 5 Fotos do aparelho genital externo de Rhodnius montenegrensis. (A): Genital externa em machos; (B): Genital externa em fêmeas.
30
Figura 6Imagem por microscopia de luz das estruturas genitais de Rhodnius montenegrensis. A - Phallus of R. montenegrensis : En, endosoma; EPlb, extensão mediana da placa basal; Plb, Placa basal. B – Parâmeros e C – Processo media do pigoforo.
35
Figura 7 Imagem do gel de agarose com os resultados da PCR com as bandas referentes à amplificação do gene do DNA mitocondrial citocromo b (Cytb) para as amostras de 1 a 12 obtidas a partir de 12 espécimes de Rhodnius montenegrensis e controle positivo (CP).
36
Figura 8 Análise Bayesiana baseada em parâmetros de semelhança entre 5 espécies do gênero Rhodnius e a espécie Rhodnius montenegrensis baseada no gene Cyt b mitocondrial. Triatoma infestans e Panstrongylus megistus foram utilizados como outgroups.
37
Figura 9 Fotos de ovos de Rhodnius montenegrensis. (A): Ovos embrionados, (B): Ovos após eclosão da ninfa de 1⁰ estádio.
39
Figura 10 Fotos de espécimes de Rhodnius montenegrensis. (A): Vista frontal da cabeça, (B): Vista frontal do abdômen da fêmea, (C): Vista frontal do abdômen do macho, (D): Vista dorsal do abdômen do macho, (E): Vista dorsal do abdômen da fêmea, (F): Vista dorsal do abdômen.
Figura 11 Lâminas contendo forma flagelada semelhante a Trypanosoma cruzi corado com Giemsa obtido no Insetário do ICB5-USP, Monte Negro-RO. Figura 12 Gel contendo fragmentos de CATL gerados a partir da amplificação por PCR diagnóstico das amostras 1 a 22, obtidas a partir do trato gastro-intestinal de Rhodnius montenegrensis.
41
47
Lista de Tabelas
Tabela 1 Peso em gramas para ovos em Rhodnius montenegrensis antes e após a ecosão da ninfa de 1⁰ estádio.
34
Tabela 2 Duração em dias do ciclo de desenvolvimento do ovo à fase adulta em Rhodnius montenegrensis.
35
Tabela 3 Peso em gramas por estádio em Rhodnius montenegrensis em jejum.
39
Tabela 4 Peso em gramas por estádio em Rhodnius montenegrensis após alimentação em camundongos.
39
Tabela 5 Número de alimentações realizadas por estádio de desenvolvimento em Rhodnius montenegrensis
45
Tabela 6 Percentual de mortalidade por estádio de desenvolvimento em Rhodnius montenegresis
Tabela 7 Positividade para formas flageladas semelhantes a Trypanosoma cruzi por exame a fresco de material fecal em ninfas de 5⁰ estádio e indivíduos adultos.
45
Lista de Gráficos:
Gráfico 1 Percentual de ovos eclodidos e ovos inviáveis em Rhodnius montenegrensis
33
Gráfico 2 Número de ecdises por estádio ninfal em Rhodnius montenegrensis.
37
Gráfico 3 Número de indivíduos por sexo em Rhodnius montenegrensis. 38
Lista de Quadros:
Quadro 1 Códigos de acesso no GenBank dos genes do citocromo b 37 mitocondrial (Cytb) de triatomíneos e outgroups (*) utilizados neste estudo.
Quadro 2 Identificação das amostras obtidas a partir da extração do trato gastro-intestinal dos triatomíneos, a respectiva localidade onde o espécime foi coletado e a espécie de tripanosoma encontrado na amostra.
1. Introdução:
Os Triatomíneos são insetos hematófagos pertencentes à Família Reduviidae (Hemíptera, Heteróptera) que possuem aparelho do tipo picador sugador, originando-se anteriormente aos olhos. Estes insetos alimentam-se do sangue de vertebrados, inclusive de humanos. Possuem importância epidemiológica por serem vetores do protozoário Trypanosoma cruzi, agente etiológico da doença de Chagas e outros protozoários flagelados como o Trypanosoma rangeli (Abad-Franch et al., 2013). A subfamília Triatominae é composta de 151 espécies, todas susceptíveis ao protozoário T. cruzi sendo, portanto, vetores em potencial do agente etiológico da doença de Chagas (Diotaiuti et al., 2005, Alevi et al., 2015).
A doença de Chagas era inicialmente uma doença de caráter enzoótico, mantida entre triatomíneos e mamíferos silvestres e posteriormente passou a ser transmitida a seres humanos quando estes invadiram os ecótopos silvestres ou quando vetores e mamíferos invadiram áreas domiciliares em decorrência dos processos de desflorestamento de áreas preservadas (Coura et al., 2015). Esse processo levou à adaptação dos vetores e colonização de domicílios e áreas peridomiciliares contribuindo para o aumento da transmissão aos seres humanos (Coura et al., 2015).
A doença de Chagas, ou tripanossomíase americana, é uma doença crônica potencialmente fatal, cujo principal mecanismo de transmissão é a deposição de fezes e/ou urina do vetor contaminadas com formas infectatntes do T. cruzi sobre os tecidos cutâneos, mucosa ou ferimento causado pelo aparelho bucal dos triatomíneos. Além deste, existem outros mecanismos de infecção como a transmissão congênita, por transfusões de sangue, doação de órgãos, a partir da ingestão de alimentos contaminados com o T. cruzi e a partir de fezes e/ou urina de triatomíneos infectados ou secreções das glândulas odoríferas de marsupiais infectados. Nenhuma vacina ou tratamento efetivo para a fase crônica da doença está disponível, portanto, o controle de vetores domiciliares ainda é a principal estratégia para prevenir a infecção humana (Massaro et al., 2008, Gurgel-Gonçalvez et al., 2012).
Aproximadamente 100 anos após a sua descoberta, a doença de Chagas continua representando um importante problema de saúde pública principalmente na América Latina. Estima-se que cerca de 7,7 milhões de pessoas estejam infectadas e 109 milhões ainda vivendo em áreas de risco (Dias et al., 2014). Nos últimos anos,
a Amazônia brasileira vem chamando a atenção devido à constante ocorrência de surtos de doença de Chagas. O primeiro caso autóctone na Amazônia brasileira foi registrado em 1969 em Belém, no estado do Pará (Shaw et al., 1969). Em 2008, Pinto e cols. observaram 233 casos agudos no período de 1968 a 2005 também no estado do Pará (Pinto et al., 2008). Desde então, o número de casos agudos da doença tem aumentado na Amazônia brasileira, sendo registrados 568 novos casos no período de 2002 a 2008 (Brum-Soares et al., 2010).
Entre outros hemoflagelados transmitidos por triatomíneos está o protozoário T. rangeli que possui ampla distribuição entre as Américas do Sul e Central e pode causar infecções mistas tanto em vertebrados quanto em invertebrados. Apesar de considerado não patogênico para o hospedeiro vertebrado, a resposta imune humoral induzida pelo T. rangeli no hospedeiro leva a produção de anticorpos que podem gerar reações cruzadas com antígenos do T. cruzi interferindo no diagnóstico da doença de Chagas (Ferreira et al., 2014).
Apesar de todas as espécies de triatomíneos serem consideradas potencialmente transmissoras do T. cruzi, a sua importância epidemiológica está diretamente relacionada à sua capacidade de invadir e colonizar domicílios. Considerando-se que a invasão e colonização de ambientes artificiais por triatomíneos é uma condição adaptativa impulsionada pelas modificações dos seus ecótopos naturais, torna-se necessário fazer uma reavaliação constante sobre os riscos da transmissão vetorial (Lent & Wygodzinsky 1979, Zárate, 1984; Carcavallo et al., 1997; Molina et al., 2000).
Observa-se que a invasão de domicílios por vetores silvestres do T. cruzi na região da Amazônia brasileira é comum e o encontro destes nas áreas domiciliares já foi reportada em diversas localidades. Além disso, são comuns nessa região as atividades extrativistas como a coleta da piassava, açaí, castanha, óleo de copaíba e borracha. Esse tipo de atividade aumenta a exposição dos trabalhadores a vetores silvestres aumentando assim, os eventos de transmissão ativa da doença de Chagas na região (Aguillar et al., 2007, Coura, 2015).
Assim como na maioria das regiões neotropicais, as ocorrências de invasão domiciliar e peridomiciliar pelos triatomíneos na região Amazônica ocorrem majoritariamente por espécies do gênero Rhodnius associados a palmeiras, sendo
esta a principal causa da ocorrência de eventos de transmissão tanto na forma de infecção endêmica ou hipoendêmica quanto na forma de surtos por transmissão oral do T. cruzi (Grijalva et al. 2003, Coura & Junqueira 2012).
A espécie R. montenegrensis Rosa, Rocha, Gardim et al. 2013, foi descrita em 2012 a partir de espécimes capturados no município de Monte Negro, Rondônia (Rosa et al., 2012). Em 2013 foi registrada pela primeira vez, em estudos na região de Buritis, Rondônia, a infecção desta espécie pelo protozoário T. rangeli, demonstrando um aumento no número de espécies do gênero Rhodnius infectados por esse protozoário (Meneguetti et al., 2013).
Devido à invasão dessas espécies do gênero Rhodnius ao domicílio, o estudo de parâmetros biológicos que influenciam a capacidade de transmissão de tripanosomatídeos pode contribuir para melhorar a compreensão da importância epidemiológica desses vetores. Parâmetros como duração do ciclo de vida e mortalidade devem ser considerados, pois são variáveis diretamente relacionadas com o tamanho das populações dos vetores (Barreto-Santana, 2011).
Este estudo, portanto, tem por objetivo a análise de parâmetros biológicos da espécie descrita recentemente Rhodnius montenegrensis e a determinação da infecção natural por tripanosomatídeos no município de Monte Negro, Rondônia.
1.1. Revisão de literatura:
Os Triatomíneos:
Os triatomíneos são insetos taxonômicamente incluídos na Ordem Hemiptera, Subordem Heteroptera, Família Reduviidae e Subfamília Triatominae (Abad-Franch et al., 2013; Alevi et al., 2013; Jurberg et al., 2013; Poinar, 2013). Estão incluídos na Ordem Hemiptera os insetos com aparelho do tipo picador sugador originando-se anteriormente aos olhos. Este é constituído por um par de mandíbulas e um de maxilas, envolvidos por um lábio tri ou tetrassegmentado, e sem palpos (Diotaiuti et al., 2005).
Os insetos que compõem a Ordem Hemíptera se dividem entre três tipos de insetos, os hematófagos que se alimentam de sangue de vertebrados, incluindo humanos, os fitófagos que se alimentam de seiva de plantas e os predadores que se alimentam da hemolinfa de outros insetos. De uma maneira geral são morfologicamente parecidos e essa semelhança faz com que os triatomíneos (hematófagos), vetores do T. cruzi, sejam facilmente confundidos com os insetos fitófagos e predadores (Brener et al., 2000). Uma das carcaterísticas que distinguem os três tipos de hemípeteros é a morfologia da probóscida. Nos hemípteros fitófagos ela é reta, constituída de quatro segmentos sempre ultrapassando o primeiro par de patas. Nos hemípteros predadores, a probóscida é curva e não ultrapassa o primeiro par de patas. Já nos hemípteros hematófagos (triatomíneos), a probóscida é reta composta de três segmentos e não ultrapassa o primeiro par de patas (Diotaiuti et al., 2005). As diferenças morfológicas básicas que distinguem os três tipos de hemípteros podem ser visualizadas na Figura 1.
Figura 1: Diferenças morfológicas do aparelho bucal dos hemípteros. Adaptado de Diotaiuti et al., 2005.
A subfamília Triatominae compreende um grupo distinto da família Reduviidae definidos pela sua obrigatoriedade a hematofagia (Monteiro et al., 2000). Comumente conhecidos como barbeiros ou chupões, são amplamente distribuídos pelas Américas podendo ser encontrados desde o sul dos Estados Unidos até o sul da Argentina (Meneguetti et al., 2011a).
Esses insetos possuem o desenvolvimento paurometábulo ou incompleto e assim, a partir do ovo é gerada uma forma imatura chamada de ninfa ou imago. Essas formas imaturas possuem os mesmos hábitos alimentares e morfologia semelhante ao inseto adulto, exceto pela ausência de asas e pela ausência de sistema reprodutor desenvolvido. Na subfamília Triatominae, o desenvolvimento se dá a partir de cinco estádios ou ínstares ninfais anteriores a fase adulta alada. Em todos os seus cinco estádios ninfais, além dos estádios adultos machos e fêmeas, estes insetos são obrigatoriamente hematófagos. Com isso, necessitam repetidos e massivos repastos sanguíneos tanto para seu desenvolvimento ninfal, quanto para sua reprodução e dispersão. Como herança de sua origem predadora, algumas espécies, quando em jejum prolongado, são capazes de se alimentar da hemolinfa de outros insetos (Lent & Wygodzinsky 1979, Lorosa et al. 2000, Garrouste 2009, Pontes et al. 2011).
Atualmente, são reconhecidas e descritas 151 espécies de triatomíneos. Entre elas, 67 espécies são encontradas no Brasil, onde se observa uma grande variedade de biomas como a floresta Amazônica, a floresta Atlântica, o pantanal e o cerrado. Essa variedade de biomas, além da rica biodiversidade, faz com que o Brasil albergue a mais diversificada fauna de triatomíneos do mundo (Galvão et al. 2003, IBAMA, 2009).
Os triatomíneos são, ainda, responsáveis pela manutenção do ciclo zoonótico do T. cruzi entre animais selvagens em ambientes domésticos e peridomésticos (Rosa et al., 2012).
A Tribo Rhodninii:
A tribo Rhodniini inclui dois gêneros sendo eles Rhodnius, com 18 espécies descritas e Psammolestes, com três espécies descritas aceitas como sendo de origem monofilética. A maioria deles possui hábitos silvestres, entretanto, diversas espécies do gênero Rhodnius colonizam áreas domésticas e peridomésticas
tornando-se, por esta razão, importantes vetores do agente etiológico da doença de Chagas humana (Coura, 2015). Em países da América Latina como a Colômbia, por exemplo, a maior parte dos eventos de transmissão vetorial em ambientes domésticos e peridomésticos está atribuída à espécie Rhodnius prolixus Stal, 1872 (Jácome-Pinilla et al., 2015). A espécie Rhodnius ecuadoriensis Lent & León 1958, vetor autóctone do Equador, também tem papel ativo na transmissão da doença de Chagas nos embientes domésticos e peridomésticos e está distribuído desde o sul do Equador até o norte do Peru (Monteiro et al., 2000).
Na região Amazônica, as espécies do gênero Rhodnius também já foram encontradas colonizando áreas domésticas e peridomésticas em diversas sub-regiões, sugerindo seu papel como vetor. A espécie Rhodnius stali Lent, Jurberg & Galvão, 1993, foi documentada em ambientes domésticos na sub-região do Alto Beni na Bolívia e na região da Amazônia brasileira, foram encontrados focos da espécie Rhodnius brethesi Matta, 1919, em áreas peridomésticas em domicílios de coletores de piassaba na micro-região de Rio Negro no estado do Amazonas (Coura & Junqueira, 2012, Coura, 2015).
Infelizmente a distribuição geográfica de algumas espécies ainda permanece imprecisa devido a dificuldades de identificação. Enquanto a identificação morfológica em nível de gênero é simples, ainda existem dificuldades na identificação específica dos triatomíneos do gênero Rhodnius devido a similaridades morfológicas. Essas dificuldades são observadas principalmente nas espécies do grupo Prolixus que inclui as espécies R. prolixus Stal 1872, R. robustus Larrousse, 1927, R. neglectus Lent, 1954, e R. nasutus Stal, 1859. Por essa razão, são constantemente observados erros quanto à identificação dos triatomíneos deste grupo (Lent & Wygodzinsky 1979, Monteiro et al., 2000, Abad-Franch et al. 2009).
A ocorrência disseminada de populações do gênero Rhodnius colonizando palmáceas na região Amazônica, juntamente às evidencias epidemiológicas, sugerem seu papel ativo na transmissão da doença de Chagas. Com isso, há a necessidade de um maior entendimento quanto aos hábitos destes vetores para uma maior compreensão dos eventos de transmissão mediados por eles (Abad-Franch et al., 2010).
O contato entre humanos e palmeiras colonizadas por triatomíneos do gênero Rhodnius pode aumentar como resultado de modificações ambientais antropogênicas. O desflorestamento seletivo é um dos fatores determinantes para a
proximidade entre essas palmeiras e os domicílios em muitas regiões (Henderson et al. 1995; Palomeque et al. 2005). Como resultado de uma pré-adaptação dos insetos do gênero Rhodnius a essas palmeiras e a variedade de mamíferos reservatórios do T. cruzi associados às mesmas, o que se observa é a formação de grandes colônias de triatomíneos como já reportado para espécies como R. pictipes Stal, 1872, R. robustus Larrousse, 1927, R. pallescens Barber, 1932, e R. colombiensis Moreno, Jurberg & Galvão, 1999 (Jaramillo et al. 2000, Vallejo et al. 2000, Palomeque et al. 2005).
A espécie Rhodnius montenegrensis:
A espécie R. montenegrensis (Figura 2) foi primeiramente descrita em 2012 a partir de espécimes capturadas em palmáceas próximas a residências na zona rural do município de Monte Negro, estado de Rondônia (Rosa et al., 2012).
Os primeiros espécimes foram encontrados em 2007, a partir de capturas realizadas em 100 propriedades do município de Monte Negro. Estes espécimes geraram dúvidas quanto sua definição específica. Assim, assumiu-se que se tratava de espécimes de Rhodnius robustus devido a sua localização geográfica (Rosa et al., 2012). Posteriormente, em 2008, foram coletados mais oito espécimes de triatomíneos na mesma região com as mesmas características observados em relação àqueles capturados anteriormente. Para que fossem esclarecidas as dúvidas levantadas, colônias foram montadas a partir destes espécimes para observação posterior. A descrição da nova espécie se deu a partir da comparação de estruturas fenotipicamente relacionadas à espécie R. robustus (Rosa et al., 2012). Entre as características que distinguem as espécies R. robustus e R. montenegrensis estão o comprimento mais largo da cabeça em R. montenegrensis, as veias bem demarcadas e tonalidade amarelada observada em R. montenegrensis e ausente em R. robustus, pontos amarelados observados no abdômen ventral de R. montenegrensis ausentes em R. robustus e estrutura do exocório dos ovos com claras distinções entre as duas espécies (Rosa et al., 2012).
Além das diferenças morfológicas descritas, demonstrou-se a partir da amplificação por PCR do produto da digestão do gene 5.8S/ITS-2 pela enzima BstUI, uma clara distinção entre os perfis de bandas observadas nas duas espécies (Rosa et al., 2012).
Visto que não se conhecia a existência da espécie R. montenegrensis, acredita-se que, em estudos anteriores, essa espécie pode ter sido confundida com R. robustus, principalmente em estudos realizados em palmeiras, pois a ocorrência de insetos do gênero Rhodnius nessas plantas é relatada em estudos nas regiões de vegetação desmatada de Manaus, Amazonas (Naiff et al., 1998). Carvalho e cols. (2011) em estudos realizados no município de Monte Negro, Rondônia, observaram que 100% dos triatomíneos capturados em babaçus neste município pertenciam a espécie R. robustus em uma amostra de 848 espécimes. Além disso, neste mesmo estudo, foram encontrados cinco espécimes de triatomíneos em áreas domiciliares. No município de Ouro Preto do Oeste, Rondônia, também foi relatada a ocorrência de triatomíneos do gênero Rhodnius associados a palmáceas, (Meneguetti et al., 2011c), sendo, também, observada a sua ocorrência em residências rurais nesse mesmo município (Meneguetti et al., 2011c).
Desde a sua identificação em 2012, esta espécie também foi encontrada em uma habitação rural em Rio Branco, Acre em setembro de 2014 (Meneguetti et al., 2015). Observou-se que, nas proximidades da habitação, havia uma área de mata preservada contendo exemplares de palmáceas do gênero Attalea que possivelmente forneciam um ecótopo natural a esses espécimes (Meneguetti et al., 2015)
Em 2013 foi reportada na região de Buritis, Rondônia, a infecção desta espécie pelo protozoário T. rangeli e esses dados demonstraram um aumento no número de espécies do gênero Rhodnius infectados por T. rangeli (Meneguetti et al., 2013).
Devido às evidências de invasão de espécies do gênero Rhodnius em ambientes domiciliares, o estudo de parâmetros biológicos que influenciam a capacidade de transmissão de tripanosomatídeos pode contribuir para a melhor compreensão da importância epidemiológica desses insetos vetores de tripanosomatídeos (Barreto-Santana et al., 2011). Com isso, torna-se importante o estudo da biologia de espécies recém-descobertas como a espécie R. montenegrensis.
Breve histórico da doença de Chagas:
A doença de Chagas, ou tripanossomíase Americana, é uma doença crônica potencialmente fatal que continua representando um importante problema sanitário na América Latina (Silva et al., 2012).
O agente etiológico e a doença foram descritos pelo médico sanitarista Carlos Ribeiro Justiniano das Chagas (Chagas, 1909), enquanto chefiava os trabalhos de combate à malária no estado de Minas Gerais, onde estava sendo construída a estrada de ferro Central do Brasil. Carlos Chagas conseguiu, naquela época, identificar o agente etiológico, T cruzi, sua biologia no hospedeiro vertebrado e invertebrado, seus reservatórios e diversos aspectos da patogenia e sintomatologia da doença (Lana & Tafuri, 2005).
A prevalência da doença de Chagas no Brasil na década de 1980 era estimada em 4,2%, entretanto, estava vigente o programa nacional de controle vetorial do principal vetor domiciliar Triatoma infestans. Naquela época, 711 municípios apresentavam infestação domiciliar. O sucesso da campanha de controle vetorial, em adição ao controle dos bancos de sangue e melhoria de condições de moradia em regiões endêmicas, levou a um declínio significativo nos testes de prevalência e incidência da doença nas últimas décadas (Coutinho et al., 2014).
Em 1991 o Brasil se juntou à iniciativa internacional dos países do Cone Sul Americano, cujo principal objetivo era a redução da transmissão vetorial a partir do uso de inseticidas com ação residual contra o vetor T. infestans. O impacto dessa iniciativa levou a uma redução de 94% na incidência da doença nos países do Cone Sul (Gurgel-Gonçalvez, 2012).
Entretanto, apesar da redução na incidência da doença de Chagas em regiões onde espécies de triatomíneos autóctones são comuns, a interação parasito-vetor-reservatório é mantida e gera riscos quando os sistemas de vigilância em saúde falham (Coutinho et al., 2014).
Atualmente, a doença de Chagas continua representando um importante problema de saúde pública nos países da América Latina, principalmente nos nove países da região Amazônica, onde o número de casos agudos da doença é crescente. Com isso, torna-se necessária à implementação de um programa de vigilância que contemple de forma continuada e uniforme os perfis de transmissão
nessas regiões com o intuito de se evitar a endemização da doença (Coura & Junqueira, 2012, Dias et al., 2014).
O Agente etiológico:
O T. cruzi (Chagas, 1909), é um protozoário hemoflagelado pertencente ao Filo Sarcomastigophora, Subfilo Mastigophora, Classe Zoomastigophora, Ordem Kinetoplastida, Subordem Trypanosomatina e Família Trypanosomatidae. Essa espécie de parasito desenvolve o seu ciclo biológico em hospedeiros vertebrados (mamíferos) e invertebrados (triatomíneos), onde assume formas evolutivas distintas (Junqueira et al., 2011).
Nos insetos vetores, formas tripomastigotas ingeridas no momento do repasto sanguíneo diferenciam-se em formas epimastigotas (apresentando cinetoplasto e bolsa flagelar na posição anterior ao núcleo) que se multiplicam. Na região posterior do intestino do triatomíneo as mesmas se diferenciam em formas infectantes denominadas tripomastigotas metacíclicas (com cinetoplasto localizado na extremidade posterior ao núcleo). No hospedeiro vertebrado, as formas tripomastigotas metacíclicas invadem células e se diferenciam em formas amastigotas (arredondadas e com flagelo interiorizado). Após diversos ciclos de reprodutição binária, as formas amastigotas se diferenciam em tripomastigotas sanguíneos, forma responsável pela disseminação da infecção e presente em grande número na circulação sanguínea periférica do hospedeiro vertebrado durante a fase aguda da doença (Coura e Castro, 2002; Tonelli et al, 2004; Caetano e Silva, 2007).
Há diversas formas de transmissão da doença de Chagas. Entre as habituais, observa-se a vetorial, caracterizada pela transmissão do T. cruzi pelas fezes e urina do barbeiro durante o repasto sanguíneo (Figura 2), sendo esta correspondente a aproximadamente 70% das formas de transmissão. Entretanto, existem outras formas de transmissão denominadas secundárias, ou seja, vias alternativas ao ciclo biológico clássico do parasito. Entre elas, podem ser citadas as infecções por transplante de órgãos, transfusões sanguíneas, transmissão congênita, acidentes de laboratório e por via oral (Pinto Dias et al., 2011).
Figura 2: Via de transmissão clássica (vetorial) do Trypanosoma cruzi.
Adaptado de: http://www.fcfrp.usp.br/dactb/Parasitologia/Arquivos/Genero_Trypanosoma_ arquivos/image003.jpg Acesso em: 04/01/2016.
A doença de Chagas na Amazônia Brasileira:
A região da Amazônia brasileira vem chamando atenção pela constante ocorrência de surtos agudos da doença de Chagas. Assim como no restante da Pan-Amazônia, a doença é considerada de caráter enzoótico, entretanto, em 2008 Pinto e cols. descreveram 233 casos agudos no período de 1968 a 2005 sendo 78,5% destes casos decorrentes de transmissão por via oral (Coura & Junqueira, 2012, Dias et al., 2014). Segundo o Ministério da Saúde, no período de 2005 a 2010 cerca de 1000 novos casos agudos da doença de Chagas foram reportados na região amazônica, sendo 87% deles ocorrendo nos estados que constituem a Amazônia legal (Barbosa et al., 2015).
Há uma série de fatores de risco envolvidos no aumento das notificações de surtos por transmissão oral do T. cruzi na Amazônia brasileira que representam riscos de uma possível endemia nesta região. Entre estes fatores, destacam-se a presença de uma grande variedade de triatomíneos, especialmente dos gêneros Rhodnius, Panstrongylus e Triatoma, com grande variedade de mamíferos atuando como reservatórios do T. cruzi. A alta incidência de surtos ocorridos pela ingestão de alimentos contaminados com fezes e urina de triatomíneos e secreções de marsupiais infectados especialmente sucos e polpas de açaí. Os processos de desflorestamento desordenado, que podem reduzir o ecótopo dos triatomíneos silvestres e ao esgotamento das fontes alimentares, podem levar ocasionalmente, a invasões domiciliares. E, por fim, o crescente aumento da imigração de regiões endêmicas para a Amazônia, induzida pela construção de novas estradas, hidroelétricas e pela exploração de óleo e gás natural, atividades geradoras de empregos, que também são considerados fatores de risco (Coura & Junqueira, 2012).
Observa-se que a invasão de domicílios por vetores silvestres do T. cruzi na região da Amazônia brasileira é comum. Assim como na maioria das regiões neotropicais elas ocorrem majoritariamente por espécies do gênero Rhodnius associados a palmeiras. Assim, a proximidade entre as residências rurais e palmeiras ocupadas por triatomíneos e mamíferos atuando como reservatórios é o principal fator de risco observado tanto para a transmissão na forma de infecção endêmica ou hipoendêmica quanto na forma de surtos por infecção oral (Abad-Franch, 2010, Coura & Junqueira 2012).
Além da invasão de domicílios já documentada anteriormente, triatomíneos do gênero Rhodnius também estão envolvidos em um foco de transmissão silvestre da doença de Chagas em coletores de piaçaba no Alto Rio Negro, Amazonas (Dias et al. 2002). Estudos realizados por Coura e cols. (1999) demonstraram que indivíduos soropositivos para anticorpos de T. cruzi, relataram a presença de triatomíneos em seus locais de trabalho (piaçabais), mencionando também a ocorrência de picadas nas cabanas utilizadas como abrigo nestas áreas.
As manifestações da fase aguda da doença de Chagas em pacientes na região Amazônica são geralmente severas. Estas manifestações diferem daquelas observadas em pacientes em fase aguda em outras regiões endêmicas devido ao principal mecanismo de transmissão nesta região ser a via oral. Nestes casos, a
quantidade de parasitos ingeridos é maior do que àquela observada no mecanismo de transmissão vetorial em que a maioria dos casos agudos é assintomática (Coura, 2015). Entre as manifestações observadas destacam-se febre, edema facial, exantema, miocardites e anormalidades no eletrocardiograma (Coura, 2015).
O Estado de Rondônia:
O estado de Rondônia, localizado na Amazônia Ocidental, possui um meio ambiente constantemente modificado pelas ações transformadoras do ser humano. Essas ações resultam em um desequilíbrio que pode facilitar a transmissão de inúmeros patógenos. Uma grande variedade e quantidade de palmáceas, em especial o babaçu, bem como mamíferos e triatomíneos, podem ser encontrados neste complexo ecossistema (Massaro et al., 2008).
No referido estado, tem-se registros de sete espécies de triatomíneos distribuídas em quatro gêneros, Panstrongylus geniculatus, Eratyrus mucronatus, Rhodnius robustus, R. pictipes, R. milesi e R. montenegrensis, além de um registro isolado de Triatoma rubrovaria (Massaro et al., 2008; Meneguetti et al., 2011a; Meneguetti et al., 2011b; Meneguetti et al., 2011c; Rosa et al., 2012).
Apesar dessa biodiversidade, o estado de Rondônia não é considerado de risco para a transmissão vetorial da doença de Chagas (Consenso, 2005). De fato, observa-se que as espécies encontradas comumente no estado de Rondônia são majoritariamente silvestres reduzindo assim, a sua importância epidemiológica. Entretanto, considerando-se que todas as espécies de triatomíneos são vetores em potencial da doença de Chagas e o principal fator a induzir a invasão e colonização de triatomíneos em domicílio é a adaptação a modificações de seus ecótopos naturais, torna-se necessário fazer uma reavaliação sobre a transmissão vetorial no estado (Lent & Wygodzinsky 1979, Zárate, 1984; Carcavallo et al., 1997; Molina et al., 2000).
A infecção natural por tripanosomatídeos:
O ciclo natural de transmissão do T. cruzi é complexo, principalmente na região Amazônica, e envolve grande diversidade de animais silvestres atuando como reservatórios e grande número de espécies de vetores. Os hospedeiros silvestres do
T. cruzi incluem espécies de oito ordens, sendo eles, Artiodactyla, Carnivora, Chiroptera, Cingulata, Didelphimorphia, Pilosa, Primatas e Rodentia (Noireau et al., 2009, Jansen & Roque, 2010).
A infecção de mamíferos pode ocorrer pela via contaminativa vetorial ou pela via oral. A via vetorial, entretanto, é ineficiente sendo necessários cerca de 1700 encontros entre o vetor e o hospedeiro para que ocorra a infecção. Já a infecção por via oral é extremamente eficiente podendo ocorrer pela ingestão de fezes/urina de triatomíneos infectados, alimentos contaminados ou pela predação de insetos ou mamíferos infectados. Por essa razão, mamíferos carnívoros e onívoros como os quatis (Nasua nasua), ocupam o topo da cadeia de transmissão do T. cruzi em meio silvestre devido à sua dieta incluir tanto insetos como mamíferos menores, resultando em diversas vias que possibilitam a transmissão (Nouvellet et al., 2013, Lima et al., 2015).
Esses fatores levam às altas taxas de infecção nos hospedeiros observadas em meio silvestre contribuindo, assim, para a manutenção do ciclo enzoótico da doença de Chagas (Monteiro et al., 2012).
O T. cruzi pode ser encontrado infectando triatomíneos e hospedeiros vertebrados nos mais diferentes ecótopos. Dentre esses ecótopos, alguns albergam outras espécies de tripanossomatídeos, como o T. rangeli, que compartilha com o T. cruzi a capacidade de infectar mamíferos e triatomíneos.
O T. rangeli, é um protozoário hemoflagelado descoberto na Venezuela no conteúdo intestinal de espécimes de R. prolixus (Junqueira et al., 2011). Assim como o T. cruzi, é encontrado majoritariamente na América do Sul e Central. Este protozoário, entretanto, não é patogênico para o ser humano apesar de ser encontrado infectando o mesmo (Ramirez et al., 2002, Junqueira et al., 2011).
A forma infectante do T. rangeli, diferentemente do T. cruzi, é encontrada na hemolinfa de triatomíneos atingindo, posteriormente, as glândulas salivares do vetor. Por essa razão o mecanismo de transmissão do T. rangeli se da pela forma inoculativa, ou seja, a partir da picada do vetor durante o repasto sanguíneo. No ser humano a infecção é considerada benigna podendo persistir por até um ano e meio, sem manifestações clínicas. (Junqueira et al., 2011).
Apesar da infecção por T. rangeli ser benigna ao ser humano, a resposta imune humoral desencadeada por este protozoário leva a produção de anticorpos que podem reagir com antígenos do T. cruzi interfirindo no diagnóstico diferencial da
doença de Chagas (Ferreira et al., 2014). No Brasil, foram reportados três casos humanos de tripanossomíase rangeli na região Amazônica e dois casos de co-infecção com T. cruzi (De Sousa et al., 2008).
Vetores silvestres e o controle vetorial:
A transmissão do T. cruzi originalmente se restringia aos ambientes silvestres passando a representar riscos às populações humanas a partir do momento em que vetores silvestres adquiriram a habilidade de colonizar e sustentar populações em domicílios humanos permitindo, assim, a transmissão do T. cruzi nestes ambientes (Grijalva et al., 2014).
Por esta razão, as estretégias de controle da doença de Chagas na América Latina tem sido baseadas na interrupção da transmissão vetorial a partir da eliminação das populações de insetos domésticos com o uso de inseticidas residuais. Essa estratégia foi implementada em 1991 para eliminação do principal vetor domiciliado T. infestans nos países do Cone Sul e foi responsável por uma redução de 94% do número de casos da doença de Chagas humana nestes países (Moncayo & Ortiz 2006, Hashimoto & Schofield 2012)
Entretanto, alguns fatores ainda contribuem para impedir uma completa redução na transmissão vetorial da doença. Entre eles, a reinfestação de domicílios por triatomíneos silvestres considerados, atualmente, como vetores secundários e o reestabelecimento de populações residuais que não foram completamente eliminadas pelos iseticidas químicos (Jácome-Pinilla et al., 2015).
Estudos realizados em países da América Latina como Bolívia, Brasil e Argentina vem demonstrando que espécies de triatomíneos silvestres frequentemente são encontradas invadindo e colonizando ambientes domiciliares e podem ter papel significativo no ciclo de transmissão do T. cruzi (Noireau et al., 1995, Ceballos et al., 2011, Gurgel-Gonçalves et al., 2012). Além disso, estudos recentes no Equador indicam que a infestação de domicílios a partir de espécimes silvestres limita a efetividade das intervenções de controle baseadas em inseticidas químicos (Grijalva et al., 2014). Observa-se que a eficácia dos inseticidas tradicionais é diretamente afetada pelo grau de domicialização do vetor, com isso, é necessário o desenvolvimento de estratégias de controle alternativas específicas contra vetores não domiciliados (Waleckx et al., 2015).
Considerando-se que, a invasão de domicílios por triatomíneos silvestres limita a eficácia dos inseticidas químicos, passa a ser necessário o desenvolvimento de estratégias que possam limitar a entrada destes triatomíneos no interior dos domicílios. Essas estratégias envolvem melhorias estruturais em casas situadas em áreas de risco, instalação de telas em janelas e impregnação de cortinas com inseticidas residuais (Waleckx et al., 2015).
Apesar da importância dos vetores silvestres nos eventos de transmissão da doença de Chagas humana serem reconhecidos, os ecótopos naturais de certas espécies de triatomíneos assim como a sua relação específica com o hospedeiro permanece ainda pouco elucidada. Com isso, observações sobre a bioecologia e o comportamento de triatomíneos silvestres e as suas interações com o hospedeiro são fundamentais para o entendimento dos fatores envolvidos na manutenção do ciclo enzoótico do T. cruzi, da dinâmica das diferentes espécies de triatomíneos silvestres e do papel epidemiológico destes vetores na transmissão da doença de Chagas (Lima et al., 2015).
2. Objetivos:
2.1. Objetivos gerais:
Estudar a biologia, em condições controladas de laboratório, da espécie de triatomíneo Rhodnius montenegrensis e verificar os índices de infecção natural por tripanosomatídeos.
2.2. Objetivos específicos:
- Verificar os parâmetros biológicos da espécie Rhodnius montenegrensis, em condições controladas em laboratório.
- Avaliar as taxas de infecção natural por tripanosomatídeos na espécie Rhodnius montenegrensis no município de Monte Negro, Rondônia.
- Identificar as espécies de tripanosomatídeos ocorrentes no trato digestivo do Rhodnius montenegrensis no município de Monte Negro, Rondônia.
3. Materiais e Métodos: 3.1. Área de estudo:
O estado de Rondônia está localizado na região norte do Brasil e faz divisa ao norte com o estado do Amazonas a leste com o estado do Mato Grosso, ao sul com a República da Bolívia, e a oeste com o estado do Acre.
O município de Monte Negro (Figura 3), situa-se entre o paralelo (10º 15’ 35”) latitude sul e meridiano (63º 18’ 06”) longitude oeste, limitando-se ao norte com o município de Ariquemes, ao sul com Governador Jorge Teixeira, ao leste com Cacaulândia e a oeste Buritis e Campo Novo de Rondônia. Localizado na região centro norte do estado de Rondônia, tem uma população estimada de 14.091habitantes (sendo 60% em área rural), ocupando uma área de 1.931,381 km² (densidade populacional de 7,3 hab/km²) e distando 250 km da capital do estado, Porto Velho (IBGE, 2011).
Em geral, a maior parte da população é composta de jovens imigrantes oriundos das regiões Sul e Sudoeste do país, que se estabeleceram no município ao longo da década de 1980 (Camargo et al., 2002).
O clima é equatorial superúmido, com média anual de precipitação pluviométrica entre 1800 e 2200 mm, maior que a do Estado, e temperatura média de 25,8º C, próxima à do Estado, oscilando entre 12 e 37º C, e umidade relativa entre 40 a 80% durante todo o ano (IBGE, 2011).
Tem como vegetação áreas de florestas equatoriais e de campos (área de solo pobre), apresentando regime hidrográfico de enchentes e vazantes relacionados a chuvas, tendo características de rios de planaltos e planícies. O relevo é constituído de planícies e baixos planaltos, variando entre 90 a 350 m acima do nível do mar (IBGE, 2011).
Há considerável ação antrópica na região, principalmente às margens da rodovia BR421 que corta o município e seus distritos vicinais. A mata original foi substituída majoritariamente, por plantações de gêneros alimentícios como soja e café e por vastas áras de pastagem.
Figura 3: Mapa do município de Monte Negro, Rondônia. Original de Dr. Marcelo Zagonel- INAGEMP/UFRGS
3.2. Capturas:
Os exemplares de R. montenegrensis foram coletados na região peri-urbana do município de Monte Negro, Rondônia sendo definida área peri-urbana como: "áreas localizadas na linha entre rural e urbana, perto da periferia de um limite legal e administrativo de uma cidade, dentro ou fora de um plano de área e normalmente caracterizada pela ocupação de terra e tendência informal e poucos serviços básicos" (Smit, 1996).
Seguindo está definição estipulou-se que as coletas seriam realizadas em toda propriedade inserida em um raio de 10 quilomêtros da sede do município. Essas coletas foram feitas diáriamente no período de março a junho de 2015.
Segundo estudos realizados por Urbano e colaboradores (2015), observando a densidade populacional de triatomíneos do gênero Rhodnius em palmáceas, demonstrou-se que esta se relaciona à localização e a estrutura física das palmeiras. Observou-se ainda que, a mais alta densidade populacional de triatomíneos encontrava-se em palmeiras altas com copa densa, localizadas em regiões de interseção entre as bordas de florestas preservadas e áreas de pastagem. Partindo-se desta premissa, foram Partindo-selecionadas entre as propriedades visitadas, aquelas com ocorrência de palmeiras nas condições acima referidas.
Dentro do limite anteriormente estipulado e, seguidas as condições acima estabelecidas, 18 propriedades foram selecionadas e sua localização geográfica obtida no momento da coleta a partir de aferição por sistema de posicionamento global.
Para obtenção de espécimes de R. montenegrensis, foram selecionados em cada propriedade visitada, quatro exemplares de Obgnya speciosa (babaçu) que tiveram suas brácteas removidas com auxílio de motosserra à gasolina Sthil® MS 08. As brácteas, onde podem se alojar uma grande quantidade de invertebrados e pequenos vertebrados, foram removidas uma por vez na busca de triatomíneos.
Foi obtido um total de 228 triatomíneos identificados segundo Jurberg e cols. (2014) como sendo R. montenegrensis. Destes, 12 espécimes foram submetidos à identificação por morfometria tradicional e por morfologia na genital interna, seguida de análise molecular e análise Bayesiana. Sessenta espécimes foram utilizados em estudo para investigação do percentual de infecção natural por tripanosomatídeos e o restante foi utilizado como matriz para formação das colônias que originaram os
triatomíneos utilizados nos estudos relativos à biometria da espécie Rhodnius montenegrensis.
Após a captura, os espécimes foram acondicionados em recipientes plásticos transparentes de aproximadamente 20 centímetros de altura. Estes foram forrados com três camadas de papel filtro e uma tira de papel cartão dobrada em sanfona, com altura aproximada à altura dos recipientes. Esta tira de papel sanfonado tem por objetivo aumentar a superfície interna do recipiente proporcionando um ambiente menos estressante aos triatomíneos.
Os espécimes foram acondicionados individualmente nos recipientes acima descritos, identificados segundo a localização onde foram capturados e mantidos em laboratório à temperatura variando entre 27 e 29°C e umidade relativa do ar variando entre 55 e 75% registrados diariamente com auxílio de um Termo-higrômetro digital Jprolab, sendo de uso interno com máxima/mínima e função “reset” - Escala de 10+50°C / -14+122°F (Mod. 7429.02.0.00). Foram realizados intervalos de 12 horas de escotofase e 12 horas de fotofase.
3.3. Identificação de triatomíneos:
3.3.1. Identificação morfológica de triatomíneos: 3.3.2. Caracterização específica ou diagnose:
Os espécimes de triatomíneos foram capturados na região peri-urbana de Monte Negro e foram indentificados por meio de caracteres morfológicos e morfométricos (cabeça, tórax e abdômen). A identificação foi realizada com auxílio do quadro de caracteres diferenciais propostos por Rosa e cols. (2012) e a chave dicotômica proposta por Galvão (2014).
Utilizou-se também, a identificação baseada na morfologia da genitália interna masculina de 12 espécimes de triatomíneos, sendo estes, dois representantes de cada localidade da região peri-urbana do município de Monte Negro. A análise da genitália interna masculina dos triatomíneos também foi feita com o auxílio dos caracteres diferenciais propostos por Rosa e cols. (2012).
O preparo da genitália interna masculina foi realizado segundo protocolo adaptado por Jader de Oliveira com base no protocolo da Apostila Disciplina Bioecologia e Identificação de Phlebotominae (2015).
Para clarificação, as genitálias foram colocadas inteiras em recipiente de porcelana (Chiarotti) e foram cobertas com solução de Hidróxido de Potássio a 10% por um período de 24 horas.
Posteriormente, a genitália foi seccionada separando-se os parâmeros, falo e processo mediano do pigóforo que foram clarificados por 12 horas em solução de Hidróxido de Potássio a 10%.
Após a retirada das peças da solução de Hidróxido de Potássio a 10%, estas foram submetidas à desidratação com álcool 70% por 10 minutos e, sucessivamente, realizou-se o mesmo procedimento com álcool 90%, 95% e álcool absoluto. As peças foram então, secas para que fosse removido o excesso de álcool.
Às peças já clarificadas e desidratadas, adcionou-se eugenol e estas foram mantidas por no mínimo três horas nessas condições antes da montagem.
Por fim, as peças foram montadas em lâminas de vidro com bálsamo do Canadá e secas por cinco dias em temperatura ambiente.
As imagens foram feitas em microscópio estereoscópio Leica MZ APO e pelo sistema de análise de imagem Motic Advanced 3.2 plus.
3.3.3. Estudos moleculares e por análise filogenética Bayesiana de triatomíneos:
3.3.4. Extração e amplificação do DNA genômico:
Foram avaliados dois espécimes de cada localidade do município de Monte Negro onde foram realizadas capturas. Para a extração do DNA genômico, foi utilizada a musculatura das pernas de cada um dos espécimes, separadamente.
O protocolo utilizado para a extração do DNA genômico é referente ao kit comercial “WIZARD - GENOMIC DNA PURIFICATION KIT” e está descrito a seguir.
Para cada amostra a ser processada, adicionou-se 120 µl de EDTA 0,5M-pH 8,0 + 500 µl de “Nucley Lysis Solution” em um eppendorf de 1,5 mL que foi posteriormente homogeneizado. As patas dos triatomíneos foram previamente fragmentadas e colocandas em eppendorfs de 1,5 mL que foram então, imersas em nitrogênio liquido e trituradas ao máximo com o auxílio de ponteiras.
Adicionou-se 600 µl de EDTA/”Nuclei Lysis Solution”, preparada anteriormente e 17,5 µl de proteinase K 20 mg/mL. As amostras foram encubadas a 55°C por 3 horas, e a cada 30 minutos foram levadas ao vórtex.
Adicionou-se 3µL de RNAse ao lisado e homogeneizou-se por inversão de 2 a 5x. Posteriormente, as amostras foram incubadas por 30 minutos a 37°C e esfriaram por 5 minutos.
Adicionou-se 200µL de “Protein Precipitation Solution” e a amostra foi levada ao vortex por 20 segundos. Esta amostra foi mantida em gelo por cinco minutos.
Posteriormente, as amostras foram centrifugadas a 14.000 rpm por 4 minutos sob refrigeração até que a proteína precipitada formasse um pellet. O sobrenadante foi removido cuidadosamente e o DNA transferido para um eppendorf novo de 1,5 onde se adicionou 600µL de isopropanol absoluto. Essa mostra foi homogeneizada vigorosamente por inversão.
A amostra obtida foi centrifugada por 1 minuto a 14.000 rpm em centrifuga refrigerada ate que o DNA ficasse visível como um pequeno pellet branco. Cuidadosamente removeu-se o sobrenadante.
Adicionou-se 600µL de etanol 70% gelado e inverteu-se o tubo rigorosamente por várias vezes para lavar o DNA. Essa amostra foi centrifugada a 14.000 rpm por 1 minuto (refrigerado a 4°C).
Por inversão removeu-se o etanol deixando o tubo invertido por alguns instantes sobre um papel absorvente, a fim de esgotar o etanol. Centrifugou-se para concentrar um possível resíduo de etanol que foi removido com uma pipeta automática. O tubo permaneceu aberto de 10 a 15 min.
Por fim, adicionou-se 100µL “DNA Rehidration Solution” e reidratou-se o DNA por incubação a 65°C por 30 minutos agitando-o em vórtex periodicamente. O DNA foi armazenado a 2-8°C.
O DNA obtido teve sua pureza estimada por meio de eletroforese em gel de agarose 0,8%. A corrida do gel foi realizada horizontalmente e orientada por um campo elétrico constante. Cada amostra de DNA correu por aproximadamente 30 minutos a 100V utilizando tampão TAE 1X. A migração do DNA (conjugado ao brometo de etídeo) foi analisada em luz ultravioleta em transluminador (Sambrook et al., 1989).
Os iniciadores utilizados nas amplificações do gene do DNA mitocondrial citocromo b (Cytb) foram aqueles descritos por Monteiro e cols. (2003).
Para amplificação do DNA por PCR foi utilizada uma mistura típica para PCR (Saiki et al., 1988) consistindo em: 5 a 10 ng de DNA molde em solução tampão de Taq polimerase 1X (200mM Tris pH 8,4, 500mM KCL); uma mistura de dATP, dCTP, dGTP, dTTP (dNTP’s) [0,2mM]; 5p moles de cada iniciador e 1,25 unidades de Taq polimerase.
Para as reações em cadeia da polimerase (Polymerase Chain Reaction- PCR) foram utilizado o termociclador T100TM Thermal Cycler – BIORAD. A amplificação dos fragmentos de interesse foi realizada utilizando a seguinte condição de reação:
- Gene Cytb
Desnaturação inicial do DNA a 94°C, por 3 minutos; Desnaturação (94°C, por 60 segundos)
Anelamento (45°C, por 90 segundos), Extensão (72°C, por 90 segundos),
Extensão final com um ciclo de 10 minutos a 72°C.
O fragmento amplificado foi avaliado em gel de agarose 1%, utilizando peso molecular (O’ GeneRuler 1 Kb Plus DNA Ladder-Fermentas) com padrão de 75,200,300,400,500,700,1.000,1.500 e 2.000 pb.
35 ciclos
3.3.5. Purificação e sequenciamento do DNA amplificado:
O produto da PCR foi purificado utilizando o kit “Illustra GFX PCR DNA and Gel Band Purification Kit” (GE Life Sciences), de acordo com as instruções do fabricante e para avaliar a concentração do DNA purificado.
O produto purificado foi processado no Departamento de Tecnologia da aculdade de Ciências Agrárias e Veterinárias (FCAV) na Universidade Estadual Paulista (UNESP), Campus de Jaboticabal, onde foram utilizados os seqüenciadores da Applied (Life Technologies) ABI3100 e ABI3730XL, que utilizam o BigDye na versão
A reação de sequenciamento foi feita com o kit BygDye (PE Applied Biosystems) de acordo com as instruções do fabricante. As amostras foram processadas em seqüenciador automático ABI 3730XL. Análise das seqüências foi feita com o auxílio do software “Sequence analysis”.
3.3.6. Identificação molecular:
As sequências obtidas foram avaliadas em sua qualidade por meio de eletroferograma no programa Bioedit Sequence Alignment Editor versão 7.25 (Hall, 1999) e alinhadas no programa ClustalW (Thompson et al., 1994) implementado no programa Bioedit Sequence Alignment Editor versão 7.25 (Hall, 1999).
Com finalidade de verificar se os genes sequenciados representavam o esperado para espécie, avaliou-se meio da ferramenta BLAST (Basic Local Aligment Search Tool) disponível em plataforma online pelo site do NCBI (https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi), a ferramenta procura correlacionar as sequências obtidas com as depositadas no banco de dados do GenBank®.
3.3.7. Análises filogenéticas: 3.3.8. Inferência bayesiana:
Os alinhamentos foram realizados em três etapas: alinhamento inicial (AI), no qual foi extraída uma sequência consenso a partir das sequências senso e antisenso obtidas para cada fragmento sequenciado, sendo três para cada espécime (triplicata); depois foi realizado o alinhamento por espécie (AE), para obtenção de uma sequência para cada espécime; e a terceira etapa o alinhamento geral (AG),
que se baseia nos alinhamentos das sequências AE com as de Triatominae disponíveis no GenBank® (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/).
As análises filogenéticas foram realizadas utilizando-se do programa Mega 7.0.14 (Molecular Evolutionary Genetics Analysis- http://www.megasoftware.net/) e os parâmetros analíticos de máxima parcimônia (Maximum Parsimony - MP) e de distância (Neighbor-Joining- NJ). Para as análises de distâncias foram utilizados dois parâmetros para a construção das matrizes: o Kimura de dois parâmetros (Kimura 2) e o Maximum Composite Likelihood (MCL) (Kumar et al., 2005).
Os filogramas foram gerados pelo programa Mega e os valores de Bootstrap foram suportados por 1.000 replicações. Nessas análises utilizou-se do alinhamento AG.
As análises bayesianas com o gene Cyt b foram realizadas usando o programa MrBayes versão 3.2 (Ronquist et al, 2011). Para atribuir o melhor ajuste de substituição nucleotídica para os dados obtidos usamos o programa MrModeltest 2.3 (Nylander, 2004), definindo o melhor ajuste para GTR + G segundo critério de informação Akaike gerado pelo programa.
Os filogramas consenso foram gerados no programa FigTree versão 1.4.2 (http://tree.bio.ed.ac.uk/).
3.4. Dados Biométricos: 3.4.1. Material biológico:
Para o estudo dos parâmetros biológicos da espécie R. montenegrensis, foram utilizados espécimes provenientes de colônias mantidas no insetário do Instituto de Ciências Biomédicas Cinco (ICB-5-USP), no município de Monte Negro, Rondônia.
As colônias utilizadas foram obtidas a partir de espécimes matrizes capturados em O. speciosa (babaçu) encontrados próximos a domicílios rurais na região peri-urbana do município de Monte Negro, previamente identificados por morfometria tradicional como descrito anteriormente.
As colônias foram mantidas à temperatura entre 27⁰C e 29⁰C e umidade relativa do ar entre 55% e 75% registrados diariamente com auxílio de um Termo-higrômetro sendo de uso interno com máxima/mínima e função “reset” - Escala de 10+50°C / -14+122°F (Mod. 7429.02.0.00). Foram realizados intervalos de 12 horas de escotofase e 12 horas de fotofase.
