Dados Biométricos: 1 Material biológico:

Para o estudo dos parâmetros biológicos da espécie R. montenegrensis, foram utilizados espécimes provenientes de colônias mantidas no insetário do Instituto de Ciências Biomédicas Cinco (ICB-5-USP), no município de Monte Negro, Rondônia.

As colônias utilizadas foram obtidas a partir de espécimes matrizes capturados em O. speciosa (babaçu) encontrados próximos a domicílios rurais na região peri-urbana do município de Monte Negro, previamente identificados por morfometria tradicional como descrito anteriormente.

As colônias foram mantidas à temperatura entre 27⁰C e 29⁰C e umidade relativa do ar entre 55% e 75% registrados diariamente com auxílio de um Termo- higrômetro sendo de uso interno com máxima/mínima e função “reset” - Escala de 10+50°C / -14+122°F (Mod. 7429.02.0.00). Foram realizados intervalos de 12 horas de escotofase e 12 horas de fotofase.

3.4.2. Ciclo biológico do triatomíneo:

Inicialmente, foram obtidas aleatoriamente 30 ninfas de 5⁰ estádio provenientes das colônias de 4⁰ geração de R. montenegrensis para obtenção de adultos virgens. Após a muda imaginal, foram formados três grupos compostos por seis fêmeas e dois machos para obtenção de ovos. A partir dos três grupos de espécimes adultos virgens foi obtido um total de 184 ovos. Estes foram então, individualizados, numerados e observados diariamente até a eclosão.

Após a eclosão dos ovos, as ninfas geradas foram pesadas e acondicionadas em frascos de coleta universal. Estes frascos foram forrados por três camadas de papel filtro e uma tira de papel cartão de aproximadamente cinco centímetros de altura dobrada em forma de sanfona foi introduzida em cada frasco para aumentar a sua superfície interna. Os frascos foram fechados com tecido de algodão de trama fina (Figura 4).

Foram realizadas observações diárias para registro de ecdises e mortes, com auxilio de lupas de aumento, estereomicroscópio binocular, com iluminação dupla episcópica, diascópica (Mod. SQF-F) e pinças entomológicas para coleta e manuseio dos triatomíneos.

A primeira alimentação foi realizada cinco dias após a eclosão, a fonte sanguínea foi oferecida diariamente até a ocorrência do primeiro repasto, passando posteriormente a ser oferecida semanalmente. Foram utilizados como fonte alimentar, camundongos Balb/C anestesiados com 100mg/kg de Cetamina intraperitoneal segundo protocolo 2014/15 aprovado pela CEUA-FioCruz. O tempo de oferecimento da fonte alimentar foi de no máximo 30 minutos sendo feita observação contínua durante todo o processo de alimentação. Somente aqueles espécimes que se recusavam a sugar ou sugavam pouca quantidade de sangue eram submetidos à nova tentativa de alimentação. Durante o período de observação, todos os espécimes foram pesados em balança semi-analítica Shimadzu com precisão de 0,001g, antes e depois do repasto em todas as fases.

Figura 4: Acondicionamento de espécimes para análise biométrica. (A) e (C): Bandejas contendo frascos para acondicionamento de espécimes. (B): Espécime de Rhodnius montenegrensis adulto observado em análise biométrica.

Com base nos valores obtidos foram calculados: - Viabilidade dos ovos;

- Massa total dos ovos;

- Massa dos ovos após a eclosão da ninfa de 1⁰ estádio; - Período de incubação de ovos;

- Massa dos triatomíneos por fase de desenvolvimento antes e depois do repasto; - Percentuais de ecdises por estádio;

- Percentual de mortalidade por estádio; - Expectativa de vida e vida média; - Razão de sexo;

Todas as análises foram feitas com base em estudo realizado por Rabinovich (1972), que teve como objetivo prover informações estatísticas sobre populações de triatomíneos mantidas em condições controladas de laboratório além de possibilitar a comparação de espécies relacionadas em termos de suas características biológicas. Este estudo foi pioneiro na análise de parâmetros demográficos como ciclo biológico e padrões de reprodução e mortalidade além de parâmetros populacionais de uma diversidade de reduvídeos.

A construção deste tipo de modelo juntamente a técnicas de simulação tem papel fundamental na elaboração das estratégias de controle vetorial para que se reduzam custos e aumentem sua eficiência.

Para a determinação da razão de sexo de triatomíneos, observações feitas a partir da morfologia do aparelho genital externo dos triatomíneos adultos levaram a distinção entre machos e fêmeas (Figura 5).

Figura 5: Fotos do aparelho genital externo de Rhodnius montenegrensis. (A): Genital externa em machos; (B): Genital externa em fêmeas.

3.4.3. Análise estatística:

Para se avaliar a normalidade das variáveis observadas foram utilizados os testes não paramétricos de aderência à distribuição normal de Kolmogorov e Smirnov e de Shapiro Wilk. Ambos os testes foram realizados no programa

Statistical Package for Social Sciences (SPSS) versão 17.0 (SPSS, 2008).

Esses testes fornecem o parâmetro valor de prova (valor-p, p-value ou

significância), que pode ser interpretado como a medida do grau de concordância entre os dados e a hipótese nula (H0), sendo H0 correspondente à distribuição Normal. Quanto menor for o valor-p, menor é a consistência entre os dados e a hipótese nula. Então, a regra de decisão adotada para saber se a distribuição é Normal ou não é rejeitar H0: (i) se valor-p ≤ α , rejeita-se H0, ou seja, não se pode admitir que o conjunto de dados em questão tenha distribuição Normal; (ii) se valor-p > α , não se rejeita H0, ou seja, a distribuição Normal é uma distribuição possível para o conjunto de dados em questão (Lopes et al., 2013).O teste de Kolmogorov e Smirnov possui como limitação sua alta sensibilidade a valores extremos, por esta razão se utiliza comumente a correção de Lilliefors que torna o teste menos conservador.

Além do teste de Kolmogorov-Smirnov, também se utilizou no presente estudo o teste de Shapiro-Wilk. Este teste também é baseado na correlação da amostra de interesse a uma amostra correspondente com distribuição normal. O teste de Shapiro-Wilk é considerado a melhor escolha para se avaliar a normalidade de uma amostra, pois apresenta um maior poder quando submetido à correção de Lilliefors. O poder de um teste é a medida mais frequente para se avaliar a habilidade do teste em detectar a não normalidade de uma amostra.

Após a análise para verificação da normalidade das amostras observadas, foram calculadas a média e desvio padrão para as variáveis analisadas.

Para a se avaliar a significância da diferença entre pares na amostra se utilizou o teste T de Student, um teste paramétrico para comparação entre médias baseado em hipóteses. Utilizou-se também o teste de análise de variância (ANOVA), também utilizado para comparação entre médias baseado em hipóteses. Utilizou-se o teste

de Qui Quadrado (X2), que substitui o teste T de Student para amostras pareadas

quando os dados não satisfazem as exigências deste último. O teste de Qui Quadrado é um método não paramétrico para comparação entre duas proporções baseado em hipóteses sendo a hipótese nula a de que não há diferença entre os

grupos relacionados, e a hipótese alternativa a de que há diferença entre os grupos relacionados. Se o p valor for inferior a 0.05, a hipótese alternativa é verdadeira e rejeita-se a hipótese nula.

Para as variáveia razão de sexo e viabilidade de ovos utilizou-se o teste de Qui- quadrado de heterogeneidade feito com base na relação teórica de 50% entre indivíduos nascidos machos e fêmeas e ovos viáveis e não viáveis para se verificar se essa relação teórica seria válida.