SAY, 1817: SUSCEPTIBILIDADE E PATOGENIA

UNIVERSIDADE FEDERAL RURAL DO RIO DE JANEIRO

INSTITUTO DE BIOLOGIA

CURSO DE PÓS-GRADUAÇÃO EM MEDICINA VETERINÁRIA

PARASITOLOGIA VETERINÁRIA

INTERRELAÇÃO ENTRE Fasciola hepatica L., 1758 E Lymnaea columella

SAY,

1817: SUSCEPTIBILIDADE E PATOGENIA

DELIR CORRÊA GOMES

SOB A ORIENTAÇÃO DA PROFESSORA

DRª SUZANA BENCKE AMATO

Tese submetida como requisito parcial para a obtenção do grau de Doutor em Ciência em Medicina Veterinária, Área de concentração em Parasitologia V e t e r i n á r i a .

ITAGUAÍ, RIO DE JANEIRO

DEZEMBRO,1985

TÍTULO DA TESE

INTERRELAÇÃO ENTRE Fasciola hepatica L., 1758 E Lymnaea columella SAY, 1817: SUSCEPTIBILIDADE E

PATOGENIA

AUTOR

DELIR CORRÊA GOMES

À NICOLAU MAUÉS DA SERRA FREIRE

Marido, amigo e companheiro de todas as horas, cuja a responsabilidade e consciência profissional foram os ba-luartes deste trabalho.

A G R A D E C I M E N T O S

Aos grandes mestres João Ferreira Teixeira de Freitas e Lauro Pereira Travassos, cujos ensinamentos são inesquecí-v e i s , nossa eterna g r a t i d ã o .

Nossos agradecimentos:

A Drª Suzana Bencke Amaro, nossa o r i e n t a d o r a .

Aos Professores Rubens Pinto de Mello e Maria Luiza Maués Garcia pela amizade, apoio e i n c e n t i v o c o n s t a n t e s .

Aos colegas do Departamento de Helmintologia do Ins-t i Ins-t u Ins-t o Oswaldo Cruz-FIOCRUZ pela ajuda i n e s Ins-t i m á v e l .

Aos Professores Sérgio Carmona de São Clemente e Pau-lo Cesar Figueiredo que sempre estiveram ao nosso alcance nas horas d i f í c e i s .

Ao Dr. José Antonio Oliveiri Maradey pela incansável ajuda nas f o t o g r a f i a s .

Parasito-lógicas W.O. Neitz pela ajuda d i á r i a .

Ao Instituto Oswaldo Cruz-FIOCRUZ, que permitiu nos-so afastamento.

A Universidade Federal Rural do Rio de Janeiro/ Para-sitologia/IB, que mais uma vez nos acolheu em seus bancos, agra-ciando-nos com os ensinamentos de seus docentes.

A CAPES pela bolsa recebida desde outubro de 1984. Aos colegas e funcionários do Curso de Pós- Graduação em Medicina Veterinária/Parasitologia Veterinária pelo

B I O G R A F I A

Delir Corrêa Gomes, filha de Antonio Corrêa Gomes e Nadya Pinhel Gomes, nasceu a 4 de setembro de 1938 na cidade do Rio de Janeiro, Estado do Rio de Janeiro, onde recebeu educa-ção primária e secundária nos Colégios da Congregaeduca-ção das Ser-vas do E s p í r i t o Santo.

Em 1963 ingressou na Faculdade de Filosofia Ciências e Letras da Universidade do Estado da Guanabara, licenciando-se em H i s t ó r i a N a t u r a l no ano de 1966.

Ao concluir o Curso de Helmintologia do Instituto Os-waldo Cruz, passou a ser bolsista desta Instituição no período de 1963 a 1967, sob a orientação dos Doutores João Ferreira Tei-x e i r a de F r e i t a s e Lauro P e r e i r a T r a v a s s o s .

No período de 1964 a 1976 foi bolsista do Conselho Na-cional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico-CNPq; já no terço final do período, como Pesquisador Assistente A, foi

ori-entadora de outros bolsistas do mesmo Conselho.

Durante o ano de 1967, participou do Curso de Aplica-ção à Pesquisa do I n s t i t u t o Oswaldo Cruz.

De 1967 até a presente data, desempenha atividade de pesquisa e magistério no Instituto Oswaldo Cruz, já tendo publi-cado 46 trabalhos. Atualmente é Chefe do Departamento de Helmin-tologia do Instituto Oswaldo Cruz-FIOCRUZ.

Em 1973 trabalhou como Professora do Curso de Patolo-gia Clínica promovido pela Secretaria de Saúde, realizado na Es-cola de Serviço Público do ex-Estado da Guanabara.

Membro da Sociedade de Biologia do Rio de Janeiro há 21 anos, já tendo ocupado diferentes cargos da Diretoria em gestões sucessivas. Atualmente desempenha as funções de Tesou-reira, fazendo parte da Comissão Editorial.

Admitida como membro da Sociedade Brasileira de Para-sitologia em 1974, e da American Society of Parasitologists em 1977.

Em 1977 obteve o grau de mestre em Medicina Veteriná-ria-Parasitologia Veterinária na Universidade Federal Rural do Rio de Janeiro.

Desde 1976 ministra aulas no tópico de Helmintologia, no Curso de Pós-Graduação em Biologia Parasitária da Fundação Oswaldo Cruz, sendo atualmente a Coordenadora deste tópico.

"Aventure-se, pois da menor das pistas surgiu tudo o que de valioso o homem veio a conhecer".

CONTEÚDO

PÁGINA

1 4 4 10 13 18 18 19 20 INTRODUÇÃO REVISÃO DE LITERATURA

1. FASCIOLAS E SEUS HOSPEDEIROS INTERMEDIÁRIOS: IDEN-TIFICAÇÃO DE ESPÉCIES, BIOLOGIA E RELACIONAMENTO MOLUS-CO/TREMATÓDEO

2. SUSCEPTIBILIDADE DE Lymnaea columella À Fasciola he-patica

3. PATOGENIA CAUSADA POR Fasciola hepatica EM Lymnaea columella

MATERIAL E MÉTODOS

1. COLETA E MANUTENÇÃO DO HOSPEDEIRO INTERMEDIÁRIO

2. OBTENÇÃO DE OVOS E DE MIRACÍDIOS DE Fasciola hepatita

4. HISTOLOGIA E HISTOPATOLOGIA DO HOSPEDEIRO INTERME-DIÁRIO

5. ANÁLISE ESTATÍSTICA 6. FOTOMICROGRAFIAS RESULTADOS

1. IDENTIFICAÇÃO DO HOSPEDEIRO INTERMEDIÁRIO DE Fas-ciola hepatica

2. SUSCEPTIBILIDADE DE Lymnaea columella À Fasciola h e p a t i c a

3. PATOGENIA CAUSADA POR Fasciola hepatica EM Lymnaea columella

DISCUSSÃO

1. IDENTIFICAÇÃO DO HOSPEDEIRO INTERMEDIÁRIO DE Fas-ciola hepatica

2. SUSCEPTIBILIDADE DE Lymnaea columella À Fasciola hepatica

3. PATOGENIA CAUSADA POR Fasciola hepatica EM Lymnaea columella CONCLUSÕES LITERATURA CITADA ix 22 23 23 24 24 25 30 45 45 49 52 58 60

ÍNDICES DAS FIGURAS

PÁGINA

Figura 1 .

Figura 2.

Figura 3.

Figura 4.

Gráfico em barras sobre a exposição de duas espécies de moluscos à miracídios recém-eclodidos de

Fasciola hepatica,

durante 56 dias, em condições de laboratório

Gráfico em barras sobre a exposição de

Lym-naea columella

à infecção com três ou cinco miracídios recém-eclodidos de

Fasciola

hepa-tica,

durante 56 dias, em condições de

labo-ratório

Gráfico em barras sobre a exposição de Lym-naea columella à miracídios recém-eclodi-dos de

Fasciola hepatica

provenientes de duas espécies de hospedeiro vertebrado

Representação gráfica da média , desvio padrão e da amplitude de variação

26

29

xi PÁGINA 31 34 37 39 Figura 5. Figura 6. Figura 7. Figura 8.

para produção de metacercárias de Fasciola hepatica a partir de infecção de Lymnaea co-lumlla com três e com cinco miracídios re-cém-eclodidos

Representação gráfica da média , moda (x), desvio padrão e amplitude de variação para tamanho de concha de Lymnaea co-lumella não infectadas (NI) e infectadas com três (I3) e com cinco (I5) miracídios de Fas-ciola hepatica, durante 56 dias, em condi-ções de laboratório

Fotomicrografia da glândula digestiva de

Lymnaea

columella livre de infecção por Fas-ciola hepatica (coloração HE aumento 10 x)

Fotomicrografia da gônada de Lymnaea colu-mella livre de infecção por Fasciola hepa-tica (coloração H.E., aumento 40 X), eviden-ciando ovócitos normais (o)

Fotomicrografia da glândula digestiva de Lymnaea columella infectada com rédias (R) de Faciola hepatica demonstrando a degene-ração vacuolar (DV) generalizada (colodegene-ração

xii PÁGINA 40 40 41 42 Figura 9. Figura 10. Figura 11. Figura 12. TM, aumento 40 X)

Fotomicrografia da glândula digestiva de Lymnaea columella infectada por Fasciola he-patica demonstrando o espaço ocupado por ré-dias (R) e cercárias (C) (coloração PAS, au-mento 40 X )

Fotomicrografia da glândula digestiva de Lymnaea columella infectada por Fasciola he-patica demonstrando o aspecto hialino do tecido conjuntivo (TC) e a presença de ré-dias (R) com cercárias (C) (coloração PAS, aumento 40 X )

Fotomicrografia da glândula digestiva de Lymnaea columella infectada por Fasciola he-patica demonstrando o aspecto hialino do te-cido conjuntivo (TC), duto principal (DP) e a presença de rédias (R) com cercárias (C) (coloração PAS, aumento 40 X)

Fotomicrografia da glândula digestiva de Lymnaea columlla infectada por Fasciola he-patica demonstrando o aspecto hiliano do te-cido conjuntivo, a desorganização dos

lóbu-xiii

PÁGINA

los secretores (LS) e a presença de rédias (R) e de cercárias (C) (coloração TM,

aumen-to 40 X)

Fotomicrografia da gônada de Lymnaea colu-mella infectada por Fasciola hepatica de-monstrando a presença de ovócitos com ta-manhos irregulares (o), aspecto amorfo da glândula, e a presença de rédias (R) e cer-cárias (C) (coloração PAS, aumento 40 X)

Fotomicrografia de Lymnaea columella infec-tada por Fasciola hepatica demonstrando o aspecto hialino do tecido onde estão locali-zadas rédias (R) maduras (coloração HE, au-mento 10 X)

Fotomicrografia de

Lymnaea columella

infec-tada por

Fasciola hepatica

demonstrando o aspecto hialino do tecido onde estão locali-zadas as cercárias (C) livres (CC = cauda da cercária) (coloração PAS, aumento 10 X)

42 43 43 44 F i g u r a 13. F i g u r a 14. F i g u r a 15.

PÁGINA 26 27 28 32 33

Exposição de Lymnaea columella e Stenophysa

marmorata a miracídios recém-eclodidos de Fasciola hepatica em condições de

laborató-r i o

Infecções de Lymnaea columella com três mi-racídios de Fasciola hepatica por molusco

Infecções de Lymnaea columella com cinco mi-racídios de Fasciola hepatica por molusco

Comparação entre as infecções de Lymnaea

columella com miracídios de Fasciola hepati-ca provenientes de ovinos e bovinos

Comparação entre infecções de Lymnaea colu-mella com três e cinco miracídios de Fascio-la hepatica/molusco para número de

metacer-cárias produzidas Tabela 1. T a b e l a 2. T a b e l a 3. Tabela 4. T a b e l a 5.

X V

PÁGINA

T a b e l a 6.

T a b e l a 7.

T a b e l a 8.

Comparação entre comprimento de concha de Lymnaea columella infectados com três e com cinco miracídios de Fasciola hepatica/ molusco e Lymnaea columella não infecta-das no prazo de 56 dias após infecção

Infecções de Lymnaea columella expostas

a elevado número de miracídios de

Fascio-la hepatica/molusco

Resultados comparativos entre Lymnaea

co-lumella (3 mm de comprimento de concha)

in-fectadas com cinco miracídios de Fasciola

hepatica/molusco e não infectadas, para

a produção de ovos durante 56 dias

34

35

RESUMO

São apresentadas as espécies Lymnaea columella Say da família Lymnaeidae Rafines que, e Stenophysa marmorata (Guilding) da família Physidae Fitzinger, como as únicas espécies dos res-pectivos gêneros, encontradas no Estado do Rio de Janeiro.

Após a identificação das espécies que ocorriam neste Estado, o estudo foi direcionado para: a) a identificação das espécies de moluscos que possuiam real potencial como hospedei-ro intermediário; b) avaliação da susceptibilidade à miracídios de Fasciola hepatica L., 1758, bem como fatores que influencia-vam na infecção; c) os aspectos patogênicos das formas larvais do trematódeo sobre o molusco.

As observações demonstraram que: L. columella foi en-contrada, naturalmente, infectada por F. hepatica, tendo se ob-tido êxito nas infecções experimentais, o que não ocorreu com S. marmorata; infecções com três miracídios/molusco são ideais para obtenção de maior número de moluscos sobreviventes

infecta-dos, e que infecções com cinco miracídios/molusco ou mais, po-dem produzir infecções mais intensas, porém ocasionavam morte precoce; o maior número de metacercárias foi obtido nas infec-ções com três miracídios/molusco; L. columella não resiste a in-fecções com 40 ou mais miracídios de F. hepatica; a proveniên-cia dos ovos de F. hepatica com relação aos hospedeiros verte-brados (Bos taurus L. e Ovis aries L.) não influenciaram nos re-sultados obtidos nas infecções; nas L. columella os principais achados histopatológicos observados foram a degeneração vacuo-lar, o aspecto hialino do tecido conjuntivo, irregularidade do tamanho dos ovócitos e o desarranjo dos lóbulos da glândula di-gestiva, provocados pelas rédias e cercárias; também grande per-da na fertiliper-dade de L. columella quando infectada por F. hepa -tica.

SUMMARY

The lymnaeid Lymnaea columella and the physid Steno-physa marmorata are the only species of these genera occuring

in the S t a t e of Rio de J a n e i r o .

After their identification, studies were conducted in order to ascertain which of these snail species was really a potential host to Fasciola hepatica L., 1758; their susceptibi-lity to miracidia of F. hepatica

;

factors responsable for the infection, as well as the pathogenic aspects related to the t r e m a t o d e l a r v a l f o r m s .

It was demonstrated that L. columella was found na-turally infected with F. hepatica and proved, experimentally, to be susceptable to infection, while S. marmorata was not. Three miracidia/snail is the ideal number to provide the survival of a great number of infected snails, while five or more miracidia/ snail, produces intense infections, which are responsable for early death. The results obtained during the experimental

infec-tions were not affected by the origin of the eggs, either Bos taurus L. or Ovis aries L.. The greatest number of metacercariae was obtained during infections with three miracidia/snail. Lym-naea columella was unable to survive when infected with 40 or more F. hepatica miracidia. The most important histopathological findings were the vacuolar degeneration, the hyaline aspect of the connective tissue, the irregularities in the size of the oocytes, and the disarrangement of acinar tubules of the diges-tive gland by the presence of rediae and cercariae. It was also observed a decrease in the fertility of L. columella when this species was infected with larvae of F. hepatica.

INTRODUÇÃO

LEUCKART (1882) e THOMAS (1883) foram os primeiros a estudar o ciclo da Fasciola hepatica L., 1758. Em trabalhos concomitantes eles identificaram Lymnaea truncatula (Müller) co-mo hospedeiro intermediário deste Trematódeo, e descreveram suas formas l a r v a i s .

Embora o ciclo da F. hepatica tenha sido o primeiro a ser descrito entre o dos trematódeos, para muitas regiões geo-gráficas como o Brasil, faltam ainda certos conhecimentos sobre o relacionamento deste helminto com o hospedeiro intermediário. Por exemplo, não se conhecem quais os moluscos com real poten-cial transmissor, qual o grau de susceptibilidade destes, assim como outros fatores que possam influenciar neste relacionamento parasito/hospedeiro.

De acordo com BORAY (1967) F. hepatica não foge à re-gra geral dos trematódeos digenéticos que são mais específicos ao hospedeiro intermediário do que ao definitivo. No Brasil,

muito pouco tem sido estudado sobre o relacionamento das formas larvais de F. hepatica e o seu hospedeiro intermediário. Quais as razões que influenciam no fato de uma espécie hospedeira in-termediária ser mais susceptível, porém eliminar menos número de cercárias? Haverá alguma reação nos tecidos do hospedeiro in-termediário, induzida pelo parasito, que possa ser observada através de estudos histopatológicos? Os fisídeos participam mesmo do ciclo da F. hepatica, como já foram incriminados por ou-tros autores (BUSETTI et a l . , 1983-1985)?

Com base na revisão bibliográfica pode-se comprovar que os trabalhos sobre o relacionamento entre as formas larvais da F. hepatica e seu hospedeiro intermediário são ainda incipi-entes no Brasil. Perguntas como as feitas acima, ainda não ha-viam sido respondidas. Assim foi proposto uma análise de alguns aspectos deste relacionamento parasito-hospedeiro; a avaliação sobre as espécies de caramujos, entre as encontradas em locais onde existe a F. hepatica no Estado do Rio de Janeiro, que pos-suam real potencial como hospedeiro intermediário; a avaliação de quais fatores influenciam no êxito da infecção no hospedeiro intermediário, bem como dos aspectos histopatológicos relacio-nados à invasão e ao desenvolvimento das formas larvais no hos-pedeiro invertebrado. Tais proposições estão em razão de consi-derar-se que todo intento para aumentar o conhecimento das rela-ções parasito/hospedeiro, em qualquer fase do ciclo biológico da F. hepatica, contribuirá para os procedimentos no controle desta parasitose que é um dos objetivos do Projeto "Parasitos

de Bovinos Leiteiros no Estado do Rio de Janeiro: epidemiolo-gia, importância econômica e contrôle", com suporte financeiro do Programa Nacional de Saúde Animal- PRONAPESA, do qual o pre-s e n t e t r a b a l h o f a z p a r t e .

REVISÃO DE LITERATURA

FASCIOLAS E SEUS HOSPEDEIROS INTERMEDIÁRIOS: IDENTIFICAÇÃO DE ESPÉCIES, BIOLOGIA E RELACIONA-MENTO MOLUSCO/TREMATÓDEO.

Embora LEUCKART (1882) e THOMAS (1883) tenham sido os primeiros a estudar o ciclo da Fasciola hepatica L.,1758, iden-tificando Lymnaea truncatula (Müller) como hospedeiro intermedi-ário, em trabalhos realizados concomitantemente, é no trabalho de THOMAS que se encontram descrições acompanhadas de figuras de todas as formas l a r v a i s e n c o n t r a d a s no m o l u s c o .

Para o Brasil a primeira referência feita foi de LUTZ (1921), para o Estado do Rio de Janeiro, quando coletou molus-cos naturalmente infectados, próximo ao município de Entre Rios (Três Rios), identificando uma das espécies como Lymmaea

ochros-tigma Lutz.

A preocupação em se identificar quais as espécies de moluscos que servem como hospedeiro intermediário de F. hepati

-ca tem levado muitos autores a tentar descobrí-los. Assim, na Venezuela, RAMIRES-VILLAMEDIANA & VERGANI (1949) estudaram a in-fectividade para Lymnaea cubensis Pfeiffer e BRICENO-ROSSI (1950) concluiu que L. cubensis era o hospedeiro intermediário da F. hepatica na Venezuela; UENO & WATANABE (1960) identificaram pa-ra o Japão Lymnaea ollula Gould; BORAY & Mc MICHAEL (1961) disse-ram ser Lymnaea tomentosa (Pfeiffer) a única espécie de hospe-deiro intermediário na Austrália. BERGHEN (1964) comparando as espécies L. truncatula, L. stagnalis (L.) e L. palustris Müller, disse ser a primeira o hospedeiro ideal para F. hepatica na Bél-gica.

Os fatores que influenciam no relacionamento entre os trematódeos e os moluscos foi o principal objetivo de KENDALL (1964), cujas as opiniões foram reforçadas pelo próprio KENDALL (1965) estudando as espécies F. hepatica e Fasciolas gigantica (Cobbold, 1855). Com esse propósito GRIGORYAN (1965) estudou o comportamento de miracídios de fasciolas em Physa acuta Dra-parnaud, Galba truncatula Müller e Radix auricularia (L.), na Armênia.

Na observação de BORAY (1966) existem raças geográfi-cas de moluscos e trematódeos; essa opinião foi emitida em tra-balho sobre espécies do gênero Fasciola (L., 1758) e os molus-cos L. Stagnalis, Lymnaea peregra (Müller), L. auricularia (nata-lensis) (L.), L. tomentosa, L. truncatula e Lymnaea lessoni

Deshayes.

RAO (1966) obteve respostas diferentes quanto a susceptibilida-de quando estas foram infectadas com cepas susceptibilida-de F. gigantica do o e s t e a f r i c a n o .

Em 1967, BORAY deu prosseguimento aos seus estudos sobre o relacionamento entre a F. hepatica e os limneídeos. Pa-ra compreender quais os fatores que maior influência tem sobre os moluscos para se tornarem bons hospedeiros da F. hepatica, WILSON (1968) estudou a possibilidade de existirem atrativos no muco de L. truncatula.

FURMAGA & GUNDLACH (1969) estudaram a participação de algumas espécies da família Lymnaeidae no ciclo de F. hepatica como Golba corvus Gmelin, G. turricula Held, Radix ovata (La-marck) e R. auricularia, onde as duas primeiras chegavam a pro-duzir rédias e as duas últimas só esporocistos.

Ácidos graxos foram considerados por WILSON & DENISON (1970b) como substâncias que determinavam a estimulação do mira-cídio de F. hepatica.

GONZALES et al. (1971) através de estudos experimen-tais identificaram Lymnaea columella (Say) como hospedeiro de F. hepatica no Rio Grande do Sul, Brasil. Em vários municípios do Estado do Rio de Janeiro, REZENDE et al. (1973) assinalaram a ocorrência de L. columella e de L. cubensis naturalmente in-fectadas por F. hepatica. A biologia de L. columella e alguns aspectos de sua relação com a F. hepatica em infecções em condi-ções experimentais foram estudadas por GOMES et al. (1974).

deo, e somente o originário do Texas foi susceptível ao segun-do, o que os levou à conclusão de que, a não susceptibilidade das espécies provenientes de Wisconsin à F. hepatica seria o fa-tor determinante da ausência da fasciolose neste estado.

Segundo NUERNBERG (1978) L. cubensis era mais suscep-tível à F. hepatica do que L. columella, mas liberava menor nú-mero de cercárias. Em 1983, NUERNBERG et al. reafirmam esse pen-samento e justificam com a suposição de que L. columella se-ria a espécie mais adaptada no Estado do Rio de Janeiro.

Em 1978, BORAY deu prosseguimento a seus estudos so-bre a susceptibilidade dos limneídeos, demonstrando que L. to -mentosa era mais suscetível a cepas australianas de F. hep ati-ca, do que L. columella e L. viridis Quay & Gaimard embora es-tas produzissem um número substancial de metacercárias viáveis, chamando inclusive atenção, para o perigo da disseminação da fasciolose.

DACAL & COSTA (1979) verificaram que os limneídeos oriundos do Estado de Minas Gerais tiveram um grau de infecção semelhante aos dos Estados do Rio de Janeiro e Rio Grande do Sul.

Utilizando L. columella oriunda dos Municípios de Ca-çapava. Taubaté, Pindamonhangaba e Piquete, situados no Vale do Paraíba paulista, UETA (1979) encontrou alta susceptibilida-de. Em 1980, esta autora observou que apenas 3% dos moluscos infectados à F. hepatica sobreviviam até a formação de

cercá-r i a s .

RONDELAUD (1980) a fim de obter dados epidemiológicos, estudou a percentagem de infecção entre as espécies L. trun catu-la, L. glabra, L. palustris e L. stagnalis. RONDELAUD & BARTHE (1982) e BOUIX-BUSSON et al. (1983) observaram que os moluscos bons hospedeiros para F. hepatica apresentavam um baixo índice de sobrevivência.

RONDELAUD et al. (1984) fazendo infecções experimen-tais, se preocuparam com a percentagem de mortalidade em condi-ções de laboratório das L. truncatula infectadas com F. hepati-ca.

3 . PATOGENIA CAUSADA POR Fasciola hepatica EM Lymnaea columella

Os efeitos ocasionados pelas formas larvais da F. he -patica nos limneídeos, tem sido um dos alvos para os pesqui-sadores. Em infecções experimentais BERGHEN (1964) observou o gigantismo em L. truncatula, considerando este o hospedeiro ide-al, e o crescimento retardado em L. stagnalis e L. polustris, menos susceptível a infecção na região trabalhada.

WRIGHT (1971) em seu trabalho sobre os trematódeos e os moluscos, além de outros aspectos, estudou as mudanças que ocorriam nos moluscos em consequência do parasitismo.

ollula e L. japonica para Fasciola sp, verificou que o segun-do molusco não produzia cercárias, e o número de sobreviventes infectados ficava reduzido a metade.

Para RONDELAUD & BARTHE (1978), o desenvolvimento das rédias dependia do tamanho do molusco, e que a distribuição des-tas no hospedeiro, principalmente as de primeira geração, podia ser responsável pelo gigantismo. Estes autores, em 1982, disse-ram que a sobrevivência estava relacionada com o número de mira-cídios empregados, e que diminuia à medida que o número aumenta-va.

A influência do parasitismo sobre o crescimento de L. (G.) truncatula, foi observada por WILSON & DENISON (1980), que caracterizaram o fenômeno do gigantismo; os autores também re-portaram a ocorrência de castração aos 21 dias de infecção.

BOUIX-BUSSON et al. (1985) concluiram que após a ex-p o s i ç ã o os moluscos crescem r a ex-p i d a m e n t e .

A exemplo dos trabalhos realizados com Schistosoma spp. como o de SUDDS (1960), que observou reação nos tecidos dos hospedeiros intermediários anormais, também para as espéci-es de Fasciola, tem-se espéci-estudado histopatológicamente os tecidos dos hospedeiros intermediários, quando infectados com formas l a r v a i s .

Em 1920, FAUST fêz um estudo das alterações patológi-cas encontradas nas glândulas digestivas, quando os gastrópo-des estavam infectados por trematódeos. AGERSBORG (1924)

traba-lhando com gastrópodes para ver o efeito do parasitismo sobre os tecidos, disse que durante prolongada e pesada infecção os tecidos degeneravam. Também REES (1931) se preocupou com os as-pectos histopatológicos provocados pelas formas larvais dos tre-matódeos.

Especificamente com L. columella, BARBER (1962), de-senvolveu seu trabalho de tese direcionado para a patologia das formas larvais de F. hepatica, onde se preocupou com a localiza-ção, lesões nos tecidos dos órgãos atingidos, dizendo ser mecâ-n i c a a p r i mecâ-n c i p a l causa de d e s t r u i ç ã o .

Outro trabalho ligado a histologia foi o de ESCUDERO-DIEZ (1970), que realizou experimentos com L. truncatula e L. palustris, onde pôs em evidência o papel das redias e cercá-rias, como principais responsáveis pelas alterações histopatoló-g i c a s .

ros intermediários de F. hepatica e F. gigantica a resposta

i n i c i a l à invasão é f r a c a .

KENDALL (1970) afirmou que para os moluscos hospedei-

As observações de HODASI (1972b), demonstraram que os pontos mais atingidos pelas formas larvais de F. hepatica em L. truncatula foram as glândulas digestiva e gônadas, provocando na ú l t i m a o fenômeno de c a s t r a ç ã o .

Para os moluscos gastrópodes, MOHANDAS (1974) direcio-nou o estudo patológico para a glândula digestiva, dizendo ser a desorganização dos túbulos destas, mais diretamente

ocasiona-da pela pressão ocasiona-das l a r v a s .

Entre uma série de trabalhos sobre a biologia de F. hepatica, JIMENEZ-ALBARRAN (1979), estudou a influência das for-mas larvais em L. (G.) truncatula, onde verificou o aumento de tamanho e a castração, causados pelo parasitismo.

RONDELAUD & BARTHE (1980a) disseram que as rédias se desenvolviam com o consumo das gônadas, e que estas apresen-tavam atrofia em vários graus. Continuando seus estudos, esses autores em 1980b, acharam uma reação amebocitária após o sétimo dia da infecção em L. truncatula.

Dando prosseguimento aos trabalhos de 1980, RONDELAUD & BARTHE (1981a, b), destacaram a produção de amebócitos em L. truncatula quando infectada por F. hepatica.

COMBES (1982) disse que o grau de patogenicidade de-pendia do número de miracídios que penetravam e sugeriu que o posicionamento das rédias nas gônodas podia ter como resultado a castração.

Com relação ao aparecimento da reação amebocitária, RONDELAUD & BARTHE (1982) disseram que esta depende da cepa geo-gráfica. Estes mesmos autores em 1983, voltaram a chamar a aten-ção sobre a presença de amebócitos em L. truncatula, quando in-fectada por F. hepatica, e descreveram modificações na estrutu-ra dos rins.

O fato do parasitismo das formas larvais de F. hepati -ca provocar ou não a reação amebocitária, foi estudada por

RON-DELAUD et al. (1984), que chegaram a conclusão de que esta rea-ção não era específica para esta parasitose, e que na presença do "virus-like particles" ela ocorria; e em experiências com L. truncatula, esses autores encontraram uma reação amebocitá-ria generalizada, sempre que eles encontravam os dois agentes a s s o c i a d o s .

MATERIAL E MÉTODOS

1 . COLETA E MANUTENÇÃO DO HOSPEDEIRO INTERMEDIÁRIO

Durante oito meses percorreram-se riachos no Estado do Rio de Janeiro, procurando-se em suas margens moluscos dos gêneros Lymnaea e Stenophysa. As coletas foram feitas nos muni-cípios de Itaguaí e Nova Iguaçu, na Zona Fisiográfica da Baixa-da do Rio Guandu; nos municípios de Mendes, Vassouras, Valença, Paraibuna, Três Rios, Miguel Pereira, Rio das Flores, Barra do Piraí, Volta Redonda, Barra Mansa e Resende, na Zona Fisiográfi-ca de Resende, e nos municípios de Friburgo, Petrópolis e Tere-sópolis, na Zona Fisiográfica do Alto da Serra. Exemplares de L. columella e S. marmorata coletados desses riachos no Estado do Rio de Janeiro foram transferidos para a Estação para Pesqui-sas Parasitológicas W.O. Neitz do Curso de Pós-Graduação em Pa-rasitologia Veterinária da Universidade Federal Rural do Rio de Janeiro e mantidos em tanques de fibra de amianto com capaci-dade para mil litros. Os moluscos realizavam posturas em placas

de isopor com 6,0 x 4,0 x 0,5 cm, aleatoriamente, deixadas à flutuar dentro dos tanques. As placas com as posturas eram iden-tificadas e transferidas para novos tanques previamente limpos e cheios d'água sem cloro. Os tanques que mantinham as colô-nias situavam-se do lado de fora dos laboratórios, em área co-berta por árvores, protegidos por cobertura com armação de ma-deira tendo na parte superior plástico que permitia a passagem de luz, e lateralmente tela de "nylon" para aeração, com malha de 2,0 mm. Assim foi dada origem à população e mantida a colô-n i a t r a b a l h a d a .

2. OBTENÇÃO DE OVOS E DE MIRACÍDIOS DE Fasciola hepatica

Ovos foram obtidos de posturas dos helmintos nos ca-nais biliares dos hospedeiros vertebrados (bovino: Bos taurus L., e ovino: Ovis aries L.); para isso a vesícula biliar foi amarrada ao nível do canal biliar, seccionada e a bile armazena-da na vesícula, junto com o conteúdo do lavado dessa, foram di-luídos em 250 ml de água destilada em cálice de Hoffman; essa diluição permaneceu em repouso cerca de 30 minutos para sedimen-tação. Diluições e sedimentações foram repetidas até que o so-brenadante permanecesse límpido. Isso conseguido agitou-se a cá-lice para que o sedimento se dispersasse e então, a suspenção de ovos foi passada em tamis de bronze com malha de 250 µm para retirada de fragmentos de cálculos biliares, e recolhidos em ta-mis de bronze com malha de 37 µm. Desse tamis, os ovos foram

re-tirados e ressuspensos em 250 ml de água destilada, sendo assim estocados em geladeira ou colocados para incubação.

Ovos provenientes dos trematódeos adultos removidos dos canais biliares ou da própria vesícula biliar, foram obti-dos pela dissecação do útero obti-dos exemplares gráviobti-dos, lavaobti-dos em água destilada pelo método de sedimentação como ocorreu com os da vesícula biliar, passados em tamis de bronze de 250 µm e recolhidos em tamis de 37 µm.

Ovos que se destinavam à incubação foram imersos em 100 ml de água destilada dentro de frasco Erlenmeyer com capaci-dade para 250 ml, com aeração permanente. O frasco Erlenmeyer foi envolvido com papel alumínio e mantido a temperatura ambien-te com média de 27°C ± 2°C e valores paramétricos entre 13°C e 39°C para o ano todo. O tempo de incubação variou de 10 a 16 di-as. Após este período o conteúdo do Erlenmeyer era distribuído em placas de Petri com 100 x 20 mm e expostos à luz para eclo-são dos miracídios.

3. INFECÇÃO DO HOSPEDEIRO INTERMEDIÁRIO E OBTENÇÃO DE METACERCARIAS

De moluscos nascidos nos tanques foram utilizados aque-les com concha de 3 ou de 5 mm de comprimento. Para as infec-ções utilizou-se placas de plástico transparente com seis com-partimentos cônicos de 12 mm de diâmetro e capacidade para 3,20 ml de líquido. Em cada compartimento era colocado um

molus-co e dois mililitros de água destilada, e então expostos a três ou cinco miracídios recém-eclodidos. Colocados em exposi-ção a luz pelo período de duas horas à temperatura de 27 a 29°C; durante todo o tempo de tentativa de infecção cuidou-se para

que os moluscos permanecessem sempre imersos. Após este período os moluscos eram transferidos para aquários de vidro de 20 x

15 x 15 cm com 2.000 ml de água destilada, com aeração permanen- te e alimentados com alface. Semanalmente procedia-se a limpe-za do aquário por sifão, trocando-se a água. A capacidade de postura dos moluscos era verificada pela instalação coletiva de 5 moluscos em aquários redondos com 16 cm de diâmetro, conten-do 500 ml de água destilada, dispensanconten-do-se o mesmo manejo conten-dos outros aquários. As posturas eram feitas em placas de isopor com 6,0 x 4,0 x 0,5 cm deixadas flutuando aleatoriamente no meio líquido. Diariamente era contado o número de posturas e de ovos, e substituídas as placas de isopor por outras novas. Moluscos infectados e moluscos controle foram mantidos dentro de laboratório, em temperatura ambiente que variou de 27 a 29ºC, com v a r i a ç ã o anual e n t r e 13°C e 39°C.

A partir do quinquagésimo sexto dia após a penetração dos miracídios nos moluscos, os que apresentavam cercárias no interior da concha, identificados com auxílio de microscópio es-tereoscópico WILD M5, foram transferidos individualmente para placas de Petri de 100 x 20 mm, com fundo revestido com papel celofane incolor transparente, contendo água destilada onde eram dissecados para liberação das cercárias sob condições de

tempe-ratura ambiente. As cercárias liberadas se encistavam sobre o papel celofane no fundo da placa, sendo contado o número de me-tacercárias formadas. Tentativas de obtenção de meme-tacercárias pela liberação expontânea de cercárias, ou provocadas por cho-que térmico e/ou luminosos foram realizadas.

4. HISTOLOGIA E HISTOPATOLOGIA DO HOSPEDEIRO INTERMEDIÁRIO

Após a comprovação da infecção dos moluscos com auxí-lio de microscópio estereoscópico, moluscos infectados e molus-cos controle foram removidos do interior de suas conchas e fixa-dos em líquido de Bouin ou em solução de formalina tamponada a 10% de acordo com BEHMER et al. (1976), e seguiu-se o processa-mento para emblocar em parafina e corar com hematoxili-na e eosihematoxili-na (HE), ácido periódico de Schiff (PAS) e tricrômio de Manson (TM) para o material fixado em Iíquido de Bouin, e co-loração por hematoxilina e eosina para o material fixado com so-lução de formalina tamponada a 10%. Os cortes foram de 5 µm de espessura, e após coloração foram montados entre lâmina e lamí-nula com Entelan (MERCK). Os preparados corados com HE tinham a função de evidenciar as estruturas acidofílicas e basofílicas do tecido; a coloração de PAS visava evidenciar estruturas cons-tituídas de mucopolissacarídeos neutros e a coloração por TM ob-jetivava a demonstração de tecido fibroso no material examina-do.

5. ANÁLISE ESTATÍSTICA

Empregou-se estatística demonstrativa para facilitar a demonstração dos fenômenos. Recorreu-se a análise de variância ("ANOVA") e cálculos da diferença mínima significativa entre médias (DMS) pelo teste "t" a níveis de 95% e 99% de segurança nas afirmações, para enfatizar possíveis diferenças biológicas observadas.

Quando o "t" calculado era maior que o "t" tabelado a 95% de segurança de acerto, o resultado foi considerado de dife-rença significativa (*); quando era maior que o "t" tabelado a 99% de segurança de acerto, o resultado foi considerado de dife-rença altamente significativa (**). Quando o "t" calculado era menor que o "t" tabelado a 95% o resultado foi considerado de diferença não s i g n i f i c a t i v a (ns) (SPIEGEL, 1976).

6. FOTOMICROGRAFIAS

As fotomicrografias foram obtidas com filme FUJICOLOR (FUJI), 150 ISO, 135 mm em microscópio CARLS ZEISS utilizan-do filtro azul KODAK 80D.

R E S U L T A D O S

IDENTIFICAÇÃO DO HOSPEDEIRO INTERMEDIÁRIO DE Fasciola hepatica

Nos oito meses de investigação de hospedeiros interme-diários de F. hepatica em 17 municípios de três Zonas Fisiográ-ficas no Estado do Rio de Janeiro, logrou-se capturar e identi-ficar moluscos gastrópodes que pertenciam aos gêneros Lymnaea

,

Stenophysa, Biomphalaria Preston e Drepanotrema Fischer & Cross; destes aproximadamente 3.000 eram representantes das fa-mílias Lymnaeidae e Physidae que já foram incriminados como hos-pedeiros intermediários de F. hepatica

.

Só foram dissecadas e examinadas Lymnaea columella e Stenophysa marmorata, únicas espécies das famílias Lymnaeidae e Physidae, respectivamente, encontradas na região t r a b a l h a d a .

Nenhuma S. mamorata capturada no vale do rio Paraíba e na região serrana do Estado do Rio de Janeiro apresentou

in-fecção por F. hepatica. A única espécie de caramujo encontrado naturalmente infectada por F. hepatica foi L. columella Entre as Zonas Fisiográficas amostradas, F. hepati -ca só foi encontrada em caramujos L. columella coletados no va-le do rio Paraíba, Zona Fisiográfica de Resende.

As tentativas de infecções experimentais com três e cinco miracídios por molusco demonstraram que S. marmorata não se infectou com miracídios de F. hepatica, entretanto 46% das L. columella com 3 a 5 mm de comprimento de concha (Tabela 1) adquiriram a infecção e permitiram a multiplicação do helminto (Fig. 1).

2. SUSCEPTIBILIDADE DE Lymnaea columella À Fasciola hepatica

Comprova do que somente L. columella se infectava com miracídios de F. hepatica testou-se a susceptibilidade dos mo-luscos a infecção com três miracídios e com cinco miracídios por moluscos (Tabela 2 e 3, Fig. 2).

Corrigidos os valores obtidos para 100 calculou-se que a média de L. columella infectados com três miracídios/ mo-luscos foi de 26,17 L. columella com desvio padrão de ± 13,67 moluscos (Tabela 2); o mesmo cálculo feito para cinco mirací-dios/molusco, mostrou que somente 11,00 L. columella em 100 ca-ramujos infectados permitiram o desenvolvimento de cercárias e rédias de F. hepatica, com desvio padrão de ± 11,98 moluscos

26

Tabela 1. Exposição de Lymnaea columella e Stenophysa

marmora-ta a miracídios recém-eclodidos de Fasciola hepatica em condições de laboratório.

Figura 1. Gráfico em barras sobre a exposição de duas espécies de moluscos a miracídios recém-eclodidos de

Fasciola

hepatica,

durante 56 dias, em condições de laboratório.

27

Tabela 2. Infecções de

Lymnaea columella

com três miracídios de

Fasciola hepatica

por molusco.

* Aos 56 dias

(Tabela 3 . ) . Comprovou-se pelo t e s t e " t " ( " t " c a l c u l a d o = 2 , 0 3 * * ) que as d i f e r e n ç a s observadas entre as duas infecções eram a l t a - mente s i g n i f i c a t i v a s , demonstrando que o maior número de m i r a - cídios/molusco promoveu infecções mais intensas com morte preco-ce das L. columella.

Para verificar se havia alguma influência do hospedei-ro vertebrado do qual phospedei-rovinham os ovos de F. hepatica anali-sou-se pelo "ANOVA" e "DMS" os dados obtidos com material de ovinos e bovinos (Tabela 4 ).

28

Tabela 3. Infecções de Lymnaea columella com cinco miracídios de Fasciola hepatica por molusco.

* Aos 56 dias

Os dados obtidos com ovos de F. hepatica provenien-tes de ovinos revelou em valores corrigidos para 100 L. columel-la que a média de moluscos infectados com três a cinco miracídi-os/molusco foi de 17,67 L. columella com desvio padrão de ± 14,82 moluscos; já para os dados provenientes de bovinos a mé-dia de L. columella infectada foi de 21,33 moluscos com desvio padrão de ± 16,65 moluscos. No entanto o teste "t" ("t" calcula-do = 0,34 NS) demonstrou que as diferenças observadas nos valo-res absolutos são obra do acaso, ou seja não há diferença

signi-29

ficativa entre as infecções com miracídios provenientes de ovos de F.

hepatica

obtidas de bovinos e de ovinos (Fig. 3).

Também se avaliou a influência das infecções em L.

columella

com três a cinco miracídios de

F. hepatica/molusco

so-bre o total de metacercárias produzidas (Tabela 5).

Estatistica-Figura 2. Gráfico em barras sobre a exposição de Lymnaea colu-mella a infecção com três ou cinco miracídios recém-eclodidos de Fasciola hepatica

,

durante 56 dias, em condições de laboratório.

mente, comprovou-se que as diferenças observadas em relação ao número de metacercárias produzidas não são obra do acaso; o

mai-or número de miracídios/molusco determinou alterações mais in-tensas nas L. columella que redundaram em perdas para a F. hepa -tica que apresentou limitações em suas fases de cercárias e ré-dias, resultando na menor produção de metacercárias (Fig.4). Des-taca-se que as metacercárias sempre foram conseguidas pela dis-secação dos moluscos com liberação das cercárias existentes no corpo das L. columella aos 56 dias pós-infecção. Nunca se conse-guiu eliminação expontânea de cercárias, assim como as tentati- vas de induzir a liberação de cercárias com choques térmicos e/ ou luminosos não obtiveram êxito.

3. PATOGENIA CAUSADA POR Fasciola hepatica EM Lymnaea columella

Procurou-se avaliar a ação do desenvolvimento das in-fecções com três ou cinco miracídios/L, columella sobre o cres-cimento dos moluscos (Tabela 6), observando-se que a diferença de tamanho encontrada entre os dois grupos de infecção não é obra do acaso. As infecções com três miracídios/molusco permiti-ram ou induzipermiti-ram o crescimento mais rápido dos moluscos sobre o grupo infectado com cinco miracídios/molusco que com freqüência morrem precocemente ("t" calculado = 2,69**). Comparados com mo-luscos não-infectados (Fig. 5), houve diferença significativa entre os moluscos controle e os infectados com cinco mirací-dios/L. columella ("t" calculado = 1,41*); mas a diferença foi altamente significativa ("t" calculado = 6,56**) entre o grupo controle e o grupo infectado com três miracídios/L. columella

31

Figura 3. Gráfico em barras sobre a exposição de Lymnaea columella à mi-racídios recém-eclodidos de Fasciola hepatica provenientes de duas espécies de hospedeiro vertebrado.

Figura 4. Representação gráfica da média desvio padrão e da am-plitude de variação para produção de metacercárias de Fas-ciola hepatica a partir de infecção de Lymnaea columella com três e com cinco miracídios recém-eclodidos.

32

Tabela 4. Comparação entre as infecções de

Lymnaea columella

com 3 a 5 miracídios de

Fasciola hepatica

provenientes de ovinos e bovinos.

* Aos 56 dias

sendo a média e a moda desses muito maior.

As tentativas de infecção com grande número de mirací-dios por L. columella demonstraram que os moluscos não resistem

33 Tabela 5. Comparação entre infecções de Lymnaea columella com três e cinco miracídios de Fasciola hepatica/molusco para número de metacercárias produzidas.

ao múltiplo desenvolvimento das formas jovens de F. hepatica a partir de um número alto de miracídios/molusco (Tabela 7).

34

Figura 5. Representação gráfica da média moda , desvio padrão e amplitude de variação para tamanho de concha de Lymanaea columella não infectadas (NI) e infectadas com três (I3) e com cinco (I5) miracídios de

Fasciola hepatica,

durante 56 dias, em condições de laboratório.

Tabela 6. Comparação entre comprimento de concha de Lymnaea columella* infectados com três e com cinco miracídios de Fosciola

hepa-tica/molusco e Lymnaea columeIla* não

infectados no prazo de 55 dias após infecção.

35

Tabela 7. Infecções de Lymnaea columella expostas a elevado número de miracídios de Fasciola hepatica/molusco.

* Aos 56 dias

Utilizando L. columella com 3 mm de comprimento de concha, e infectadas com cinco miracídios de F.

hepatica/molus-co hepatica/molus-comparou-se a produção de ovos do molusco e n t r e esse g r u - po infectado e um outro não infectado (Tabela 8). Constatou-se que houve diferença significativa entre os dois grupos para o número de

ovos/massa ovígera (tcalc=2,88*) e para o número médio de massas ovíge- ras (tcalc=1,42*), também houve diferença significativa (tcalc=1,47*) para o número de moluscos que r e a l i z a r a m p o s t u r a ; no grupo não infec- tado a média de dias de postura foi significativamente (tcalc=1,78*) maior que a média do grupo infectado.

36

Tabela 8. Resultados comparativos entre

Lymnaea columella

(3mm de comprimento de concha) infectadas com cinco mi-racídios de

Fasciola hepatica/molusco

e não in-fectadas, para a produção de ovos durante 56 dias.

37

4 . HISTOLOGIA E HISTOPATOLOGIA DE Lymnaea columella INFECTADA POR Fasciola hepatica

De toda organização morfológica de L. columella obser-vou-se que a glândula digestiva e as gônadas apresentaram algu-mas alterações quando foram comparadas estruturas de moluscos infectados com as dos moluscos controle, não infectados.

Nos moluscos controle (Fig. 6 e 7) comprovou-se que o epitélio de revestimento do corpo é do tipo ciIíndrico, com núcleos ovais dispostos perpendicularmente a base celular. Em alguns pontos observou-se cílios nas células, mas na região

pró-Figura 6. Fotomicrografia da glândula digestiva de Lymnaea

co-lumella livre de infecção por Fasciola hepatica (coloração HE, objetiva 10 X).

xima ao pé do molusco o epitélio apresenta-se cúbico e até es-tratificado. O citoplasma das células epiteliais corou-se em vermelho ligeiramente basófilo nos preparados com HE, apresen-tando-se granular. Aos 56 dias de infectados não foram comprova-das alterações do epitélio de L. columella.

No tecido conjuntivo sub-epitelial dos moluscos con-troles observou-se vários tipos celulares e fibras colágenas caracterizadas pela coloração com TM. Os fibroblastos tinham forma estrelada com prolongamentos que se intercruzavam forman-do um típico teciforman-do conjuntivo frouxo, com núcleos esféricos e citoplasma homogêneo. Também o tecido sub-epitelial não apre-sentou alterações nos moluscos com 56 dias de infecção por F. hepatica.

A glândula digestiva apresentou-se com estrutura tu-bulosa, formada por um conduto principal e um conjunto de lóbu-los secretores separados entre si por tecido conjuntivo nos mo-luscos controle. O conduto principal tinha epitélio cilindrico ciliado, e formou pregueamento em espiral cujas dobras dimunui-am de tdimunui-amanho até desaparecer completdimunui-amente na parte final. Nos lóbulos identificaram-se dois tipos celulares: um com forma pi-ramidal, núcleo esférico, citoplasma reticular com grânulos ba-sófilos, dispostos mais próximo à luz do órgão, que foram re-conhecidos como células mucinosas; e o outro tipo, de células polimórficas, ora com reação basofílica ora acidofílica e que se localizavam entre as primeiras, sendo reconhecidas como

célu-las digestivas.

As alterações histopatológicas observadas nas

L. colu-

mella aos 56 dias pós-infecção foram induzidas pelas formas de

rédia e de cercária da F. hepatica. Tais alterações foram

deter-minadas por ação mecânica por compressão, em conseqüência da

lo-calização do parasito no tecido conjuntivo ao redor da glândula

digestiva e gônadas. Foi observada degeneração vacuolar (Fig.8)

e exaustão glandular nos moluscos parasitadas, e também rédias

e cercárias ocupando um amplo espaço, responsável pela compres-

são do conduto principal e dos lóbulos (Fig. 9). Na parte

exter-39

Figura 7. Fotomicrografia da gônada de Lymnaea columella livre

de infecção por Fasciola hepatica (coloração H.E.,

objetiva 40 X), evidenciando ovócitos normais (o).

40

Figura 8. Fotomicrografia da glândula

digestiva de

Lymnaea columella

infecta-da com rédias (R) de

Faciola hepatica demonstrando a degeneração

vacuolar (DV) generalizada (coloração Tricrômio de Mallory,

objeti-va 40 X).

Figura 9. Fotomicrografia da glândula digestiva de

Lymnaea columella

infecta-da por

Fasciola hepatica demonstrando o espaço ocupado por rédias

(R) e cercárias (C) (coloração PAS, objetiva 40 X).

41

na e em volta do conduto observou-se o aspecto hialino do teci-do conjuntivo (Figs. 10, 11, 12), porém sem reação celular.

Nas gônadas a presença de rédias e cercárias produzi-ram alterações no parênquima por compressão do tecido, caracte-rizada por lise celular. As células da glândula evidenciaram ca-riorrexia. Os ovocitos são irregulares com núcleos picnóticos. Em algumas áreas se observou a perda da acidofilia do citoplasma que assumiu aspecto amorfo com difícil identificação do núcleo (Fig. 13).

Em todos os moluscos infectados sobreviventes aos 56 dias pós-infecção observou-se a presença de rédias maduras e cercárias livres (Figs. 14 e 15).

Figura 10. Fotomicrografia da glândula digestiva de Lymnaea columella infectada por Fasciola hepatica demonstrando o aspecto hiali-no do tecido conjuntivo (TC) e a presença de rédias (R) com

42

Figura 11. Fotomicrografia da glândula digestiva de Lymnaea columella infec-tada por Fasciola hepatica demonstrando o aspecto hialino do te-cido conjuntivo (TC), duto principal (DP) e a presença de rédias (R) com cercárias (C) (coloração PAS, objetiva 40X).

Figura 12. Fotomicrografia da glândula digestiva de Lymnaea columella infec-tada por Fasciola hepatica demonstrando o aspecto hialino do te-cido conjuntivo, a desorganização dos lóbulos secretpres (LS) e a presença de rédias (R) e de cercárias (C) (Coloração Tricrômio de

44

Figura 15. Fotomicrografia de Lymnaea columella infectada por

Fasciola hepatica demonstrando o aspecto hialino do tecido onde estão localizadas as cercárias (C) livres (CC = cauda da cercária) (coloração PAS, ob-jetiva 10 X).

45

Figura 13. Fotomicrografia da gônada de Lymnaea columella infectada por

Fasciola hepatica demonstrando a presença de ovócitos com

ta-manhos irregulares (o), aspecto amorfo da glândula, e a

pre-sença de rédias (R) e cercárias (C) (coloracão PAS, objetiva

40 x).

Figura 14. Fotomicrografia de Lymnaea columella infectada por Fasciola

he-patica demonstrando o aspecto hialino do tecido onde estão

DISCUSSÃO

IDENTIFICAÇÃO DO HOSPEDEIRO INTERMEDIÁRIO DE

Fasciola hepatica

Depois dos estudos de LEUCKART (1882) e de THOMAS (1883), grande número de pesquisadores tem se preocupado em iden-tificar os hospedeiros intermediários e responsáveis por parte da dispersão da Fasciola hepatica

,

nos países em que esta para-sitose ocorre. Embora já fossem conhecidos os resultados do le-vantamento de moluscos hospedeiros de F. hepatica no Estado do Rio de Janeiro, realizado por REZENDE et al. (1973), procurou-se reinvestigar a ocorrência desprocurou-ses possíveis hospedeiros inter-mediários ou dos moluscos com potencial transmissor. Assim du-rante oito meses foram percorridos dezessete municípios de três Zonas Fisiográficas do Estado só tendo sido encontrado natural-mente infectados por F. hepatica moluscos do gênero Lymnaea, e da espécie L. columella, e apenas na região do vale do rio

Pa-raíba. Se por um lado comprovou-se os resultados de REZENDE et al. (1973) demonstrando a ocorrência e a participacão de L. co -lumella no ciclo da F. hepatica no Estado do Rio de Janeiro, por outro lado não confirmou-se a ocorrência de L. cubensis as-sim não foi possível comprovar o envolvimento dessa espécie no ciclo do trematódeo tal como foi referido por NUERNBERG et al. (1983). Contudo esses resultados parecem estar de acordo com a opinião de PARAENSE (1982) que considerou L. cubensis como sinô-nimo de Lymnaea viatrix e afirmou que essa espécie não ocorria no Estado do Rio de Janeiro, propondo que nesse Estado só ocor-ra L. columella.

O fato de nenhuma S. marmorata capturada no vale do rio Paraíba ou na região serrana do Estado apresentar-se natu-ralmente infectada, apresentou coerência com a maioria da lite-ratura especializada, e principalmente com os resultados alcan-çados nas tentativas de infecções experimentais (Tabela 1, Fig. 1). Apesar disso tais resultados foram conflitantes com os vá-rios achados de BUSETTI et al., apresentados nos anos de 1983 e 1984, que incriminaram moluscos da Família Physidae, pertencen-tes ao gênero Physa, como hospedeiro intermediário de F. hepati-ca; nesses trabalhos os autores relacionaram as espécies que acharam naturalmente infectadas, referindo a seguinte distribui-ção: Physa bermudezi Aguayo com 0,54% de moluscos infecta-dos dentre 920 espécimes examinainfecta-dos; P. cubensis com 0,48% de infectados dentre 818 espécimes examinados; Physa papaveroi Le-me com 0,36% de infectados dentre 265 examinados. Esses

auto-res asseguraram, valendo-se de infecções experimentais em 150 moluscos das três espécies do gênero Physa por eles encontradas naturalmente infectadas, com três miracídios/molusco, que 11% destes sobreviveram até completar o ciclo; dos que morreram, 9% apresentavam esporocistos; e que aos 56 dias três exempla-res de P. bermudezi e um de P. cubensis continham rédias e cer-cárias de F. hepatica. RUIZ et al. (1985), com o mesmo grupo de pesquisadores, e também infectando experimentalmente essas espécies do gênero Physa com três miracídios/molusco consegui-ram 21% de índice de infecção. Esses resultados são discrepantes com os ora obtidos que se identificaram aos divulgados por GO-MES et al. (1985) quando apresentaram a percentagem dos molus-cos encontrados naturalmente infectados no vale do rio Paraíba, onde as espécies L. columella e S. marmorata foram observadas ocupando o mesmo habitat, mas só L. columella apresentava in-fecção por F. hepatica; e de AMATO et al. (1985) que estudaram a epidemiologia da fasciolose hepatica no vale do rio Paraíba, observaram a ocorrência simultanea dessas espécies de moluscos e, em cinco anos nunca encontraram fisídeos infectados por F. hepatica.

As obsercaçõe de GOMES et al. (1985) e de AMATO et al. (1985) podem ser explicadas com base na opinião de WILSON (1968) sobre o poder atrativo em potencial do muco de L. truncatula pa-ra mipa-racídios de F. hepatica. Tais atrativos seriam certos áci-dos graxos que estimalariam pontos de sensibilidade química es-pecífica presentes nos miracídios (WILSON & DENISON, 1970).

Preocupados com esse fenômeno NANSEN et al. (1976) sugeriram o uso de substâncias radioativas para tentar elucidar qual a in-fluência física ou química do caramujo para que o miracídio o infectasse. Mas os trabalhos de GRIGORYAN (1965) com P. acuta e de GRIGORYAN & BADEYAN (1977) com P. acuta assinalaram a exis-tência de substância tóxica secretada por esses moluscos, que mata os miracídios de fasciolas em 20 a 30 minutos; embora esta substância seja produzida na ausência dos miracídios a pre-sença destes aumenta sua produção; por isso os autores suge-riram investigações nesse campo com vistas ao controle biológi-co. Com tais explicações parece evidente ser muito difícil a participação de moluscos do gênero Physa no ciclo de F. hepati-ca.

A idéia de controle biológico de trematódeos com mo-luscos que não se infectam com determinados miracídios foi tam-bem sugerida por MALEK (1977). Embora CHERNIN (1968) e CHERNIN & PERLSTEIN (1969) trabalhassem com Schistosoma mansoni Sambon, seus trabalhos trouxeram subsídios para o estudo de capacidade de miracídios infectar somente seus hospedeiros específicos, e que moluscos não específicos poderiam servir de iscas, tendo papel importante na epidemiologia e controle biológico. Molus-cos do gênero Lymnaea em regiões onde ocorre uma determinada es-pécie com grande potencial de infectividade, podem funcionar co-mo iscas, diminuindo a possibilidade desta se infectar; tal fa-to já foi comprovado por UENO & WATANABE (1960), BERGHEN (1964), BORAY (1966), RAO (1966), SAZANOV (1972), WILLOMITZER (1974a, b),

KAWANAKA (1978), MASSOUD & SADJADI (1980), RONDELAUD (1980), CRUZ-REYES (1982), McREATH et al. (1982), BUSSON et al. (1982), BOUIX-BOUSSON et al. (1983) que estudaram o grau de infectivida de de diferentes espécies que podem ocorrer nas regiões traba-lhadas, sendo algumas espécies consideradas de menor importân-cia como hospedeiro de F. hepatica.

Com base nos achados referidos anteriormente e na opi-nião de KENDALL (1964) de que existe um grande grau de especifi-cidade para o hospedeiro e mútua adaptação, e de BORAY (1967) de que F. hepatica é específica ao limneídeo do que ao hos-pedeiro vertebrado, julgou-se que no Estado do Rio de Janeiro L. columella seja o hospedeiro intermediário de F. hepatica

,

por não ocorrer outro com maior potencial de infectividade, e que os moluscos da família Physidae não funcionam como tal.

SUSCEPTIBILIDADE DE Lymnaea columella À Fasciola hepatica

Com a experiência adquirida no desenvolvimento do pro-jeto piloto reconheceu-se que as L. columella infectadas com F. hepatica sobreviviam no máximo 60 dias pós-infecção; assim de-terminou-se, com base nesse fato, que o momento ideal para ava-liações da infecção era o quinquagéssimo sexto dias pós-infec-ção. Esta determinação, de um modo geral, não afastou-se dos resultados de outros autores que relataram em seus achados os períodos para que o ciclo se completasse no molusco. Entre

ou-tros encontram-se: FURMAGA & GUNDLACH (1967) que trabalhando com L. stagnalis encontraram um período de 42 a 63 dias; NUERNBERG (1978) que achou 35 a 36 dias para os moluscos com que traba-lhou (L. cubensis)

;

RONDELAUD (1980) quando comparou a suscepti-bilidade de L. trucatula com a de outras espécies de Lymnaea

,

observou 42 dias como o tempo gasto para o desenvolvimento nas L. truncatula

,

consi-deradas como hospedeiro normal da região trabalhada; UETA (1980) que observou que o número de moluscos mortos aumentava a partir do quinquagésimo dia pós-infecção; observação similar foi feita por BOUIX-BOUSSON et al. (1983) quando passaram a considerar co-mo o dia máxico-mo o quadragésico-mo quinto após a infecção; RONDELAUD et al. (1984) que comprovaram que 90% dos moluscos estavam mor-tos aos 28 dias pós-infecção.

A preocupação da maioria dos autores está no tempo de sobrevivência dos moluscos após a infecção pois, já em 1883, THOMAS demonstrara esta preocupação. THOMAS (1883) disse que poucos moluscos sobrevivem a infecção artificial e que no labo-ratório a infecção é mais fatal para o molusco do que para o ovino. Esta sobrevivência não está presa somente a adaptação pa-rasito/hospedeiro, considerando-se que as outras condições ide-ais de sobrevivência estejam mantidas, mas a uma estreita rela-ção com o número de miracídios/molusco. Esse fato foi comprova-do quancomprova-do se obteve maior índice de mortalidade com infecções de cinco miracídios/molusco do que as com três miracídios/molus-co, cuja diferença foi altamente significativa. A percentagem de infecção também sofreu a mesma influência; este fato identi-ficou-se ao observado por RONDELAUD & BARTHE (1982), que com

in-fecções com um, dois, cinco, dez e vinte miracídios/molusco ob-teve, respectivamente, as seguintes percentagens de infecção: 60, 56, 32, 30 e 18. BOUIX-BOUSSON et al. (1983) afirmaram que o número de sobreviventes diminuiu a medida que o número de mi-racídios/molusco aumentou. Também corroborando com essa observa-ção NUERNBERG et al.(1983) disseram que com mais de cinco mira-cídios/molusco sobrevinha a morte do caramujo antes da emergên-cia de cercárias.

A comprovação de que não houve influência do hospedei-ro vertebrado do qual phospedei-rovinham os ovos para as infecções dos moluscos pode ser considerada como uma identidade à afirmação do BORAY (1967); segundo esse autor a maior especificidade de F. hepatica é para o limneídeo, o hospedeiro vertebrado pouco representa na especificidade parasito/hospedeiros.

O fato de só terem sido conseguidas metacercárias pe-la dissecação dos moluscos para liberação das cercárias encon-tra correspondência com a literatura especializada. KENDALL (1945) também não observou a emergência de cercárias quando es-tudou os efeitos dos fatores nutricionais para o desenvolvimen-to das formas larvais de F. hepatica. A emergência das cercá-rias continuou sendo a preocupação de KENDALL & McCULLOUGH (1951) quando disseram que a emergência é passiva e resultante da ati-vidade do manto que causa o aumento da pressão na parte termi-nal do espaço perivisceral. Esses autores também referiram que no campo as chuvas e movimento da água aumentam a atividade do molusco favorescendo a emergência das cercárias. BORAY (1963)

confirmou esses autores destacando que a emissão natural é me-lhor do que a experimental. Contudo é pertinente enfatizar que houveram tentativas, sem resultado positivo, para se induzir a liberação de cercárias por choque térmico e/ou luminoso, pa-ra a libepa-ração expontânea das cercárias. BERGHEN (1964) também não obteve emissão de cercárias em condições de

laborató-rio, e HODASI (1972a) consolidou afirmando que, em condições nor-mais de laboratório L. truncatula não fazia emergência total de cercárias. Com L. columella, UETA (1979) não conseguiu obser-var a eliminação expontânea de cercárias de F. hepatica, e só conseguiu metacercárias através do sacrifício dos moluscos com sinais de padecimento.

3 . PATOGENIA CAUSADA POR Fasciola hepatica EM Lymnaea columella

O aumento do crescimento das L. columella infectadas por F. hepatica, já verificado por BERGHEN (1964), parece ter sido induzido pela presença das formas larvais em desenvolvimen-to; esse raciocínio se apoia na proposição de WRIGHT (1971). Se-gundo esse autor o crescimento do molusco gastrópode é conse-quente aos aumentos de volume interno da concha, e essas mudan-ças resultam no aumento das proporções externas que poderiam ser usadas como um índice superficial da maturidade reproduti-va dos moluscos. Considerando a pressão interna ocasionada pelo aumento do volume corporal do molusco parasitado, o mecanismo

de crescimento da concha poderia ser similar ao descrito por WRIGHT (1971) embora não correspondesse a maturidade do molus-co. Outros autores também já assinalaram o fenômeno de gigantis-mo em suas observações, cogigantis-mo: RONDELAUD & BARTHE (1978) que dis-seram que a distribuição de rédias de primeira geração poderia influenciar o crescimento do molusco; WILSON & DENISON (1980) quando referiram o maior tamanho de L. truncatula quando esta estava infectada; JIMENEZ-ALBARRAN (1979) quando infectou L. truncatula com tamanhos de concha variando entre 5,27 mm e 5,66 mm, comparando com moluscos testemunha não infectados com conchas de 5,23 a 5,62 mm, e obteve os aumentos de 12,62 a 12,96 mm para os infectados e 10,41 a 10,81 mm para os testemu-nha, durante o período em que o grupo dos infectados levou a termo a infecção; BOUIX-BUSSON et al. (1985) que referiram um crescimento rápido para os moluscos infectados, salientando que o tamanho inicial não influenciava no tamanho de depois da ex-p o s i ç ã o .

O fato de ter sido constatado que as L. columella in-fectadas com três miracídios/molusco, tanto foram maiores que as não infectadas, como das que foram infectadas com cinco mira-cídios/molusco talvez seja um reflexo de que, nessas infecções, à medida que era aumentado o número de miracídios/molusco a so-brevivência diminuia (Tabela 7). Tal pensamento mantem identida-de com o achado identida-de KAWANAKA (1978) e coerência com a opinião identida-de COMBES (1982), ao afirmar que a patogenicidade depende do núme-ro de miracídios que penetram no caramujo.

A comparação histológica também foi feita com base nos 56 dias após a exposição, pois os caramujos não infectados poderiam ser comparados com os que levaram a êxito a infecção, e não morreram, estando os dois grupos com igual parâmetro de comparação em relação a idade. Esta comparação foi feita a nível de glândula digestiva e gônadas, sítios que se mostraram ser mais afetados n'aquela fase da infecção, quando rédias e cercá-rias estavam presentes. As ações das fases anteriores foram con-sideradas de pequena monta, como relata BARBER (1962) ao dizer que a lesão causada pelo miracídio correspondia a uma área dimi-nuta na superfície epitelial. RAO (1966) reportou-se ao estádio de esporocisto para concluir que nessa fase não há reação signi-ficativa no tecido. Endossando a conclusão de RAO (1966), ESCU-DERO-DIEZ (1970) disse que pelo fato do esporocisto não se movi-mentar, não provocava lesões. Essa colocação e passível de ques-tionamento já que pelo fato de não se movimentar o esporocisto não se torna menos nocivo; ele representa uma fase de multipli-cação acentuada e esta expoliando o hospedeiro retirando nutri-entes. Também KENDALL (1970) reforça a idéia de pequena reação e pouca lesão quando disse que a barreira a infecção inicial não era muito forte. Assim, de um modo geral, não houve desorganiza-ção a nível tecidual ou celular, a não ser nas áreas em que a presença de grande número de parasitos ou a movimentação des-tes, tiveram uma ação mais danosa.

As alterações histopatológicas observadas foram deter-minadas por ações de compressão e de traumatismo; a primeira