UNIVERSIDADE SÃO JUDAS TADEU PÓS-GRADUAÇÃO STRICTO SENSU EM EDUCAÇÃO FÍSICA. Janaina de Oliveira Brito

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UNIVERSIDADE SÃO JUDAS TADEU

PÓS-GRADUAÇÃO STRICTO SENSU EM EDUCAÇÃO FÍSICA

Janaina de Oliveira Brito

INFLUÊNCIA DA HIPERTENSÃO NOS AJUSTES INDUZIDOS PELO

TREINAMENTO FÍSICO NA MODULAÇÃO AUTONÔMICA CARDIOVASCULAR E NO ESTRESSE OXIDATIVO EM UM MODELO EXPERIMENTAL

DE MENOPAUSA E DISFUNÇÃO METABÓLICA

SÃO PAULO 2008

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UNIVERSIDADE SÃO JUDAS TADEU

PÓS-GRADUAÇÃO STRICTO SENSU EM EDUCAÇÃO FÍSICA

Janaina de Oliveira Brito

INFLUÊNCIA DA HIPERTENSÃO NOS AJUSTES INDUZIDOS PELO

TREINAMENTO FÍSICO NA MODULAÇÃO AUTONÔMICA CARDIOVASCULAR E NO ESTRESSE OXIDATIVO EM UM MODELO EXPERIMENTAL DE

MENOPAUSA E DISFUNÇÃO METABÓLICA

Dissertação apresentada ao Programa de Mestrado em Educação Física da Universidade São Judas Tadeu como requisito parcial à obtenção do título de Mestre em Educação Física.

Área de Concentração: Bases Biodinâmicas da Atividade Física.

Orientadora: Profa. Dra. Kátia De Angelis.

SÃO PAULO 2008

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Brito, Janaina de Oliveira

Influência da hipertensão nos ajustes induzidos pelo treinamento físico na modulação autonômica cardiovascular e no estresse oxidativo em um modelo experimental de menopausa e disfunção metabólica / Janaina de Oliveira Brito. - São Paulo, 2008.

103 f. ; 30 cm

Dissertação (mestrado) – Universidade São Judas Tadeu, São Paulo, 2008. Orientador: Kátia De Angelis

1. Hipertensão. 2. Menopausa. 3. Estresse Oxidativo. 4. Treinamento Físico. I. De Angelis, Kátia. II. Título

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DEDICATÓRIA

Dedico aos meus pais, José de Brito e Elza Francisca de Oliveira Brito, não somente esta

dissertação, mas todos os anos de estudo que me proporcionaram. Aproveito para agradecer a

compreensão nos momentos de correria em casa (e de ausência) e por todo o auxílio (com o qual

posso contar sempre). As próximas páginas são resultado de uma longa trajetória, repleta de

esforços e dedicação para que tudo saísse da melhor maneira possível. O conteúdo desta dissertação

é fruto do que, antes de mais ninguém, vocês plantaram!

Dedico também ao meu irmão Sebastião de Brito, meu amigo durante 23 anos da minha

vida! A pessoa que está ao meu lado em vários momentos bons e tristes, me ajudando nas horas

mais difíceis.

Dedico ao meu namorado Emerson Monzani, por compreender as minhas ausências nos

finais de semana, as minhas viagens para Congressos, a troca do “cinema em casa” pelos artigos.

Enfim, por estar ao meu lado desde o início da minha trajetória acadêmica.

Dedico esta dissertação aos meus familiares: meus avós que não estão mais presentes, meus

tios, tias, primos, primas, cunhadas, sogro, sogra, ex-professores e amigos. Todos, mesmo aqueles

que moram longe e encontro pouquíssimo, contribuem para a minha formação enquanto ser

humano.

Dedico aos meus amigos e eternos ANGELITOS: Bruno Rodrigues, Cristiano Mostarda,

Danielle Dias, Demilto Yamaguchi, Diego Figueroa, Geórgia Cândido, Henrique Marchet, Íris

Callado Sanches, Jacqueline Freire, Janaina Paulini, Juliana Francica, Karin Flues, Kátia Ponciano,

Luciana Jorge, Lucinar Flores, Marcelo Heeren, Márcia Val, Marcio Tubaldini, Michelle Sartori e

Renata Juliana. Pessoas que, às vezes, passam mais tempo ao meu lado do que meus próprios pais.

Pessoas com características ímpares, sempre ouvindo o que tenho a falar e me ensinando com suas

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AGRADECIMENTOS

À Professora Doutora Kátia De Angelis, por ter acreditado em mim desde o 2º ano da graduação, orientando minha pesquisa de Iniciação Científica, meu Trabalho de Conclusão de Curso, esta dissertação!! Enfim, o meu mais sincero muito obrigada por fazer parte da minha vida, por passar noites em claro, por ser justa com todos os seus alunos, por confiar na minha pessoa.

À Professora Doutora Maria Cláudia Irigoyen por estar sempre presente em nosso grupo, nos auxiliando com o suporte técnico e acrescentando seus conhecimentos em nossos trabalhos de maneira doce e significativa!

À minha amiga de graduação, companheira de TCC, colega de laboratório e parceira de todas as horas, Nathalia Bernardes, por me aturar quando estou com muita fome e fico de mau-humor, por ouvir as minhas diversas histórias com atenção e sempre rir das minhas palhaçadas....É nada!!

Aos profissionais responsáveis pelos laboratórios e equipamentos da Universidade São Judas Tadeu, em especial a Leide, Rosana e João Paulo, pela disposição em nos ajudar e bom humor sempre!

À Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES), pelo apoio financeiro.

À Universidade São Judas Tadeu (USJT) e todos os professores, coordenadores, secretários e funcionários que, direta ou indiretamente, contribuíram para a realização deste trabalho!

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“A ciência não pode prever o que vai acontecer. Só pode prever a probabilidade de algo acontecer.” César Lattes

“Você faz suas escolhas, e suas escolhas fazem você.” Steve Beckman

“Você nasceu para vencer, mas para ser um vencedor você precisa planejar para vencer, se preparar para vencer e

esperar para vencer.” Zig Ziglar

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SUMÁRIO

Lista de figuras

Lista de tabelas e quadros Lista de abreviaturas Resumo

Abstract

1. INTRODUÇÃO 1

1.1. Doença Cardiovascular e Gênero: O Impacto da Menopausa... 1

1.2. Doença Cardiovascular e Síndrome Metabólica ... 4

1.3. Doença Cardiovascular e Disfunção Autonômica... 10

1.4. Doença Cardiovascular e Estresse Oxidativo ... 12

1.5. Doença Cardiovascular e Treinamento Físico ... 15

2. OBJETIVOS... 20 2.1. Objetivo Geral... 20 2.2. Objetivos Específicos... 20 3. MATERIAIS E MÉTODOS... 21 3.1. Amostra... 21 3.2. Seqüência Experimental... 22 3.3. Procedimentos ... 22

3.3.1. Indução do Modelo Experimental de Síndrome Metabólica... 22

3.3.2. Ooforectomia Bilateral... 23

3.3.3. Teste de Esforço Máximo... 24

(8)

3.3.5. Medida da Glicemia e dos Triglicerídeos Plasmáticos... 27

3.3.6. Canulação... 28

3.3.7. Registro de Pressão Arterial ... 30

3.3.8. Avaliação da Modulação Autonômica Cardiovascular... 31

3.3.8.1. Análise da Variabilidade da Pressão Arterial Sistólica... 31

3.3.8.2. Análise da Variabilidade do Intervalo de Pulso... 31

3.3.8.3. Análise da Sensibilidade Barorreflexa Espontânea (Índice Alfa)... 32

3.3.9. Teste de Resistência à Insulina... 32

3.3.10. Eutanásia dos Animais... 32

3.3.11. Preparação dos Tecidos... 33

3.3.12. Dosagem de Proteínas... 33

3.3.13. Estresse Oxidativo e Enzimas Antioxidantes... 34

3.3.13.1. Medida de Lipoperoxidação (LPO): Quimiluminescência Iniciada por t-BOOH (QL)... 34 3.3.13.2. Razão GSH/GSSG... 35

3.3.13.2.1. Glutationa Total... 35

3.3.13.2.2. Glutationa Oxidada... 36

3.3.13.3. Superóxido Dismutase (SOD)... 36

3.3.13.4. Catalase (CAT)... 37

3.3.13.5. Glutationa Peroxidase (GPx)... 38

3.4. Análise Estatística... 39

4. RESULTADOS………... 40

4.1. Avaliação da Capacidade Física……….………..….. 40

(9)

4.3. Avaliação do Tecido Adiposo………..………... 43

4.4. Avaliações Metabólicas………... 44

4.5. Avaliações Hemodinâmicas……… 47

4.6. Avaliações da Modulação Autonômica da Freqüência Cardíaca... 49

4.7. Avaliação da Variabilidade da Pressão Arterial... 53

4.8. Avaliação da Sensibilidade Barorreflexa Espontânea... 56

4.9. Avaliações de Estresse Oxidativo... 57

4.10. Análise das Enzimas Antioxidantes... 60

5. DISCUSSÃO... 62

5.1. Avaliações da Capacidade Física... 62

5.2. Avaliações Metabólicas e de Pesos Corporal e do Tecido Adiposo... 64

5.3. Avaliações Hemodinâmicas e Autonômicas... 70

5.4. Avaliações do Perfil Oxidativo... 76

6. CONCLUSÃO... 84

(10)

LISTA DE FIGURAS

Figura 1. Esquema geral das principais fontes celulares de produção e metabolização das ERO. UQH• + ubisemiquinona; GSSG = glutationa oxidada; GSH = glutationa reduzida; DH2 e D = sistemas redutores de NADP não-específicos; SOD = superóxido dismutase;

GPx = glutationa peroxidase; CAT = catalase; B e BH2 = doadores de hidrogênio...13

Figura 2. Seqüência Experimental do protocolo...22

Figura 3. Tratamento de D-frutose na água de beber...23

Figura 4. Etapas de realização da ooforectomia bilateral em ratas...23

Figura 5. Correlação entre o consumo de oxigênio (VO2) e a velocidade do teste de esforço (km/h) em ratas ooforectomizadas...24

Figura 6. Fotografia de ratos submetidos ao protocolo de treinamento físico em esteira ergométrica a USJT...25

Figura 7. Aparelhos que foram utilizados para análises das concentrações sangüíneas de glicose e triglicerídeos...28

Figura 8. Esquema do local da canulação da artéria carótida e veia jugular...29

Figura 9. Foto do animal com a cânula exteriorizada...29

Figura 10. Sistema de registro de pressão arterial e conexão entre a cânula e o transdutor eletromagnético...30

Figura 11. Velocidade máxima alcançada no teste de esforço inicial, intermediário (4ª semana) e final (8ª semana) nos grupos FOS (frutose ooforectomizado sedentário), FOT (frutose ooforectomizado treinado), FOHS (ooforectomizado hipertenso sedentário tratado com frutose) e FOHT (ooforectomizado hipertenso treinado tratado com frutose)...41

(11)

Figura 12. Peso corporal dos grupos FOS (frutose ooforectomizado sedentário), FOT (frutose ooforectomizado treinado), FOHS (ooforectomizado hipertenso sedentário

tratado com frutose) e FOHT (ooforectomizado hipertenso treinado tratado com frutose)

ao longo das últimas semanas de protocolo...42

Figura 13. Tecido adiposo dos grupos FOS (frutose ooforectomizado sedentário), FOT (frutose ooforectomizado treinado), FOHS (ooforectomizado hipertenso sedentário

tratado com frutose) e FOHT (ooforectomizado hipertenso treinado tratado com

frutose)...44

Figura 14. Glicemia nos grupos FOS (frutose ooforectomizado sedentário), FOT (frutose ooforectomizado treinado), FOHS (ooforectomizado hipertenso sedentário tratado com

frutose) e FOHT (ooforectomizado hipertenso treinado tratado com frutose)...46

Figura 15. Concentrações sanguíneas de triglicerídeos nos grupos FOS (frutose ooforectomizado sedentário), FOT (frutose ooforectomizado treinado), FOHS

(ooforectomizado hipertenso sedentário tratado com frutose) e FOHT (ooforectomizado

hipertenso treinado tratado com frutose)...43

Figura 16. Constante de decaimento da gliemia (KITT) durante o teste de tolerância à insulina nos grupos FOS (frutose ooforectomizado sedentário), FOT (frutose

ooforectomizado treinado), FOHS (ooforectomizado hipertenso sedentário tratado com

frutose) e FOHT (ooforectomizado hipertenso treinado tratado com frutose)...46

Figura 17. Pressão Arterial Média nos grupos FOS (frutose ooforectomizado sedentário), FOT (frutose ooforectomizado treinado), FOHS (ooforectomizado

hipertenso sedentário tratado com frutose) e FOHT (ooforectomizado hipertenso treinado

(12)

Figura 18. Freqüência Cardíaca nos grupos FOS (frutose ooforectomizado sedentário), FOT (frutose ooforectomizado treinado), FOHS (ooforectomizado hipertenso sedentário

frutose)...49

Figura 19. Variância do intervalo de pulso nos grupos FOS (frutose ooforectomizado sedentário), FOT (frutose ooforectomizado treinado), FOHS (ooforectomizado

hipertenso sedentário tratado com frutose) e FOHT (ooforectomizado hipertenso treinado

tratado com frutose)...52

Figura 20. Banda de baixa freqüência do intervalo de pulso normalizada nos grupos FOS (frutose ooforectomizado sedentário), FOT (frutose ooforectomizado treinado), FOHS

Figura 21. Banda de alta freqüência do intervalo de pulso normalizada nos grupos FOS (frutose ooforectomizado sedentário), FOT (frutose ooforectomizado treinado), FOHS

hipertenso treinado tratado com frutose)...53

Figura 22. Variância da pressão arterial sistólica nos grupos FOS (frutose ooforectomizado sedentário), FOT (frutose ooforectomizado treinado), FOHS

Figura 23. Banda de baixa freqüência da pressão arterial sistólica nos grupos FOS (frutose ooforectomizado sedentário), FOT (frutose ooforectomizado treinado), FOHS

(13)

Figura 24. Índice alfa nos grupos FOS (frutose ooforectomizado sedentário), FOT (frutose ooforectomizado treinado), FOHS (ooforectomizado hipertenso sedentário

frutose)...56

Figura 25. Quimiluminescência no tecido cardíaco nos grupos FOS (frutose ooforectomizado sedentário), FOT (frutose ooforectomizado treinado), FOHS

Figura 26. Razão da glutationa reduzida pela glutationa oxidada (GSH/GSSG) no tecido cardíaco nos grupos FOS (frutose ooforectomizado sedentário), FOT (frutose

ooforectomizado treinado), FOHS (ooforectomizado hipertenso sedentário tratado com

frutose) e FOHT (ooforectomizado hipertenso treinado tratado com frutose)...58

Figura 27. Correlação negativa obtida entre a QL no tecido cardíaco e o índice alfa nos grupos FOS (frutose ooforectomizado sedentário), FOT (frutose ooforectomizado

treinado), FOHS (ooforectomizado hipertenso sedentário tratado com frutose) e FOHT

(ooforectomizado hipertenso treinado tratado com frutose)...59

Figura 28. Correlação negativa entre a QL no tecido cardíaco e o RMSSD obtida nos grupos FOS (frutose ooforectomizado sedentário), FOT (frutose ooforectomizado

treinado), FOHS (ooforectomizado hipertenso sedentário tratado com frutose) e FOHT

(ooforectomizado hipertenso treinado tratado com frutose)...60

Figura 29. Atividade da enzima catalase no tecido cardíaco nos grupos FOS (frutose ooforectomizado sedentário), FOT (frutose ooforectomizado treinado), FOHS

(14)

LISTA DE TABELAS E QUADROS

Tabela 1. Velocidade máxima alcançada no teste de esforço inicial, intermediário (4ª semana) e final (8ª semana) nos grupos FOS (frutose ooforectomizado sedentário), FOT (frutose ooforectomizado treinado), FOHS (ooforectomizado hipertenso sedentário tratado com frutose) e FOHT (ooforectomizado hipertenso treinado tratado com frutose)...40 Tabela 2. Peso corporal dos grupos FOS (frutose ooforectomizado sedentário), FOT (frutose ooforectomizado treinado), FOHS (ooforectomizado hipertenso sedentário tratado com frutose) e FOHT (ooforectomizado hipertenso treinado tratado com frutose) ao início (dia ooforectomia) e ao final do protocolo...43 Tabela 3. Valores sanguíneos de glicose (GLIC), triglicerídeos (TG) e constante de decaimento da glicemia (KITT) dos grupos FOS (frutose ooforectomizado sedentário), FOT (frutose ooforectomizado treinado), FOHS (ooforectomizado hipertenso sedentário tratado com frutose) e FOHT (ooforectomizado hipertenso treinado tratado com frutose) no início e ao final do protocolo...45 Tabela 4. Parâmetros hemodinâmicos avaliados em repouso dos grupos FOS (frutose ooforectomizado sedentário), FOT (frutose ooforectomizado treinado), FOHS (ooforectomizado hipertenso sedentário tratado com frutose) e FOHT (ooforectomizado hipertenso treinado tratado com frutose)...48

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Tabela 5. Variabilidade da freqüência cardíaca dos grupos FOS (frutose ooforectomizado sedentário), FOT (frutose ooforectomizado treinado), FOHS (ooforectomizado hipertenso sedentário tratado com frutose) e FOHT (ooforectomizado hipertenso treinado tratado com frutose)...51 Tabela 6. Variabilidade da pressão arterial sistólica dos grupos FOS (frutose ooforectomizado sedentário), FOT (frutose ooforectomizado treinado), FOHS (ooforectomizado hipertenso sedentário tratado com frutose) e FOHT (ooforectomizado hipertenso treinado tratado com frutose)...54 Tabela 7. Atividade das enzimas catalase (CAT), superóxido dismutase (SOD) e glutationa peroxidase (GPx) no tecido cardíaco dos grupos FOS (frutose ooforectomizado sedentário), FOT (frutose ooforectomizado treinado), FOHS (ooforectomizado hipertenso sedentário tratado com frutose) e FOHT (ooforectomizado hipertenso treinado tratado com frutose)...61 Quadro 1. Protocolo de treinamento físico para ratas Wistar...26 Quadro 2. Protocolo de treinamento físico para ratas SHR...27 Quadro 3. Alterações metabólicas dos grupos controle (CS), ooforectomizada (OS), ooforectomizada hipertensa (OHS), frutose ooforectomizada (FOS) e frutose ooforectomizada hipertensa (FOHS)...66 Quadro 4. Alterações hemodinâmicas e autonômicas dos grupos controle (CS), ooforectomizada (OS), ooforectomizada hipertensa (OHS), frutose ooforectomizada (FOS) e frutose ooforectomizada hipertensa (FOHS)...71

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LISTA DE ABREVIATURAS

%AF = banda de alta freqüência normalizada %BF = banda de baixa freqüência normalizada AF = banda de alta freqüência

ATRAMI =Autonomic Tone and Reflexes After

Myocardial Infarction

B e BH2 = doadores de hidrogênio

BF = banda de baixa freqüência CAT = catalase

CO3HK = bicarbonato potásico

COEP = Comitê de Ética em Pesquisa CuSO4.= sulfato de cobre

DH2 e D = sistemas redutores de NADP

não-específicos

DM = diabetes mellitus

DNA = ácido desoxirriblonucleico DTNB = acido ditionitrobenzóico ERO = espécies reativas de oxigênio FC = frequência cardíaca

FFT = Transformada Rápida de Fourrier FOHS = frutose hipertensa ooforectomizada

sedentária

FOHT = frutose hipertensa ooforectomizada

treinada

FOS = frutose ooforectomizada sedentária FOT = frutose ooforectomizada treinada GPx = glutationa peroxidase

GSH = glutationa reduzida

GSH/GSSG = razão glutationa reduzida pela

glutationa oxidada

GSSG = glutationa oxidada H2O = água

HAS = hipertensão arterial sistêmica HDL = lipoproteína de alta densidade i.p. = intra-peritonial

IP = intervalo de pulso KCl = cloreto de potássio

Kitt = constante de queda da glicose plasmática KNaC4H4O6 = tartarato de sódio e potássio

LPO = lipoperoxidação Na2HPO4 = fosfato dissódico

NADPH = forma reduzida da nicotinamida

adenina dinucleotídeo fosfato

NaHCO3 = bicarbonato de sódio

NaOH = hidróxido de sódio NO = óxido nítrico

PA = pressão arterial

PAD = pressão arterial diastólica PAM = pressão arterial média PAS = pressão arterial sistólica

PMSF = fluoreto de fenil metil sulfonila QL = quimiluminescência

RMSSD = raiz quadrada da média dos quadrados

das diferenças entre os intervalos R-R normais sucessivos

SHR = rato espontaneamente hipertenso SM = síndrome metabólica

SNA = sistema nervoso autônomo SOD = superóxido dismutase

t-BOOH = hidroperóxido de tert-butil UQH• = ubisemiquinona

VAR = variância

VO2 = volume de oxigênio

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RESUMO

O objetivo do presente estudo foi verificar os efeitos do treinamento físico (TF) em parâmetros

cardiovasculares e metabólicos, na modulação autonômica cardiovascular e no estresse

oxidativo em ratas fêmeas Wistar e em ratas espontaneamente hipertensas (SHR), ambas

ooforectomizadas submetidas à sobrecarga de frutose na água de beber. Foram utilizadas 40

fêmeas Wistar e SHR divididas em 4 grupos (n=10 em cada grupo) de ratas ooforectomizadas

(remoção bilateral dos ovários) submetidas à sobrecarga de frutose (100g/L de água): sedentária

(FOS), treinada (FOT), hipertensa sedentária (FHOS), hipertensa treinada (FHOT). Os grupos

treinados foram submetidos a um programa de TF em esteira ergométrica (1 hora/dia, 5

dias/semana, 8 semanas, 40-60% da velocidade máxima no teste de esforço). A concentração

sanguínea de glicose e triglicerídeos e o teste de resistência à insulina foram utilizados para

avaliar o perfil metabólico. Ao final do protocolo, os animais foram canulados para registro

direto de pressão arterial (PA). Além disso, avaliou-se a modulação autonômica cardiovascular

no domínio do tempo e da freqüência (análise espectral). O perfil oxidativo foi verificado no

tecido cardíaco avaliando-se a quimiluminescência (QL), a relação glutationa

reduzida/glutationa oxidada (GSH/GSSG), bem como a atividade das enzimas antioxidantes:

superóxido dismutase (SOD), glutationa peroxidase (GPx) e a catalase (CAT). O grupo FOS

apresentou redução dos valores de triglicerídeos e do KITT (constante de decaimento da

glicose) no teste de tolerância à insulina quando comparado ao grupo FOT. Os grupos FOHS e

FOHT apresentaram valores de resistência à insulina e valores triglicerídeos semelhantes ao

grupo FOS. Os valores de PA foram maiores nos grupos FOHS e FOHT em relação aos grupos

FOS e FOT. Além disso, os animais do grupo FOHS apresentaram taquicardia de repouso em

relação aos demais grupos estudados. O TF induziu bradicardia de repouso nos grupos

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das diferenças entre os intervalos R-R normais sucessivos) do intervalo de pulso (IP); e o TF

induziu aumento do RMSSD somente no grupo FOT em relação aos demais grupos estudados.

Com relação à banda de baixa freqüência do IP (BF), os grupos FOHS e FOHT demonstraram

uma redução exacerbada desses valores em relação aos grupos FOS e FOT. A banda de alta

freqüência do IP (AF) foi menor no grupo FOHT quando comparados ao grupo FOT. A

hipertensão induziu um aumento na VAR-PAS e da banda de BF da PAS. No entanto, o TF

atenuou tais disfunções nos grupos FOT e FOHT. A hipertensão provocou uma redução no

índice alfa, representativa da sensibilidade barorreflexa espontânea que foi atenuada pelo TF

(FOT e FOHT). A QL estava reduzida somente no grupo FOT em relação ao grupo FOS. Já a

relação GSH/GSSG estava maior no grupo FOHT em relação ao grupo FOHS. A atividade da

CAT foi maior nos grupos treinados, mas a atividade da GPx e da SOD foi semelhante entre os

grupos estudados. Observaram-se correlações negativas entre a QL e o RMSSD (r=-0,60) e o

índice alfa (r=-0,63), sugerindo que animais que reduziram o estresse oxidativo cardíaco

apresentavam melhora na modulação autonômica cardiovascular. Concluindo, os resultados

demonstraram prejuízos no perfil metabólico e autonômico em ratas ooforectomizadas

sedentárias normotensas tratadas com sobrecarga frutose, e que a hipertensão induziu

disfunções hemodinâmica e autonômica adicionais nesses animais. Entretanto, o achado mais

importante de nosso trabalho foi que o treinamento físico atenuou algumas dessas disfunções

decorrentes da privação dos hormônios ovarianos e do consumo crônico de frutose, pelo menos

em parte associado à redução do estresse oxidativo; todavia, a presença de hipertensão aboliu

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ABSTRACT

The purpose of this study was to evaluate the effects of physical training on cardiovascular and

metabolic parameters, on autonomic cardiovascular modulation and on oxidative stress in

female rats Wistar and in spontaneously hypertensive rats (SHR), both ovariectomized and

submitted to fructose overload in drinking water. Ovariectomized (bilateral ovary removal)

female Wistar rats and female SHR submitted to fructose overload (100g/L) were divided into 4

groups (n=10 each): sedentary (SOF), trained (TOF), sedentary hypertensive (SHOF), trained

hypertensive (THOF). The trained groups were submitted to an exercise training protocol on a

treadmill (1 hour/day; 5 days/week; 8 weeks; 40-60% of the maximum velocity of the exercise

test). The blood glucose and triglycerides concentrations and the insulin tolerance test were

performed to evaluate the metabolic profile. At the end of the protocol all the rats were

cannulated to arterial pressure (AP) direct recording. Moreover, the cardiovascular autonomic

control was evaluated in the time and the frequency (spectral analysis) domains. The oxidative

profile was verified in the heart tissue by the chemiluminescence (CL), the glutathione

reductase/glutathione oxidase ratio (GSH/GSSG), as well as by the antioxidant enzymes

superoxide dismutase (SOD), glutathione peroxidase (GPx) and catalase (CAT) activities. The

SOF group presented reduced triglycerides values and KITT (constant of glucose reduction) in

the insulin tolerance test when compared with the TOF group. The SHOF and THOF rats

showed similar KITT and triglycerides values when compared to SOF rats. The AP values were

higher in SHOF and THOF groups when compared with SOF and TOF groups. Furthermore,

SHOF rats presented resting tachycardia in relation to the other studied groups. Exercise

training (ET) induced resting bradycardia in the trained groups. The hypertension induced to a

reduction in RMSSD (root mean square of successive differences) of the pulse interval (PI);

(20)

other studied groups. Regarding the low frequency band (LF) of the PI, the SHOF and THOF

groups showed a exacerbated reduction as compared to SOF and TOF groups. The high

frequency band (HF) of the PI was lower in the THOF group in relation to the TOF group. The

hypertension induced an enhancement in the variance of the PA (VAR-PAS) and the LF band

of the PA. However, the ET attenuated such dysfunctions in the SOF and THOF groups. The

hypertension induced a reduction in the alpha-index (which represents the spontaneous

baroreflex sensitivity), that was attenuated by the ET (TOF e THOF). The CL was reduced in

the TOF rats as compared to the SOF rats. The GSH/GSSG ratio was increased in the SHOF

group in relation to THOF group. The CAT activity was higher in the trained groups, but the

GPx and SOD activities were similar between studied groups. Negative correlations were

obtained between CL and RMSSD (r=-0.60) and the alpha index (r=-0.63), suggesting that

animals that reduced oxidative stress showed improvement in the autonomic cardiovascular

modulation. In conclusion, the results demonstrated impairments in the metabolic and

autonomic profiles in ovariectomized sedentary normotensive rats submitted to fructose

overload, and that hypertension induced additional hemodynamic and autonomic dysfunctions

in these animals. However, the main finding of our study was that the ET had attenuated some

dysfunctions observed in female rats submitted to ovarian hormones deprivation and chronic

fructose overload, at least in part associated with oxidative stress reduction; nevertheless the

presence of hypertension abolished some benefits that were observed in the normotensive

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1. INTRODUÇÃO

1.1. Doença Cardiovascular e Gênero: O Impacto da Menopausa

Atualmente, as doenças cardiovasculares constituem a mais importante causa de morte em ambos os sexos em todas as regiões do país e no mundo ocidental (CASTANHO et al., 2001; NAHAS, 2001; BOUCHARD, 2003). A morte devido às doenças cardiovasculares é maior em homens (39%) do que em mulheres na faixa etária dos 45 a 64 anos. Entretanto, após os 65 anos, a taxa de mortalidade das mulheres por doenças cardiovasculares ultrapassa à dos homens em até 22% (NATIONAL CENTER FOR HEALTH STATISTICS, 1997). Além disso, a taxa de mortalidade devido às doenças cardiovasculares no sexo feminino elevou-se rapidamente nas últimas décadas. Isso provavelmente ocorreu, pois atualmente, as mulheres estão mais expostas a fatores de risco como o estresse, o fumo, os maus hábitos alimentares e o sedentarismo, sem contar com a sua inserção no mercado de trabalho. No Brasil, a prevalência de morte por doença cardiovascular aumentou de 10 para 25% entre os anos 60 e 70 para o sexo feminino (CASTANHO et al., 2001).

Castanho et al. (2001) citam como fatores de risco para doença cardiovascular: o diabetes, o excesso de peso e a obesidade, a inatividade física, o fumo, a hipercolesterolenia e a hipertensão, sendo estes dois últimos fatores de risco mais prevalentes em mulheres do que em homens. Neste contexto, vale destacar que a diferença em mortalidade cardiovascular entre os sexos pode ser devida a vários fatores, como prevalência diferenciada dos fatores de risco cardiovascular citados acima, bem como diferenças na modulação autonômica cardiovascular. Estudos clínicos e experimentais

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parecem concordar que o sexo feminino, antes da privação dos hormônios ovarianos, tem maior predomínio vagal e maior sensibilidade dos pressorreceptores (o mais importante regulador da pressão arterial (PA) à curto prazo) e, portanto, maior proteção cardiovascular, em relação ao sexo masculino (KUO et al., 1999; HUIKURI et al., 1996; GREGOIRE et al., 1996; LEINWAND, 2003). Entretanto, é importante enfatizar que essa proteção autonômica cardiovascular apresentada pelo sexo feminino é atenuada após a privação dos hormônios ovarianos (KUO et al., 1999). Além disto, um estudo demonstrou que 24% das mulheres com mais de 40 anos de idade apresentam uma marcante diminuição na sensibilidade dos barorreceptores em relação a mulheres jovens (LAITINEN et al., 1998). Considerando esses achados, parece razoável supor que a disautonomia cardiovascular possa estar relacionada à equivalência nas taxas de eventos cardiovasculares entre os sexos após o advento da menopausa (BRENNER, 1988; NCEP, 2001).

De fato, após a menopausa (a última menstruação da mulher), observaram-se progressivamente importantes alterações fisiológicas que podem afetar vários locais do organismo e determinar sinais e sintomas conhecidos por síndrome climatérica e que podem estar relacionadas a alterações no controle do sistema nervoso autônomo sobre órgãos e sistemas (GUYTON & HALL, 2002; ANTUNES, MARCELINO & AGUIAR, 2003; DE ANGELIS et al., 2004). Vale destacar que quanto mais cedo ocorrer à parada da produção dos hormônios femininos, (em especial induzidos cirurgicamente), mais efeitos negativos são observados, gerando um abrupto aumento do risco de infarto agudo do miocárdio (COLDITZ et al., 1987). Conforme Schouw et al. (1996) quanto mais cedo o climatério, maiores os riscos, ou seja, quanto mais precoce a mulher entra no período de restrição dos hormônios femininos maior é o risco de eventos cardíacos. Neste contexto,

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estudos vêm demonstrando que os hormônios ovarianos podem ser responsáveis por tais alterações no risco cardiovascular. Corroborando a importância dos hormônios ovarianos no controle cardiovascular, estudos demonstram que a PA é mais baixa em mulheres pré-menopausa e também que se eleva em mulheres pré-menopausadas (STAESSEN et al., 1997; WEIS, 1972) ou em animais submetidos à privação dos hormônios ovarianos (IRIGOYEN et al., 2005; RECCKELHOLF et al., 2000).

Trabalhos experimentais vêm colaborando para o melhor entendimento dos processos envolvidos no aumento do risco cardiovascular após a menopausa (SHAWAERY et al., 1997; ADAMS et al., 1995). Estudos demonstram disfunção autonômica relacionada a privação dos hormônios ovarianos (KUO et al., 1999, LAITINEN et al., 1998; IRIGOYEN et al., 2005; JURCA et al., 2004). Além disto, trabalhos sugerem que um dos vários mecanismos de cardioproteção dos estrogênios seria a preservação da função endotelial, através, por exemplo, da inibição da proliferação da célula muscular lisa, das ações antioxidantes e da melhora na reatividade vascular, os quais induziriam um melhor equilíbrio na função vasodilatadora/vasoconstrictora com conseqüente diminuição dos riscos cardiovasculares. Por fim, não se pode esquecer que em paralelo a privação dos hormônios ovarianos começa a ocorrer mudanças desfavoráveis em lipídios, na tolerância à glicose (AMODEO & HEIMANN, 2003), aumento do peso corporal e da prevalência de diabetes e redução na capacidade de exercício, na força muscular e na massa óssea (SOWERS & LA PIETRA, 1995). Essas alterações aumentam significativamente o risco de eventos cardiovasculares nesta fase de vida da mulher e também podem estar relacionadas à disfunção autonômica, uma vez que esses fatores

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associados podem desencadear o aparecimento de doenças cardiovasculares (SINAGRA & CONTI, 2007).

1.2. Doença Cardiovascular e Síndrome Metabólica

Nos últimos anos houve um aumento na incidência de doenças crônicas (obesidade, diabetes, doenças cardiovasculares) e fatores de risco associados para essas doenças (como tabagismo, estresse, sedentarismo e alimentação inadequada) o que ocasionou o aumento da morbidade e da mortalidade da população adulta mundial. Estima-se que nos Estados Unidos a atual prevalência da síndrome metabólica (SM) seja de 21,8% da população adulta, o que representa cerca de 47 milhões de norte-americanos (GUIMARÃES & CIOLAC, 2004).

A SM é um termo que tem sido utilizado para relacionar a doença coronariana, a hipertensão, o diabetes Tipo II (DM2) e a obesidade da porção superior do corpo a resistência à insulina e à hiperinsulinemia. Essa síndrome foi também denominada síndrome X e síndrome da civilização. Não está totalmente claro quando essa síndrome começa, mas foi observado que a obesidade da porção superior do corpo está associada à resistência à insulina e que esta está relacionada a um maior risco de doença coronariana, hipertensão e DM2. Essa síndrome tornou-se um importante tópico de pesquisa na década de 1990, devendo os resultados ajudar-nos a compreender melhor a fisiopatologia dessas doenças e suas inter-relações (WILMORE & COSTILL, 2001).

A SM foi provavelmente identificada em 1923, quando Kylin notou que a hipertensão e a hiperglicemia se correlacionavam. Nos anos 60, surgiu uma definição mais moderna desta síndrome, que incluía obesidade, hipertensão, diabetes, e hiperlipidemia.

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Investigadores alemães dos anos 70 foram os primeiros a usar o termo “síndrome metabólica“, começando a explorar a associação da síndrome com a arteriosclerose. Após os anos 90, Ferrannini e colaboradores (1990) sugeriram que a causa subjacente da síndrome era resistência à insulina e, por isso, sugeriram o termo “síndrome de resistência à insulina”.

De fato, há aumento do risco cardiovascular decorrente da associação entre obesidade, hipertensão arterial e alterações no metabolismo lipídico e glicêmico. Tem sido, inclusive, demonstrado que a distribuição da gordura no corpo é mais importante do que o aumento de peso (HALPEN, 1998). Além disto, o acúmulo de gordura abdominal, mesmo em não obesos, está relacionado a doenças metabólicas comuns na meia-idade. Denominou esse estado de "Síndrome X" que passou posteriormente a ser chamada de "Síndrome Plurimetabólica" ou "Metabólica" (REPETTO, 1998).

Além disso, foi demonstrado que as mulheres que apresentaram obesidade abdominal tinham maior dificuldade na redução da glicemia do que o grupo controle de mulheres eutróficas e do que um grupo de obesas com gordura localizada perifericamente (WARRAM et al., 1990). Este fato pode, talvez, ser explicado porque os adipócitos abdominais são muito maiores e têm aumentada tendência em converter os lipídios em ácidos graxos, quando comparados aos adipócitos acumulados em outros compartimentos corporais (WARRAM et al., 1990). Ao liberar rapidamente seu conteúdo de ácido graxo na corrente sangüínea, os adipócitos viscerais provocam um aumento dos ácidos graxos circulantes, ocasionando aumento dos níveis séricos de glicose e triglicérides. Ainda, os ácidos graxos livres dificultam a entrada de glicose nas células musculares, levando à hiperglicemia com aumento do risco de desenvolvimento de DM2. Esses ácidos graxos têm

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acesso direto ao fígado pela veia porta, interferindo no metabolismo da insulina e afetando conseqüentemente a captação celular de glicose, por sua vez levando a resistência à insulina. Esse estado fisiopatológico é considerado como elemento fundamental na etiologia da SM (ISSA & FRANCISCO, 1996).

Vários estudos correlacionaram a hiperinsulinemia e resistência à insulina com risco aumentado para aterosclerose, hipertensão arterial, cardiopatia isquêmica, dislipidemias, intolerância à glicose, obesidade abdominal e DM2 (ROCCHINI et al.,1989; DALY & LANDSBERG, 1991). Dessa forma, observa-se que a SM engloba variáveis que aumentam o risco para as doenças cardiovasculares (LOPES, 2005). Trabalhos recentes têm demonstrado que pessoas com SM baseados no critério de NCEP/ATP III apresentam maior risco de diabetes e doenças cardiovasculares (FORD et al., 2004; DASKALOPOULOU et al 2004; MATSUZAWA, 2005). Vale destacar que a associação da SM com a doença cardiovascular está aumentando a mortalidade geral em cerca de 1,5 vezes e a cardiovascular em cerca de 2,5 vezes (LAKKA et al., 2002; FORD & GILES, 2003; HAFFNER & TAEGTMEYER, 2003; GANG et al.; 2004; GIRMAM et al., 2004).

As evidências da literatura levam a crer que a SM resulta da influência do meio ambiente em indivíduos geneticamente predispostos. Tudo indica que a obesidade central, a pressão arterial aumentada, o aumento de triglicérides, a glicemia de jejum alterada e o baixo HDL-colesterol são os principais componentes para definir a SM (LOPES, 2005). A resistência à insulina, e até mesmo o diabetes, podem não estar presente no paciente com SM conforme os critérios da NCEP/ATP III (2001). Porém, de acordo com a Organização Mundial da Saúde (OMS), o ponto de partida para definição da SM é a avaliação da resistência à insulina ou do distúrbio do metabolismo da glicose (ALBERTI & ZIMMET,

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1998). De fato, um estudo de Goff e colaboradores (2003) indicaram haver uma correlação inversa entre sensibilidade à insulina e incidência de hipertensão, independente de idade, sexo ou etnia.

A associação de disfunções como intolerância à glicose, adiposidade abdominal, elevação de triglicérides, baixos níveis de colesterol HDL, hipertensão, dislipidemia, hipertrigliceridemia aumentam ainda mais a doença cardiovascular (KAMITANI et al., 2005). Contudo, acreditam que resistência à insulina é um fator chave para a patogênese da SM. Sendo que, a resistência metabólica à insulina constitui a maior disfunção na patogênese do DM tipo 2 e condições relacionadas, incluindo alterações do tecido endotelial. Carneiro e colaboradores (2003) citam em seu estudo que a maior prevalência de hipertensão tem sido atribuída a hiperinsulinemia decorrente da resistência à insulina presente em indivíduos obesos, principalmente naqueles que apresentam excesso de gordura na região abdominal. Neste estudo foi observado um aumento significativo na prevalência da hipertensão relacionada com o aumento do índice de massa corpórea (CARNEIRO et al., 2003).

A relação entre dislipidemia e doença cardiovascular na população geral está bem estabelecida, sendo independente do sexo, idade, história de tabagismo e presença de hipertensão arterial ou DM (BATISTA & RODRIGUES, 2004). Além da hipertensão e da dislipidemia, o diabetes citado anteriormente representa um importante fator de risco para desenvolvimento e morte por doença cardiovascular (EDWING et al., 1980; VINIK et al., 2003; KASETA et al., 1999). Indivíduos com DM do tipo 2 apresentam 2 a 4 vezes mais risco de doenças cardiovasculares do que não-diabéticos, sendo a doença cardiovascular a causa de morte em até 80% deles (KANNEL & MCGEE, 1979; STAMLER et al.,1993).

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O modelo experimental de diabetes por estreptozotocina tem sido utilizado por muitos investigadores, inclusive por nosso grupo, no estudo das alterações metabólicas e cardiovasculares, bem como na busca dos benefícios do treinamento físico nesta doença (MAEDA et al., 1995; DE ANGELIS et al., 2000, 2002; DALL’AGO, 2007; MAEDA et al., 2007; HARTHMANN et al., 2007). É importante destacar ainda que estudos demonstram que o diabetes dobra o risco de desenvolvimento das doenças cardio-circulatória no homem e triplica nas mulheres (MUIR et al., 1992; KASETA et al., 1999). Nosso grupo recentemente demonstrou que o treinamento físico induziu melhora na função autonômica associada à redução da mortalidade em ratas ooforectomizadas diabéticas por estreptozotocina (SOUZA et al., 2007). Todavia, este modelo experimental não apresenta aumento de peso corporal ou hipertensão, diferenciando-se nestes aspectos de um modelo de SM.

Neste aspecto, novos modelos experimentais têm sido desenvolvidos para o estudo da SM, entre eles o modelo de sobrecarga de frutose. Interessantemente, acompanhando o aumento da epidemia de obesidade e SM, o consumo de frutose na dieta (principalmente em alimentos industrializados), casualmente ou não, aumentou cerca de 250% nos últimos 15 anos (BASCIANO et al., 2005; BRAY et al., 2004). Dessa forma, recentemente sugeriu-se que o aumento marcante no consumo de frutosugeriu-se poderia favorecer o ganho de peso e a obesidade (BASCIANO et al., 2005; ELLIOT et al., 2002). Estudos em humanos verificaram que o consumo de frutose pode induzir ganho de peso, redução da sensibilidade à insulina, hipertrigliceridemia e aumento da PA (ELLIOT et al., 2002). Já estudos experimentais em animais machos, com sobrecarga de frutose na ração ou na água de beber, verificaram aumento dos triglicerídeos e da insulina plasmática, elevação discreta da

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PA e resistência à insulina, alterações compatíveis com um quadro inicial de desenvolvimento de SM (SUZUKI et al., 1997; FARAH et al., 2006; CUNHA et al., 2006; TEFF et al., 2004; ELLIOT et al., 2002).

Recentemente, um estudo realizado por nosso grupo em camundongos machos submetidos à sobrecarga de frutose demonstrou intolerância à glicose, além de correlação entre disfunções renais e as alterações cardiovasculares e autonômicas (CUNHA et al., 2007). Corroborando os resultados obtidos em machos, resultados recentes de nosso laboratório evidenciaram que a resistência à insulina estava associada à disfunção autonômica (redução do tônus vagal) em ratas fêmeas saudáveis submetidas à sobrecarga de frutose na água de beber de ratas (BRITO et al., 2008). Verificamos também que o treinamento físico neste modelo em ratas (fase não ovulatória) induziu redução da resistência à insulina, normalização da PA e do exacerbado efeito simpático cardíaco, além de aumento do efeito vagal (BRITO et al., 2006).

Estudos recentes do Women´s Health Initiative (WHI) têm mostrado relação das mudanças metabólicas que ocorrem nas mulheres na transição da pré-menopausa com a pós-menopausa, diretamente com a falência ovariana ou alternativamente como um resultado metabólico indireto da redistribuição da gordura central decorrente da deficiência estrogênica (CARR & BRUNZELL, 2003). Diante desses achados, a detecção da SM é fundamental para estratificar o risco global do indivíduo, principalmente da mulher e instituir um tratamento adequado, com o objetivo de controlar todos os distúrbios fisiológicos presentes.

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1.3. Doença Cardiovascular e Disfunção Autonômica

Walter Canon por volta de 1920 definiu que o sistema nervoso autônomo (SNA) era fundamental para manutenção do equilíbrio do organismo, denominando esta situação com o termo “homeostasia” (CANON, 1939). Atualmente, é consenso na literatura que a regulação neural do coração ocorre através da integração da atividade nervosa do simpático e do parassimpático, consistindo na manutenção da função cardíaca. Além disso, a atuação dos reflexos originados pelos pressorreceptores arteriais e sua integração central, dependem do controle cardiovascular (MANCIA et al., 1997; IRIGOYEN et al., 2005). Estes reflexos contribuem para manter a perfusão tecidual adequada, uma vez que a PA não sofra grandes variações. Contudo, as alterações da atividade nervosa simpática são bem mais conhecidas e estudadas que as do parassimpático, uma vez que as doenças cardiovasculares representam uma das mais importantes causas de morte nos países ocidentais (NAHAS, 2001; BOUCHARD, 2003), logo essas alterações constituem as mais fortes evidências da disfunção autonômica (FRANCHINI & KRIEGER, 1989). Entretanto, vale ressaltar que a função vagal relaciona-se com a proteção e preservação é benéfica na manutenção da variabilidade da PA, com conseqüente proteção de lesão de órgão alvo (SU & MIAO, 2001).

Uma das formas que vem sendo muito utilizada para avaliar o controle autonômico é o estudo da variabilidade da freqüência cardíaca (FC). Até 20 anos atrás, variações do ritmo cardíaco (ou da PA) eram completamente ignoradas pelos fisiologistas e cardiologistas. A variabilidade natural de parâmetros cardiovasculares como PA e FC reflete a interação de diversos fatores que, em sua maioria, envolvem uma influência do SNA sobre o aparelho cardiovascular (JOAQUIM et al., 2005). Hoje se sabe que

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irregularidades na variabilidade da FC e da PA significam algum tipo de anormalidade, e que a diminuição da variabilidade da FC é um mau prognóstico (RIBEIRO & MORAES, 2005).

A avaliação da varibilidade da FC e da PA e de seus componentes também permite a avaliação da sensibilidade espontânea dos pressorreceptores, que são mecanorreceptores responsáveis pelo controle da PA através da atividade simpática e parassimpática em um curto espaço de tempo (DE ANGELIS et al., 2004; IRIGOYEN et al., 2003). Neste aspecto, vale destacar que recentemente, o controle reflexo da circulação comandado pelos barorreceptores tem sido reconhecido também como um importante preditor de risco após evento cardiovascular (TASK FORCE, 1996; LA ROVERE et al., 1998).

De fato, estudos experimentais e clínicos vêm demonstrando que a disautonomia (disfunções no SNA) está presente em uma série de patologias, tais como a hipertensão arterial, a insuficiência cardíaca, o diabetes mellitus e outras alterações metabólicas (DE ANGELIS et al., 2004; IRIGOYEN & KRIEGER, 1998; ZANCHETTI & MANCIA, 1991; LA ROVERE et al., 1998; EWING et al., 1980; VINIK et al., 2003; DE ANGELIS et al., 2004, FARAH et al., 2007). Neste contexto, estudos vêm demonstrando de forma consistente que a hiperatividade simpática aumenta o risco cardiovascular, ao passo que uma função vagal preservada ou aumentada tem sido considerada um fator de proteção cardiovascular (TASK FORCE, 1996; KLEIGER et al., 1987). Mais recentemente, o estudo ATRAMI (Autonomic Tone and Reflexes After Myocardial Infarction) forneceu evidências clínicas do valor prognóstico da disfunção autonômica cardiovascular na mortalidade cardíaca pós-infarto do miocárdio (LA ROVERE et al.,1998). Dessa forma, intervenções no sentido de detectar, prevenir e/ou atenuar a disfunção autonômica

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cardiovascular tem sido vistas como novas e/ou importantes estratégias no manejo das doenças cardiovasculares (LA ROVERE et al., 2002). Todavia, os estudos que verificaram disfunção autonômica foram realizados em sua grande maioria em indivíduos do sexo masculino. Em contrapartida, é consenso na literatura que machos e fêmeas apresentam diferenças fisiológicas importantes que merecem ser mais bem estudadas.

1.4. Doença Cardiovascular e Estresse Oxidativo

Os mecanismos pelos quais o estrogênio reduz o desenvolvimento de doenças cardiovasculares são multifatoriais e incluem alterações no metabolismo lipídico, ações nos componentes das paredes vasculares (endotélio, músculo liso e células adventiciais), e em elementos do sangue (plaquetas e leucócitos), bem como alterações no controle do autonômico cardiovascular (MILLER, 1999). De uma forma geral, a participação do estrogênio como cardioprotetor, agindo como um antioxidante, atribui-se a sua estrutura fenólica que pode agir como neutralizador dos radicais livres (NIKKI, 1990). O grupamento hidrofenólico do estrogênio doa o hidrogênio para uma molécula instável, tornando-se um radical menos lesivo; assim o anel da molécula do estrogênio se reorganiza e se estabiliza, retirando do meio um radical livre. Dessa forma, o estrogênio tem ação antioxidante importante agindo como “scavenger” de radicais livres, ativando enzimas antioxidantes, aumentando a expressão da enzima superóxido dismutase (SOD), aumentando a síntese de mediadores vasoativos derivados do endotélio e diminuindo a expressão de enzimas pró-oxidantes (NADPH oxidase) (NIKI, 1992; KIM et al., 1996).

Considerando o papel do estrogênio como uma molécula que pode neutralizar as espécies reativas de oxigênio (ERO), vale lembra que as ERO são substâncias que

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apresentam alta reatividade para outras biomoléculas, principalmente lipídios e proteínas das membranas celulares e para o DNA. Todas as células aeróbias possuem mecanismos para combater os efeitos agressivos das ERO, que incluem as enzimas SOD citada anteriormente, a catalase (CAT) e a glutationa peroxidase (GPx) e o sistema não enzimático (DORMANDY, 1978; SIES, 1986). As ERO promovem estresse oxidativo quando as defesas antioxidantes da célula são insuficientes para deter a produção pró-oxidante (NORDMANN, 1994).

Observa-se na figura 1 as principais fontes celulares de ERO e sua metabolização.

Figura 1: Esquema geral das principais fontes celulares de produção e metabolização das ERO. UQH• + ubisemiquinona; GSSG = glutationa oxidada; GSH = glutationa reduzida; DH2 e D = sistemas redutores de NADP não-específicos; SOD = superóxido dismutase; GPx = glutationa peroxidase; CAT = catalase; B e BH2 = doadores de hidrogênio (Adaptado de BOVERIS & CHANCE, 1973).

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Um número crescente de trabalhos tem demonstrado o papel fundamental do estresse oxidativo na patogênese das doenças cardiovasculares (CAI & HARRISON, 2000). A geração de ERO em maiores quantidades causa uma diminuição do (NO) biodisponível, o que induz prejuízo na função endotelial e cardíaca (PANZA et al., 1990). O NO pode ser destruído pelo radical superóxido e protegido por mecanismos antioxidantes como a enzima superóxido dismutase (SOD) (RUBANYI & VANHOUTE, 1986; GRYGLEWSKI et al., 1986). Contudo, pacientes com hipertensão, hipercolesterolemia, diabetes, fumantes, e até mesmo no processo fisiológico do envelhecimento demonstraram relação na disfunção da vasodilatação e do endotélio, por sua vez com o estresse oxidativo (BERRY et al., 2001; CAI & HARRISON, 2000; ORIEN et al., 1999).

É interessante notar que em trabalhos do nosso grupo, a redução do estresse oxidativo e o aumento das enzimas antioxidantes têm sido correlacionados com melhora em parâmetros cardiovasculares e autonômicos, como a sensibilidade dos pressorreceptores, em ratos machos velhos, com insuficiência cardíaca ou hipertensão e em ratas fêmeas submetidas à privação dos hormônios ovarianos (DE ANGELIS et al., 1997; RABELO et al., 2001; IRIGOYEN et al., 2005; BERTAGNOLI et al., 2006). Dessa forma, o óxido nítríco, e conseqüentemente a redução de sua biodisponibilidade em situações de aumento de estresse oxidativo, tem sido destacado como um potencial mecanismo que pode estar envolvido na disfunção dos pressorreceptores, uma vez que é um regulador central da função autonômica e da sensibilidade dos pressorreceptores (CHOWDHARY et al., 2000; DE ANGELIS et al., 1999), é um fator que pode alterar a distensibilidade arterial (KASSIS & AMTORP, 1987), bem como o efeito direto do NO ou do ânion superóxido pode

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modificar a descarga dos pressorreceptores (LI et al., 1996; SHULTZ & USTINOVA, 1998).

Nosso grupo vem estudando há alguns anos os efeitos do treinamento físico dinâmico aeróbio em modelos animais, ratos e camundongos machos, como uma abordagem não farmacológica capaz de induzir alterações favoráveis na regulação autonômica cardiovascular, bem como tem buscado os possíveis mecanismos, entre eles o estresse oxidativo, envolvidos nos benefícios dessa abordagem (DE ANGELIS et al., 1997, 1999, 2000, 2004; PARENTE COSTA et al., 2004, BERTAGNOLLI et al., 2006, HARTHMANN et al., 2007). Todavia, deve-se considerar que a maior parte dos trabalhos publicados na literatura com relação aos efeitos hemodinâmicos, autonômicos e no estresse oxidativo em animais e humanos foi realizado em amostras do sexo masculino, ficando a dúvida se o sexo feminino, em situações fisiológicas, como o climatério, e fisiopatológicas, como a SM, se adaptaria de forma semelhante. Além disto, é necessária a busca de alternativas terapêuticas para atenuar e ou tratar as disfunções decorrentes da privação dos hormônios ovarianos. Neste aspecto, vários estudos têm demonstrado o papel benéfico do treinamento físico em situações fisiológicas e patológicas.

1.5. Doença Cardiovascular e Treinamento Físico

Estudos epidemiológicos têm demonstrado que o sedentarismo é um grande fator de risco para o desenvolvimento da hipertensão e do diabetes não insulino dependente (NIDDM) (HARDMANN, 1996). Os efeitos benéficos do exercício físico têm sido demonstrados na prevenção e tratamento da HAS, na resistência à insulina, no DM, na dislipidemia e na obesidade, no qual são fatores predominantes na síndrome metabólica

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(NCEP, 2001; TUOMILEHTO et al., 2001; WHELTON et al., 2002; HENRISSEN, 2002; ROSS et al., 2000; TORJESEN et al., 1997; HOUMARD et al., 2004; KNOWLER et al., 2002; PAN et al., 1997; BACON et al., 2004; HAGBERG et al., 2000; CARROL & DUDFIELD, 2004; GUIMARÃES & CIOLAC, 2004).

A prática regular de atividade física é considerada um tratamento não-farmacológico para o manejo e/ou prevenção de diversas patologias. Nesse contexto, sem dúvida o estilo de vida adotado pelas sociedades modernas pode colaborar para esses altos índices de sedentarismo, o qual pode contribuir de forma importante para o desenvolvimento de doenças crônicas (FRANCISCHI, 2000).

Gregoire e colaboradores (1996) observaram uma maior variabilidade da FC, um achado associado à menor risco cardiovascular, em mulheres jovens (treinadas e não-treinadas) e de meia-idade (treinadas e não-não-treinadas) quando comparadas a homens. As jovens não-treinadas e as mulheres de meia-idade (treinadas e não-treinadas) tiveram uma atividade simpática de repouso significativamente menor em relação aos homens nas idades correspondentes. Além disso, as jovens não-treinadas e as de meia-idade treinadas tiveram uma maior atividade parassimpática de repouso do que os seus correspondentes do sexo masculino. Esses dados em conjunto, mesmo indicando melhor modulação autonômica cardiovascular no sexo feminino do que no masculino, não permitem, entretanto, concluir sobre os efeitos do treinamento físico na proteção cardiovascular da mulher, pois outros fatores, como os genéticos poderiam modular esses resultados.

Considerando que a hipertensão é um achado comum em pacientes com SM, é importante destacar a redução dos níveis pressóricos pós-treinamento observada de forma consistente tanto em homens como em mulheres hipertensos, pré ou pós-menopausa

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(WHELTON et al., 2002; KELLEY, 1999; SEALS et al., 1997). Um dos fatores que pode contribuir para reduzir a PA é reversão da atenuação da disfunção barorreflexa após treinamento físico dinâmico em indivíduos hipertensos (BRUM et al., 2000; O´SULLIVAN & BELL, 2000).

Estudos em mulheres no climatério vêm demonstrando que o treinamento físico também induz melhora no perfil lipídico principalmente em presença de sobrepeso ou dislipidemia (ASIKAINEN et al., 2004). Sugawara e colaboradores (2004), em estudo em mulheres após a menopausa, verificaram que o treinamento físico de baixa ou de moderada intensidade melhorou a complacência arterial. Sabe-se que a redução na complacência arterial resulta no aumento progressivo da PAS relacionado ao envelhecimento, aumentando também a função ventricular esquerda, diminuindo a pressão diastólica, e com isso alterando a perfusão coronariana.

O treinamento físico pode provocar alterações cardiovasculares e autonômicas importantes tais como bradicardia de repouso (NEGRÃO et al., 1992; DE ANGELIS et al., 1997, 1999, 2004; KATONA et al., 1982; FRICK, 1967), redução da PA em ratos espontaneamente hipertensos (SHR) (SILVA et al., 1997; BERTAGNOLLI et al., 2006) e melhora da sensibilidade dos pressorreceptores em sujeitos normotensos (MC`DONALD et al., 1993; BARNEY et al., 1988; DE ANGELIS et al., 2004; NEGRÃO et al, 1992; BEDFORD & TIPTON, 1987) e em ratos SHR e diabéticos (SILVA et al., 1997; BERTAGNOLLI et al., 2006; HARTHMANN et al., 2007). Além disto, estudos demonstraram adaptações das enzimas antioxidantes e redução do estresse oxidativo em resposta ao treinamento físico (JI & FU, 1992; MARGARATIS et al., 1997; VENDITTI E

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DI MEO, 1997; DE ANGELIS et al., 1997; IRIGOYEN et al., 2005; BERTAGNOLLI et al., 2006).

Apesar dos vários trabalhos evidenciando os benefícios do treinamento físico, a grande maioria desses estudos foi realizada em amostras do sexo masculino. Em estudos mais recentes tem sido demonstrado que treinamento físico aeróbio pode induzir melhora nos perfis metabólico e lipídico, reduzir a inflamação e as moléculas de adesão (WEGGE et al., 2004) e aumentar a variabilidade da FC (JURCA et al., 2004) em mulheres menopausadas (ASIKAINEN et al., 2004), bem como melhorar a resposta da insulina estimulada pelo teste de tolerância a glicose em ratas ooforectomizadas (LATOUR et al., 2001). Um trabalho recente de nosso laboratório evidenciou que o treinamento físico aeróbio em um modelo experimental de menopausa em ratas induziu aumento da capacidade aeróbia, redução do peso corporal, da PA e da FC de repouso e melhora na sensibilidade dos pressorreceptores associada à redução no estresse oxidativo e ao aumento nas defesas antioxidantes no tecido cardíaco (IRIGOYEN et al., 2005).

Por fim, vale destacar que a taxa de mortalidade devido a doenças cardiovasculares aumentou de 10 para 25% nos anos 60 e 70 em mulheres (CASTANHO et al., 2001) é eminente a necessidade da busca de alternativas terapêuticas para a prevenção e o tratamento das doenças cardiovasculares e metabólicas na mulher. Cabe lembrar que atualmente os efeitos de proteção cardiovascular através da terapia hormonal são altamente

controversos (WRITING GROUP FOR THE WOMEN`S INITIATIVE

INVESTIGATORS, 1996). Em contrapartida, os benefícios obtidos através da atividade física regular têm cada vez mais reforçando a importância desta abordagem na prevenção e no tratamento das doenças (PEDERSEN & SALTIN, 2006; MOSCA et al., 2007).

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Considerando o importante papel da disautonomia como fator de risco de doença cardiovascular, bem como o possível envolvimento do estresse oxidativo nesta disfunção, intervenções que reduzam o estresse oxidativo e/ou melhorem a função autonômica tem sido vistas como potenciais estratégias no manejo do risco cardiovascular. Neste projeto avaliamos o efeito da sobrecarga de frutose na água de beber (um modelo de disfunção cardiovascular e metabólico) tanto em ratas fêmeas Wistar como em fêmeas espontaneamente hipertensas (SHR), ambas ooforectomizadas, na tentativa de alcançarmos um modelo de SM, e, assim, pudemos avaliar os efeitos do treinamento físico em diferentes fatores de risco muitas vezes observados de forma concomitante em mulheres no climatério.

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2. OBJETIVOS

2.1. Objetivo Geral

O objetivo do presente estudo foi verificar os efeitos do treinamento físico em parâmetros cardiovasculares e metabólicos, na modulação autonômica cardiovascular e no estresse oxidativo em ratas fêmeas ooforectomizadas normotensas e hipertensas submetidas à sobrecarga de frutose.

2.2. Objetivos Específicos

Os objetivos específicos do presente projeto foram avaliar os efeitos do treinamento físico em ratas fêmeas normotensas e hipertensas submetidas à privação dos hormônios ovarianos e a ingestão crônica de frutose na água de beber nos seguintes parâmetros:

• peso corporal;

• glicose e nos triglicerídeos sanguíneos;

• resistência à insulina;

• pressão arterial e na freqüência cardíaca;

• variabilidade da frequência cardíaca (RMSSD, VAR-IP, %BF e %AF);

• variabilidade da pressão arterial (VAR-PAS, BF);

• sensibilidade barroreflexa espontânea (Índice alfa);

• estresse oxidativo (QL e GSH/GSSG);

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3. MATERIAIS E MÉTODOS

O presente estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa da Universidade São Judas Tadeu (COEP-USJT) de acordo com os seguintes protocolos: 024/2005, 064/2006 e 01/2008.

3.1. Amostra

Foram utilizadas 20 ratas Wistar fêmeas e 20 ratas SHR (ratas espontaneamente hipertensas) fêmeas, pesando entre 50-60g, provenientes do biotério da Universidade São Judas Tadeu e do Biotério da Universidade Federal de São Paulo. Os animais foram mantidos em gaiolas, contendo no máximo 4 animais em cada uma, em ambiente com temperatura controlada (220 - 240C) e com luz controlada em ciclo de 12 horas (claro - escuro, invertido). Os animais foram divididos em 4 grupos experimentais com 10 ratas em cada grupo:

Grupo I - Frutose ooforectomizada sedentária (FOS) (n=10): ração industrial para ratos + solução de água com frutose (10%), durante um período de 18 semanas.

Grupo II - Frutose ooforectomizada treinada (FOT) (n=10): ração industrial + solução de água com frutose (10%), durante um período de 18 semanas, sendo que foram submetidas à treinamento físico em esteira ergométrica rolante (Imbramed TK-01) a partir da 9ª semana de protocolo.

Grupo III - Frutose hipertensa ooforectomizada sedentária (FOHS) (n=10): ração industrial + solução de água com frutose (10%) durante 18 semanas.

Grupo IV - Frutose hipertensa ooforectomizada treinada (FOHT) (n=10): ração industrial + solução de água com frutose (10%) durante 18 semanas, sendo que foram

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submetidas à treinamento físico em esteira ergométrica rolante (Imbramed TK-01) a partir da 9ª semana de protocolo.

3.2. Seqüência Experimental

Os grupos experimentais seguiram a seqüência experimental ilustrada abaixo:

Figura 2: Seqüência Experimental do protocolo.

3.3.PROCEDIMENTOS

3.3.1. Indução do Modelo Experimental de Síndrome Metabólica

Todos os grupos foram submetidos a ingestão de frutose na água de beber (D-frutose, 100g/L) (SUZUKI et al., 1997). O tratamento foi iniciado após o desmame e seguiu até o final do protocolo (Figura 3).

A va lia çõ es B io qu ím ic a s (FOT e FOHT) (FOS e FOHS) Tratamento com Frutose (FOS e FOHS) A va lia çõ es B io qu ím ic a s (FOT e FOHT) (FOS e FOHS) Tratamento com Frutose (FOS e FOHS)

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Figura 3: Tratamento de D-frutose na água de beber.

3.3.2. Ooforectomia Bilateral

As ratas foram anestesiadas com cloridrato de cetamina (Ketalar) e cloridrato de xilazina (Rompum) e colocadas em decúbito dorsal para que se realize uma pequena incisão (1cm) em paralelo com a linha do corpo na pele e na musculatura no terço inferior na região abdominal. Os ovários foram localizados e foi realizada a ligadura dos ovidutos, incluindo os vasos sangüíneos. Os ovidutos foram seccionados e os ovários removidos. A musculatura e a pele foram suturadas e uma dose de antibiótico foi administrada (Benzetacil, 40 000 U/Kg, i.m) (LATOUR et al., 2001; IRIGOYEN et al., 2005) (Figura 4).

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3.3.3. Teste de Esforço Máximo

O teste de esforço constituiu em um protocolo escalonado com incrementos de velocidade de 0,3 km/h a cada 3 minutos, até que seja atingida a velocidade máxima suportada pelos animais. O critério utilizado para a determinação da exaustão do animal e interrupção do teste foi o momento em que o rato não foi mais capaz de correr mediante o incremento de velocidade da esteira (BROOKS & WHITE, 1978). Vale ressaltar que recentemente demonstramos relação entre velocidade do atingida no teste de esforço e a medida direta do consumo de oxigênio em ratos (RODRIGUES et al., 2007) (Figura 5).

Figura 5: Correlação entre o consumo de oxigênio (VO2) e a velocidade do teste de esforço (km/h) em ratas ooforectomizadas.

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3.3.4. Treinamento Físico

O grupo de ratas treinadas foi submetido a um protocolo de treinamento físico (40-60% da velocidade máxima alcançada no teste de esforço) em esteira ergométrica com velocidade e carga progressiva durante 8 semanas conforme descrito resumidamente abaixo (IRIGOYEN et al., 2005, DE ANGELIS et al., 1997, 1999) (Figura 6, Quadro 1 e Quadro 2).

Figura 6: Fotografia de ratos submetidos ao protocolo de treinamento físico em esteira ergométrica na USJT.

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Quadro 1: Protocolo de treinamento físico para ratas Wistar Semana Duração (min) Velocidade (Km/h)

1ª 15 – 23 0,3 – 0,6 2ª 23 – 50 0,3 – 0,8 3ª 47 – 55 0,3 – 0,8 4ª 55 – 60 0,3 – 0,8 5ª 60 0,3 – 1,0 6ª 60 0,3 – 1,0 7ª 60 0,3 – 1,0 8ª 60 0,3 - 1,0